CN111206104B

CN111206104B - 一种高效简便获取木虱总科昆虫线粒体基因组的通用引物和方法及其应用

Info

Publication number: CN111206104B
Application number: CN201911330260.4A
Authority: CN
Inventors: 吴丰年; 黄剑坚; 吴清韩
Original assignee: Hanshan Normal University
Current assignee: Hanshan Normal University
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2039-12-20
Also published as: CN111206104A

Abstract

本发明公开了一种高效简便获取木虱总科昆虫线粒体基因组的通用引物和方法及其应用。所述通用引物包括6对引物：Psyllid‑1、Psyllid‑2、Psyllid‑3、Psyllid‑4、Psyllid‑5和Psyllid‑6，其上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1～12所示。本发明首次提供了一种用于扩增木虱总科昆虫线粒体基因组的通用引物，可用于获取木虱总科昆虫整个线粒体基因组信息；本发明的通用引物需要的引物对数少，通过常规PCR和一代测序即可获得完整的属于木虱总科的昆虫线粒体基因组信息，扩增效率高、快捷、操作简便、价格便宜，对操作仪器和分析设备要求较低，容易实现，且扩增和分析过程中不受昆虫本身和其他内生菌基因组干扰，具有较大的应用前景。

Description

一种高效简便获取木虱总科昆虫线粒体基因组的通用引物和方法及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，更具体地，涉及一种高效简便获取木虱总科线粒体基因组的通用引物和方法及其应用。

背景技术

线粒体是绝大多数真核生物细胞氧化供能的主要细胞器，它的存在关系着细胞的生存和凋亡，该细胞器中有一套独立于核染色体的基因组——线粒体基因组(Ridley,2006)。近年来，线粒体全基因组在研究昆虫进化和种群数量中起到重要作用，主要是因为该基因组相对较小、基因数目少、重组率低、碱基突变率高、可遗传性和相对浓度高等特点，因此它是研究昆虫分子分类、系统进化、群体遗传和变异等方面很好的分子遗传标记(Boore,1999；Clayton,1992；Taanman,1999；Wolstenholme,1992)。

昆虫线粒体基因组除了少数例外，一个完整的环形昆虫线粒体主要包括：13个编码基因(Protein-coding genes,PCGs)，2个核糖体RNA基因(rRNA)，22个转移RNA基因(tRNA)和一个富含AT的非编码区(控制区)。线粒体基因组排序相对比较稳定，保留祖先的基因排列顺序(Cameron,2014)。

目前全世界通过形态学描述的木虱总科已经超过3000种(Forero,2008；Hollis,2004)，其中部分属于农业生产上的重要害虫和传病媒介。分子系统方法的出现允许更加精确和快速地描述入侵物种群体之间的多样性，可比形态学评估确定更多信息。目前GenBank数据库公布的完整线粒体基因组中属于木虱总科有：隶属于木虱科的木通木虱Cacopsyllacoccinea和朴树木虱Pachypsylla venusta(Que et al.,2015；Thao et al.,2004)，隶属于个木虱科的枸杞木虱Paratrioza sinica和马铃薯木虱Bactericera cockerelli(Zhanget al.,2016；Wu et al.,2016a)，隶属于扁木虱科的柑橘木虱Diaphorina citri(Wu etal.,2016b)，随着二代测序技术的引进促进基因组(包括昆虫线粒体基因组)的快速发展(Cantacessi et al.,2010；Williams et al.,2014)。但高通量测序价格相对较高，对数据分析能力和软硬件要求也较高，难以得到充分推广。

目前细胞色素氧化酶1(cox1)基因的部分片段已被广泛用于部分木虱昆虫物种多态性分析、个体或种群的系统发育和鉴定当中，特别是对于遗传距离较远的样品(Boykinet al.,2012；De León et al.,2011；Lashkari et al.,2014)。Wu等(2016)报道了cox1基因在木虱总科的线粒体基因组中是最保守的。然而只分析单一基因生物信息量较少，对于遗传距离较近的木虱种群可能与事实发生偏离，多个基因或线粒体全基因组序列综合分析结果才更加准确(Yamauchi et al.,2003)，能够初步得知比cox1基因变化率更大的基因组区域，找到更多的碱基突变位点SNPs，从而鉴定出更多的单倍型，获得更加准确的鉴别结果。除了cox1基因，其他线粒体基因同样具有分析种群差异的潜力。因此，获得木虱线粒体全基因组序列可提供更多生物信息，是分析遗传距离较近的样品种群的前提。

先前报道的木虱线粒体的通用引物主要用于扩增cox1基因的部分区域，无法获取其线粒体全基因组信息；而Simon等(2006)设计的动物线粒体基因组测序的通用引物，该套引物是基于10个昆虫目18种昆虫、2种节肢动物、2种脊椎动物和3种无脊椎动物线粒体基因组序列比对而设计的。这套引物虽然已被广泛使用，但由于动物线粒体基因组结构变异大，碱基突变位点高，该套引物的通用性并不高，在使用中存在诸多不足，不是所有引物对都能在整个线粒体基因组扩增中起到很好的效果，申请人前期发现，该套通用引物并不适用于木虱总科的昆虫样品，扩增效果较差，特别是无法在变异性较高的基因上起作用，没办法用于实际研究。因此，亟需开发一种高效简便、专门用于获取木虱总科昆虫样品线粒体基因组的通用引物，为后续昆虫分子分类、系统进化、群体遗传和变异等方面研究提供更全面的分子遗传标记信息。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种高效简便获取木虱总科线粒体基因组的通用引物。

本发明的另一目的在于提供一种获取木虱总科线粒体基因组的方法。

本发明的再一目的在于提供上述通用引物和方法的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一套用于获取木虱总科昆虫线粒体基因组的通用引物，包括6对引物Psyllid-1、Psyllid-2、Psyllid-3、Psyllid-4、Psyllid-5和Psyllid-6，其上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～12所示。

本发明根据现有木虱总科中不同木虱科已知线粒体基因组序列为参考序列，根据已知线粒体基因组的保守区域设计通用引物，扩增条带之间须有交叉，方便后续实验对其进行整体拼接，且引物设计尽量满足基本原则，通过一系列的引物筛选试验，最终得到了上述6对可用于扩增木虱总科线粒体基因组的通用引物。引物对Psyllid-1的上下游引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，其扩增的片段大小为3498bp；引物对Psyllid-2上下游引物序列如SEQ ID NO.3～4所示，其扩增的片段大小为2358bp；引物对Psyllid-3的上下游序列如SEQID NO.5～6所示，其扩增的片段大小为4855bp；引物对Psyllid-4的上下游序列如SEQ IDNO.7～8所示，其扩增的片段大小为1596bp；引物对Psyllid-5的上下游序列如SEQ ID NO.9～10所示，其扩增的片段大小为1530bp；引物对Psyllid-6的上下游序列如SEQ ID NO.11～12所示，其扩增的片段大小为1319-3287bp。

上述通用引物在获取木虱总科线粒体基因组或在制备用于扩增木虱总科线粒体基因组的试剂盒中的应用也在本发明保护范围内。

一种获取木虱总科线粒体基因组的方法，包括如下步骤：

S1.提取待测木虱的基因组DNA；

S2.以步骤S1的基因组DNA为模板，利用上述的6对通用引物分别进行PCR扩增反应；

S3.对步骤S2的PCR扩增产物测序，然后拼接序列，即得待测木虱的线粒体基因组。

优选地，步骤S2所述PCR扩增反应体系为：1μL浓度大于5ng/μL的DNA模板，0.2μM单个引物，2μL的dNTP混合液，5μL的5X PrimeSTAR GXL Buffer和0.5μL的TaKaRa HS Taq，加ddH₂O至总体积25μL。

优选地，步骤S2所述PCR扩增反应程序为：98℃预热10s；98℃10s，48℃15s，68℃2.5min，35个循环；72℃7min；最后4℃保存。

优选地，所述待测木虱为扁木虱科、个木虱科、木虱科、斑木虱科或盾木虱科中的一种。

优选地，所述待测木虱为柑橘木虱、马铃薯木虱、枸杞木虱、木通红喀木虱、朴树木虱、柚喀木虱、梨木虱、角颊木虱、小叶榕木虱、桉树芽木虱中的一种。

本发明还提供一种用于扩增木虱总科线粒体基因组的试剂盒，所述试剂盒包含上述SEQ ID NO.1～12所示的6对通用引物。

优选地，所述试剂盒还包含PCR扩增反应所需的试剂。

上述的通用引物、任一所述的方法或试剂盒在昆虫系统发育分析及基因组测序中的应用也在本发明保护范围内。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次提供了一种用于扩增木虱总科昆虫线粒体基因组的通用引物，可用于获取木虱总科昆虫整个线粒体基因组信息；本发明的通用引物需要的引物对数少，即可获得完整的木虱总科线粒体基因组信息，且扩增效率高，快捷，操作简便，相比高通量测序，测序价格低，在多个实验室均容易实现，只要有常规PCR仪、电泳仪和一代(Sanger)测序就可实现，且拼接和分析简单，不需要涉及大量复杂的生物信息学软件和高通量序列分析过程，不需要配置较高的工作站和服务器就可完成，在昆虫系统发育分析及基因组测序中具有较大的应用前景。

附图说明

图1为本发明的六对通用引物设计位置图示。

图2为本发明通用引物对木虱总科中已知2个样品和未知的5个待测样品的扩增电泳图。

图3为本发明获得的完整的线粒体基因组图谱，以柚喀木虱Cacopsyllacitrisuga为例。注：J链用顺时针箭头表示，N链用逆时针表示。颜色代表：黄＝编码蛋白基因(PCGs)，蓝＝tRNA基因，深红＝rRNA基因。

图4为验证利用本发明6对引物拼接而成的各木虱线粒体全基因组。注：验证方法为以高通量测序结果映射(Mapping)常规PCR拼接而成的基因组；高通量测序方法为Illumina Hiseq；红色横线代表测序文库中正向Read；绿色横线代表反向序列Read。

图5为本发明在探索通用引物过程中尝试的三对引物的扩增效果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1木虱总科线粒体基因组通用引物设计

(1)线粒体基因组序列

从GenBank下载现有木虱总科的线粒体基因组，参考基因组尽量5个以上编号1-5为已知样品基因组，编号6-10为待测样品(表1)：

表1本研究所用木虱总科样品材料信息

(2)根据上述已知基因组的保守区域设计通用引物，扩增条带之间须有交叉，且引物设计尽量满足基本原则；通过一系列的引物筛选和扩增试验，获得以下表2所示6对通用引物序列；因线粒体基因组位点存在较多变异，即使是同科昆虫不同物种差异也较大，本发明所设计的6对引物所在位置是在仅有的保守区域中能满足引物设计原则和符合实验需求的位置(图1)。

表2本发明用于扩增木虱总科Psylloidea的6对引物

(3)为了验证6对引物的扩增效果，以表1中已知线粒体基因组的柑橘木虱和马铃薯木虱(1-2)作为常规PCR中的正对照，随机选取的木虱总科不同木虱品种为待测样品(3-7)，分别提取DNA、PCR扩增、一代测序(Sanger测序)、序列拼接、基因注释。

PCR扩增反应体系(25μL)(本体系以TAKARA PrimeSTAR GXL DNA polymerase为例，其他DNA聚合酶产品亦可实现)：1μL的DNA模板(浓度大于5ng/μL)，0.2μM单个引物，2μL的dNTP混合液，5μL的5X PrimeSTAR GXL Buffer和0.5μL的TaKaRa HS Taq，最后加ddH₂O至总体积25μL。

PCR扩增反应程序：

98℃预热10s；(98℃10s，48℃15s，68℃2min 30s)35个循环；72℃7min；最后4℃保存。

PCR扩增结果如图2所示，表明上述得到的6对通用引物均可扩增出木虱总科中不同昆虫的线粒体基因组。将获得的测序结果进行拼接，注释可得到木虱的线粒体基因组信息，如图3所示(以柚喀木虱为例)。

(4)利用高通量测序验证

同时对木虱进行高通量测试，通过高通量测序结果验证上述6对通用引物常规PCR拼接而成的线粒体基因组序列的准确性；验证方法为以高通量测序结果映射(Mapping)常规PCR拼接而成的基因组。其结果如图4所示，表明本发明上述6对通用引物可获得完整的木虱总科线粒体基因组信息，扩增效率高，快捷，操作简便。

对比例

在上述通用引物设计过程中，曾经尝试过多对引物，按照基本的引物设计原则得到了例如表3中所示的引物对，并探索实验反应条件，然而发现扩增效果不好，并不能扩增出目前已有的所有木虱样品(如图5)，表明并非只要按照常规的引物设计原则就可以得到本发明上述6对通用引物，是需要发明人付出创造性探索的。

表3三对探索方法过程中的尝试引物

序列表

<110> 韩山师范学院

<120> 一种高效简便获取木虱总科昆虫线粒体基因组的通用引物和方法及其应用

<141> 2019-12-20

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 木虱(Psyllidae)

<400> 1

aagctattgg attcataat 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 木虱(Psyllidae)

<400> 2

tttaagagac cattacttgc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 木虱(Psyllidae)

<400> 3

aaagcaagta atggtctctt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 木虱(Psyllidae)

<400> 4

gagatagtta gcagctttct 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 木虱(Psyllidae)

<400> 5

agagacaaat tattgttaat aatt 24

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 木虱(Psyllidae)

<400> 6

tatcattctg gttgaatatg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 木虱(Psyllidae)

<400> 7

catattcaac cagaatgata 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 木虱(Psyllidae)

<400> 8

ttatgacctc gatgttgaat t 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 木虱(Psyllidae)

<400> 9

ggtctgaact caaatcatgt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 木虱(Psyllidae)

<400> 10

caggattaga taccctgtta 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 木虱(Psyllidae)

<400> 11

aagataaaat accgccaaat 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 木虱(Psyllidae)

<400> 12

attatgaatc caatagctt 19

Claims

1.一套用于获取木虱昆虫线粒体基因组的通用引物，其特征在于，包括6对引物Psyllid-1、Psyllid-2、Psyllid-3、Psyllid-4、Psyllid-5和Psyllid-6，其上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～12所示。

2.权利要求1所述的通用引物在获取木虱线粒体基因组或在制备用于扩增木虱线粒体基因组的试剂盒中的应用；所述木虱为柑橘木虱、马铃薯木虱、柚喀木虱、梨木虱、角颊木虱、小叶榕木虱、桉树芽木虱中的一种。

3.一种获取木虱昆虫线粒体基因组的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取待测木虱的基因组DNA；

S2.以步骤S1的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的通用引物分别进行PCR扩增反应；

S3.对步骤S2的PCR扩增产物进行测序，然后拼接序列，即可获得待测木虱的线粒体基因组；

所述待测木虱为柑橘木虱、马铃薯木虱、柚喀木虱、梨木虱、角颊木虱、小叶榕木虱、桉树芽木虱中的一种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2所述PCR扩增反应的体系为：1 μL浓度大于5 ng/μL的DNA模板，0.2 μM每种引物，2 μL的dNTP混合液，5 μL的5X PrimeSTAR GXLBuffer和0.5 μL的TaKaRa HS Taq，加ddH₂O至总体积25 μL。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2所述PCR扩增反应的程序为：98℃预热10 s；98℃ 10 s，48℃ 15 s，68℃ 2.5min，35个循环；72℃ 7 min；最后4℃保存。

6.一种用于扩增木虱线粒体基因组的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1的通用引物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包含PCR扩增反应所需的试剂。

8.权利要求1所述的通用引物、权利要求3～5任一所述的方法或权利要求6或7所述的试剂盒在昆虫系统发育分析及基因组测序中的应用。