CN109777878B - 一种利用核苷酸多态性分子遗传标记对鹅羽色进行选择的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用核苷酸多态性分子遗传标记对鹅羽色进行选择的方法，属于家禽育种技术领域，利用提供的试剂盒进行聚合酶链式反应(PCR)并检测产物，将PCR产物测序并判定基因型，利用对育种鹅群体每个个体在标记基因多态性位点的测定，依据多态性位点的基因型，挑选出合格的个体用于组建育种群，从而使育种鹅群在羽色上几乎一致，根据该位点基因型判别羽色的准确率达到100%，在该位点完全纯合而不含有另一等位基因，排除了在繁育后代中再出现该位点等位基因杂合的现象，相对于传统的表型选择方法，本发明在鹅羽色选择时准确率显著提高，明显加快了育种进程，显著减少育种成本，极大提高育种公司在鹅育种方面的竞争力和经济效益。
Description
技术领域
本发明属于家禽育种技术领域，涉及一种鹅羽色选择的方法，具体的说是涉及一种利用羽色形成关键基因核苷酸多态性作为分子遗传标记对鹅羽色进行选择的方法。
背景技术
羽色是家禽的经济性状之一，由于易于观察，羽色常用于家禽的品种划分、品种纯度评价以及自别雌雄等，也有证据表明，羽色性状可能与禽类的一些经济性状相关联。此外，白羽相对于灰羽，在羽绒利用、屠体美观方面更有优势。因此，羽色在家禽生产和育种中有着广泛的应用。
灰、白羽是鹅的常见羽色，然而由于鹅羽色形成的分子遗传机制并不清楚，所以目前灰、白羽鹅的育种依然基于表型选择。依据近年来的研究，鹅的白、灰羽性状不仅受主效基因影响，而且还受到一些修饰基因的影响。此外，灰、白羽之间还存在一定的显隐性关系。因此，要获得纯色羽鹅，特别是纯白羽鹅并非易事。虽然扩大群体可以提高育种效率，但不可避免地增加了育种成本，而且耗时耗力。即使如此，也可能在育成群体中含有一些隐性基因，使群体有机会在繁育过程中再次出现非纯色羽个体。尽管测交试验可以大大降低育成群体中出现非纯色个体的机率，但大大提高了育成成本，延缓了育成时间，降低了育成效率。
相对于表型选择，分子遗传标记在鹅纯羽色育种中具有极大的优势和应用价值。已有大量研究表明羽色涉及到不少信号通路(如MSH/MC1R通路、WNT/Frizzled通路、SCF/c-Kit通路和ET-1/ETB-R等)和许多基因(如MITF、TYR、TYRP1、DCT等)，但究竟哪些通路和基因的变化造成了鹅羽色的改变，至今仍不清楚。而利用分子遗传标记进行育种，则需要成功的找到与目标性状关联的分子遗传标记。目前，在鹅羽色育种中还未筛选到与鹅羽色紧密连锁的分子遗传标记，因此严重制约了鹅羽色的分子育种。
发明内容
本发明的目的是针对目前在鹅羽色育种中普遍采用表型选择的方法，表型选择需要扩大育种群体规模和进行测交试验，这显著增加了育种公司在进行羽色性状选择时耗费的人力、物力和财力，而采用分子遗传标记育种则还未筛选到与鹅羽色紧密连锁的分子遗传标记，严重制约了鹅羽色的分子育种等不足，提出一种利用核苷酸多态性分子遗传标记对鹅羽色进行选择的方法，通过该方法判别羽色的准确率可达到100％，有助于促进与鹅羽色育种相关的研究与育种工作。
本发明的技术方案：一种利用核苷酸多态性分子遗传标记对鹅羽色进行选择的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)选定待测个体：从育种群体中挑选外形符合要求的个体；
(2)抽取血液并提取DNA：从检测个体的翅静脉中抽取0.1mL的血液，利用DNA提取试剂盒，提取DNA模板；
(3)聚合酶链式反应及产物检测：利用提取的DNA作PCR中的模板和提供的PCR试剂盒进行PCR；取5μL产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，如呈现657bp大小的单一条带，则将PCR产物进行测序检测；
(4)测序并判定基因型：将PCR产物和引物进行测序，依据测序结果确定基因型；
(5)依据基因型挑选合格的个体，凡是在多态性位点1具有GG基因型且在多态性位点2具有AA基因型的个体为白羽；在多态性位点1具有TT基因型且在多态性位点2具有CC基因型的个体为灰羽；在多态性位点1具有GT基因型且在多态性位点2具有AC基因型的个体为杂羽；
(6)根据羽色性状的选育目标确定留用个体。
本发明的有益效果为：本发明提出的一种利用核苷酸多态性分子遗传标记对鹅羽色进行选择的方法，方法科学合理，通过选定待测鹅群体，抽取待测个体的血液并提取DNA，利用提供的试剂盒进行聚合酶链式反应(PCR)并检测产物，将PCR产物测序并判定基因型，利用对育种鹅群体每个个体在标记基因多态性位点的测定，选择与灰、白羽对应的基因型个体，从而可以快速建立羽色为灰或白色的育种群，依据多态性位点的基因型，挑选出合格的个体用于组建育种群，从而使育种鹅群在羽色上几乎一致，根据该位点基因型判别羽色的准确率达到100％，在该位点完全纯合而不含有另一等位基因，排除了在繁育后代中再出现该位点等位基因杂合的现象，相对于传统的表型选择方法，本发明在鹅羽色选择时准确率显著提高，明显加快了育种进程，显著减少育种成本(如育种群体规模可减少至少一半，选择世代至少减少一代)，这将极大提高育种公司在鹅育种方面的竞争力和经济效益。本方法为建立羽色性状的分子育种平台奠定基础；避免了表型选择时存在的隐性基因残留问题，克服了后代繁育过程中再次出现淘汰羽色的情况。
附图说明
图1为本发明实施例中2个朗德鹅的DNA样品PCR产物电泳图。
图2为本发明实施例中遗传标记基因SNP位点GG基因型和AA基因型对应测序峰图。
图3为本发明实施例中遗传标记基因SNP位点TT基因型和CC基因型对应测序峰图。
图4为本发明实施例中遗传标记基因SNP位点GT基因型和AC基因型对应测序峰图。
图5为本发明实施例中标记基因SNP位点不同个体测序结果示例图。
具体实施方式
下面以一批34只朗德鹅为例并结合附图对本发明作进一步说明：
(1)选定待测的朗德鹅个体：从一批朗德鹅群体中挑选了34只外形符合要求的个体。
(2)抽取血液并提取DNA：从检测个体的翅静脉中抽取0.1mL的血液。利用DNA提取试剂盒，提取DNA模板。
(3)聚合酶链式反应及产物检测：利用提取的DNA作PCR中的模板和提供的PCR试剂盒(所含试剂的清单详见附表1)进行PCR(反应体系详见附表2，反应条件详见附表3)。取5μL产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，如呈现657bp大小的单一条带(参见附图1)，则将PCR产物送测序公司检测。
(4)测序并判定基因型：将PCR产物和引物(引物同附表1中的引物)送测序公司测序，依据测序结果确定基因型(参见附图2、3、4、5)。
(5)准确率分析：为了分析本发明在羽色选择上的准确性，本例对这批朗德鹅进行了基因型判别与羽色的比对，并计算出判别的准确率(详见附表4)。结果显示，本发明的判别准确率为100％。注：该发明在实际应用时，可跳过此步骤。
(6)依据羽色性状的培育目标，选择对应的基因型。凡是在多态性位点1具有GG基因型且在多态性位点2具有AA基因型的个体为白羽，在多态性位点1具有TT基因型且在多态性位点2具有CC基因型的个体为灰羽，在多态性位点1具有GT基因型且在多态性位点2具有AC基因型的个体为杂羽。
附表1：试剂盒中的试剂清单
附表2：遗传标记基因的PCR体系
注：体系中的上述物质在按顺序加入反应管后在台式离心机上以1000转/分钟离心1分钟，使所加物质全部沉于底部，然后放置于PCR仪中按附表3反应条件进行PCR扩增。取5μL产物用于凝胶电泳，检测产物的大小与单一性。
附表3：PCR条件
附表4：标记基因多态性位点基因型与羽色的对应关系及判别准确率
图1中的条带(657bp大小)是2个朗德鹅的DNA样品PCR产物电泳图。
图2-4中SNP的左右侧序列为：
GTCTTTTT(G/T)TATTATTATTTTTTAATAAAACAACCTGCCACATACCAAACAACCCCC(A/C)GGTTCC。
图5中B-1到B-11为白羽个体；Z-1到Z-13为杂羽个体；H-1到H-10为灰羽个体。带背景的序列为突变位点，其中M为该位点对应的杂合子。
本发明在鹅羽色的选择上优势明显，应该具有良好的市场应用前景。以培育一个鹅品种或品系为例，应用本发明的经济效益主要体现在由于选择准确性的提高而缩小的育种群体规模以及减少所需的选择代次。如培育一个品种或品系，可以减少育种群个体数2000只，每只鹅以100元计，总共可节省成本20万元。由此可见，本发明显著提高了鹅育种企业的经济效益。
<110>扬州大学
<120>一种利用核苷酸多态性分子遗传标记对鹅羽色进行选择的方法
<140>201910153871.X
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Claims (3)
1.一种利用单核苷酸多态性分子遗传标记对鹅羽色进行选择的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)选定待测个体：从育种群体中挑选外形符合要求的个体；所述个体为朗德鹅个体；
(2)抽取血液并提取DNA：从检测个体的翅静脉中抽取0.1 mL的血液，利用DNA提取试剂盒，提取DNA模板；
(3)聚合酶链式反应及产物检测：利用提取的DNA作PCR中的模板和提供的PCR试剂盒进行PCR；取5 µL产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，如呈现657 bp大小的单一条带，则将PCR产物进行测序检测；所述试剂盒由如下试剂组成：上游引物：5’-ACTCTGGGCATTGTAAGCCT-3’、下游引物：5’-AGCAGAACAACAAGGTGCAG-3’、2×Taq mix、水；
(4)测序并判定基因型：将PCR产物和引物进行测序，依据测序结果确定基因型；所述测序结果中，PCR产物中SNP的左右侧序列为：
GTCTTTTT(G/T)TATTATTATTTTTTAATAAAACAACCTGCCACATACCAAACAACCCCC(A/C)GGTTCC；
(5)依据基因型挑选合格的个体，凡是在多态性位点1具有GG基因型且在多态性位点2具有AA基因型的个体为白羽；在多态性位点1具有TT基因型且在多态性位点2具有CC基因型的个体为灰羽；在多态性位点1具有GT基因型且在多态性位点2具有AC基因型的个体为杂羽；其中，多态性位点1为上述SNP的左右侧序列中具有G/T突变的位点，多态性位点2为上述SNP的左右侧序列中具有A/C突变的位点；
(6)根据羽色性状的选育目标确定留用个体。
2.根据权利要求1所述的一种利用单核苷酸多态性分子遗传标记对鹅羽色进行选择的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的PCR由如下体系组成：10µM的上游引物0.5μL、10µM的下游引物0.5μL、2×Taq mix 10μL、水8μL、200ng/μL的DNA1μL。
3.根据权利要求1所述的一种利用单核苷酸多态性分子遗传标记对鹅羽色进行选择的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的PCR反应条件为：
(1)95℃预变性5分钟；
(2)95℃/30秒、56℃/30秒、72℃/30秒、循环35次；
(3)循环结束后72℃/5分钟；
(4)4℃保持至电泳。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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