CN113308557B - 一种与鸭凤头性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents

一种与鸭凤头性状相关的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种与鸭凤头性状相关的分子标记及其应用，首次提供了用于快速鉴别鸭凤头性状的分子标记（SEQ ID NO:1所示序列中的第78位处的G/A碱基突变），同时利用该分子标记设计引物（SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3）进行PCR扩增检测。将所得扩增产物进行直接测序后判定受测个体基因型。本发明方法先进科学，通过使用分子标记技术可以实现对润州凤头白鸭个体的快速筛选，操作简单且结果可靠，可以为润州凤头白鸭的遗传资源保护和合理利用提供科学依据。

Description

一种与鸭凤头性状相关的分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域、基因检测技术领域，具体涉及一种与鸭凤头性状相关的分子标记及其应用。
背景技术
凤头性状是禽类特有的性状，且早在明朝时期就有润州凤头白鸭的历史记载，表现为“顶有高毛、白毛、乌骨”。润州凤头白鸭作为目前我国唯一的头部具有凤头的鸭遗传资源，除了具有极高的观赏价值外，还有较高的肉用、药用价值。对于润州凤头白鸭这一品种资源的保护与利用亟需开展。
遗传标记是指可以稳定遗传的、易于识别的、特殊的遗传多态性形式。分子标记指DNA水平上的遗传多态性。DNA水平的遗传多态性表现为核苷酸序列的任何差异，包括单个核苷酸的差异。随着高通量测序技术和基因组遗传标记检测技术的突飞猛进，结合数量遗传学和统计学的方法来研究基因组上某一个位点与表型性状的关联，是一种有效寻找表型性状分子标记的方法。全基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)是指以全基因组范围内的单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism，SNP)为遗传标记，对复杂性状进行关联分析，从中筛选出与性状相关的变异位点。这些变异位点可以作为分子标记，便于通过分子手段提高目的性状的选育进展，也利于进行品种资源的保护。本发明基于GWAS原理挖掘出与鸭凤头性状相关的分子标记并对其进行一定的开发利用，具有重要应用价值。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种与鸭凤头性状相关的分子标记及其应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：一种与鸭凤头性状相关的分子标记，其特征是，该分子标记为SEQ ID NO:1所示序列中的第78处的G/A碱基突变；SEQ ID NO:1为：
TGTAGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACACAAAAACCAACAGCTTGGCTACTGTATAATCCTAAACTTCTGTATTTCG。
一种利用与鸭凤头性状相关的分子标记快速判定鸭凤头性状相关的基因型的方法，其特征是，包括以下步骤：
步骤1)、提取鸭的基因组DNA；
步骤2)、针对TAS2R40 5'UTR设计引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3进行PCR扩增：
SEQ ID NO:2为：
TAS2R40-5’UTR-F：ATACAAATATAGGTCTATAAAGTGGC；
SEQ ID NO:3为：
TAS2R40-5’UTR-R：AGCAATTATTAGGCATATAGCAGA；
步骤3)、将步骤2)中扩增产物直接送测，并统计测序结果；
若基因型为GG，表示受测个体为凤头纯合子野生型基因型；若基因型为GA，表示受测个体为非凤头个体杂合基因型；若基因型为AA，表示受测个体为非凤头个体纯合基因型。
本发明方法先进科学，首次提供了用于快速鉴别鸭凤头性状的分子标记，同时利用该分子标记设计引物进行PCR扩增检测判定受测个体基因型。与鸭凤头性状相关的分子标记(123272114_c.G78A)，属TAS2R40 5'UTR第78处的G/A碱基突变。利用与鸭凤头性状相关的分子标记快速判定鸭凤头性状相关的基因型的方法。包括以下步骤：
步骤1)、提取鸭的基因组DNA；
步骤2)、针对TAS2R40 5'UTR设计如下引物进行PCR扩增：
TAS2R40-5’UTR-F：ATACAAATATAGGTCTATAAAGTGGC，
TAS2R40-5’UTR-R：AGCAATTATTAGGCATATAGCAGA；
步骤3)、将步骤2)中扩增产物直接送测。
统计步骤3)中获得的测序结果，
若基因型为GG，表示受测个体为凤头纯合子野生型基因型；
若基因型为GA，表示受测个体为非凤头个体杂合基因型；
若基因型为AA，表示受测个体为非凤头个体纯合基因型。
有益效果：本发明通过使用分子标记技术可以实现对润州凤头白鸭个体的快速筛选，操作简单且结果可靠，可以为润州凤头白鸭的遗传资源保护和合理利用提供科学依据。
以樱桃谷鸭×润州凤头白鸭为亲本构建的杂交F2代资源群体为研究对象(樱桃谷鸭来自江苏省益客种禽有限公司，润州凤头白鸭来自镇江市天成农业科技有限公司)。通过对308只F2个体进行重测序，结合F2的表型记录，使用case-control试验设计进行凤头性状关联分析，结果检测到与凤头性状显著相关的SNP最高点位于1号染色体KEL和TAS2R40之间。同时发现TAS2R40 5'UTR(123272114_c.G78A)的基因型可以将凤头鸭与普通鸭分开。本发明即以该SNP位点作为分子标记，针对该SNP位点设计引物进行PCR检测，根据检测结果快速判定鸭凤头性状相关的基因型。
附图说明
图1为TAS2R40 5'UTR(123272114_c.G78A)在樱桃谷鸭、润州凤头白鸭、连城白鸭、金定鸭群体中的群体验证的基因型频率分布。
具体实施方式
下面结合实施例、附图以及附图说明对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
一种利用与鸭凤头性状相关的分子标记快速判定鸭凤头性状相关的基因型的方法。具体步骤如下：
1.材料与方法；
1.1实验材料；
樱桃谷鸭(n＝15)、润州凤头白鸭(n＝30)、连城白鸭(n＝30)、金定鸭(n＝30)。
1.2受测个体基因组DNA提取；
采集每个样本翅下静脉血，采用磁珠法动物组织基因组DNA提取试剂盒(DP341，北京天根)，操作流程如下：
(1)取10μl抗凝血液，放入1.5ml离心管中，加入200μl组织消化液GHA和20μl蛋白酶K；
(2)加入300μl裂解液GHB，振荡混匀；
(3)将离心管置于75℃，孵育15min，期间颠倒混匀3回，每回3-5次；
(4)室温放置5min；
(5)加入350μl异丙醇，振荡混匀10sec；
(6)加入30μl磁珠悬浮液G(使用前振荡混匀)，振荡混匀1min，静置9min，且每3min振荡混匀1min；
(7)将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体；
(8)加入700μl缓冲液GDA(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，振荡混匀30sec；
(9)将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体；
(10)加入700μl漂洗液PWD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，振荡混匀30sec；
(11)将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体；
(12)重复步骤10和11一次；
(13)将离心管放置于磁力架上，室温晾干10-15min；
注意：乙醇残留会抑制后续的酶反应，所以晾干时要确保乙醇挥发干净。但也不要干燥太长时间，以免难以洗脱DNA。
(14)将离心管从磁力架上取下，加入100-200μl洗脱缓冲液TB，振荡混匀，置于56℃，孵育10min，期间颠倒混匀3回，每回3-5次；
(15)将离心管放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，小心将DNA溶液转移至一个新离心管中，并于-20℃冰箱保存。
1.3PCR扩增检测；
1.3.1扩增引物
TAS2R40-5’utr-F：ATACAAATATAGGTCTATAAAGTGGC，
TAS2R40-5’utr-R：AGCAATTATTAGGCATATAGCAGA。
1.3.2PCR反应体系及反应条件；
a.PCR具体反应体系见下表：
PCR反应体系25μl
b.PCR具体反应条件见下表：
反应条件
1.4委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行扩增产物测序；
1.5使用ContigExpress软件针对测序结果进行统计分析，获得各品种群体基因型频率分布。
2.结果；
对123272114_c.G78A位点在不同鸭品种间的基因型进行统计分析，其中，在凤头个体中发现100％纯合子野生型基因型(n＝30)，而樱桃谷鸭种群(n＝15)显示出100％突变基因型。在地方鸭品种中，连城白鸭(n＝30)和金定鸭种群(n＝30)显示出100％的杂合基因型和纯合的突变基因频率。由上述检测结果可知，基因型为GG的个体均为凤头个体，基因型为GA或AA则为非凤头个体，即受测个体基因型与凤头表型一致，表明检测该位点可有效区分凤头与非凤头个体。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种与鸭凤头性状相关的分子标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 78
<212> DNA
<213> 鸭(mallard)
<400> 1
tgtagttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaacac aaaaaccaac agcttggcta ctgtataatc 60
ctaaacttct gtatttcg 78
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atacaaatat aggtctataa agtggc 26
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcaattatt aggcatatag caga 24

Claims (1)

1.一种利用分子标记快速判定鸭凤头性状相关的基因型的方法，其特征是，包括以下步骤：
步骤1）、提取鸭的基因组DNA ；
步骤2）、针对TAS2R40 5'UTR设计引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3进行PCR扩增：
SEQ ID NO:2为：
TAS2R40-5’UTR-F：ATACAAATATAGGTCTATAAAGTGGC；
SEQ ID NO:3为：
TAS2R40-5’UTR-R：AGCAATTATTAGGCATATAGCAGA；
步骤3）、将步骤2）中扩增产物直接送测，并统计测序结果；所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，且第78处的碱基为G/A；SEQ ID NO:1为：TGTAGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACACAAAAACCAACAGCTTGGCTACTGTATAATCCTAAACTTCTGTATTTCG；
若基因型为GG，表示受测个体为凤头纯合子野生型基因型；若基因型为GA，表示受测个体为非凤头个体杂合基因型；若基因型为AA，表示受测个体为非凤头个体纯合基因型。
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