CN114875161B - 与鸡低温耐受相关的分子标记、引物组合及相应的选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种鉴定鸡低温耐受品种的分子标记、引物组成及相应的选育方法,分子标记位点位于NCBI上鸡的参考基因组(Gallus Gallus 5.0)第Z号染色体第16134664核苷酸处的A>G突变与鸡低温耐受相关,能够用于家禽低温耐受品种的筛选,其鉴定效率及准确率高。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和遗传育种领域,具体涉及一种与鸡低温耐受相关的分子标记、引物组合及相应的选育方法。
背景技术
随着畜牧业规模化、集约化发展,应激因子亦越来越多。一般来说,畜禽越小,对应激越敏感,家禽表现尤甚。在家禽生产中,不可避免地要面对各种类型的应激,包括高温、低温、转群、运输等,而低温是畜禽养殖业面临的最具挑战的应激之一。尤其在我国的冬春季节,温度变化突然且降温幅度大,一旦管理不当,鸡群就有可能因为冷应激而引起家禽体内酸碱失衡、内分泌紊乱等,进而影响家禽的生长性能的发挥,甚至引发潜在疾病,导致大批量死亡。目前,针对家禽冷应激除了加强日常管理外,或通过提高能量、降低蛋白、添加小肽等措施改善营养水平,或添加维生素E、中草药、绿茶粉等抗冷应激物质,但这些方式缓解效果有限,仍无法满足临床需要。因此,耐低温品种的选育也是家禽养殖业的迫切需求。
分子育种是利用DNA分子标记对育种素材进行选择的技术,能快速地提升子代的经济性状。单核苷酸多态性(SNP)是目前应用最广、最新的分子标记。目前国内外关于鸡低温耐受的分子标记开发的研究尚少,且在产业中缺乏可应用于分子标记辅助育种的标记。因此开发耐受低温性状的分子标记对家禽的健康养殖及加速育种进程具有重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种鉴定鸡低温耐受品种的分子标记、引物组合及相应的选育方法。分子标记位点位于NCBI上鸡的参考基因组(Gallus Gallus 5.0)第Z号染色体第16134664核苷酸处的A>G突变与鸡低温耐受相关,能够用于家禽低温耐受品种的筛选,其鉴定效率及准确率高。为达到上述发明的目的,本发明所采用的技术方案如下:
本发明第一方面提供了一种与鸡低温耐受相关的SNP分子标记,所述SNP分子标记位点位于NCBI上鸡的参考基因组(Gallus Gallus 5.0)第Z号染色体第16134664位,所述的位点处碱基是A或G。
较佳地,所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示且第53位碱基是A或G。
较佳地,所述分子标记的低温耐受基因型为AA基因型。
本发明第二方面提供了一种用于检测上述SNP分子标记的引物组合,所述引物组合具体如下组成:
上游引物F:ggcctgtgcacaaattacaaca(SEQ ID NO.1)
下游引物R:gtggctgaataccactggaca(SEQ ID NO.2)。
本发明第三方面提供了一种选育低温耐受的鸡的方法,包括以下步骤:
(1)提取鸡的基因组DNA;
(2)利用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2对提取的基因组DNA进行PCR扩增,得到扩增产物;
(3)对扩增产物进行测序,选择测序结果中基因型为AA的群体。
较佳地,所述的步骤(2)中PCR反应条件为:预变性94℃3min;变性94℃3s,退火58℃30s,延伸72℃1min,重复35个循环,循环外延伸72℃5min。
本发明通过对低温耐受组和低温不耐受组的鸡进行全基因组测序和生物信息学分析筛选获得SNP突变位点,并通过进一步验证试验,得到一个鸡的低温耐受分子标记;利用本发明提供的分子标记及其引物检测鉴定鸡低温耐受的性状,方法准确可靠,操作简单,能够快速有效的筛选出符合要求的低温耐受性状,辅助选育出低温耐受的鸡品种,因此具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为鸡基因组上与低温耐受相关的选择信号。
图2为受选择信号区域SNP位点在4个品种中的突变频率。
图3为SNP位点在8个品种群体中的基因型分布图。
图4为SNP位点sanger测序图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容,特举以下实施例详细说明。
实施例1:
选择中国4个不同环境生长的地方品种鸡包括林甸鸡、藏鸡、东乡绿壳蛋鸡和文昌鸡各50只,翅静脉采集2mL血样于EDTA-Na抗凝管中,利用酚-氯仿法进行基因组DNA提取。通过DNA质控后基于Illumina Hiseq PE150平台进行全基因组测序。过略掉接头序列(>10nt与适配器进行校准,允许≤10%的错配),去除低质量的序列包括≥10%未被识别的核苷酸或者>50%且碱基测序质量<5的,去除建库过程中可能产生的PCR重复序列。使用BWA(Burrows-Wheeler Aligner)(0.7.8版本)软件包将剩余的高质量的配对序列用命令mem-t4-k32 M与鸡参考基因组Gallus_gallus-5.0进行匹配分析;同时为了减少测序前PCR扩增产生的错配,通过SAMtools(0.1.19版本)软件包去除重复的序列。将获得的序列根据Gallus_gallus-5.0基因组,使用ANNOVAR软件包进行SNP和InDel注释。
选择信号筛选:筛选思路即将低温地区生长的林甸鸡(LDC)、藏鸡(TBC)、非高温生长地区的绿壳蛋鸡(GSC)分别与高温地区生长的文昌鸡(WCC)比较筛选受选择信号,取LDC和TBC低温受选择信号交集,去除GSC受选择信号,来获得低温受选择信号。筛选方法即通过基于群体分化、以哈温平衡为前提种群遗传学统计方法Fst定位受选择信号(见图1),并分析和筛选受选择信号上与低温适应相关的SNP位点(见图2),结果初步筛选到3个SNP位点,包括Z16123795、Z16134664、Z161451477这3个与低温耐受相关的候选SNP位点。
实施例2
为了进一步研究上述筛选到的3个SNP位点的等位基因突变频率模式是否与低温耐受相关,试验与德国联邦动物健康研究所沟通获得的50只波兰本土鸡(Poland)、92只芬兰本土鸡(Finland)、40只以色列本土鸡(Israel)和97只埃及本土鸡(Egypt)的Affymetrix580k芯片数据,并结合重测序分析的LDC、TBC、GSC、WCC这个四个群体3个SNP位点,发现只有在Z16134664位点上,随着地方品种鸡生长温度的降低,AA基因型频率呈现规律性增加趋势(图3),说明不同品种地方鸡AA基因型频率与环境温度之间有很强的相关性。进一步分析发现,该SNP位点突变频率随着鸡生长环境温度的降低而增加(表1),进一步认为该位点(Z16134664)与低温耐受相关。
表1 4个鸡品种3个SNP位点突变频率
实施例3:
为了进一步探索实施例2中的SNP位点是否适用于低温耐受群体的筛选,试验选择45周龄蛋鸡品系A和品系B各120只,放入环境控制舱中,适应3天后,将试验环境温度设置为10±1℃,试验期间试验鸡饲喂基础日粮,自由采食。试验第10天,统计其生产性能,并采集血液提取DNA。
PCR扩增:本实施例中试剂来源于北京天根生化科技有限公司,引物合成及测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。以本实施例中2个鸡群体基因组DNA为模板,使用上述引物序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2进行PCR扩增。
扩增序列的测序与鉴定:
上述所扩增的PCR产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行Sanger测序,具体测序图见图4。将所得的序列与鸡的参考基因组比对,获得对应的SNP突变位点。PCR扩增产物如下所示:
SEQ ID NO.3:
ggcctgtgcacaaattacaacaaacttctagatagagcaattgaaaaaaagag(a)cttgtaaaataacagtaacacatactatttatgatcctactttttacagagatgttgtagaatgcttgcattttaaccacataggtaaatttaaagaaacagcttttgtccagtggtattcagccac
注意:序列首位加粗的碱基序列为上下游引物序列区域,序列中加粗并标有下划线显示的碱基是突变位点,括号内的为突变碱基且为等位基因突变。
结果如表2所示,A组鸡平均产蛋率下降幅度和鸡群死亡率低于B组,推测A组鸡比B组鸡低温耐受性更强;通过测序分析发现A组鸡在Z16134664位点的AA基因型频率高,推测在应对冷应激环境时,A组鸡群体由于具有更好的低温耐受而拥有相对较低的死亡率和产蛋率下降幅度,同时进一步说明Z16134664SNP位点在低温耐受品种的选择中具有一定的应用价值。
表2热应激环境下二组鸡生产性能和SNP位点突变频率
在此说明书中,本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是,很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此,说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
序列表
<110> 江苏省家禽科学研究所
<120> 与鸡低温耐受相关的分子标记、引物组合及相应的选育方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcctgtgca caaattacaa ca 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtggctgaat accactggac a 21
<210> 3
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcctgtgca caaattacaa caaacttcta gatagagcaa ttgaaaaaaa gagcttgtaa 60
aataacagta acacatacta tttatgatcc tactttttac agagatgttg tagaatgctt 120
gcattttaac cacataggta aatttaaaga aacagctttt gtccagtggt attcagccac 180
<210> 4
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcctgtgca caaattacaa caaacttcta gatagagcaa ttgaaaaaaa gaacttgtaa 60
aataacagta acacatacta tttatgatcc tactttttac agagatgttg tagaatgctt 120
gcattttaac cacataggta aatttaaaga aacagctttt gtccagtggt attcagccac 180
Claims (5)
1. 一种检测与鸡低温耐受相关的SNP分子标记的试剂的应用,其特征在于,所述的SNP分子标记位点位于NCBI上鸡的参考基因组Gallus Gallus 5.0第Z号染色体第16134664位,所述的位点处碱基是A或G,用于家禽低温耐受品种的筛选;所述分子标记的低温耐受基因型为AA基因型。
2. 根据权利要求1所述的检测与鸡低温耐受相关的SNP分子标记的试剂的应用,其特征在于,所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示且第53位碱基是A或G。
3. 根据权利要求1或2所述的检测与鸡低温耐受相关的SNP分子标记的试剂的应用,其特征在于,所述试剂包括引物组合,所述引物组合具体如下组成:
上游引物F:GGCCTGTGCACAAATTACAACA
下游引物R:GTGGCTGAATACCACTGGACA。
4.一种选育低温耐受的鸡的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)提取鸡的基因组DNA;
(2)利用引物SEQ ID NO .1和SEQ ID NO .2对提取的基因组DNA进行PCR扩增,得到扩增产物;
(3)对扩增产物进行测序,检测如权利要求1或2所述的SNP分子标记,所述的SNP分子标记位点位于NCBI上鸡的参考基因组Gallus Gallus 5.0第Z号染色体第16134664位,选择测序结果中所述SNP分子标记位点处的基因型为AA基因型的群体。
5.根据权利要求4所述的选育低温耐受的鸡的方法,其特征在于,所述的步骤(2)中PCR反应条件为:预变性94℃3min;变性94℃3s,退火58℃30s,延伸72℃1min,重复35个循环,循环外延伸72℃5min。
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