CN111334588B

CN111334588B - 一种与鸭黑色和褐色羽性状相关的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN111334588B
Application number: CN202010313269.0A
Authority: CN
Inventors: 刘贺贺; 席洋; 王磊; 李亮; 王继文; 胡博; 白丽丽
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2020-04-20
Filing date: 2020-04-20
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2040-04-20
Also published as: CN111334588A

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种与鸭黑色和褐色羽性状相关的分子标记及其应用；所述分子标记位于鸭基因组的11号染色体上，区间为Chr11:20696245‑20697373核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述分子标记位于所述区间的第157位点，突变碱基为A或G，利用本发明的分子标记及其应用，仅需要一个世代的检测，就可以使育种群在目标羽色性状(黑色、褐色)上达到100％纯合，避免后代再次产生羽毛性状分离，提升育种效率；在麻羽肉鸭新品种或新品系的培育过程中，可以雏鸭阶段快速准确的鉴别待测个体的目标羽色类型(黑色羽、褐色羽)及其基因型，从而进行早期剔除，降低育种成本，缩短育种周期。

Description

一种与鸭黑色和褐色羽性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种与鸭黑色和褐色羽性状相关的分子标记及其应用。

背景技术

我国肉鸭年屠宰量超过30亿只，占世界肉鸭屠宰量的80％。随着我国人民生活水平的提高，消费者需求驱动我国肉鸭种业朝着多元化发展。优质麻羽肉鸭具有肉质好、抗逆能力强等特点，是满足未来肉鸭市场的良种之一，具有广阔的市场前景。近些年，国内很多科研单位、企业利用麻羽肉鸭地方品种资源，开展优质麻羽肉鸭的育种研究和实践。

羽色是家禽重要的“包装性状”，直接影响着肉禽的经济价值。羽色整齐一致和稳定遗传，是家禽品种培育的关键指标之一。禽类羽色类型丰富，且遗传机制复杂，不同羽色类型群体间开展杂交，甚至同一群体不同个体间选配，会导致后代羽色发生性状分离，且很难通过常规的表型选育将目标羽色性状固定下来。准确、高效的羽色选种方法，是优质麻羽肉鸭育种亟待解决的关键育种技术问题之一。

我们在前期研究中，筛选出了决定鸭羽色类型中黑羽和褐色羽毛类型的功能基因。同时发现，鸭黑羽(有色羽区域黑色)相对褐色(有色羽区域表现褐色)为显性性状，也就是说，黑色羽的鸭，可能是纯合体，也可能是杂合体。在优质麻羽鸭的选育过程中，育种者希望所选留的个体均为符合羽毛育种目标的纯合有色羽个体，从而保持后代羽色遗传稳定，避免羽色性状分离。但是单从鸭羽色表型上难以区分其基因型，只能借助准确的系谱信息记录，通过对后代的表型进行观察，利用孟德尔遗传规律推断其亲本的基因型。这种方法耗时长、成本高。因此，在麻羽鸭的育种群中，往往无法真正检测和剔除杂合个体，进而选出纯合的群体。此外，禽类羽毛在成年前，要经过四次换羽，家禽生长到成年时才能开始对成年羽色的选择，耗时又费成本。

因此，一种简单、快速、准确鉴定黑羽、褐色羽个体基因型的与鸭黑色和褐色羽性状相关的分子标记及其应用有待研究。

发明内容

针对上述问题，本发明旨在提供一种与鸭黑色和褐色羽性状相关的分子标记及其应用，本发明的分子标记，可以在雏鸭阶段快速准确的鉴别待测个体的目标羽色类型(黑色羽、褐色羽)及其基因型，从而进行早期剔除，降低育种成本，缩短育种周期。

为了达到上述的目的，本发明所采用的技术方案是：

一种与鸭黑色和褐色羽性状相关的分子标记，所述分子标记位于鸭基因组的11号染色体上，区间为Chr11:20696245-20697373如SEQ ID NO.1所示；所述分子标记位于所述区间的第157位点，突变碱基为A或G。

进一步的，所述与鸭黑色和褐色羽性状相关的分子标记的应用，包括以下步骤：

(1)采集待测鸭个体的生物检材，提取待测鸭个体生物检材的基因组DNA；

(2)以所提取基因组DNA为模板，设计特异性扩增引物，再以步骤(1)的DNA为模板进行PCR扩增反应，获得PCR产物；

(3)将步骤(2)得到的PCR产物进行基因序列测序，通过基因测序峰图判定鸭羽色基因型。

进一步的，所述步骤(1)中，待测鸭个体生物检材的基因组DNA为鸭翅下静脉血样基因组DNA、皮肤样品基因组DNA或毛囊样品基因组DNA。

进一步的，所述步骤(2)的特异性扩增引物序列为：

上游引物(5’—3’)：CATGTCCCCTTGACCTCGCA(SEQ ID NO.5)；

下游引物(5’—3’)：CGATGAGGCAGAGGAGGATG(SEQ ID NO.6)。

进一步的，步骤(2)中，反应体系为20uL，包括上下游引物各0.5uL、模板DNA 2uL、dNTP 1.5uL、taqDNA聚合酶1uL、灭菌去离子水12.5uL和10×solutionbuffer 2uL。

进一步的，步骤(2)中，反应程序为：95℃变性5min；然后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，重复30个循环；最后12℃保存PCR产物。

进一步的，步骤(3)中，判定鸭羽色对应的基因型：位于所述区间的第157位点的核苷酸为A时，核苷酸序列如SEQ ID NO.1，待测鸭个体为纯合黑羽；位于所述区间的第157位点的核苷酸为G时，核苷酸序列如SEQ ID NO.2，待测鸭个体为纯合麻羽；位于所述区间的第157位点的核苷酸为A/G时，核苷酸序列如SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，待测鸭个体为杂合黑羽。

纯合黑羽SEQ ID NO.1：

ccgggacgcggcgggcagccgggcctcagggggcctgcaggtgctgtggggggccctggggccacggccgccatccagggagcccccggggctgaggtcggggccatgtcaacattggcccccctgcgcctgctccgtgagccctggaacgccagcaagggcaaccagagcaacgccacggccggggctggaggcgcctggtgccaggggctcgacgtgcccaacgaactcttcctcacgctggggctggtgagcctggtggagaacctgctggtggtggccgccatcctaaagaacaggaacctgcactcgcccatgtactacttcatctgctgcctggccgtctccgacatgctggtgagcgtcagcaacctggcggagacgctcttcatgctgctgatggagcatggcgtgctggtgatccacgccagcatcatccgccacatggacaacatcatcgacatgctcatctgcagctccatcgtgtcctccctctccttcctaggggtgatcgccgtggaccgctacatcaccatcttctacgccctgcgctaccacagcatcatgacgctgcagcgggccgtggtcaccatggccagcgtctggctggccagcaccgtctccagcaccgtcttcatcacctactaccgcaacaacgccatcccttggggccccccctcggcgaagaggg

纯合麻羽SEQ ID NO.2：

ctcggagcggcggggcagccgggcctcagggggcctgcaggtgctgtggggggccctggggccacggccgccatccagggagcccccggggctgaggtcggggccatgtcaacattggcccccctgcgcctgctccgtgagccctggaacgccagcgagggcaaccagagcaacgccacggccggggctggaggcgcctggtgccaggggctcgacgtgcccaacgaactcttcctcacgctggggctggtgagcctggtggagaacctgctggtggtggccgccatcctaaagaacaggaacctgcactcgcccatgtactacttcatctgctgcctggccgtctccgacatgctggtgagcgtcagcaacctggcggagacgctcttcatgctgctgatggagcatggcgtgctggtgatccacgccagcatcatccgccacatggacaacatcatcgacatgctcatctgcagctccgtcgtgtcctccctctccttcctaggggtgatcaccgtggaccgctacatcaccatcttctacgccctgcgctaccacagcatcatgacgctgcagcgggccgtggtcaccatggccagcgtctggctggccagcaccgtctccagcaccgtcttcatcacctactaccgcaacaacgccatcctctcggggcctcctttgggaat

杂合黑羽SEQ ID NO.3：

gctcgggaccggcgggcagccgggcactcagggggcctgcaggtgctgtggggggccctggggccacggccgccatccagggagcccccggggctgaggtcggggccatgtcaacattggcccccctgcgcctgctccgtgagccctggaacgccagcaagggcaaccagagcaacgccacggccggggctggaggcgcctggtgccaggggctcgacgtgcccaacgaactcttcctcacgctggggctggtgagcctggtggagaacctgctggtggtggccgccatcctaaagaacaggaacctgcactcgcccatgtactacttcatctgctgcctggccgtctccgacatgctggtgagcgtcagcaacctggcggagacgctcttcatgctgctgatggagcatggcgtgctggtgatccacgccagcatcatccgccacatggacaacatcatcgacatgctcatctgcagctccatcgtgtcctccctctccttcctaggggtgatcgccgtggaccgctacatcaccatcttctacgccctgcgctaccacagcatcatgacgctgcagcgggccgtggtcaccatggccagcgtctggctggccagcaccgtctccagcaccgtcttcatcacctactaccgcaacaacgccatcctcctgggccccccacatcg

杂合黑羽SEQ ID NO.4：

gctcgggaccggcgggcagccgggcactcagggggcctgcaggtgctgtggggggccctggggccacggccgccatccagggagcccccggggctgaggtcggggccatgtcaacattggcccccctgcgcctgctccgtgagccctggaacgccagcgagggcaaccagagcaacgccacggccggggctggaggcgcctggtgccaggggctcgacgtgcccaacgaactcttcctcacgctggggctggtgagcctggtggagaacctgctggtggtggccgccatcctaaagaacaggaacctgcactcgcccatgtactacttcatctgctgcctggccgtctccgacatgctggtgagcgtcagcaacctggcggagacgctcttcatgctgctgatggagcatggcgtgctggtgatccacgccagcatcatccgccacatggacaacatcatcgacatgctcatctgcagctccatcgtgtcctccctctccttcctaggggtgatcgccgtggaccgctacatcaccatcttctacgccctgcgctaccacagcatcatgacgctgcagcgggccgtggtcaccatggccagcgtctggctggccagcaccgtctccagcaccgtcttcatcacctactaccgcaacaacgccatcctcctgggccccccacatcg

本发明的有益效果：

(1)在麻羽肉鸭新品种或新品系的培育过程中，利用本发明的分子标记和应用，仅需要一个世代的检测，就可以使育种群在目标羽色性状(黑色、褐色)上达到100％纯合，避免后代再次产生羽毛性状分离，提升育种效率；

(2)在麻羽肉鸭新品种或新品系的培育过程中，利用本发明的分子标记和应用，可以雏鸭阶段快速准确的鉴别待测个体的目标羽色类型(黑色羽、褐色羽)及其基因型，从而进行早期剔除，降低育种成本，缩短育种周期。

附图说明

图1为鸭黑色和褐色羽个体基因型鉴定图。

具体实施方式

为了进一步说明本发明的技术效果，下面通过实施例对本发明进行具体描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

(1)基因型的测定

在发明检测引物的过程中，从鸭翅下静脉采集血样，其中黑羽鸭和褐色羽鸭各20个体。获得的血样采用苯酚-氯仿法提取DNA。采用纳米粒电泳和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和数量。使用标准过程为每个合格DNA样本建成cDNA文库。所有文库均在

Hiseq X-Ten平台上进行测序，平均原始读取序列覆盖率为5×，采用双端测序，读长150bp(PE150)。

使用带有默认参数的NGS QC(v2.3.3)工具包过滤原始读取数据。使用默认参数，使用Burrows-Wheeler alignment(BWA aln)将clean reads分别mapping到鸭参考基因组(IASCAAS_PekingDuck_PBH1.5，GCF_003850225.1)。使用GATK(版本3.5)收集全基因组范围的单核苷酸突变位点(SNP)信息，输出的SNP使用VCFtools(版本0.1.15)进一步过滤，设置参数为最小等位基因频率(MAF)>0.05、最大等位基因频率<0.99、最大缺失率<0.1。所有筛选的SNP均匀分布在鸭29条常染色体、Chr Z、ChrW和Chr U(未贴壁支架)上。

通过将应用全基因组基因组分化比较，分析黑羽鸭和褐羽鸭群的基因组变异差异。最终将决定鸭黑色羽和褐色羽的遗传位点锁定在鸭基因组的11号染色体上，区间为Chr13:20696245-20697373。通过对该区域SNP位点进一步检测，发现了本申请专利中的分子标记位点，该位点可将黑色羽鸭和褐色羽鸭准确分开(表1)。通过对上述DNA区域设计PCR扩增引物，以及验证扩增的可靠性和效率，最终设计了本专利中的检测引物。

实施例1

本发明的应用，包括以下步骤：

1)采集多组黑色羽鸭和褐色羽鸭的生物检材，从鸭翅下静脉采集血样，提取血样的基因组DNA；

2)以所提取基因组DNA为模板，通过PCR引物进行常规PCR反应；

上游引物(5’—3’)：CATGTCCCCTTGACCTCGCA(SEQ ID NO.5)；

下游引物(5’—3’)：CGATGAGGCAGAGGAGGATG(SEQ ID NO.6)。

反应体系为20uL，包括上下游引物各0.5uL、模板DNA2 uL、dNTP 1.5uL、taqDNA聚合酶1uL、灭菌去离子水12.5uL、10×solution buffer 2uL。反应程序为：95℃变性5min；(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s)×30个循环；12℃保存反应产物。

3)将步骤(2)得到的PCR产物进行基因序列测序，通过基因测序峰图判定鸭羽色基因型。

4)根据图1判定待测个体在该位点的基因型。纯合黑羽个体基因型为A/A；杂合黑羽个体基因型为G/A；纯合褐色羽个体基因型为G/G，结合育种目标需要，可选留纯合黑色羽(A/A)或者纯合褐色羽(G/G)个体留种，则可实现群体稳定遗传目标羽色性状。具体的，位于所述区间的第157位点的核苷酸为A时，核苷酸序列如SEQ ID NO.1，待测鸭个体为纯合黑羽；位于所述区间的第157位点的核苷酸为G时，核苷酸序列如SEQ ID NO.2，待测鸭个体为纯合麻羽；位于所述区间的第157位点的核苷酸为A/G时，核苷酸序列如SEQ ID NO.3/SEQID NO.4，待测鸭个体为杂合黑羽。

表1利用本发明专利测鸭不同羽毛类型(黑色、褐色)个体基因型

最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，本领域技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种与鸭黑色和褐色羽性状相关的分子标记及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 691

<212> DNA

<213> Anas platyrhynchos

<400> 1

ccgggacgcg gcgggcagcc gggcctcagg gggcctgcag gtgctgtggg gggccctggg 60

gccacggccg ccatccaggg agcccccggg gctgaggtcg gggccatgtc aacattggcc 120

cccctgcgcc tgctccgtga gccctggaac gccagcaagg gcaaccagag caacgccacg 180

gccggggctg gaggcgcctg gtgccagggg ctcgacgtgc ccaacgaact cttcctcacg 240

ctggggctgg tgagcctggt ggagaacctg ctggtggtgg ccgccatcct aaagaacagg 300

aacctgcact cgcccatgta ctacttcatc tgctgcctgg ccgtctccga catgctggtg 360

agcgtcagca acctggcgga gacgctcttc atgctgctga tggagcatgg cgtgctggtg 420

atccacgcca gcatcatccg ccacatggac aacatcatcg acatgctcat ctgcagctcc 480

atcgtgtcct ccctctcctt cctaggggtg atcgccgtgg accgctacat caccatcttc 540

tacgccctgc gctaccacag catcatgacg ctgcagcggg ccgtggtcac catggccagc 600

gtctggctgg ccagcaccgt ctccagcacc gtcttcatca cctactaccg caacaacgcc 660

atcccttggg gccccccctc ggcgaagagg g 691

<210> 2

<211> 686

<212> DNA

<213> Anas platyrhynchos

<400> 2

ctcggagcgg cggggcagcc gggcctcagg gggcctgcag gtgctgtggg gggccctggg 60

gccacggccg ccatccaggg agcccccggg gctgaggtcg gggccatgtc aacattggcc 120

cccctgcgcc tgctccgtga gccctggaac gccagcgagg gcaaccagag caacgccacg 180

gccggggctg gaggcgcctg gtgccagggg ctcgacgtgc ccaacgaact cttcctcacg 240

ctggggctgg tgagcctggt ggagaacctg ctggtggtgg ccgccatcct aaagaacagg 300

aacctgcact cgcccatgta ctacttcatc tgctgcctgg ccgtctccga catgctggtg 360

agcgtcagca acctggcgga gacgctcttc atgctgctga tggagcatgg cgtgctggtg 420

atccacgcca gcatcatccg ccacatggac aacatcatcg acatgctcat ctgcagctcc 480

gtcgtgtcct ccctctcctt cctaggggtg atcaccgtgg accgctacat caccatcttc 540

tacgccctgc gctaccacag catcatgacg ctgcagcggg ccgtggtcac catggccagc 600

gtctggctgg ccagcaccgt ctccagcacc gtcttcatca cctactaccg caacaacgcc 660

atcctctcgg ggcctccttt gggaat 686

<210> 3

<211> 685

<212> DNA

<213> Anas platyrhynchos

<400> 3

gctcgggacc ggcgggcagc cgggcactca gggggcctgc aggtgctgtg gggggccctg 60

gggccacggc cgccatccag ggagcccccg gggctgaggt cggggccatg tcaacattgg 120

cccccctgcg cctgctccgt gagccctgga acgccagcaa gggcaaccag agcaacgcca 180

cggccggggc tggaggcgcc tggtgccagg ggctcgacgt gcccaacgaa ctcttcctca 240

cgctggggct ggtgagcctg gtggagaacc tgctggtggt ggccgccatc ctaaagaaca 300

ggaacctgca ctcgcccatg tactacttca tctgctgcct ggccgtctcc gacatgctgg 360

tgagcgtcag caacctggcg gagacgctct tcatgctgct gatggagcat ggcgtgctgg 420

tgatccacgc cagcatcatc cgccacatgg acaacatcat cgacatgctc atctgcagct 480

ccatcgtgtc ctccctctcc ttcctagggg tgatcgccgt ggaccgctac atcaccatct 540

tctacgccct gcgctaccac agcatcatga cgctgcagcg ggccgtggtc accatggcca 600

gcgtctggct ggccagcacc gtctccagca ccgtcttcat cacctactac cgcaacaacg 660

ccatcctcct gggcccccca catcg 685

<210> 4

<211> 685

<212> DNA

<213> Anas platyrhynchos

<400> 4

gctcgggacc ggcgggcagc cgggcactca gggggcctgc aggtgctgtg gggggccctg 60

gggccacggc cgccatccag ggagcccccg gggctgaggt cggggccatg tcaacattgg 120

cccccctgcg cctgctccgt gagccctgga acgccagcga gggcaaccag agcaacgcca 180

cggccggggc tggaggcgcc tggtgccagg ggctcgacgt gcccaacgaa ctcttcctca 240

cgctggggct ggtgagcctg gtggagaacc tgctggtggt ggccgccatc ctaaagaaca 300

ggaacctgca ctcgcccatg tactacttca tctgctgcct ggccgtctcc gacatgctgg 360

tgagcgtcag caacctggcg gagacgctct tcatgctgct gatggagcat ggcgtgctgg 420

tgatccacgc cagcatcatc cgccacatgg acaacatcat cgacatgctc atctgcagct 480

ccatcgtgtc ctccctctcc ttcctagggg tgatcgccgt ggaccgctac atcaccatct 540

tctacgccct gcgctaccac agcatcatga cgctgcagcg ggccgtggtc accatggcca 600

gcgtctggct ggccagcacc gtctccagca ccgtcttcat cacctactac cgcaacaacg 660

ccatcctcct gggcccccca catcg 685

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catgtcccct tgacctcgca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgatgaggca gaggaggatg 20

Claims

1.一种检测与鸭黑色和褐色羽性状相关的分子标记的试剂在检测鸭黑色和褐色羽性状上的应用，其特征在于，所述分子标记位于鸭基因组的12号染色体上，如SEQ ID NO.1所示；所述分子标记位于序列的第157位点，突变碱基为A或G。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）采集待测鸭个体的生物检材，提取待测鸭个体生物检材的基因组DNA；

（2）以所提取基因组DNA为模板，设计特异性扩增引物，再以步骤（1）的DNA为模板进行PCR扩增反应，获得PCR产物；

所述特异性扩增引物序列为：

上游引物（5’—3’）：CATGTCCCCTTGACCTCGCA；

下游引物（5’—3’）：CGATGAGGCAGAGGAGGATG；

（3）将步骤（2）得到的PCR产物进行基因序列测序，通过基因测序峰图判定鸭羽色基因型；

判定鸭羽色对应的基因型的方法为：位于所述序列的第157位点的核苷酸为A时，核苷酸序列如SEQ ID NO.1，待测鸭个体为纯合黑羽；位于所述序列的第157位点的核苷酸为G时，核苷酸序列如SEQ ID NO.2，待测鸭个体为纯合麻羽；位于所述序列的第157位点的核苷酸为A/G时，核苷酸序列如SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，待测鸭个体为杂合黑羽。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，待测鸭个体生物检材的基因组DNA为鸭翅下静脉血样基因组DNA、皮肤样品基因组DNA或毛囊样品基因组DNA。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，反应体系为20 uL，包括上下游引物各0.5 uL、模板DNA 2 uL、dNTP 1.5 uL、taqDNA聚合酶1 uL、灭菌去离子水12.5 uL和10×solution buffer 2 uL。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，反应程序为：95℃变性 5 min；然后95℃变性30 s，55℃退火30s，72℃延伸50s，重复30个循环；最后12℃保存PCR产物。