CN111909989A - 一种鸡隐性白快速基因分型检测方法 - Google Patents
一种鸡隐性白快速基因分型检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111909989A CN111909989A CN202010809546.7A CN202010809546A CN111909989A CN 111909989 A CN111909989 A CN 111909989A CN 202010809546 A CN202010809546 A CN 202010809546A CN 111909989 A CN111909989 A CN 111909989A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tube
- centrifugal tube
- minutes
- magnetic frame
- placing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 title claims abstract description 46
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 42
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 25
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 7
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 2
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 43
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 34
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 8
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 6
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 5
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 5
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 3
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 2
- 101000620359 Homo sapiens Melanocyte protein PMEL Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102100022430 Melanocyte protein PMEL Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000003805 vibration mixing Methods 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/124—Animal traits, i.e. production traits, including athletic performance or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种鸡隐性白快速基因分型检测方法，涉及鸡隐性白快速基因分型检测方法技术领域，以解决现有技术中存在的难以准确鉴定杂合子与纯合子的技术问题，该方法根据隐性白控制基因位点设计引物；建立PCR体系；进行PCR扩增，94℃预变性15min，94℃变性20s,55‑61℃退火和延伸60s,进行10个循环；94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，进行26个循环；94℃变性20s，57℃退火和延伸60s，进行3个循环；进行数据扫描得到隐性白控制基因的分型结果，本发明用于准确鉴定杂合子与纯合子。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记育种领域，尤其是涉及一种基于KASP检测鸡隐性白基因多态性位点分型的方法。
背景技术
随着生活水平的提高，人们消费观念从过去的数量型转变为质量型。白羽鸡是国外引进的肉鸡和部分蛋鸡的重要象征之一，国外引进的肉鸡生长快、饲料效率高，但肉质较中国本地鸡品种差，近年来通过利用引进国外的鸡种改良中国本地鸡产生的油脂及越来越受到消费者的青睐。市场需求推动了优质鸡育种的发展，一个好的育种素材对育种来说至关重要，隐性白羽对于中国地方鸡种的有色羽为隐性，同中国地方鸡杂交后代羽色与中国地方鸡羽色一致，因此，隐性白羽鸡种质资源是利用地方鸡进行优质鸡育种的稀缺育种素材资源。传统的方法是根据杂交后代鸡的表型性状留种，进行测交检测，繁殖扩群等步骤，需要一个漫长的过程，耗时耗力，且不利于快速适应现在的市场变化，因此采用分子方法检测隐性鸡十分必要。
鸡的羽毛颜色受多个等位基因控制，目前已经发现存在5对等位基因，分别为抑制色素形成基因I、色素原基因C、氧化酶基因O、抑制色素表现基因P以及非白化基因A，其中只有I基因和C基因已分别被定位于PMEL17与TYR基因上，其他基因未见报道。I基因存在时，无论其他基因是否显隐性都表现为白羽型，因此通常被称为显性白羽；隐性白羽情况比较复杂，但目前为止对于C基因控制的白羽研究比较多，因此由C基因控制的白羽通常称为隐性白羽。Kerje等研究发现，PMEL17基因第十外显子区域插入了一段9bp的核苷酸序列导致黑色素基因非正常转录翻译，引起显性白羽产生。Chang等研究得出TYR(络氨酸酶基因)第四内含子区域插入了一段长7.7kp的内源性白血病病毒ALV序列，插入的片段造成酪氨酸酶RNA异常加工，内含子部分片段滞留，部分外显子不能转录。隐性白羽鸡以较短的转录酪氨酸酶转录本为主，含有少量正常长度的转录本，因而细胞内的酪氨酸酶活性降低。酪氨酸酶外显子编码跨膜区中由于内源性病毒的插入，不仅影响了转录本长度，也导致基因表达量改变从而使酪氨酸酶失去正常功能活性，致使黑色素无法合成，导致隐性白羽形成。中国消费者对鸡羽毛颜色具有一定偏好，认为白色是一种不吉利的颜色，因此本研究对鸡群白羽与有色羽鉴定具有一定的研究价值。
目前通过分子生物学方法进行的检测主要是在隐性白羽基因插入片段两端设计特异性引物进行扩增，但由于该基因插入片段较长，使得模板DNA对引物形成竞争，导致杂合子中只能检测到缺失后的片段而检测不到完整的片段，从而难以准确鉴定杂合子与纯合子。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡隐性白快速基因分型检测方法，以解决上述背景技术中提出的技术问题。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供的一种鸡隐性白快速基因分型检测方法，具体步骤如下：
S1：根据隐性白控制基因位点设计引物；
S2：建立PCR体系；
S3：进行PCR扩增，94℃预变性15min，94℃变性20s,55-61℃退火和延伸60s,进行10个循环；94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，进行26个循环；94℃变性20s，57℃退火和延伸60s，进行3个循环；
S4：进行数据扫描得到隐性白控制基因的分型结果。
优选地，步骤S2中，建立的PCR体系中的DNA来自鸡的血液，其中，鸡血液中的DNA获取方法如下：
S21：先向离心管中加入Proteinase K，之后再加入血液；
S22：向离心管中加入Buffer ML，涡旋振荡5秒钟使其充分混匀后，将离心管放于56℃水浴锅中孵育15分钟，期间涡旋震荡混匀2次；
S23：将离心管从水浴锅中取出，短暂离心后室温放置5分钟，加入彻底混匀的异丙醇与Magbeads混合物，涡旋震荡混匀5秒钟后将离心管放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀5分钟或将离心管连续颠倒混匀10分钟；
S24：将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去溶液，过程中需保持离心管固定于磁力架上；
S25：将离心管从磁力架上取下，加入无水乙醇，加入Buffer GW1后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟，之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液，整个过程保持离心管固定于磁力架上；
S26：重复步骤S25；
S27：将离心管从磁力架上取下，加入无水乙醇，加入Buffer GW2后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟，之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架，将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液，整个过程需保持离心管固定于磁力架上；
S28：重复步骤S27；
S29：保持离心管固定于磁力架上，用移液器进一步去除离心管管底和管盖上的溶液，之后室温放置5—10分钟，使乙醇完全挥发；
S210：将离心管从磁力架上取下，加入Buffer EB，涡旋震荡使磁珠完全悬浮于洗脱液中后将其放于56℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡洗脱10分钟，或将离心管放于56℃水浴锅中孵育10分钟，期间每隔3分钟涡旋震荡10秒钟；
S211：将离心管放于磁力架上静置2分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。
优选地，步骤S29中，如果离心管侧壁上有液珠，可向离心管中加入无水乙醇，盖盖后颠倒离心管，同时保持离心管固定于磁力架上，之后彻底弃去无水乙醇。
优选地，所述引物包括以下3种引物：
核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2及SEQ ID No.3所示的引物。
优选地，所述PCR体系包括DNA、KASP Master Mix以及3种引物的混合物。
本发明提供的一种鸡隐性白快速基因分型检测方法，通过隐性白羽基因和非隐性白羽基因的核苷酸序列比对后设计引物，FAM标记的引物1与隐性白羽基因特异匹配，HEX标记的引物2与非隐性白羽基因特异匹配，通用引物为反向引物，反向引物结合后，与等位基因特异结合的正向引物得以延伸，FAM标记的引物1与隐性白羽基因特异匹配后扩增，仅检测到FAM荧光即为隐性白羽基因纯合子，记为oo；HEX标记的引物2与非隐性白羽基因特异匹配后扩增，仅检测到HEX荧光即为非隐性白羽基因纯合子，记为OO；如果同时检测到FAM和HEX信号，则为非隐性白羽基因杂合子，记为Oo。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明根据本发明的基因型检测得到的隐性白基因位点分型结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
下面参照附图详细地说明本发明的具体实施方式。在各附图中，相同的附图标记表示相同或相应的技术特征。各附图仅作为示意图，并非一定按实际比例绘制的。
KASP方法利用通用荧光探针，就可以通过PCR的方法实现SNP分型。含有SNP的等位基因1和等位基因2作为模板，针对等位基因SNP位点设计的两个正向引物和一个通用反向引物，每条正向引物尾部有特异性序列，可与荧光标记结合。
第一轮PCR，能够和模板互补的正向引物得到延伸，无法和模板互补的正向引物无法延伸；第二轮PCR，反向引物结合，与等位基因特异结合的正向引物得以延伸。
随着PCR循环数增加，扩增子数量呈指数增长，此时FAM或HEX标记特异结合的正向引物不再被淬灭从而发出荧光可被检测。不同颜色荧光反映不同SNP类型，使用酶标仪对实验结果进行检测就能够达到我们的最终实验目的。本发明的技术是一种对鸡隐性白羽基因的分子鉴定方法，通过隐性白羽基因和非隐性白羽基因的核苷酸序列比对后设计引物，FAM标记的引物1与隐性白羽基因特异匹配，HEX标记的引物2与非隐性白羽基因特异匹配，通用引物为反向引物，反向引物结合后，与等位基因特异结合的正向引物得以延伸。FAM标记的引物1与隐性白羽基因特异匹配后扩增，仅检测到FAM荧光即为隐性白羽基因纯合子，记为oo；HEX标记的引物2与非隐性白羽基因特异匹配后扩增，仅检测到HEX荧光即为非隐性白羽基因纯合子，记为OO；如果同时检测到FAM和HEX信号，则为非隐性白羽基因杂合子，记为Oo。
引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT TGGCTCTATTTGACTACACAGTGTT-3’(SEQ IDNo.1，下划线部分为特异荧光序列FAM)；
引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT CTCTGAGCCTTCCAGTGTTATCT-3’(SEQ IDNo.2，下划线部分为特异荧光序列HEX)；
引物3：5’-ATGATGCAATGCAGTACCAGTG-3’(SEQ ID No.3)。
实施例：
S1:通过隐性白羽基因和非隐性白羽基因的核苷酸序列比对后，根据隐性白控制基因位点设计引物：
引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT TGGCTCTATTTGACTACACAGTGTT-3’(SEQ IDNo.1)，下划线部分为特异荧光序列FAM；
引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT CTCTGAGCCTTCCAGTGTTATCT-3’(SEQ IDNo.2)，下划线部分为特异荧光序列HEX；
引物3：5’-ATGATGCAATGCAGTACCAGTG-3’(SEQ ID No.3)。
S2:建立PCR体系，该体系包括2.5uL DNA、2.5uL KASP Master Mix(LGCGenomics，Hoddeston,UK)以及0.07uL以上3种混合引物。
S3：设置空白对照，将PCR体系中的DNA以等量的ddH2O代替，以作为空白对照。
S4：进行PCR扩增
94℃预变性15min，94℃变性20s,55-61℃退火和延伸60s,进行10个循环
94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，进行26个循环
94℃变性20s，57℃退火和延伸60s，进行3个循环。
S5：参照《ABI7900HT Fast Real Time PCR System实验室操作规程》进行数据扫描得到隐性白控制基因的分型结果。
其中步骤S2中，PCR体系中的DNA来自鸡的血液，本实施例中利用康为世纪的血液基因组DNA提取试剂盒CW2361从鸡血液中提取基因组DNA。
所述鸡血液中的DNA获取方法如下：
S21：向1.5mL的离心管中加入20μL Proteinase K，之后加入200μL的血液。
S22：向离心管中加入200μL Buffer ML，涡旋振荡5秒钟使其充分混匀后，将离心管放于56℃水浴锅中孵育15分钟，期间涡旋震荡混匀2次。
S23：将离心管从水浴锅中取出，短暂离心后室温放置5分钟。加入彻底混匀的320μL异丙醇与Magbeads混合物，涡旋震荡混匀5秒钟后将离心管放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀5分钟或将离心管连续颠倒混匀10分钟。
S24：将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)。
S25：将离心管从磁力架上取下，加入750uL Buffer GW1(使用前请检查是否已加入无水乙醇)后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保Magbeads处于混匀状态)。之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)。
S26：重复步骤S25。
S27：将离心管从磁力架上取下，加入750uL Buffer GW2(使用前请检查是否已加入无水乙醇)后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟(震荡过程中确保Magbeads处于混匀状态)。之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架，将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液(保持离心管固定于磁力架上)。
S28：重复步骤S27。
S29：保持离心管固定于磁力架上，用移液器进一步去除离心管管底和管盖上的溶液，之后室温放置5-10分钟，使乙醇挥发干净。
注意：如果离心管侧壁上有液珠，可向离心管中加入750μL无水乙醇。盖盖后颠倒离心管(保持离心管固定于磁力架上)，之后彻底弃去无水乙醇。
S210：将离心管从磁力架上取下，加入50-200μL Buffer EB。涡旋震荡使磁珠完全悬浮于洗脱液中后将其放于56℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡洗脱10分钟，或将离心管放于56℃水浴锅中孵育10分钟，期间每隔3分钟涡旋震荡10秒钟。
S211：将离心管放于磁力架上静置2分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。
图1为根据本发明的基因型检测得到的鸡隐性白基因分型图，由图1可知，本发明利用KASP进行鸡隐性白基因型检测，对DNA样本的需求低，适于大批量样本检测，检测准确性可达100％，且支持低、中或高通量研究及单个重复实验。
三、实验验证情况
对163只香炉山鸡检测及结果判定，结果统计如下：
1、经检测34只鸡为仅检测到FAM荧光，为隐性白羽基因纯合子；
2、经检测45只鸡为仅检测到HEX荧光，为非隐性白羽基因纯合子；
3、经检测81只鸡同时检测到FAM和HEX荧光，为非隐性白羽基因杂合子；
4、3只鸡未检测到FAM或HEX荧光，判定检测失败。
以上检测成功的个体分型结果全部与表型相符，一致率达到100％。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (4)
1.一种鸡隐性白快速基因分型检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
S1:根据隐性白控制基因位点设计引物，所述引物包括以下3种引物：
核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2及SEQ ID No.3所示的引物；
S2:建立PCR体系；
S3：进行PCR扩增，94℃预变性15min，94℃变性20s,55-61℃退火和延伸60s,进行10个循环；94℃变性20s，55℃退火和延伸60s，进行26个循环；94℃变性20s，57℃退火和延伸60s，进行3个循环；
S4：进行数据扫描得到隐性白控制基因的分型结果。
2.根据权利要求1所述的鸡隐性白快速基因分型检测方法，其特征在于，步骤S2中，建立的PCR体系中的DNA来自鸡的血液，其中，鸡血液中的DNA获取方法如下：
S21：先向离心管中加入Proteinase K，之后再加入血液；
S22：向离心管中加入Buffer ML，涡旋振荡5秒钟使其充分混匀后，将离心管放于56℃水浴锅中孵育15分钟，期间涡旋震荡混匀2次；
S23：将离心管从水浴锅中取出，短暂离心后室温放置5分钟，加入彻底混匀的异丙醇与Magbeads混合物，涡旋震荡混匀5秒钟后将离心管放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀5分钟或将离心管连续颠倒混匀10分钟；
S24：将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去溶液，过程中需保持离心管固定于磁力架上；
S25：将离心管从磁力架上取下，加入无水乙醇，加入Buffer GW1后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟，之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液；
S26：重复步骤S25；
S27：将离心管从磁力架上取下，加入无水乙醇，加入Buffer GW2后涡旋点震1分钟或涡旋振荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡混匀2分钟，之后将离心管放于磁力架上静置1分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后轻轻颠倒磁力架，将离心管盖上的杂质洗落后彻底弃去溶液；
S28：重复步骤S27；
S29：保持离心管固定于磁力架上，用移液器进一步去除离心管管底和管盖上的溶液，之后室温放置5—10分钟，使乙醇完全挥发；
S210：将离心管从磁力架上取下，加入Buffer EB，涡旋震荡使磁珠完全悬浮于洗脱液中后将其放于56℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡洗脱10分钟，或将离心管放于56℃水浴锅中孵育10分钟，期间每隔3分钟涡旋震荡10秒钟；
S211：将离心管放于磁力架上静置2分钟，待Magbeads完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。
3.根据权利要求2所述的鸡隐性白快速基因分型检测方法，其特征在于：步骤S29中，如果离心管侧壁上有液珠，则向离心管中加入无水乙醇，盖盖后颠倒离心管，同时保持离心管固定于磁力架上，之后彻底弃去无水乙醇。
4.根据权利要求1所述的鸡隐性白快速基因分型检测方法，其特征在于：所述PCR体系包括所述3种引物、DNA以及KASP Master Mix的混合物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010809546.7A CN111909989A (zh) | 2020-08-12 | 2020-08-12 | 一种鸡隐性白快速基因分型检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010809546.7A CN111909989A (zh) | 2020-08-12 | 2020-08-12 | 一种鸡隐性白快速基因分型检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111909989A true CN111909989A (zh) | 2020-11-10 |
Family
ID=73283957
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010809546.7A Pending CN111909989A (zh) | 2020-08-12 | 2020-08-12 | 一种鸡隐性白快速基因分型检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111909989A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116926207A (zh) * | 2023-08-07 | 2023-10-24 | 华南农业大学 | 一种基于lamp检测鸡隐性白羽基因携带者的引物、试剂盒以及应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101696452A (zh) * | 2009-10-19 | 2010-04-21 | 华中农业大学 | 一种鸡隐性白羽基因的分子鉴定方法 |
| CN103571963A (zh) * | 2013-11-20 | 2014-02-12 | 河南农业大学 | 一种用于检测鸡隐性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法 |
| CN103667486A (zh) * | 2013-12-09 | 2014-03-26 | 上海市农业科学院 | 鸡隐性白基因的快速鉴定方法 |
| CN107217106A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-09-29 | 长江师范学院 | 一种水稻稻米香味基因的snp功能分子标记及应用 |
| CN107475412A (zh) * | 2017-09-20 | 2017-12-15 | 山东农业大学 | 一种与鸡产蛋性状相关的分子标记及其在鸡育种中的应用 |
-
2020
- 2020-08-12 CN CN202010809546.7A patent/CN111909989A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101696452A (zh) * | 2009-10-19 | 2010-04-21 | 华中农业大学 | 一种鸡隐性白羽基因的分子鉴定方法 |
| CN103571963A (zh) * | 2013-11-20 | 2014-02-12 | 河南农业大学 | 一种用于检测鸡隐性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法 |
| CN103667486A (zh) * | 2013-12-09 | 2014-03-26 | 上海市农业科学院 | 鸡隐性白基因的快速鉴定方法 |
| CN107217106A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-09-29 | 长江师范学院 | 一种水稻稻米香味基因的snp功能分子标记及应用 |
| CN107475412A (zh) * | 2017-09-20 | 2017-12-15 | 山东农业大学 | 一种与鸡产蛋性状相关的分子标记及其在鸡育种中的应用 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116926207A (zh) * | 2023-08-07 | 2023-10-24 | 华南农业大学 | 一种基于lamp检测鸡隐性白羽基因携带者的引物、试剂盒以及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110273010B (zh) | 一种mc1r基因单倍型的鉴定与应用方法 | |
| CN107022604B (zh) | 猪ntf3启动子区snp作为公猪繁殖性状分子标记与应用 | |
| CN104962634B (zh) | 用于检测鸡体尺性状的试剂盒及鸡的分子育种方法 | |
| CN106399574A (zh) | 鉴定西瓜种皮颜色的InDel分子标记及其引物和应用 | |
| CN109593876A (zh) | 高通量检测AhFAD2B基因突变位点的KASP标记分型引物组及其应用 | |
| CN107828897B (zh) | 与猪达100kg体重日龄性状相关的SNP分子标记及其应用 | |
| CN107746896B (zh) | 与桃果皮绒毛性状相关的snp标记及其应用 | |
| CN109825565B (zh) | 一种基于荧光分子标记体系的半滑舌鳎真伪雄鱼甄别方法 | |
| CN114854880A (zh) | 一种基于kasp技术的丝羽乌骨鸡玫瑰冠分子标记及其应用 | |
| CN111909989A (zh) | 一种鸡隐性白快速基因分型检测方法 | |
| CN107586857B (zh) | 用于快速鉴定猪的红黑毛色基因的核酸、试剂盒及方法 | |
| CN101818195A (zh) | 猪miR-27a前体侧翼序列SNP作为猪产仔数性状的遗传标记及应用 | |
| CN113355453A (zh) | 一种甘蓝型油菜萝卜细胞质不育恢复基因Rfo的SNP分子标记及其应用 | |
| CN110241227B (zh) | 一种检测绵羊spata6基因单核苷酸多态性的方法及应用 | |
| CN111909988B (zh) | 一种基于KASP检测鸡青胫Id基因多态性位点分型的方法 | |
| CN111334588A (zh) | 一种与鸭黑色和褐色羽性状相关的分子标记及其应用 | |
| CN111893193A (zh) | 一种鸡显性白快速基因分型检测方法 | |
| CN107858441B (zh) | 与猪达100kg体重日龄性状相关的SNP分子标记及其应用 | |
| CN109536624A (zh) | 用于甄别半滑舌鳎真伪雄鱼性的荧光分子标记和检测方法 | |
| KR101823372B1 (ko) | 우리흑돈 품종 식별용 snp 마커 및 이를 이용한 우리흑돈 품종 식별 방법 | |
| CN113322332B (zh) | 一种与鸡冠长度相关的分子标记及其应用 | |
| CN113755628A (zh) | 一种基于mSNP技术检测白萝卜种子纯度的混样检测方法 | |
| CN111705146A (zh) | 一种用于鉴定鸭黄麻羽性状的分子标记及其应用 | |
| CN110592237A (zh) | 一种用于检测浙东白鹅体重性状的引物、探针、试剂盒及其检测方法 | |
| CN114250314B (zh) | 与花生种皮颜色相关的kasp分子标记及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201110 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |