CN112725468B

CN112725468B - 肉鸡腹脂率分子标记APOB c.246及检测方法

Info

Publication number: CN112725468B
Application number: CN202110238109.9A
Authority: CN
Inventors: 罗庆斌; 季从亮; 聂庆华; 张德祥; 罗文�; 张细权; 李红梅; 李恒丰; 张燕
Original assignee: Guangdong Wens Southern Poultry Breeding Co ltd; South China Agricultural University
Current assignee: Guangdong Wens Southern Poultry Breeding Co ltd; South China Agricultural University
Priority date: 2021-03-04
Filing date: 2021-03-04
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2041-03-04
Also published as: CN112725468A

Abstract

本发明公开了肉鸡腹脂率分子标记APOB c.246及检测方法，涉及家禽遗传育种技术领域。本发明提供了一种与肉鸡腹脂率相关的SNP，其序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了检测所述SNP的特异性引物组和具体的检测方法，能够高效灵敏快捷的检测所述SNP序列，以筛选鉴定低腹脂率肉鸡品种。本发明的实施能够有效筛选低腹脂率肉鸡，为肉鸡的遗传育种提供了新的技术方案，适合在肉鸡养殖产业上大规模推广应用。

Description

肉鸡腹脂率分子标记APOB c.246及检测方法

技术领域

本发明涉及家禽遗传育种技术领域，具体而言，涉及肉鸡腹脂率分子标记APOBc.246及检测方法。

背景技术

鸡肉独特风味的来源主要是肌内脂肪和皮下脂肪。一方面，肉品质指标中嫩度、多汁性源于肌内脂肪对肌肉纤维的溶解；另一方面，鸡肌内脂肪、皮下脂肪的脂质降解过程中，含量丰富的磷脂产生的香味，是组成鸡肉风味的重要部分，同时，肌肉中的不饱和脂肪酸在加热时发生氧化反应，氧化产物进一步分解为烯醛等挥发性物质，是鸡肉香味的重要组成成分。而我国多种著名的地方品种鸡，如北京油鸡、清远麻鸡、彭县黄鸡等具有的独特风味均来源于因一定程度的皮下脂肪和肌内脂肪沉积。但受限于鸡体内脂肪沉积规律，想达到一定程度的肌内脂肪的沉积往往难以避免大量的腹脂沉积，从而导致饲料报酬的下降，影响肉鸡生产的效益，如何解决肉鸡的过度脂肪沉积是肉鸡遗传育种中育种工作者相当重视的一个问题，也是提高黄羽肉鸡生产率的一个重要途径。

分子标记辅助选择(MAS)是一种常用的分子育种技术。MAS可以直接根据遗传物质的多态性进行相应的分析，如单核苷酸多态性(SNP)。分子标记辅助选择技术在其他家畜的育种中已有相当长的历史，与传统育种方法相比，MAS具有存在范围广、遗传稳定、直观准确等优点，目前并未大规模的应用于鸡的育种中。其原因一方面是对于鸡的经济性状的分子标记研究和挖掘较少，可应用于实际育种中选择重要经济性状的分子标记不足；另一方面是分子标记的检测往往成本较高，在世代间隔短，育种群体大的鸡育种中应用分子标记辅助选择技术的成本较常规育种方法更高。但随着更多低成本检测技术的发展以及分子标记的开发，分子标记辅助选择技术在鸡的育种中的应用成本显著降低，因此，进一步挖掘分子水平上与鸡重要经济性状相关的候选基因，通过对其多态性的研究并建立相关分子遗传标记，可以有效推动优质鸡的育种工作。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供肉鸡腹脂率分子标记APOB c.246及检测方法。根据APOB基因的已知序列，利用直接测序，寻找与黄羽肉鸡腹脂率关联的SNP位点，并通过飞行时间质谱分析对SNP分型结果与群体性状进行关联分析，从而获得与黄羽肉鸡腹脂率关联的分子标记，为鸡的标记辅助选择提供新的分子标记资源。

为实现上述目的，提供了如下方案：

第一方面，提供了一种与肉鸡腹脂率相关的分子标记APOB c.246C>T，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述序列的第99位碱基处是C或T(即碱基C与碱基T发生替换)。

第二方面，提供了检测分子标记APOB c.246C>T的引物组，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示。

第三方面，提供了所述分子标记或检测所述分子标记的试剂在筛选低腹脂率肉鸡中的应用。

在一些实施方案中，检测所述分子标记的试剂中包括检测所述分子标记的特异性引物组。

在一些实施方案中，检测所述分子标记的特异性引物组为本发明所述的引物组。

第四方面，提供了一种利用分子标记APOB c.246C>T筛选低腹脂率肉鸡的方法，包括以下步骤：

(a)提取待检测鸡的DNA；

(b)目的片段的获得及测序：利用能够扩增所述分子标记序列的引物组对通过PCR扩增待检测鸡的DNA，将获得的产物进行测序，分析序列碱基；

(c)根据分析结果，育种时选择保留低腹脂率的个体。

在一些实施方案中，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示，育种时保留TT基因型的个体。

在一些实施方案中，步骤(b)中所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性25s，57.6℃退火25s，72℃延伸10s，32个循环；72℃延伸5min。

在一些实施方案中，步骤(b)中所述PCR扩增的反应体系包括：DNA模板100ng，2XM5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 15μl，上下游引物各0.4μl，ddH₂O补足至30μl。

本发明公开了以下技术效果：

本发明所选择的SNP位点是独特的，具有很高的广义遗传力，能比较准确的筛选出低腹脂率肉鸡。本发明筛选方法操作简便，速度快、成本低、准确度高。本发明的实施能够有效筛选低腹脂率肉鸡，为肉鸡的遗传育种提供了新的技术方案，适合在肉鸡养殖产业上大规模推广应用。

附图说明

图1为琼脂糖凝胶电泳结果。其中M为DL2000的Marker(自上而下分别为2000、1000、750、500、250、100bp)；1、2、3、4、5、6为PCR产物；

图2为APOB基因多态位点不同基因型。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1SNP位点筛选

1、实验对象

以腹脂率为选择标准，在五个品种中选择高腹脂率组(记为H组)和低腹脂率组(记为L组)两尾样，选择的品种以及每个品种中两尾样数量如下：广西灵山鸡12只、矮脚黄鸡12只、江丰麻黄鸡12只、智诚杏花鸡10只、隐性白羽洛克鸡10只。

各个品种两尾样腹脂率等性状测定数据统计如表1所示。在广西灵山鸡的两尾样中，H组和L组活重无显著差异(P>0.05)，H组的平均腹脂重(173.25g)高于L组平均腹脂重(37.58g)约4.61倍，H组平均腹脂率(9.31％)高于L组平均腹脂率(2.63％)约3.54倍。

表1用于筛选SNP位点的两尾样信息

2、候选基因的选择

根据前期研究选择与慢速型黄羽肉鸡脂肪沉积相关的候选基因APOB。

3、基因组DNA的提取

使用血液DNA提取试剂盒提取鸡基因组DNA，根据血液DNA提取说明书操作，提取血液样品的基因组DNA后，检测DNA样本浓度和OD值，将DNA浓度大于25ng/μl、OD₂₆₀/OD₂₈₀之比值在1.7-1.8之间的样品储存于-20℃中备用。

4、候选基因引物

根据NCBI中发表的鸡候选基因组序列，利用NCBI在线引物设计工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)设计引物扩增候选基因片段，从3’端开始扩增大小约1000bp的基因片段，具体引物如表2所示：

表2候选基因PCR扩增引物

5、候选基因片段的PCR扩增及序列分析

PCR反应体系如下：DNA模板100ng，2X M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 15μl，上下游引物各0.4μl，ddH₂O补足至30μl。

PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性25s，57.6℃退火25s，72℃延伸10s，32个循环；72℃延伸5min；12℃保存。

将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据产物大小判定结果：

用含EB的1.5％琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产品进行检测，所述电泳条件为电压100V，时间为20min，在凝胶成像系统中观察条带(约1000bp，如图1所示)，并进行回收和纯化，最后进行测序，分析序列碱基，筛查候选SNP位点(部分测序峰图如图2所示)。

实施例2飞行时间质谱分析

用北京六合华大基因科技有限公司的飞行时间质谱分型技术在500只N409(广西灵山鸡)群体中对通过直接测序得到的候选SNP位点进行基因分型，通过SPSS 21.0软件对SNP分型结果和腹脂相关(腹脂率、腹脂重)的屠宰性状结合进行关联分析，鉴定出与黄羽肉鸡腹脂率显著相关的SNP，如下表3所示。

表3 SNPs信息表

实施例3与腹脂率显著相关SNP基因型之间的差异分析

通过SPSS 21.0软件，对与腹脂率显著相关的SNP位点内不同基因型与腹脂率、腹脂重、皮下脂肪厚等性状的分析结果如表4。

表4与腹脂率显著相关SNP基因型的差异分析

注：基因型后括号内数字表示基因型的样本数；3种基因型间相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)，无字母标注则表示该基因型与其他2种基因型的差异均不显著。

因此，可以通过APOB基因标记辅助选择，在肉鸡育种中选择腹脂率低的肉鸡，推动优质鸡的育种工作。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 华南农业大学

广东温氏南方家禽育种有限公司

<120> 肉鸡腹脂率分子标记APOB c. 246及检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 186

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> mutation

<222> (99)..(99)

<223> y=t或c

<400> 1

tgttacattt aaatacattg cggtacaaac ttattatttc tcgtcttctg catgttcatt 60

caggtcttca tgcgcttctg tatgttttcc acaatctgyt gaaaactcag ctgctcagtg 120

gcaagttgtt catcaatgaa tgcttgcatt tcttcccatt tcctggtgcc ttgttcaacg 180

ccttgc 186

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagtaagccc tatggcccaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcattgcgg gaggaatact 20

Claims

1.一种利用与肉鸡腹脂率相关的分子标记筛选低腹脂率肉鸡的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)提取待检测鸡的DNA；

(b)目的片段的获得及测序：利用能够扩增所述分子标记序列的引物组通过PCR扩增待检测鸡的DNA，将获得的产物进行测序，分析序列碱基；

(c)根据分析结果，育种时选择保留低腹脂率的个体；

所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中该序列的第99位碱基为SNP位点，其碱基为C/T；

所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:2-3所示，育种时保留TT基因型的个体；

所述待检测鸡为广西灵山鸡。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性25s，57.6℃退火25s，72℃延伸10s，32个循环；72℃延伸5min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中所述PCR扩增的反应体系包括：DNA模板100ng，2× M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 15μl，上下游引物各0.4μl，ddH₂O补足至30μl。

4.检测权利要求1中所述的分子标记的试剂在筛选低腹脂率广西灵山鸡中的应用，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中该序列的第99位碱基为SNP位点，其碱基为C/T；

引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:2-3所示，育种时保留TT基因型的个体。