CN110551828B

CN110551828B - 一种与鸡背部毛孔密度相关的snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN110551828B
Application number: CN201910884732.4A
Authority: CN
Inventors: 沈曼曼; 王克华; 曲亮; 马猛; 卢建; 窦套存; 胡玉萍; 郭军; 王星果; 李永峰; 李尚民
Original assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Current assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Priority date: 2019-09-19
Filing date: 2019-09-19
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2039-09-19
Also published as: CN110551828A

Abstract

本发明公开了一种与鸡背部毛孔密度相关的SNP分子标记，属于分子标记与遗传育种领域。所述SNP分子标记的SNP位点位于国际鸡参考基因组GRCg6a Primary Assembly版本第1号染色体第169981107位，且该处碱基是G或A。本发明还提供了用于检测上述SNP标记的引物组合及其应用。利用该SNP分子标记和引物组合，可建立背部毛孔密度高效准确的分子标记辅助育种方法，从而有效地对背部毛孔密度进行选择，促进抗应激品种鸡的选育。

Description

一种与鸡背部毛孔密度相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与鸡背部毛孔密度相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

随着全球温室效应的加剧，集约化养殖环境下的鸡受到的非生物胁迫影响越来越大，尤其以热应激表现最为明显。由于禽类无汗腺组织，体温的调节主要通过呼吸，毛孔的密度间接影响了禽类的体温调节。高温环境下，较少的毛孔表现为羽毛覆盖度要少，可以改善热应激状况，有效地进行体温调节，从而能够适应闷热潮湿的环境。

育种的主要目的是为了提高畜禽的生产性能，然而畜禽生产性能的提高必然需要适应能力的提高，尤其是适应未来高热环境的能力，这样才能使得培育的品种在未来的环境条件下提高生产性能。毛孔密度间接地反映了鸡种的热应激能力，可作为热耐受性的间接指标。而表现毛孔密度通常采用测量背部毛孔密度的方法，一般以背部正中线2×2㎝²的面积计算。不同品种鸡的毛孔密度显著不同，如邵伯鸡的毛孔密度为7.82个/㎝²，雪山草鸡的毛孔密度为4.61个/㎝²，本课题组选育的资源群体毛孔密度为6.5个/㎝²。

研究表明，背部毛孔密度的遗传力为0.723，为高遗传力性状，直接选育可稳定遗传给后代。鸡的毛孔密度在胚胎期即已生长完成，然而生产中背部毛孔的测量多在屠宰后进行，限制了毛孔密度性状的选育。随着分子生物学技术的发展，分子标记辅助选择方法(marker assisted selection,MAS)被越来越多地应用于育种环节。利用有效的分子标记进行毛孔密度的选择将是对该性状选育的重要手段，可以显著促进抗热应激资源品种或品系的培育。

发明内容

为了解决生产中背部毛孔密度选育方法的空白，发明人进行了大量研究，意外地发现国际鸡参考基因组GRCg6a Primary Assembly版本第1号染色体上物理位置第169981107核苷酸处的G>A突变与鸡背部毛孔密度相关，从而完成本发明。

本发明第一方面提供一种与鸡背部毛孔密度相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的SNP位点位于国际鸡参考基因组GRCg6a Primary Assembly版本第1号染色体第169981107位，且该处碱基是G或A。所述的SNP标记在国际鸡参考基因组上的名称为rs312355347。

本发明第二方面提供一种与鸡背部毛孔密度相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，且其第162位碱基是G或A。

本发明第三方面提供检测本发明第一方面或第二方面所述的SNP分子标记的试剂在制备用于鉴定待测鸡背部毛孔密度的试剂盒中的应用。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂为能够扩增所述SNP分子标记的引物组合。

在本发明的一些实施方案中，所述引物组合由具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物组成。

本发明的第四方面提供一种用于鉴定鸡背部毛孔密度的试剂盒，包括能够检测本发明第一方面或第二方面所述的SNP分子标记的试剂。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂为能够扩增所述分子标记的引物组合。

本发明的第五方面提供一种抗应激能力强的鸡的方法，包括以下步骤：

(1)获取待测鸡的基因组DNA；

(2)检测所述基因组DNA中本发明第一方面或第二方面所述SNP分子标记的基因型，

选择AA基因型鸡，淘汰GG和GA基因型鸡。

在本发明的一些实施方案中，步骤(2)中利用引物组合检测所述SNP分子标记的基因型。

在本发明的一些具体实施方案中，所述引物组合由具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物组成。

在本发明中，AA基因型的背部毛孔密度较少，GG和GA基因型的毛孔密度较多。在本发明的一些实施方案中，当背部毛孔密度大于参考值，表明该背部毛孔密度多。在本发明的一些优选实施方案中，所述参考值是指特定鸡种大量样本鸡背部毛孔密度的平均值或中位值，在本发明的一些更优选实施方案中，所述大量样本是指具有统计学意义数量的样本。在本发明的另一些更优选实施方案中，所述大量样本是指50只、100只、200只、500只、1000只、10000只或更多。在本发明的一些具体实施方案中，所述大量样本是指1252只。

在本发明中，背部毛孔密度少的鸡的抗应激能力强，即能够在高温和/或潮湿环境下有效进行体温调节。

本发明的有益效果

本发明相对于现有技术具有如下的优势和效果：

(1)利用本发明的与鸡背部毛孔密度相关的SNP分子标记进行分子标记辅助选择，能够有效地减少背部毛孔密度；

(2)本发明同时提供了该SNP分子标记的序列以及鉴定的引物，通过该分子标记和引物，可利用Sanger测序法建立快速高效准确的分子标记辅助育种技术，降低鸡背部毛孔密度。

附图说明

图1示出了由东乡绿壳蛋鸡和白莱航蛋鸡构建的F2代资源群体关于背部毛孔密度全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)曼哈顿图；其中横坐标代表鸡的染色体编号；纵坐标代表-logP值，黑色水平线代表以8.43×10^-7为显著性表达水平阈值。

图2示出了不同基因型背部毛孔密度的表型值(相同面积毛孔数值越高，密度越多)。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店可购买到的。

下述实施例1中，利用由东乡绿壳蛋鸡和白莱航蛋鸡构建的F2代资源群体母鸡1252只，屠宰后测定背部正中线2×2㎝²的背部毛孔数(毛孔数值越大，毛孔密度越多，反之，毛孔数值越小，毛孔密度越少)。试验在江苏省家禽科学研究所邵伯试验基地进行，所有母鸡整个饲养时期环境、营养条件均一致。

实施例1全基因组关联分析

(1)采集F2代群体母鸡翅静脉血，利用标准的酚-氯仿法进行基因组DNA提取。通过标准的程序进行DNA质量检测、浓度测定等，最终选择以OD260/280比值在1.8-2.0之间为合格以备后续试验。统一将浓度稀释为50ng/μl用于基因分型。

(2)利用Affymetrix公司的鸡600K高密度基因芯片进行基因分型，参照芯片说明书进行基因分型和质量控制，主要包括：利用APT v1.16.0进行分型前的质量控制；PLINK v1.90进行质量控制，剔除call rate小于0.97，偏离哈代温伯格平衡≤10^-6的SNP标记；BEAGLE v4.0选择R²>0.5的SNPs进行填充。质控剩余了435867个SNPs和1252个样本用于后续分析。

(3)全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)方法：进行GWAS分析之前为了消除假阳性，计算多维度主成分分析，以前5个主成分作为协变量加入到模型中。利用R脚本“simpleM”方法计算各SNPs位点独立检验估计，得到了59308个indepSNPs。利用Bonferroni进行校正，得到基因组显著水平为8.43×10^-7。利用GEMMA v0.94软件中混合线性模型对背部毛孔数进行GWAS分析，模型为：y＝Wα+xβ+u+ε，中y代表所有个体的表型性状的n×1向量值；W指协变量矩阵(指包括一列向量1和5个主成分的固定效应)，α为包括截距在内对应系数的一列向量，Wα代表群体结构效应；x为标记基因型向量，β标记位点效应的大小，xβ代表SNP的效应；u为个体的随机效应向量，u～N(0，KV_g)，K代表由SNP标记计算出的已知的n×n遗传关系矩阵，V_g多基因加性方差；ε代表n×1随机误差向量，符合ε～N(0，IV_e)分布，I代表n×n身份矩阵，V_e代表残差组分。

GWAS分析的结果如图1所示，最显著的SNP分子标记为位于1号染色体的rs312355347，P＝1.38×10^-8；由于显著关联区域可能是由连锁不平衡(Linkagedisequilibrium，LD)造成，以1号染色体鉴定到的所有潜在显著的SNP进行LD分析，经LD分析后，显著和潜在的位点位于连锁不平衡状态。

实施例2背部毛孔密度的等位基因检测方法的建立

(1)对与背部毛孔密度显著相关的SNP标记位点的目的片段引物扩增1号染色体上一段205bp核苷酸片段，序列扩增的上下游引物为：

上游引物pore-F：AACCCATGAGTGATCTGCCA(SEQ ID NO.1)

下游引物pore-R：CCAGGGGTTGTCATAACTGC(SEQ ID NO.2)

(2)PCR扩增：

本实施例中试剂是南京诺维赞公司获得，引物合成及测序由上海生工公司完成。

以获取的C3品系鸡基因组DNA为模板，使用引物pore-F和pore-R进行PCR扩增。

扩增体系如下：

PCR反应程序如下：

(3)序列测序与鉴定

PCR扩增的产物pore_SEQ在上海生工公司进行Sanger测序，基因片段进行正反两个反应。将所得序列与鸡的参考基因组GRCg6a Primary Assembly进行比对，得出对应的SNP标记位点突变。

PCR扩增产物pore_SEQ如下所示(SEQ ID NO.3)：

注：序列中标注的R为突变位点，用加粗并标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，序列的首尾加粗显示为引物序列。

实施例3分子标记SNP rs312355347G>A突变的效应分析

本发明提供的一个降低鸡背部毛孔密度的SNP分子标记，以AA基因型的背部毛孔密度较少，GG和GA基因型的毛孔密度较多，如图2所示。在继代选育过程中选留AA基因型的个体，淘汰GG和GA基因型的个体。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 江苏省家禽科学研究所

<120> 一种与鸡背部毛孔密度相关的SNP分子标记及其应用

<130> XY-2019-1-W-072

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aacccatgag tgatctgcca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccaggggttg tcataactgc 20

<210> 3

<211> 222

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aacccatgag tgatctgcca tcattactct aacgtcattc acagcatcta gtttcatctc 60

agtttccttt aaaaatatta gaaaaaaaat gttacaggga agaagtgtac tcttctaagt 120

cagttctaag atgaactgca atattcatat gcctcagctt grttctgtgc tccactaatt 180

atctagcagt tatgacaacc cctggtacag ttaagctttg gc 222

Claims

1.检测一种SNP分子标记的试剂在制备用于鉴定待测鸡背部毛孔密度的试剂盒中的应用，其中，

所述鸡选自由东乡绿壳蛋鸡和白莱航蛋鸡构建的F2代资源群体母鸡，所述SNP分子标记的SNP位点位于国际鸡参考基因组GRCg6a PrimaryAssembly版本第1号染色体第169981107位，且该处碱基是G或A，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，且其第162位碱基是G或A。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为能够扩增所述SNP分子标记的引物组合。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物组合的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。

4.一种选育背部毛孔密度少的鸡种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取待测鸡的基因组DNA；

(2)检测所述基因组DNA中一种SNP分子标记的基因型，

选择AA基因型鸡，淘汰GG和GA基因型鸡，其中，

所述鸡选自由东乡绿壳蛋鸡和白莱航蛋鸡构建的F2代资源群体母鸡，所述SNP分子标记的SNP位点位于国际鸡参考基因组GRCg6a PrimaryAssembly版本第1号染色体第169981107位，且该处碱基是G或A，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，且其第162位碱基是G或A，

所述背部毛孔密度少是指背部毛孔密度不大于参考值，所述参考值是指特定鸡种大量样本鸡背部毛孔密度的平均值或中位值。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，(2)中利用引物组合检测所述SNP分子标记的基因型。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物组合的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。