CN111893191A - 一种鸡绿壳蛋快速基因分型检测方法 - Google Patents

一种鸡绿壳蛋快速基因分型检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种鸡绿壳蛋快速基因分型检测方法，包括：根据绿壳蛋基因SLCO1B3及4.2kb EAV‑HP病毒序列插入位点设计引物，引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.1的第一引物、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的第二引物、核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的第三引物和核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的第四引物；建立PCR检测体系；将PCR检测体系中的DNA以等量的ddH2O代替，建立PCR检测体系的空白对照；进行PCR扩增反应；进行数据扫描以得到绿壳蛋控制基因的分型结果，解决了现有技术中难以准确鉴定杂合子与纯合子的技术问题，达到了准确鉴定杂合子与纯合子的技术效果。

Description

一种鸡绿壳蛋快速基因分型检测方法
技术领域
本申请涉及分子标记育种技术领域，尤其涉及一种鸡绿壳蛋快速基因分型检测方法。
背景技术
目前，鸡蛋壳颜色是重要的蛋用性状，一直备受关注。在自然条件下，对鸡蛋而言，绿色可以作为一种保护色，对蛋起保护作用。除此之外，蛋壳颜色性状是一种重要的包装性状。蛋鸡在繁殖过程中，无蛋壳附着的鸡蛋进入子宫壳腺部后，壳腺部的内皮细胞通过分泌，在蛋表面附着上碳酸钙蛋壳。碳酸钙蛋壳形成后，壳腺部内皮细胞在蛋壳表面添加角质并染色。蛋壳颜色的染色物质组成主要有3种：原卟啉、胆绿素和胆绿素的锌螯合物。其中，胆绿素及其锌螯合物沉积于蛋壳是形成绿色蛋壳颜色的主要原因，由于不同比例的原卟啉的加入，可以形成从天蓝色到茶绿色的不同颜色。
鸡绿壳性状的遗传规律阐明后，科研工作者对鸡的绿壳蛋基因开展了一系列相关研究。Punnett认为鸡的绿壳性状是1号染色体上显性绿壳基因(Oocyan，O)作用的结果。Bartlett等将鸡的绿壳基因(O)定位于1号染色体短臂上，它与内源病毒因子(ev1)及豆冠位点(P)连锁。它们在染色体上的排列顺序为P-evl-O，遗传距离分别为4.1cM(P与O之间)和1.8cM(evl与O之间)。Bitgood等进一步验证了Bartlett等的结论。Wang等发现鸡的绿壳性状是由有机阴离子转运多肽1B3基因(Solute carrier organic an-ion transporterfamily member 1B3，SLCO1B3，位于1号染色体65319441～65338450bp)5′侧翼区插入鸟类逆转录酶病毒(EAV-HP，长度为4.2kb)所造成。当EAV-HP插入到SLCO1B3的5′侧翼区后，导致SLCO1B3基因在子宫部特异表达，从而使蛋壳颜色表现为绿壳。
按照常规育种方法,对绿壳率的选育就是纯系留种时淘汰产生粉壳后代的种鸡以及杂交测定以选出杂合子,理论上一次测定就可以分出不同基因型。但是由于受到公鸡产蛋表型无法直接测定以及留种后代数有限等条件的约束,需要多代连续选育才能达到育种目标。利用分子标记辅助选择进行分子育种不但可以进行直接选择,还可以在早期选择,大大加快遗传进展。
目前通过分子生物学方法进行的检测主要是在基因插入片段两端设计特异性引物进行扩增，但由于该基因插入片段较长，使得模板DNA对引物形成竞争，导致杂合子中只能检测到未插入的片段而检测不到插入后的片段，从而难以准确鉴定杂合子与纯合子。
发明内容
为了解决上述背景技术中提出的技术问题或者至少部分地解决上述技术问题，本申请提供一种鸡绿壳蛋快速基因分型检测方法。
第一方面，本申请提供了一种鸡绿壳蛋快速基因分型检测方法，具体步骤包括：
S1：根据绿壳蛋基因SLCO1B3及4.2kb EAV-HP病毒序列插入位点设计引物，所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.1的第一引物、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的第二引物、核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的第三引物和核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的第四引物；
S2：建立PCR检测体系；
S3：将所述PCR检测体系中的DNA以等量的ddH2O代替，建立所述PCR检测体系的空白对照；
S4：进行PCR扩增反应；
S5：进行数据扫描以得到绿壳蛋控制基因的分型结果。
可选的，所述PCR体系包括2.5uL DNA、2.5uL KASP Master Mix(LGC Genomics，Hoddeston,UK)以及0.07uL所述第一引物、所述第二引物、所述第三引物和所述第四引物混合得到的第五引物。
可选的，步骤S2中，所述PCR检测体系中的DNA来自鸡的血液，其中，鸡血液中的DNA获取方法包括：
S21：依次向离心管中加入20μL Proteinase K、200μL的鸡的血液和200μL BufferML，充分混匀，将所述离心管放于56℃水浴锅中孵育15分钟，期间涡旋震荡混匀2次；
S22：将所述离心管从所述水浴锅中取出，离心后室温放置5分钟；加入彻底混匀的320μL异丙醇与Magbeads混合物，涡旋震荡混匀5秒钟后将所述离心管放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀5分钟或将所述离心管连续颠倒混匀10分钟；
S23：将所述离心管放于磁力架上静置1分钟，待所述Magbeads完全吸附于所述离心管的侧壁后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)；
S24：将所述离心管从所述磁力架上取下，加入750uL Buffer GW1(使用前请检查是否已加入无水乙醇)后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保所述Magbeads处于混匀状态)；之后将所述离心管放于所述磁力架上静置1分钟，待所述Magbeads完全吸附于所述离心管的侧壁后轻轻颠倒所述磁力架将所述离心管的盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持所述离心管固定于所述磁力架上)。
S25：重复步骤S24；
S26：将所述离心管从所述磁力架上取下，加入750uL Buffer GW2(使用前请检查是否已加入无水乙醇)后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保所述Magbeads处于混匀状态)，之后将所述离心管放于所述磁力架上静置1分钟，待所述Magbeads完全吸附于所述离心管的侧壁后轻轻颠倒所述磁力架，将所述离心管的盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持所述离心管固定于所述磁力架上)。
S27：重复步骤S26；
S28：保持所述离心管固定于所述磁力架上，用移液器进一步去除所述离心管的管底和盖上的溶液，之后室温放置5至10分钟，使乙醇完全挥发；
S29：将所述离心管从所述磁力架上取下，加入50-200μL Buffer EB，涡旋震荡使磁珠完全悬浮于洗脱液中后将其放于56℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡洗脱10分钟；或将所述离心管放于56℃水浴锅中孵育10分钟，期间每隔3分钟涡旋震荡10秒钟；
S210：将所述离心管放于所述磁力架上静置2分钟，待所述Magbeads完全吸附于所述离心管的侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。
可选的，所述PCR扩增反应的程序为：
94℃预变性15min，94℃变性20s，55-61℃退火和延伸60s，进行10个循环；
94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，进行26个循环；
94℃变性20s，57℃退火和延伸60s，进行3个循环。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：本发明提供了一种鸡绿壳蛋快速基因分型检测方法，可以基于KASP快速检测鸡绿壳蛋控制基因SLCO1B3多态性，根据绿壳蛋基因SLCO1B3及4.2kb EAV-HP病毒序列插入位点设计引物，引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.1的第一引物、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的第二引物、核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的第三引物和核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的第四引物；即通过对绿壳蛋基因和非绿壳蛋基因的核苷酸序列比对后设计引物，FAM标记的第一引物、第四引物与绿壳蛋基因特异匹配，VIC标记的第二引物、第三引物与非绿壳蛋基因特异匹配；且经过实验验证，FAM标记的第一引物与绿壳蛋基因特异匹配后扩增，仅检测到FAM荧光即为绿壳蛋基因纯合子；VIC标记的第二引物与非绿壳蛋基因特异匹配后扩增，仅检测到VIC荧光即为非绿壳蛋基因纯合子；如果同时检测到FAM和VIC信号，则为绿壳蛋基因杂合子，检测结果全部与表型相符，一致率达到100％，可以准确鉴定杂合子与纯合子。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的一种基因型检测得到的绿壳蛋基因SLCO1B3位点分型结构示意图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
为了便于理解，首先对KASP方法进行简单介绍，KASP是竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)的缩写，可在广泛的基因组DNA样品种(甚至一些复杂基因组的DNA样品)，对SNPs和特点位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。
KASP方法利用通用荧光探针，就可以通过PCR的方法实现变异位点分型。含有变异位点的第一等位基因和第二等位基因作为模板，针对等位基因变异位点设计的两个正向引物和一个通用反向引物，每条正向引物尾部有特异性序列，可与荧光标记结合。
第一轮PCR，能够和模板互补的正向引物得到延伸，无法和模板互补的正向引物无法延伸；第二轮PCR，反向引物结合，与等位基因特异结合的正向引物得以延伸。
随着PCR循环数增加，扩增子数量呈指数增长，此时FAM或VIC标记特异结合的正向引物不再被淬灭从而发出荧光可被检测。不同颜色荧光反映不同SNP类型，使用酶标仪对实验结果进行检测就能够达到最终实验目的，即实现精准的基因判断。
下面对本申请实施例提供的一种鸡绿壳蛋快速基因分型检测方法进行详细介绍，参见图1，鸡绿壳蛋快速基因分型检测方法，具体步骤包括：
步骤S1：根据绿壳蛋基因SLCO1B3及4.2kb EAV-HP病毒序列插入位点设计引物，所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的第一引物、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的第二引物、核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的第三引物和核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的第四引物；
这里，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的第一引物为：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT CCAACTGGCCACATTTAAAGC-3’(SEQ ID No.1，下划线部分为特异荧光序列FAM)；
核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的第二引物为：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT ACAGAGGGCAGAACTGGGAG-3’(SEQ ID No.2，下划线部分为特异荧光序列VIC)；
核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的第三引物为：
5’-AGTTAGGACCTTGCTTTAAATGTG-3’(SEQ ID No.3)；
核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的第四引物为：
5’-AGCAAGACTGTGTTGGTACTTGG-3’(SEQ ID No.4)。
步骤S2：建立PCR检测体系；
在本申请的一些具体实施例中，所述PCR体系包括2.5uL DNA、2.5uL KASP MasterMix(LGC Genomics，Hoddeston,UK)以及0.07uL所述第一引物、所述第二引物、所述第三引物和所述第四引物混合得到的第五引物。
步骤S3：将所述PCR检测体系中的DNA以等量的ddH2O代替，建立所述PCR检测体系的空白对照；
步骤S4：进行PCR扩增反应；
在本申请的一些具体实施例中，所述PCR扩增反应的程序为：
94℃预变性15min，94℃变性20s，55-61℃退火和延伸60s，进行10个循环；
94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，进行26个循环；
94℃变性20s，57℃退火和延伸60s，进行3个循环。
步骤S5：进行数据扫描以得到绿壳蛋控制基因的分型结果。
这里，作为一个示例，可以参照《ABI7900HT Fast Real Time PCR System实验室操作规程》进行数据扫描得到绿壳蛋控制基因的分型结果。
在本申请的一些具体实施例中，步骤S2中，所述PCR检测体系中的DNA来自鸡的血液，其中，鸡血液中的DNA获取方法包括：
步骤S21：依次向离心管中加入20μL Proteinase K、200μL的鸡的血液和200μLBuffer ML，充分混匀，将所述离心管放于56℃水浴锅中孵育15分钟，期间涡旋震荡混匀2次；
步骤S22：将所述离心管从所述水浴锅中取出，离心后室温放置5分钟；加入彻底混匀的320μL异丙醇与Magbeads混合物，涡旋震荡混匀5秒钟后将所述离心管放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀5分钟或将所述离心管连续颠倒混匀10分钟；
步骤S23：将所述离心管放于磁力架上静置1分钟，待所述Magbeads完全吸附于所述离心管的侧壁后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)；
步骤S24：将所述离心管从所述磁力架上取下，加入750uL Buffer GW1(使用前请检查是否已加入无水乙醇)后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保所述Magbeads处于混匀状态)；之后将所述离心管放于所述磁力架上静置1分钟，待所述Magbeads完全吸附于所述离心管的侧壁后轻轻颠倒所述磁力架将所述离心管的盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持所述离心管固定于所述磁力架上)。
步骤S25：重复步骤S24；
步骤S26：将所述离心管从所述磁力架上取下，加入750uL Buffer GW2(使用前请检查是否已加入无水乙醇)后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保所述Magbeads处于混匀状态)，之后将所述离心管放于所述磁力架上静置1分钟，待所述Magbeads完全吸附于所述离心管的侧壁后轻轻颠倒所述磁力架，将所述离心管的盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持所述离心管固定于所述磁力架上)。
步骤S27：重复步骤S26；
步骤S28：保持所述离心管固定于所述磁力架上，用移液器进一步去除所述离心管的管底和盖上的溶液，之后室温放置5至10分钟，使乙醇完全挥发；
步骤S29：将所述离心管从所述磁力架上取下，加入50-200μL Buffer EB，涡旋震荡使磁珠完全悬浮于洗脱液中后将其放于56℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡洗脱10分钟；或将所述离心管放于56℃水浴锅中孵育10分钟，期间每隔3分钟涡旋震荡10秒钟；
步骤S210：将所述离心管放于所述磁力架上静置2分钟，待所述Magbeads完全吸附于所述离心管的侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。
下面介绍实验验证情况：
对163只林甸鸡检测及结果判定，检测结果如下：
1、77只鸡仅检测到FAM荧光，为绿壳蛋基因纯合子。
2、21只鸡仅检测到VIC荧光，为非绿壳蛋基因纯合子。
3、65只鸡同时检测到FAM和VIC荧光，为绿壳蛋基因杂合子。
以上检测结果全部与表型相符，一致率达到100％。
本发明提供了一种鸡绿壳蛋快速基因分型检测方法，可以基于KASP快速检测鸡绿壳蛋控制基因SLCO1B3多态性，根据绿壳蛋基因SLCO1B3及4.2kb EAV-HP病毒序列插入位点设计引物，引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.1的第一引物、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的第二引物、核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的第三引物和核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的第四引物；即通过对绿壳蛋基因和非绿壳蛋基因的核苷酸序列比对后设计引物，FAM标记的第一引物、第四引物与绿壳蛋基因特异匹配，VIC标记的第二引物、第三引物与非绿壳蛋基因特异匹配；且经过实验验证，FAM标记的第一引物与绿壳蛋基因特异匹配后扩增，仅检测到FAM荧光即为绿壳蛋基因纯合子；VIC标记的第二引物与非绿壳蛋基因特异匹配后扩增，仅检测到VIC荧光即为非绿壳蛋基因纯合子；如果同时检测到FAM和VIC信号，则为绿壳蛋基因杂合子，检测结果全部与表型相符，一致率达到100％，可以准确鉴定杂合子与纯合子。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (4)

1.一种鸡绿壳蛋快速基因分型检测方法，其特征在于，具体步骤包括：
S1：根据绿壳蛋基因SLCO1B3及4.2kb EAV-HP病毒序列插入位点设计引物，所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.1的第一引物、核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的第二引物、核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的第三引物和核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的第四引物；
S2：建立PCR检测体系；
S3：将所述PCR检测体系中的DNA以等量的ddH2O代替，建立所述PCR检测体系的空白对照；
S4：进行PCR扩增反应；
S5：进行数据扫描以得到绿壳蛋控制基因的分型结果。
2.根据权利要求1所述的鸡绿壳蛋快速基因分型检测方法，其特征在于，所述PCR体系包括2.5uL DNA、2.5uL KASP Master Mix(LGC Genomics，Hoddeston,UK)以及0.07uL所述第一引物、所述第二引物、所述第三引物和所述第四引物混合得到的第五引物。
3.根据权利要求1所述的鸡绿壳蛋快速基因分型检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述PCR检测体系中的DNA来自鸡的血液，其中，鸡血液中的DNA获取方法包括：
S21：依次向离心管中加入20μL Proteinase K、200μL的鸡的血液和200μL Buffer ML，充分混匀，将所述离心管放于56℃水浴锅中孵育15分钟，期间涡旋震荡混匀2次；
S22：将所述离心管从所述水浴锅中取出，离心后室温放置5分钟；加入彻底混匀的320μL异丙醇与Magbeads混合物，涡旋震荡混匀5秒钟后将所述离心管放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀5分钟或将所述离心管连续颠倒混匀10分钟；
S23：将所述离心管放于磁力架上静置1分钟，待所述Magbeads完全吸附于所述离心管的侧壁后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)；
S24：将所述离心管从所述磁力架上取下，加入750uL Buffer GW1(使用前请检查是否已加入无水乙醇)后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保所述Magbeads处于混匀状态)；之后将所述离心管放于所述磁力架上静置1分钟，待所述Magbeads完全吸附于所述离心管的侧壁后轻轻颠倒所述磁力架将所述离心管的盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持所述离心管固定于所述磁力架上)。
S25：重复步骤S24；
S26：将所述离心管从所述磁力架上取下，加入750uL Buffer GW2(使用前请检查是否已加入无水乙醇)后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保所述Magbeads处于混匀状态)，之后将所述离心管放于所述磁力架上静置1分钟，待所述Magbeads完全吸附于所述离心管的侧壁后轻轻颠倒所述磁力架，将所述离心管的盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持所述离心管固定于所述磁力架上)。
S27：重复步骤S26；
S28：保持所述离心管固定于所述磁力架上，用移液器进一步去除所述离心管的管底和盖上的溶液，之后室温放置5至10分钟，使乙醇完全挥发；
S29：将所述离心管从所述磁力架上取下，加入50-200μL Buffer EB，涡旋震荡使磁珠完全悬浮于洗脱液中后将其放于56℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡洗脱10分钟；或将所述离心管放于56℃水浴锅中孵育10分钟，期间每隔3分钟涡旋震荡10秒钟；
S210：将所述离心管放于所述磁力架上静置2分钟，待所述Magbeads完全吸附于所述离心管的侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。
4.根据权利要求1至3任一所述的鸡绿壳蛋快速基因分型检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的程序为：
94℃预变性15min，94℃变性20s，55-61℃退火和延伸60s，进行10个循环；
94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，进行26个循环；
94℃变性20s，57℃退火和延伸60s，进行3个循环。
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