CN116926207A - 一种基于lamp检测鸡隐性白羽基因携带者的引物、试剂盒以及应用 - Google Patents

一种基于lamp检测鸡隐性白羽基因携带者的引物、试剂盒以及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于LAMP检测鸡隐性白羽基因携带者的引物、试剂盒以及应用,属于分子生物技术领域,所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑8所示。本发明以家鸡基因组DNA为扩增模板,利用本发明公开的引物组、通过本发明公开的扩增体系与扩增条件后,仅通过扩增反应体系的颜色变化就能判定样品中是否携带隐性白羽基因;该方法基于8条引物进行扩增,检测的特异性和准确率高;此外,该方法仅需恒温水浴锅或恒温金属板,无需进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳,无需专业设备,对检测人员的专业技术要求较低,极大地降低了隐性白羽基因检测的技术门槛,对于家鸡群体的隐性白羽基因筛查和淘汰隐性白羽基因携带者个体具有重要意义。

Description

一种基于LAMP检测鸡隐性白羽基因携带者的引物、试剂盒以 及应用
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域,特别是涉及一种基于LAMP检测鸡隐性白羽基因携带者的引物、试剂盒以及应用。
背景技术
羽色是家鸡新品种(配套系)培育工作中最重要的表型之一。家鸡的羽色通常可以分为黄羽、白羽、芦花羽、横斑羽、麻羽及其各种组合羽色等等。家鸡羽毛的色素沉着主要依赖于真黑色素(黑褐色色素)和黄色素(黄红色色素)的沉积。这两种色素的生物发生都依赖于酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)。
家鸡隐性白羽基因aa在家鸡群体中最为常见,其定位在家鸡第一号常染色体的TYR基因上,其致因突变是在TYR基因的第4内含子中插入了一段长度约为7.7kb的禽白血病内源性逆转录病毒所导致。该大片段插入导致TYR缺少第五外显子编码的跨膜结构域从而使TYR失去正常功能活性,致使黑色素无法合成,导致隐性白羽表型的形成。
由于家鸡早期育种工作的不规范,导致目前非白羽鸡群体中包含隐性白羽基因携带者,这导致后代中时常出现白羽表型,影响了家鸡外貌表型的育种工作进展。目前非白羽鸡育种行业内对于育种群和生产群中的隐性白羽基因检测的需求十分迫切。但有碍于传统分子检测方法的引物特异性差、检测步骤多、所需仪器昂贵等原因很难进行推广应用。因此,目前行业内需要一种简单易操作且准确率搞的检测方法应用于隐性白羽基因的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于LAMP检测鸡隐性白羽基因携带者的引物、试剂盒以及应用,以解决上述现有技术存在的问题,本发明操作简单,检测准确率高,易于推广,有利于在家鸡分子育种过程中准确筛查隐性白羽基因携带者,有利于提高家鸡的品种选育工作效率。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种基于LAMP检测鸡隐性白羽基因携带者的引物,所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-8所示。
本发明还提供一种基于LAMP检测鸡隐性白羽基因携带者的试剂盒,所述试剂盒包括所述的引物。
本发明还提供一种所述的引物或所述的试剂盒在检测鸡隐性白羽基因携带者中的应用。
本发明还提供一种所述的引物或所述的试剂盒在隐性白羽鸡种质资源培育中的应用。
本发明还提供一种检测鸡隐性白羽基因携带者的方法,包括以下步骤:
以待测鸡的基因组DNA为模板,利用所述的引物或所述的试剂盒进行LAMP恒温扩增反应,LAMP恒温扩增反应结束后,根据扩增反应体系颜色变化判断待测鸡是否为隐性白羽基因携带者。
进一步地,若扩增反应体系颜色为天蓝色,判断待测鸡是隐性白羽基因携带者,若扩增反应体系颜色为淡紫色,判断待测鸡是非隐性白羽基因纯合子。
进一步地,所述LAMP恒温扩增反应的反应体系包括:热反应缓冲液2.5μL、硫酸镁1.5μL、脱氧核糖核苷三磷酸混合液3.5μL、所述引物各1μL、Bst DNA聚合酶1μL、模板DNA2μL、羟基萘酚蓝1μL和去离子水5.5μL。
进一步地,所述LAMP恒温扩增反应的反应条件为:65℃,60min。
本发明公开了以下技术效果:
本发明是以家鸡基因组DNA为扩增模板,利用本发明公开的引物组、通过本发明公开的扩增体系与扩增条件后,仅通过扩增反应体系的颜色变化就能判定样品中是否携带隐性白羽基因。该方法基于8条引物进行扩增,检测的特异性和准确率高。此外,该方法仅需恒温水浴锅或恒温金属板,无需进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳,无需专业设备,对检测人员的专业技术要求较低,极大地降低了隐性白羽基因检测的技术门槛,对于家鸡群体的隐性白羽基因筛查和淘汰隐性白羽基因携带者个体具有重要意义。本发明操作简单,检测准确率高,易于推广,有利于在家鸡分子育种过程中准确筛查隐性白羽基因携带者,有利于提高家鸡的品种选育工作效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2基于LAMP扩增检测家鸡群体中隐性白羽基因携带者的检测结果图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值,以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
实施例1一种基于LAMP检测家鸡群体中隐性白羽基因携带者方法
本实施例在于提供一种分子检测方法,利用家鸡基因组DNA为模板,通过LAMP恒温扩增来鉴定家鸡TYR基因中的内源性逆转录病毒大片段插入序列,进而鉴定隐性白羽基因携带者。具体包括以下方法步骤:
步骤1:模板准备
(1)血样采集:随机选取16例广州市江丰实业股份有限公司的130日龄麻黄鸡,上述鸡的羽色均为非白羽。使用含EDTA抗凝剂的抗凝采血管采集上述16例鸡的翅下静脉的血液2mL。
(2)血样处理:抽取20μL(1)中采集的抗凝血样,使用血液DNA提取纯化试剂盒提取血样的基因组DNA。
步骤2:LAMP扩增
以经过步骤1提取的基因组DNA为模板,利用如表1所示的引物,按照如表2所示的扩增反应体系以及如表3所示的参数进行LAMP恒温扩增。
步骤3:结果判定
LAMP扩增完成后观察扩增反应体系颜色变化,若体系为天蓝色,则是隐性白羽基因携带者;若体系为淡紫色,则为非隐性白羽基因纯合子。
表1LAMP扩增引物
表2LAMP扩增反应体系
表3所用热循环参数及程序
实施例2验证引物的扩增效率及其特异性
本实例对已知基因型样本进行分型。试验材料选取已知为隐性白羽基因携带者的麻黄鸡8只和已知是不携带隐性白羽基因的纯合子麻黄鸡8只,用于验证引物的扩增效率及其特异性
1.实验材料
选取已知为隐性白羽基因型携带者的隐性白洛克鸡8只和已知是不携带隐性白羽基因的纯合子麻黄鸡8只。上述16例血样均采集自广州市江丰实业股份有限公司。
2.实验方法
步骤1:模板准备
(1)血样采集:使用含EDTA抗凝剂的抗凝采血管采集上述16例鸡的翅下静脉的血液2mL。
(2)血样处理:抽取20μL(1)中采集的抗凝血样,使用血液DNA提取纯化试剂盒提取血样的基因组DNA。
步骤2:LAMP扩增
经过步骤1处理的基因组DNA为模板,利用实施例1中表1所示的引物,以及表2所示的扩增反应体系,和表3所示的热循环参数及程序进行PCR扩增。
步骤3:结果判定
LAMP扩增完成后观察扩增反应体系颜色变化,结果显示,8只已知为隐性白羽基因型携带者的隐性白洛克鸡的体系均为天蓝色;8只已知是不携带隐性白羽基因的纯合子麻黄鸡的体系均为淡紫色(图1)。
上述结果表明,通过该方法可以准确地将隐性白羽基因携带者和非隐性白羽基因的纯合子个体区分开。
实施例3单盲检测判定方法的可靠性。
本实例采用单盲的方式,对已知基因型样本进行分型。试验材料选取通过测交确定的12只隐性白羽基因杂合子麻黄鸡F1代(Aa)和12只无隐性白羽基因纯合子麻黄鸡(AA)。
1.实验材料
选取已知为纯系无隐性白羽基因的麻黄鸡12只以及麻黄鸡与纯系隐性白羽白洛克杂交F1代血样12只。上述24例血样均采集自广州市江丰实业股份有限公司。
2.实验方法
步骤1:模板准备
(1)血样采集:使用含EDTA抗凝剂的抗凝采血管采集上述16例鸡的翅下静脉的血液2mL。
(2)血样处理:抽取20μL(1)中采集的抗凝血样,使用血液DNA提取纯化试剂盒提取血样的基因组DNA。
步骤2:LAMP扩增
经过步骤1处理的基因组DNA为模板,利用实施例1中表1所示的引物,以及表2所示的扩增反应体系,和表3所示的热循环参数及程序进行PCR扩增。
步骤3:结果判定
LAMP扩增完成后观察扩增反应体系颜色变化,若体系为天蓝色,则是隐性白羽基因携带者;若体系为淡紫色,则为非隐性白羽基因纯合子。结果汇总如表4所示。
表4单盲检测判定结果
注:纯系无隐性白羽基因的麻黄鸡血样编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12,麻黄鸡与纯系隐性白羽白洛克杂交F1代血样编号为F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5、F1-6、F1-7、F1-8、F1-9、F1-10、F1-11、F1-12。
上述结果表明,通过该方法可准确地检测有色羽鸡群中的是否存在隐性白羽基因携带者。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种基于LAMP检测鸡隐性白羽基因携带者的引物,其特征在于,所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-8所示。
2.一种基于LAMP检测鸡隐性白羽基因携带者的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。
3.一种如权利要求1所述的引物或权利要求2所述的试剂盒在检测鸡隐性白羽基因携带者中的应用。
4.一种如权利要求1所述的引物或权利要求2所述的试剂盒在隐性白羽鸡种质资源培育中的应用。
5.一种检测鸡隐性白羽基因携带者的方法,其特征在于,包括以下步骤:
以待测鸡的基因组DNA为模板,利用权利要求1所述的引物或权利要求2所述的试剂盒进行LAMP恒温扩增反应,LAMP恒温扩增反应结束后,根据扩增反应体系颜色变化判断待测鸡是否为隐性白羽基因携带者。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,若扩增反应体系颜色为天蓝色,判断待测鸡是隐性白羽基因携带者,若扩增反应体系颜色为淡紫色,判断待测鸡是非隐性白羽基因纯合子。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述LAMP恒温扩增反应的反应体系包括:热反应缓冲液2.5μL、硫酸镁1.5μL、脱氧核糖核苷三磷酸混合液3.5μL、所述引物各1μL、BstDNA聚合酶1μL、模板DNA 2μL、羟基萘酚蓝1μL和去离子水5.5μL。
8.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述LAMP恒温扩增反应的反应条件为:65℃,60min。
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