CN114854880B - 一种基于kasp技术的丝羽乌骨鸡玫瑰冠分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于KASP技术的丝羽乌骨鸡玫瑰冠分子标记及其应用，属于动物遗传育种技术及分子生物学领域。该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在SEQ ID NO：1所示序列第201bp处有一个G/T碱基突变。本发明发现鸡基因组7号染色体第21948753位发生G向T的点突变，对该SNP位点设计引物，获得的引物组可有效区分等位变异位点，并且通过DNA提取、PCR特异性扩增、KASP基因分型检测即可完成对丝羽乌骨鸡玫瑰冠的鉴定，利用本发明分子标记可筛选杂合玫瑰冠基因型，对丝羽乌骨鸡玫瑰冠辅助选择育种具有重要价值。

Description

一种基于KASP技术的丝羽乌骨鸡玫瑰冠分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及动物遗传育种技术及分子生物学领域，特别是涉及一种基于KASP技术的丝羽乌骨鸡玫瑰冠分子标记及其应用。

背景技术

鸡冠外观的选择在家禽育种工作中是一项重要的任务，同时也是用于论证孟德尔遗传定律的经典案例。雌性鸡在择偶时相较于其他的装饰性状，主要看雄性的鸡冠，它们更偏向于具有较大颜色较深鸡冠的雄性鸡。

丝羽乌骨鸡外貌与其他鸡种有明显的不同，标准的丝羽乌骨鸡具有暗紫色的玫瑰冠、冠后生有绒球状的丝羽、耳叶现出蓝绿色彩、肉垂减小并生有胡须、胫部生胫羽、乌皮乌肉乌骨等十余个特点。故玫瑰冠不仅作为三种特殊冠型(豆冠、玫瑰冠和双冠)之一，更是丝羽乌骨鸡的标志性外观性状之一。但玫瑰冠为常染色体显性遗传，如何选择高效的方法剔除具有单冠等位基因的杂合子，是保证其玫瑰冠稳定遗传的重要问题。

KASP(竞争性等位基因特异性PCR Kompetitive Allele Specific PCR)技术是一种基于荧光信号的竞争性等位基因特异性PCR，是针对模板样品中的SNP(单核苷酸多态性，Single Nucleotide Polymorphisms)位点进行检测分型，可以够精确地进行双等位基因分型。其相较于传统的PCR具有通量高、成本低、效率高、准确度高、遗传稳定性好等优点。因此基于KASP技术鉴定丝羽乌骨鸡玫瑰冠的分子标记，用于筛选杂合玫瑰冠基因型，对丝羽乌骨鸡玫瑰冠辅助选择育种具有重要价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于KASP技术的丝羽乌骨鸡玫瑰冠分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过该分子标记可开展对丝羽乌骨鸡玫瑰冠的鉴定，筛选杂合玫瑰冠基因型，对丝羽乌骨鸡玫瑰冠辅助选择育种具有重要价值。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种与丝羽乌骨鸡玫瑰冠相关的分子标记，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

进一步地，SEQ ID NO：1所示序列第201bp处有一个G/T碱基突变。

本发明还提供一种检测上述的分子标记的KASP引物组，包括核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示的第一正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的第二正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向引物。

进一步地，所述第一正向引物和所述第二正向引物5’端连接不同颜色的荧光基团；

所述第一正向引物连接HEX荧光基团，所述第二正向引物连接FAM荧光基团。

本发明还提供一种基于KASP技术检测丝羽乌骨鸡玫瑰冠基因分型的试剂盒，包括上述的KASP引物组。

本发明还提供一种鉴定丝羽乌骨鸡玫瑰冠基因型的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测丝羽乌骨鸡的基因组DNA；

(2)利用上述KASP引物组进行PCR扩增，获取扩增产物；

(3)根据扩增产物的荧光信号鉴定待测丝羽乌骨鸡的玫瑰冠基因型；

若荧光信号为HEX，则鉴定待测丝羽乌骨鸡的玫瑰冠基因型为RR；若为FAM和HEX，则鉴定为Rr，若为FAM，则鉴定为rr。

进一步地，所述PCR扩增的反应体系包括：模板DNA 2μL，引物混合液KASP Assaymix 0.14μL，2×2×KASP Master mix 5μL，ddH₂O 2.86μL。

进一步地，所述引物混合液KASP Assay mix中第一正向引物、第二正向引物和反向引物的体积比为1：1：2。

进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：预变性94℃15min；变性94℃20s，Touch-down退火并延伸61℃～55℃60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；变性94℃20s，退火并延伸55℃60s，26个循环。

本发明还提供一种上述的分子标记、上述的KASP引物组或上述的试剂盒在鉴定丝羽乌骨鸡玫瑰冠基因型中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明发现鸡基因组7号染色体第21948753位发生G向T的点突变，对该SNP位点设计引物，通过对引物组合出现的错配、发夹结构、引物二聚体等情况进行筛选，获得的引物组可有效区分等位变异位点，通过DNA提取、PCR特异性扩增、KASP基因分型检测即可完成对丝羽乌骨鸡玫瑰冠的鉴定，利用本发明分子标记可筛选杂合玫瑰冠基因型，对丝羽乌骨鸡玫瑰冠辅助选择育种具有重要价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为丝羽乌骨鸡玫瑰冠的等位基因分型图；1：玫瑰冠纯合子RR；2：玫瑰冠杂合子Rr；3：单冠纯合子rr。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1丝羽乌骨鸡玫瑰冠基因的功能KASP分子标记及其引物的探究

位于鸡第7号染色体上的CFAP65基因是玫瑰冠形成的候选基因MNR2的相邻基因之一，该基因位置发生的染色体倒置使得原本的鸡冠发生了变异，形成了玫瑰冠的表型。利用Sanger测序技术分析发现，在丝羽乌骨鸡的群体中，玫瑰冠群体和单冠群体在鸡第7号染色体上存在序列差异，即CFAP65基因的第1203位碱基的G/T突变。根据上述序列差异，开发了KASP分子标记，并利用该标记对45份丝羽乌骨鸡血样进行单倍型分析，探究其应用价值。

实施例2丝羽乌骨鸡玫瑰冠基因的功能KASP分子标记在群体中的使用

本实施例中使用的群体为混有单冠及玫瑰冠的丝羽乌骨鸡群体，目的是验证功能分子标记KASP是否可以用于丝羽乌骨鸡玫瑰冠基因分型。

1、丝羽乌骨鸡总DNA的提取

对丝羽乌骨鸡进行DNA的提取。具体步骤如下：

(1)取新鲜血样50μL，放入1.5mL的离心管，加入200μL裂解液，2μL的10mg/ml的蛋白酶K后37℃摇床12h。

(2)加入RNaseA至终浓度20ug/ml，水浴30min。

(3)加入700μL的苯酚：氯仿：异戊醇(体积比25:24:1)，轻轻颠倒混匀，室温条件下14000rpm离心5min。

(4)吸取上清液，加入等体积氯仿：异戊醇(体积比24:1)14000rpm离心5min。

(5)吸取上清液，两倍体积无水乙醇，颠倒混匀后14000rpm离心5min。

(6)75％乙醇洗涤沉淀两次，放于通风处室温晾干。

(7)加入20-50μL ddH₂O，涡旋混匀后于-20℃冰箱中保存备用。

2、引物的合成及PCR扩增

扩增CFAP65的引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的第一正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的第二正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向引物：

SEQIDNO:2：CCCTGCCTGCTCTGGGACT；

SEQIDNO:3：CCTGCCTGCTCTGGGACG；

SEQIDNO:4：GAGCCAAACTCTTAGTAAGRGCAGAAA；

第一正向引物和第二正向引物采用不同荧光基团标记物修饰；

第一正向引物采用HEX标签序列修饰SEQ ID NO:5，第二正向引物采用FAM标签序列修饰SEQ ID NO:6；

SEQ ID NO:5：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCTGCCTGCTCTGGGACT(其中下划线部分为HEX荧光标签序列)；

SEQ ID NO:6：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCTGCCTGCTCTGGGACG(其中下划线部分为FAM荧光标签序列)。

通过生物公司合成KASP修饰引物的混合物KASP Assay mix(第一正向引物、第二正向引物和反向引物体积比为1:1:2)。

利用步骤1提取的基因组DNA为模板，使用溶解后的混合引物对DNA模板进行Touch-down PCR扩增：

PCR扩增的反应总体系为10μL：模板DNA 2μL，引物混合液(KASP Assay mix)0.14μL，2×2×KASP Master mix 5μL，ddH₂O 2.86μL。

PCR扩增的反应程序为：预变性94℃15min；变性94℃20s，Touch-down退火并延伸61℃～55℃60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；变性94℃20s，退火并延伸55℃60s，26个循环。

将扩增得到的PCR产物进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：

注：阴影处为目的位点。

3.将PCR产物利用qPCR进行荧光信号检测。

荧光检测的qPCR反应体系为：荧光读取37℃1min。

通过qPCR配套软件进行第7号染色体上第21948753位SNP分型，并使用qPCR对每个样品不同的荧光信号检测，不同的基因型显示出不同的荧光类型。根据PCR产物的荧光信号确定待鉴定丝羽乌骨鸡玫瑰冠的具体基因型，完成对群体中玫瑰冠杂合子的鉴别，从而达到分子辅助育种的目的。

分型结果如图1所示，其中1号显示的荧光信号为HEX，是SNP的TT类型，并代表丝羽乌骨鸡玫瑰冠纯合子(RR)；2号为FAM和HEX，是SNP的TG类型,代表丝羽乌骨鸡玫瑰冠杂合子(Rr)；3号为FAM，是SNP的GG类型，代表丝羽乌骨鸡单冠纯合子(rr)。

具体的45个分型结果如下(表1)：

表1

/>

采用本发明的KASP分子标记对45份丝羽乌骨鸡血样进行基因型分析，结果显示，KASP实验结果与待测样品的实际鸡冠基因型相同，说明利用该分子标记对待测样本进行KASP实验，能够有效检测其基因型，可用于丝羽乌骨鸡玫瑰冠的鉴定与辅助育种。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种基于KASP技术的丝羽乌骨鸡玫瑰冠分子标记及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 401

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagtatttaa aatgcaatgc ctttctaaaa ttcggttttg ctgatacttc tgtctgtgag 60

gcatttccag tctagtgaga gatttgaatc gtggatgtat gccagccagc cgctggtgtg 120

tcccgaaacc atggctccag ggagtcctgc tggacgtcag gccatgccag cattccctgt 180

gaccctgcct gctctgggac tcaaatgttt ctgcccttac taagagtttg gctcacgctg 240

cgtggcctgg gaatgtaaaa tattgcttca ggaaggggca ggtatttaga gctgggaagg 300

gattttcagg acgcctgggt tctgttcctg tttgctgagt gtctttgggg tcaggtttgt 360

aagtcacctc taactggggg gctttggggc cttttaatac t 401

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccctgcctgc tctgggact 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctgcctgct ctgggacg 18

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagccaaact cttagtaagr gcagaaa 27

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat tccctgcctg ctctgggact 40

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaaggtgacc aagttcatgc tcctgcctgc tctgggacg 39

Claims (5)

1.一种鉴定丝羽乌骨鸡玫瑰冠基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测丝羽乌骨鸡的基因组DNA；

(2)利用检测与丝羽乌骨鸡玫瑰冠相关的分子标记的KASP引物组进行PCR扩增，获取扩增产物；

(3)根据扩增产物的荧光信号鉴定待测丝羽乌骨鸡的玫瑰冠基因型；

在步骤(2)中，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，SEQ ID NO：1所示序列第201bp处有一个G/T碱基突变；

所述KASP引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的第一正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的第二正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向引物；所述第一正向引物和所述第二正向引物5’端连接不同颜色的荧光基团；

所述第一正向引物连接HEX荧光基团，所述第二正向引物连接FAM荧光基团；

在步骤(3)中，若荧光信号为HEX，则所述扩增产物的分子标记是TT类型，鉴定待测丝羽乌骨鸡的玫瑰冠基因型为玫瑰冠纯合子RR；若为FAM和HEX，则所述扩增产物的分子标记是TG类型，鉴定为鸡玫瑰冠杂合子Rr，若为FAM，则所述扩增产物的分子标记是GG类型，鉴定为单冠纯合子rr。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系包括：模板DNA2μL，引物混合液KASP Assay mix 0.14μL，2×KASP Master mix 5μL，ddH₂O 2.86μL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述引物混合液KASP Assay mix中第一正向引物、第二正向引物和反向引物的体积比为1：1：2。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：预变性94℃15min；变性94℃20s，Touch-down退火并延伸61℃～55℃60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；变性94℃20s，退火并延伸55℃60s，26个循环。

5.一种权利要求1中所述的KASP引物组在鉴定丝羽乌骨鸡玫瑰冠基因型中的应用，其特征在于，利用所述KASP引物组检测待测丝羽乌骨鸡基因组在权利要求1中所述分子标记类型，若是TT类型，鉴定待测丝羽乌骨鸡的玫瑰冠基因型为玫瑰冠纯合子RR；若是TG类型，鉴定待测丝羽乌骨鸡的玫瑰冠基因型为鸡玫瑰冠杂合子Rr，若是GG类型，鉴定待测丝羽乌骨鸡的玫瑰冠基因型为单冠纯合子rr。

Images