CN101565744A - 一种三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统及遗传分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水产遗传育种领域，具体说是一种三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统及遗传分析方法。多元高通量遗传标记系统为线粒体序列信息系统和微卫星分子标记系统，其中微卫星分子标记系统为由7个SSR标记的系统1和6个SSR标记的系统2组成；方法：运用线粒体的三对引物扩增COI，16S和CR的序列的信息作为分子标记，将混养家系中同一母本和不同母本所产的后代根据遗传结构和遗传多样性分开，再运用微卫星分子标记，将已区分母本的后代根据遗传距离和遗传多样性进行父本的区分，从而完成三疣梭子蟹遗传育种过程中的系谱认证并确认近交系数。本发明在有效利用物种遗传信息的基础上，使用多元高通量遗传标记系统区分子代之间的亲缘关系，同时有效避免近交衰退。
Description
技术领域
本发明涉及水产遗传育种领域，具体说是一种三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统及遗传分析方法。
背景技术
随着生物技术的发展，分子标记也在不断更新，目前广泛应用在海洋动物遗传学分析中的标记是线粒体序列和微卫星标记。线粒体序列(mtDNA)作为核外遗传物质，具有进化速度快、非重组变异和母系遗传等特点，完全相同的序列信息表明样品来源于同一母本。常用作种内遗传分析的mtDNA片段有COI，16S和CR。微卫星(SSRs)是在真核和原核生物基因组中存在的由2-6个碱基构成的串联重复序列，具有高度多态性和共显性特点。微卫星标记能够提供双亲的遗传信息，尤其应用在揭示个体间和群体间的基因交流、推测亲权关系和杂交现象的分析中，能更全面的反映群体间的遗传关系。基因组微卫星标记常被用于濒危珍贵保护动物以及海洋经济物种的遗传多样性评估及系谱认证。目前，三疣梭子蟹序列信息(国际共享数据库GenBank中公布112个核苷酸序列和494个EST序列)还没有被系统的开发并真正应用于遗传育种所需的系谱认定和遗传关系分析中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、有效的三疣梭子蟹多元高通量遗传标记及遗传分析方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统：所述多元高通量遗传标记系统为线粒体序列信息系统和微卫星分子标记系统，其中微卫星分子标记系统为由7个SSR标记的系统1和6个SSR标记的系统2组成；
系统1由7个SSR标记组成，扩增7个SSR标记的7对引物分别是
E13(F：AAGGAGGAGGCTTTGATATG；R：GTCTTCCACTCCCTTACTGT)；
P04(F：GCCACTATCTTGCTGAGGTTGA；R：GCCATAGCACGAACACTTTTGA)；
E20(F：CCTCAGGGCAGCTCTGGAT；R：CCCGGACTAGGTGACAGGTT)；
E24(F：AACTATGGGTCCTGAGTATTA；R：CTCGGTTTCTGTCCACTT)；
C13(F：CTGTCTGATGAGTGAGGCTAC；R：TGACCACGAGGAAAGGAG)；
C31(F：TATAAGGGCTTAAGTGTACG；R：GATCTAAACTCAAGGCAAAA)；
H4(F：AATCACTTCACTACACCTTTT；R：CTTGATGGGTGGCAGTCT)；
系统2由6个SSR标记组成，扩增6个SSR标记的6对引物分别是
E9(F：TACTGAGACGCCGCTGGTTA；R：ACAAGATCCTTCGTGGTGGG)；
E18(F：CCACAACTGCAAACACCT；R：TTGGCATTTTCATCACTTAC)；
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C14(F：AGTGAGATTAACGCAACT；R：CATCTTTCATTACAGGGA)；
H13(F：ATGGGCAAGCCTCTTAATGT；R：GGATCTTCGGGTAGGACTGA)；
E17(F：ATAAATATCTTGGAAGCCCTCA；R：ACGCCACATAGAACACTCACTC)。
所述线粒体序列信息系统，扩增COI，16S和CR序列的三对引物分别是LCO1490(GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG)和HCO2198(TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)；16Sar-L(CGCCTGTTTATCAAAAACAT)和16Sbr-H(CCGGTCTGAACTCAGATCACGT)；12ST(AGGAATTAAGAAACAATCAAACTTT)和CRT(GCCGTTGAGTGAAGAGTGTTCAGATAG)。
三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统的遗传分析方法：首先，运用线粒体的三对引物扩增COI，16S和CR的序列的信息作为分子标记，将混养家系中同一母本和不同母本所产的后代根据遗传结构和遗传多样性分开，然后再运用微卫星分子标记，将已区分母本的后代根据遗传距离和遗传多样性进行父本的区分，从而完成三疣梭子蟹遗传育种过程中的系谱认证并确认近交系数。所述扩增COI，16S和CR序列的三对引物分别是LCO1490(GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG)和HCO2198(TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)；16Sar-L(CGCCTGTTTATCAAAAACAT)和16Sbr-H(CCGGTCTGAACTCAGATCACGT)；12ST(AGGAATTAAGAAACAATCAAACTTT)和CRT(GCCGTTGAGTGAAGAGTGTTCAGATAG)。
所述微卫星分子标记由系统1和系统2组成；
系统1由7个SSR标记组成，扩增7个SSR标记的7对引物分别是
E13(F：AAGGAGGAGGCTTTGATATG；R：GTCTTCCACTCCCTTACTGT)；
P04(F：GCCACTATCTTGCTGAGGTTGA；R：GCCATAGCACGAACACTTTTGA)；
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C31(F：TATAAGGGCTTAAGTGTACG；R：GATCTAAACTCAAGGCAAAA)；
H4(F：AATCACTTCACTACACCTTTT；R：CTTGATGGGTGGCAGTCT)；
系统2由6个SSR标记组成，扩增6个SSR标记的6对引物分别是
E9(F：TACTGAGACGCCGCTGGTTA；R：ACAAGATCCTTCGTGGTGGG)；
E18(F：CCACAACTGCAAACACCT；R：TTGGCATTTTCATCACTTAC)；
E28(F：CGTTACTGAAAGAGTGGTGAA；R：GCAGAGGTTGTACCACCG)；
C14(F：AGTGAGATTAACGCAACT；R：CATCTTTCATTACAGGGA)；
H13(F：ATGGGCAAGCCTCTTAATGT；R：GGATCTTCGGGTAGGACTGA)；
E17(F：ATAAATATCTTGGAAGCCCTCA；R：ACGCCACATAGAACACTCACTC)。
所有引物方向为5′-3′方向。所述三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统遗传分析的方法可同时检测成百上千个样品。
本发明所具有的优点：
1.育种的遗传背景清晰，避免了传统育种的盲目性。本发明利用线粒体序列和微卫星作为分子标记，解析了我国海域三疣梭子蟹野生群体的遗传多样性，明确了育种基础群、育种选择群个体间的遗传关系，使育种材料的选择具有更强的目的性。
2.本发明线粒体序列和微卫星分子标记的结合，既避免了仅用线粒体序列无法明确父系信息的缺点，也减少了仅用微卫星标记的繁琐，有利于快速确认所研究个体的系谱发生。
3.本发明应用多元高通量遗传标记系统对育种群体遗传多样性的实时监测，可以有效避免遗传育种过程中的近交衰退，保障育种的科学性和可持续性。
附图说明
图1为本发明遗传分析三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统(其中数字代表每个标记的等位基因数，横轴所示标记名称，纵轴所示等位基因的大小。)。
图2a和图2b为运用本发明方法模拟检测图(其中在双亲信息未知的情况下，运用软件Cervus Version2.0的Simulation功能，区分400个家系的准确率为100％；由线粒体信息确定母本后、在一个亲本信息已知的情况下，区分1000个家系的准确率为100％。)。
图3为运用本发明家系鉴定图(其三个家系，每个家系个体数分别为10、14和16。运用本发明检测，运用软件populations 1.2.30，采用DAS法计算遗传距离，UPGMA图显示，正确率为100％。)。
具体实施方式
实施例
1)三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统为线粒体序列信息系统和微卫星分子标记系统，其中微卫星分子标记为由7个SSR标记的系统1和6个SSR标记的系统2组成(参见图1)；
系统1由7个SSR标记组成，扩增7个SSR标记的7对引物分别是
E13(F：AAGGAGGAGGCTTTGATATG；R：GTCTTCCACTCCCTTACTGT)；
P04(F：GCCACTATCTTGCTGAGGTTGA；R：GCCATAGCACGAACACTTTTGA)；
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C31(F：TATAAGGGCTTAAGTGTACG；R：GATCTAAACTCAAGGCAAAA)；
H4(F：AATCACTTCACTACACCTTTT；R：CTTGATGGGTGGCAGTCT)；
系统2由6个SSR标记组成，扩增6个SSR标记的6对引物分别是
E9(F：TACTGAGACGCCGCTGGTTA；R：ACAAGATCCTTCGTGGTGGG)；
E18(F：CCACAACTGCAAACACCT；R：TTGGCATTTTCATCACTTAC)；
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H13(F：ATGGGCAAGCCTCTTAATGT；R：GGATCTTCGGGTAGGACTGA)；
E17(F：ATAAATATCTTGGAAGCCCTCA；R：ACGCCACATAGAACACTCACTC)。
以上引物参见序列表。
2)三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统遗传分析的方法：首先，运用线粒体的三对引物扩增COI，16S和CR的序列的信息作为分子标记，将混养家系中同一母本和不同母本所产的后代根据遗传结构和遗传多样性分开，然后再运用微卫星分子标记，将已区分母本的后代根据遗传距离和遗传多样性进行父本的区分，从而完成三疣梭子蟹遗传育种过程中的系谱认证并确认近交系数。
(1)运用线粒体的三对引物扩增COI，16S和CR的序列的信息：
a.提取三疣梭子蟹样品的DNA；
b.以步骤a的DNA为模板，用引物LCO1490(GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG)和HCO2198(TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)扩增COI片段，用引物16Sar-L(CGCCTGTTTATCAAAAACAT)和16Sbr-H(CCGGTCTGAACTCAGATCACGT)扩增16S片段，用引物12ST(AGGAATTAAGAAACAATCAAACTTT)和CRT(GCCGTTGAGTGAAGAGTGTTCAGATAG)扩增CR片段。上述PCR扩增产物回收、纯化并测序。PCR扩增条件为：95℃变性2分钟，32-35个循环包括95℃变性30秒、54-56℃退火45秒、72℃延伸60秒，最后72℃延伸5分钟.
(2)运用微卫星分子标记
c.以步骤a的DNA为模板，分别用引物
E13(F：AAGGAGGAGGCTTTGATATG；R：GTCTTCCACTCCCTTACTGT)；
P04(F：GCCACTATCTTGCTGAGGTTGA；R：GCCATAGCACGAACACTTTTGA)；
E20(F：CCTCAGGGCAGCTCTGGAT；R：CCCGGACTAGGTGACAGGTT)；
E24(F：AACTATGGGTCCTGAGTATTA；R：CTCGGTTTCTGTCCACTT)；
C13(F：CTGTCTGATGAGTGAGGCTAC；R：TGACCACGAGGAAAGGAG)；
C31(F：TATAAGGGCTTAAGTGTACG；R：GATCTAAACTCAAGGCAAAA)；
H4(F：AATCACTTCACTACACCTTTT；R：CTTGATGGGTGGCAGTCT)
扩增系统1的全部微卫星标记共计7个。分别用引物E9(F：TACTGAGACGCCGCTGGTTA；R：ACAAGATCCTTCGTGGTGGG)；
E18(F：CCACAACTGCAAACACCT；R：TTGGCATTTTCATCACTTAC)；
E28(F：CGTTACTGAAAGAGTGGTGAA；R：GCAGAGGTTGTACCACCG)；
C14(F：AGTGAGATTAACGCAACT；R：CATCTTTCATTACAGGGA)；
H13(F：ATGGGCAAGCCTCTTAATGT；R：GGATCTTCGGGTAGGACTGA)；
E17(F：ATAAATATCTTGGAAGCCCTCA；R：ACGCCACATAGAACACTCACTC)扩增系统2的全部微卫星标记共计6个。PCR扩增条件为：95℃变性2分钟，28-32个循环包括95℃变性30秒、54-58℃退火45秒、72℃延伸60秒，最后72℃延伸5分钟。
将上述PCR扩增产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，并应用CervusVersion2.0软件进行数据处理。
应用例1
运行Cervus的模拟分析功能得到使用本发明三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统遗传分析的方法，区分混养家系的数目与家系鉴别成功率之间的关系，见图2。从图2a中红线所示，完全使用本发明方法，由线粒体信息确定母本后、在一个亲本信息已知的情况下，再运用SSR标记系统1和系统2可成功区分1000个家系(准确率100％)；从图2a中黑线所示，若不先使用线粒体信息确定母本、在双亲信息未知情况下，应用SSR标记系统1和系统2仅能区分400个家系(准确率100％)；从图2b中红线所示，由线粒体信息确定母本后、在一个亲本信息已知的情况下，单独应用SSR标记系统1或系统2可成功区分300个家系(准确率100％)；从图中黑线所示，若不先使用线粒体信息确定母本、在双亲信息未知情况下，单独应用SSR标记系统1或系统2可成功区分20个家系(准确率100％)。
应用例2
三个家系的样品于2008年8月21日取自浙江省宁海县振海水产有限公司，每个家系都为一雌、一雄所产的全同胞家系。分别从每个家系中随机取10、14和16只幼蟹个体，分别编号明确其亲缘关系组成样本I。从另一个养殖群体中随机选6只雌蟹和6只雄蟹分别编号后与真正的3对亲本一起共同作为候选亲本组成样本II。进行混养家系的分析时假定样本I、II之间的亲缘关系未知，将样本I与样本II一起应用本发明方法进行遗传分析，具体为先测定所有样本的线粒体信息，明确母本信息并将不同母亲的个体分开；再应用SSR系统1和系统2检测所有样本的基因型，明确父本信息，并根据样本I中40个个体基因型的数据，用Populations软件计算出个体之间的遗传距离，用UPGMA的方法根据个体间遗传距离将三个家系的40个个体分别聚成三类，同一家系的个体均被单独聚成一类，分析的结果与记录编号比对，正确率100％(图3)。
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院海洋研究所
<120>一种三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统及遗传分析方法
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<170>PatentIn version 3.1
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<222>(1)..(18)
<223>
<400>20
gcagaggttg taccaccg 18
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>人工设计
<220>
<221>satellite
<222>(1)..(18)
<223>
<400>21
agtgagatta acgcaact 18
<210>22
<211>18
<212>DNA
<213>人工设计
<220>
<221>satellite
<222>(1)..(18)
<223>
<400>22
catctttcat tacaggga 18
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工设计
<220>
<221>satellite
<222>(1)..(20)
<223>
<400>23
atgggcaagc ctcttaatgt 20
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工设计
<220>
<221>satellite
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<223>
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ggatcttcgg gtaggactga 20
<210>25
<211>22
<212>DNA
<213>人工设计
<220>
<221>satellite
<222>(1)..(22)
<223>
<400>25
ataaatatct tggaagccct ca 22
<210>26
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<212>DNA
<213>人工设计
<220>
<221>satellite
<222>(1)..(22)
<223>
<400>26
acgccacata gaacactcac tc 22
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<212>DNA
<213>avertebrate
<220>
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<222>(1)..(25)
<223>
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<210>28
<211>26
<212>DNA
<213>avertebrate
<220>
<221>gene
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<212>DNA
<213>avertebrate
<220>
<221>gene
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<223>
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cgcctgttta tcaaaaacat 20
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<220>
<221>gene
<222>(1)..(22)
<223>
<400>30
ccggtctgaa ctcagatcac gt 22
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<213>人工设计
<220>
<221>gene
<222>(1)..(25)
<223>
<400>31
aggaattaag aaacaatcaa acttt 25
<210>32
<211>27
<212>DNA
<213>人工设计
<220>
<221>gene
<222>(1)..(27)
<223>
<400>32
gccgttgagt gaagagtgtt cagatag 27
Claims (7)
1.一种三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统，其特征在于：所述多元高通量遗传标记系统为线粒体序列信息系统和微卫星分子标记系统，其中微卫星分子标记系统为由7个SSR标记的系统1和6个SSR标记的系统2组成；
系统1由7个SSR标记组成，扩增7个SSR标记的7对引物分别是
E13(F：AAGGAGGAGGCTTTGATATG；R：GTCTTCCACTCCCTTACTGT)；
P04(F：GCCACTATCTTGCTGAGGTTGA；R：GCCATAGCACGAACACTTTTGA)；
E20(F：CCTCAGGGCAGCTCTGGAT；R：CCCGGACTAGGTGACAGGTT)；
E24(F：AACTATGGGTCCTGAGTATTA；R：CTCGGTTTCTGTCCACTT)；
C13(F：CTGTCTGATGAGTGAGGCTAC；R：TGACCACGAGGAAAGGAG)；
C31(F：TATAAGGGCTTAAGTGTACG；R：GATCTAAACTCAAGGCAAAA)；
H4(F：AATCACTTCACTACACCTTTT；R：CTTGATGGGTGGCAGTCT)；
系统2由6个SSR标记组成，扩增6个SSR标记的6对引物分别是
E9(F：TACTGAGACGCCGCTGGTTA；R：ACAAGATCCTTCGTGGTGGG)；
E18(F：CCACAACTGCAAACACCT；R：TTGGCATTTTCATCACTTAC)；
E28(F：CGTTACTGAAAGAGTGGTGAA；R：GCAGAGGTTGTACCACCG)；
C14(F：AGTGAGATTAACGCAACT；R：CATCTTTCATTACAGGGA)；
H13(F：ATGGGCAAGCCTCTTAATGT；R：GGATCTTCGGGTAGGACTGA)；
E17(F：ATAAATATCTTGGAAGCCCTCA；R：ACGCCACATAGAACACTCACTC)。
2.按权利要求1所述的三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统，其特征在于：所述线粒体序列信息系统，扩增COI，16S和CR序列的三对引物分别是LCO1490(GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG)和HCO2198(TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)；16Sar-L(CGCCTGTTTATCAAAAACAT)和16Sbr-H(CCGGTCTGAACTCAGATCACGT)；12ST(AGGAATTAAGAAACAATCAAACTTT)和CRT(GCCGTTGAGTGAAGAGTGTTCAGATAG)。
3.一种按权利要求1所述的三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统的遗传分析方法，其特征在于：首先，运用线粒体的三对引物扩增COI，16S和CR的序列的信息作为分子标记，将混养家系中同一母本和不同母本所产的后代根据遗传结构和遗传多样性分开，然后再运用微卫星分子标记，将已区分母本的后代根据遗传距离和遗传多样性进行父本的区分，从而完成三疣梭子蟹遗传育种过程中的系谱认证并确认近交系数。
4.按权利要求3所述的三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统的遗传分析方法，其特征在于：所述扩增COI，16S和CR序列的三对引物分别是LCO1490(GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG)和HCO2198(TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)；16Sar-L(CGCCTGTTTATCAAAAACAT)和16Sbr-H(CCGGTCTGAACTCAGATCACGT)；12ST(AGGAATTAAGAAACAATCAAACTTT)和CRT(GCCGTTGAGTGAAGAGTGTTCAGATAG)。
5.按权利要求3所述的三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统的遗传分析方法，其特征在于：所述微卫星分子标记由系统1和系统2组成；
系统1由7个SSR标记组成，扩增7个SSR标记的7对引物分别是
E13(F：AAGGAGGAGGCTTTGATATG；R：GTCTTCCACTCCCTTACTGT)；
P04(F：GCCACTATCTTGCTGAGGTTGA；R：GCCATAGCACGAACACTTTTGA)；
E20(F：CCTCAGGGCAGCTCTGGAT；R：CCCGGACTAGGTGACAGGTT)；
E24(F：AACTATGGGTCCTGAGTATTA；R：CTCGGTTTCTGTCCACTT)；
C13(F：CTGTCTGATGAGTGAGGCTAC；R：TGACCACGAGGAAAGGAG)；
C31(F：TATAAGGGCTTAAGTGTACG；R：GATCTAAACTCAAGGCAAAA)；
H4(F：AATCACTTCACTACACCTTTT；R：CTTGATGGGTGGCAGTCT)；
系统2由6个SSR标记组成，扩增6个SSR标记的6对引物分别是
E9(F：TACTGAGACGCCGCTGGTTA；R：ACAAGATCCTTCGTGGTGGG)；
E18(F：CCACAACTGCAAACACCT；R：TTGGCATTTTCATCACTTAC)；
E28(F：CGTTACTGAAAGAGTGGTGAA；R：GCAGAGGTTGTACCACCG)；
C14(F：AGTGAGATTAACGCAACT；R：CATCTTTCATTACAGGGA)；
H13(F：ATGGGCAAGCCTCTTAATGT；R：GGATCTTCGGGTAGGACTGA)；
E17(F：ATAAATATCTTGGAAGCCCTCA；R：ACGCCACATAGAACACTCACTC)。
6.按权利要求3所述的三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统的遗传分析方法，其特征在于：所有引物方向为5′-3′方向。
7.按权利要求3所述的三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统的遗传分析方法，其特征在于：所述三疣梭子蟹多元高通量遗传标记系统遗传分析的方法可同时检测成百上千个样品。
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