CN102041310B - 一种检测鸡玫瑰冠性状的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列组成的引物对。所述引物对可应用于检测鸡玫瑰冠性状。并提供了用其检测鸡玫瑰冠性状的方法。本发明发现鸡的CCDC108基因内含子3中的扩增片段长度多态与玫瑰冠性状具有显著相关的特性，可以作为鸡的遗传标记，使用分子生物学手段，进行标记辅助选择。

Description

一种检测鸡玫瑰冠性状的方法
技术领域
本发明涉及使用分子生物学手段，对鸡冠性状进行分子标记检测的方法。
背景技术
随着畜牧业的发展，外貌特征在鸡的育种和保种中占据了重要地位，分子标记也在育种和保种中起到了重要作用。但是，对于控制外貌特征的分子标记的研究仍然较少，仅有少量的外貌特征能够通过分子标记进行辅助选择育种。
鸡冠为皮肤衍生物，位于头部，不同品种有不同冠形，冠形为品种特征之一，包括单冠、玫瑰冠、豆冠、肉垫冠、草莓冠、杯状冠、羽毛冠等7种，冠的颜色大多为红色，色泽鲜艳、细致、丰满、滋润是健康的征状。1905年，Bateson和Punnett第一次在动物中利用玫瑰冠和豆冠阐明了位点互作的现象(Bateson W.，Punnett R.C.Asuggestion as to the nature of the″walnut″comb in fowls.Proceedings ofthe Cambridge Philosophical Society 13：165-168，1905)，利用玫瑰冠位点开展的遗传学研究在遗传学的发展历史中起到了重要作用。
玫瑰冠表型相对于单冠表型是一种单位点控制的显性性状，因而在保种和育种的过程中，根据表型无法准确区分显性纯合子和杂合子个体，造成选育效率低下。随着分子数量遗传理论的发展，需找到影响玫瑰冠性状的分子标记，通过标记辅助选择，可以迅速准确地鉴定候选个体的基因型，从根本上解决这一保种和育种难题。
DNA分子标记是以个体间遗传物质中的核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的
Figure BDA0000026156860000011
接反映。在鸡基因组中分布有大量的分子标记，携带巨大的遗传信息量，目前已经有多个重要性状得到了定位，可以利用相关的分子标记进行分子标记辅助选择育种，对育种起到了巨大的促进作用。
扩增片段长度多态性是指用聚合酶链式反应(PCR)技术进行体外扩增DNA时出现的片段长度多态性现象，是一种十分理想、有效的分子标记。
CAU资源家系是由中国农业大学李宁教授课题组1998年建立的用于研究定位影响鸡重要经济性状QTL、寻找克隆主效基因的实验群体，亲本为法国明星肉鸡和泰和丝羽乌骨鸡(邓学梅，李俊，李宁，吴常信.(2001).基于F-2群体的鸡重要生长性状遗传分析.遗传学报28，801-807)。在CAU资源家系中记录了F0、F1和F2代个体的鸡冠形状，根据连锁分析定位了影响鸡玫瑰冠性状的基因位点，为进一步的研究打下了基础。通过分析该区域的鸡卷曲螺旋结构域108(Coiled-Coil Domain Containing 108，CCDC108)基因序列，分离得到了影响鸡玫瑰冠性状的基因和序列变异。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用鸡卷曲螺旋结构域108(Coiled-Coil Domain Containing 108，CCDC108)基因的扩增片段长度多态检测鸡玫瑰冠性状的方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案首先提供用于检测鸡玫瑰冠性状的引物对，其具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3
Figure BDA0000026156860000021
所示的核苷酸序列。
利用此引物对的扩增产物，检测待测鸡的CCDC108基因内含子3中扩增片段为294bp还是418bp。
上述引物对还可应用于制备检测鸡玫瑰冠性状的试剂盒。只需含有必需的PCR试剂和引物对即可，也可同时含有提取待测鸡的基因组DNA的试剂。
本发明进一步提供一种检测鸡玫瑰冠性状的方法，包括如下步骤：分别以每只待测鸡的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO.1、SEQID NO.2和SEQ ID NO.3所
Figure BDA0000026156860000031
示的DNA组成的引物对进行PCR扩增，如果扩增片段为294bp(如SEQ ID NO.4所
Figure BDA0000026156860000032
示)，待测鸡的基因型为SS；如果扩增片段为418bp(如SEQ ID NO.5所
Figure BDA0000026156860000033
示)，待测鸡的基因型为RR；如果扩增片段为294bp和418bp，待测鸡的基因型为RS；
Figure BDA0000026156860000034
述SS基因型鸡为单冠纯合子，RR基因型鸡为玫瑰冠纯合子，RS基因型鸡为玫瑰冠杂合子。上述检测方法可以为常规的PCR-琼脂糖检测方法。
上述的方法，引物对或试剂盒可应用于鸡的育种。
本发明所提供的方法和产品，对鸡的玫瑰冠性状进行选择，可以接
Figure BDA0000026156860000037
玫瑰冠性状纯合子个体保留下来，从而大大地提高育种和保种效率。本发明为鸡育种的分子标记辅助选择提供了一个高效准确、简便快速的分子遗传标记，为鸡的玫瑰冠性状的选种和保种提供了一种有效的分子标记育种手段。用该遗传标记对鸡的玫瑰冠性状进行标记辅助选择，可有效地缓解实际育种和保种中的无法区分玫瑰冠纯合子和杂合子的问题，提供选种保种效率，并为利用该性状进行分子聚合育种
Figure BDA0000026156860000038
定基础，
Figure BDA0000026156860000039
加快育种进程。本发明的检测方法操作简单，费用低廉，准确度高，可实现自动化检测。可根据本发明的方法开发出相应的检测试剂盒，用于选择携带有利基因型(RR)的个体，为鸡的育种保种工作提供便利。
附图说明
图1为PCR方法检测CCDC108基因片段长度多态电泳胶图；其中泳道1(M)为100bp Marker；泳道2(CK)为空白对照；泳道3-13为CAU资源家系的11个不同个体。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。
实施例1、PCR检测方法的建立及多态位点的确定
一、基因型分析
1、实验材料：CAU资源家系是由中国农业大学李宁教授课题组1998年建立的用于研究定位影响鸡重要经济性状QTL、寻找克隆主效基因的实验群体，亲本为法国明星肉鸡和泰和丝羽乌骨鸡。本实验选取了CAU资源家系的4个家系的F0、F1和F2代个体，共计278个。
2、基因组DNA的提取
鸡12周龄时翅静脉采血，抗凝处理后裂解，经蛋白酶K消化后，用酚仿抽提，TE溶解-20℃保存。
3、PCR扩增
以步骤2提取的基因组DNA为模板，用引物对CCDC108基因进行PCR扩增。
RosecombF1：5′-GCCCCTTCCTGAAGCAATA-3′(如SEQ ID NO.1所
Figure BDA0000026156860000042
示)；
RosecombF2：5′-GACTCCTTCCATCGCTCAGA-3′(如SEQ ID NO.2所
Figure BDA0000026156860000043
示)；
RosecombR：5′-CCTTGTTCCCAGCAGGAGTA-3′(如SEQ ID NO.3所
Figure BDA0000026156860000044
示)；
PCR反应体系(25μl)终浓度为：基因组DNA 40ng，1x扩增缓冲液，Mg2+1.5mM，dNTPs 200μM，去离子甲酰胺(也可用二甲基亚砜替代)5％，RosecombF1 0.14μM，RosecombF2 0.26μM，RosecombR 0.4μM，Taq DNA聚合酶1U，加灭菌水补至25μl。
PCR反应条件：94℃变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35循环；72℃延伸7min；20℃保存。
4、PCR产物检测
取5μl PCR产物进行2％琼脂糖凝胶检测(见图1)。
产生三种带型：
第一种带型：只有一个条带，为294bp；
Figure BDA0000026156860000051
基因型命名为SS；
第二种带型：只有一个条带，为418bp；
Figure BDA0000026156860000052
基因型命名为RR；
第三种带型：有二个条带，分别为294bp和418bp；
Figure BDA0000026156860000053
基因型命名为RS。
二、测序验证
分别
Figure BDA0000026156860000054
各个样本的PCR产物进行测序。结果表明，所
Figure BDA0000026156860000055
有个体的鸡中：SS基因型均为如SEQ ID NO.4所示的DNA的纯合体；RR基因型均为如SEQ ID NO.5所
Figure BDA0000026156860000057
示的DNA的纯合体；RS基因型均为如SEQ ID NO.4所
Figure BDA0000026156860000058
示的DNA和如SEQ ID NO.5所
Figure BDA0000026156860000059
示的DNA的杂合体。
三、相关性分析
结果如表1表明，在所
Figure BDA00000261568600000510
检测的278个个体中，RR基因型有15个，RS基因型有106个，SS基因型有157个。RR基因型和RS基因型个体均为玫瑰冠表型，SS基因型个体均为单冠表型。其中RR基因型个体均为显性纯合子，而RS基因型个体均为杂合子。
表1 CCDC108基因不同基因型与玫瑰冠性状的相关性分析统计表
  表型   数量   RR基因型   RS基因型   SS基因型
  玫瑰冠   121   15   106   0
  单冠   157   0   0   157
  总计   278   15   106   157
实施例2、分子标记的应用
分别对具有玫瑰冠表型的6个品种(均获自中国农业科学院家禽研究
Figure BDA00000261568600000511
、北京家禽育种公司)和非玫瑰冠表型的(包括单冠和豆冠等非玫瑰冠表型)31个品种测定，具体品种见表2和表3。
1、基因组DNA的提取
鸡12周龄时翅静脉采血，抗凝处理后裂解，经蛋白酶K消化后，用酚仿抽提，TE溶解-20℃保存。
2、PCR扩增
以步骤1提取的基因组DNA为模板，用引物对CCDC108基因进行PCR扩增。
RosecombF1：5′-GCCCCTTCCTGAAGCAATA-3′(如SEQ ID NO.1所
Figure BDA0000026156860000061
示)；
RosecombF2：5′-GACTCCTTCCATCGCTCAGA-3′(如SEQ ID NO.2所
Figure BDA0000026156860000062
示)；
RosecombR：5′-CCTTGTTCCCAGCAGGAGTA-3′(如SEQ ID NO.3所
Figure BDA0000026156860000063
示)；
PCR反应体系(25μl)终浓度为：基因组DNA 40ng，1x扩增缓冲液，Mg2+1.5mM，dNTPs 200μM，去离子甲酰胺(也可用二甲基亚砜替代)5％，RosecombF1 0.14μM，RosecombF2 0.26μM，RosecombR 0.4μM，Taq DNA聚合酶1U，加灭菌水补至25μl。
PCR反应条件：94℃变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35循环；72℃延伸7min；20℃保存。
3、PCR产物检测
取5μl PCR产物进行2％琼脂糖凝胶检测。
4、相关性分析结果
从表2中可以看出，6个玫瑰冠表型的品种中，490个个体中可以检测到RR和RS两种基因型，其中RR为纯合子，共计151个个体，RS为杂合子，共计339个个体。从表3中可以看出，31个非玫瑰冠表型的品种中，378个个体均为SS基因型。
结果表明，RR基因型为玫瑰冠纯合子，RS基因型为玫瑰冠杂合子，SS基因型为非玫瑰冠表型。本位点可以作为一个遗传标记，应用于鸡玫瑰冠性状的选种和保种工作中，提高选择效率。
表2  CCDC108基因不同基因型与
玫瑰冠表型品种的相关性分析统计表
  玫瑰冠品种   数量   RR基因型   RS基因型   SS基因型
  丝羽乌骨鸡   229   102   127   0
  金湖乌鸡   75   14   61   0
  快大乌鸡   71   18   53   0
河南斗鸡 43  5  38  0
固原鸡 65  12  53  0
边鸡 7  0  7  0
总计 490  151  339  0
表3  CCDC108基因不同基因型与非玫瑰冠表型品种的相关性分析统计表
Figure BDA0000026156860000071
Figure BDA0000026156860000081
以上
Figure BDA0000026156860000082
述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.用于检测鸡玫瑰冠性状的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4和/或SEQ ID NO.5所示。
2.用于扩增权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.用于检测鸡玫瑰冠性状的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的引物对。
4.一种检测鸡玫瑰冠性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测鸡的基因组DNA为模板，用权利要求2所述的引物对进行PCR-琼脂糖检测。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，其中PCR反应条件为：94℃变性5min；94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35循环；72℃延伸7min；20℃保存。
6.权利要求1所述的分子标记在玫瑰冠表型鸡的育种中的应用。
7.权利要求2所述的引物对在玫瑰冠表型鸡的育种中的应用。
8.权利要求3所述的试剂盒在玫瑰冠表型鸡的育种中的应用。
9.权利要求4或5所述的方法在玫瑰冠表型鸡的育种中的应用。
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