CN110273008A

CN110273008A - 一种与肉鸡生长发育性状相关的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN110273008A
Application number: CN201910567303.4A
Authority: CN
Inventors: 张细权; 胡博文; 李红梅; 张德祥; 聂庆华; 罗庆斌; 罗文�; 胡霜; 杨敏敏; 廖志赢
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-06-27
Filing date: 2019-06-27
Publication date: 2019-09-24
Anticipated expiration: 2039-06-27
Also published as: CN110273008B

Abstract

本发明公开了一种与肉鸡生长发育性状相关的分子标记及其应用。所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述分子标记的突变位于其外显子1c.409G>A(p.Ala137Thr)处。本发明发现由于TWNK基因突变引起的线粒体DNA耗竭，导致肉鸡生长进一步受阻，影响肉鸡的生产性状。因此，所述分子标记可应用于剔除“僵鸡”，包括如下步骤：S1.提取待检测鸡的DNA；S2.目的片段的获得及测序：利用正反向引物对通过PCR扩增待测鸡的DNA，将获得的产物进行测序，分析序列碱基；S3.根据分析结果，育种时选择保留判定为GG基因型的个体。该分子标记有利于选育优势纯合基因型肉鸡，提高肉鸡的生产性能。

Description

一种与肉鸡生长发育性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及家禽遗传育种技术领域，具体地，涉及一种与肉鸡生长发育性状相关的分子标记及其应用。

背景技术

我国具有丰富的优质肉鸡资源，生长是畜禽生产中非常重要的经济性状，然而即使是同一品种的肉鸡，在不同个体间的生长发育情况也有着明显的差异。因此肉鸡的生长发育性状一直是家禽育种的重点研究对象，研究生长发育性状对肉鸡的生长和育种具有重要意义。

随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，能够从分子水平上快速准确地分析畜禽的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，将分子标记辅助育种技术应用于优质肉鸡的选育，有利于提高选种效率。

近年来发现，在肉鸡养殖过程中，鸡群中会出现一类生长受阻和发育障碍综合症(Runting and Stunting Syndrome，RSS)鸡，俗称“僵鸡”。主要特征为：病鸡食欲减退、精神不振、两腿软弱无力，步态摇晃，或跛行，嘴和脚色素褪色而苍白，成活率低，11日龄时死亡达到高峰。在临诊上主要表现为：生长停滞，发育受阻，个体矮小瘦弱。RSS主要危害肉鸡并在某些地区持续、周期性地发生，其严重程度和频率在养鸡场之间也不一致，给生产造成巨大的损失和浪费。同时，在生产上发现SLD鸡中特别容易出现“RSS鸡”，比例高达5％～20％左右。过去有一些研究表明RSS鸡的形成可能与遗传、环境、营养和管理等因素有关。但由于RSS鸡的病因尚不明确，目前还没有有效的方法可用于控制这种疾病。因此，研究RSS鸡的病因对肉鸡的选育和生产养殖有着重要意义。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种与肉鸡生长发育性状相关的分子标记。本发明发现TWNK基因突变引起的线粒体DNA耗竭，导致肉鸡生长进一步受阻，影响肉鸡的生产性状。因此，该分子标记有利于选育优势纯合基因型肉鸡，剔除“僵鸡”，提高肉鸡的生产性能。

本发明的另一目的在于提供上述分子标记在剔除“僵鸡”中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述分子标记剔除“僵鸡”的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种与肉鸡生长发育性状相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示，所述分子标记的突变位于其外显子1c.409G>A(p.Ala137Thr)处。

本发明人前期对SLD鸡中出现的RSS鸡样本进行观察及解剖，并通过组织病理切片分析和设计针对某些病毒的PCR引物鉴定，发现RSS鸡未受到细菌和病毒感染。随后采用“僵鸡”VS正常鸡肝脏芯片表达谱分析，发现差异表达的基因主要富集在一些代谢通路和氧化磷酸化(oxidative phosphorylation OXPHOS)途径，而人类医学研究中通常把引起OXPHOS缺陷的疾病定义为线粒体疾病。对“僵鸡”肝脏电镜切片研究发现，其线粒体结构发生损伤，数量减少。经进一步对线粒体功能进行检测发现，OXPHOS复合物的酶活性降低，同时存在mtDNA耗竭现象。经进一步对mtDNA耗竭相关基因筛查发现，与线粒体DNA合成有关的常染色体隐性遗传的TWNK基因发生突变，突变位于其外显子1c.409G>A(p.Ala137Thr)处。由于线粒体产能需要足量的mtDNA来合成OXPHOS复合物的亚基，因此mtDNA耗竭所引发的器官功能障碍是由于OXPHOS复合物亚基合成不足导致相关复合物活性下降，最终造成ATP合成不足而引发生长受阻的。

因此，本发明还请求保护上述分子标记在剔除“僵鸡”中的应用。

本发明还请求保护一种利用上述分子标记剔除“僵鸡”的方法，包括如下步骤：

S1.提取待检测鸡的DNA；

S2.目的片段的获得及测序：利用正反向引物对通过PCR扩增待测鸡的DNA，将获得的产物进行测序，分析序列碱基；

S3.根据分析结果，育种时选择保留判定为GG基因型的个体。

优选地，步骤S2中所述正反向引物对的序列如下所示：正向引物5’到3’为SEQ IDNO:2，反向引物5’到3’为SEQ ID NO:3。

优选地，步骤S2中所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。

优选地，步骤S2中所述PCR扩增的反应体系包括DNA模板1μL、正反向引物各1μL、2×T5Super PCR Mix 25μL和ddH₂O 22μL。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明发现TWNK基因突变引起的线粒体DNA耗竭，导致肉鸡生长进一步受阻，影响肉鸡的生产性状。因此，本发明所提供的分子标记有利于选育优势纯合基因型肉鸡，剔除“僵鸡”，提高肉鸡的生产性能。

附图说明

图1为琼脂糖凝胶电泳结果。

图2为TWNK基因多态位点不同基因型。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

试验材料：矮小型品系N301母鸡184只。

实施例1

一种利用与肉鸡生长发育性状相关的分子标记剔除“僵鸡”的方法，包括如下步骤：

1、鸡血样的采集和DNA的提取：

被检测鸡群的生长性状测定完成后，采用一次性注射器从鸡翅下静脉中抽取约1mL血液，注入经高压灭菌并装有约200μL 2％无菌EDTA(Ethylene diamine tetraaceticacid，EDTA)抗凝剂的1.5mL离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-80℃保存备用。

基因组DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法：

(1)取全血30μL置于1.5mL离心管，分别加入470μL 1×SET缓冲液、12.5μL 20％SDS和6μL10mg/mL蛋白酶K，混合均匀后放于55℃水浴过夜；

(2)取出样本于1.5mL离心管，加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，于10,000rpm离心10min；

(3)取上清，再次加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，于10,000rpm离心10min；

(4)取上清，加入500μL氯仿-异戊醇(23:1)轻摇2 0min，于10,000rpm离心10min；

(5)取上清，加入1mL冰无水乙醇(-20℃)，来回摇摆以沉淀DNA，于10,000rpm离心10min后倒出乙醇；

(6)用1mL 75％乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱内烘干；

(7)待DNA完全干燥后加入300μL灭菌后的双蒸水溶解，50℃水浴锅中过夜以溶解DNA；

(8)存放于-20℃冰箱中保存备用。

2、鸡TWNK基因目的片段的获得：

根据已报道的鸡TWNK基因序列(Gene ID:425626)，利用生物学引物设计软件Primer5.0设计引物，经Oligo软件检测，确定引物序列，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；采用上述引物对待测样品进行PCR扩增(扩增长度为562bp)，PCR反应混合体系如表1所示。

正向引物F(SEQ ID NO:2)：5’-GTGTCCGTCACCGAGATCC-3’；

反向引物R(SEQ ID NO:3)：5’-GCAACGTCTCCTCCGTGTAG-3’。

表1PCR反应混合体系

混合样	用量(μL)
		DNA模板	1
F	1
		R	1
2×T5Super PCR Mix	25
		ddH<sub>2</sub>O	22
Total volume	50

PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min；-20℃保存。

3、将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据产物大小判定结果：

用含EB的1.5％琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产品进行检测，所述电泳条件为电压100V，时间为20min，在凝胶成像系统中观察条带(562bp，如图1所示)，并进行回收和纯化，最后进行测序，分析序列碱基。发现存在c.409G>A(p.Ala137Thr)错义突变(如图2所示)。

实施例2

本发明对TWNK基因多态位点不同基因型与鸡生长发育性状进行了关联分析的检测应用。

结果如表2所示，由表2中可以得出2种基因型对鸡的日增重(p<0.05)、屠体重(p<0.01)、腿肌重(p<0.01)、胸肌重(p<0.05)和腹脂重(p<0.05)达到显著或极显著水平。GG基因型个体生长发育性状显著高于AA型个体，为优势基因型。

表2.TWNK c.409G>A不同基因型与生长发育性状的关联分析

因此，可以通过TWNK基因标记辅助选择，在肉鸡育种中剔除杂合型的鸡，避免“僵鸡”的产生，解决生产中肉鸡中不断出现僵鸡的问题。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种与肉鸡生长发育性状相关的分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2010

<212> DNA

<213> 肉鸡(chicken)

<400> 1

atggcggcgg tgccgctgcg gccctgcagg gcctccgggc ggttcctgcc gctgctgcgc 60

ggcggggcgc ggagccgcgg ggcctccccg tgggcggcgg ggccgggccg ggtggcgcag 120

cggcggtaca agaaggacgt gctgcccgag cccggcggcg ccgcgcccgc cgtgtccgtc 180

accgagatcc ggcggtacct ccgcgctcag ggcatcccgt tccaggacgg ctacagctgc 240

ctgcacgccc ccagcctgtt cgggccggag ctgccgcccg ccgccgggcc gcccttcacg 300

ctgttcatcg acaagacgac gggcagcttc ctctgcaccg ccacgttagc cgagggcggc 360

tggcaggacc tgcaggctgc cgtggagctg cggcaccgcg gggtcccggc gcccggccct 420

gacgagggag agcgcgagga ggaggaggag gcggaggcga ggagggcgcg cgaggatgcg 480

cggcgcatct gggagcgggc gctgccgctg ggagagctgc tggacgagga ggagacgcga 540

gccaccaagg cggccttcgg catcgccccg ctggccgacg gcacgctgaa gcgcttcggg 600

gtgcgctacc tgcgggcggc caaggccctg gtgttccctt ggttcgcccc acgcgatgcg 660

gcgctgcggg gcctgaagct gctggtggcg gagcagcgag gcgatgccgt gagctacacg 720

gaggagacgt tgccccgctt cgacgcctac cgcaacctct tcgggctgcc gctgatcggc 780

cgccgcgacg ccgaggtggt gctgaccggg agcgagctgg atgccctggc cctgcaccag 840

gccaccggtg tgccctgcct ggcgctgccg cgtggggcca ccatcctgcc gcctgccctg 900

ctgccctacc tggagcagtt caggcgcgtc acgctgtggc tgggcgacga cctgcgctcc 960

tgggaggcct ccaagctctt cgcccgcaag ctgaacccca agcgctgctc gctggtgcag 1020

cctggagacc tccagccgcg gcctttggag gcgttgaacc gggggctgaa cctcaccaag 1080

atcctgcgtg ccgccctgcc tgccggacac aaagccatcg tctccttccg acagctgcgt 1140

gaggaggtgt ttggggagct ggccaacagc gagcaggtgg ccggcgtcaa gtgggcgcgc 1200

ttccctgagc tcaacaagct gctcaagggg caccgccggg gcgagctcac cgtcttcacc 1260

ggtccgacag gcagcggaaa gacaacgttc attagcgagt atgcactgga cctgtgcaca 1320

caaggggtgt gcacgctgtg gggcagcttt gagatcaaca acatccggct ggccaagatc 1380

atgctgaccc agtttgccac ccggcgcctg gaggaccagc tggagctgta tgacgagtgg 1440

gccgaccgct tcgaggacct gccgctctac ttcatgacct tccatggcca acagaacatc 1500

aagacggtgc ttgacaccat gcagcacgcc gtctacatgt acgacatcac ccacgtggtg 1560

gtggacaacc tgcagttcat gatgggccac gagcagctct ctgcagacag gttggcagca 1620

caggatttca tcgtcggagc cttccgcaag ttcgccaccg acaacacgtg ccacatcacg 1680

ctggtcatcc acccgcgcaa ggaggacgac gagaaggagc tgcagaccgc ctccatcttc 1740

ggctctgcca aggccagcca ggaggccgac aacgtcctca tcctgcagga ccgcaagctc 1800

acgacgggtc ccgggaagcg ctacctgcag gtgtccaaga accgcttcga tggcgatgta 1860

ggcgtcttcc cactggagtt cagcaaggcc tcgctcacct tctcctccta cggcaaaagc 1920

aaagccaaac tgaagaaggt gaaggaggag aagggacctt cgcccaagaa gggtcccagt 1980

ggaggtgtgg gtggttccag caagccctga 2010

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 2

gtgtccgtca ccgagatcc 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 3

gcaacgtctc ctccgtgtag 20

Claims

1.一种与肉鸡生长发育性状相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述分子标记的突变位于其外显子1c.409G>A(p.Ala137Thr)处。

2.权利要求1所述分子标记在剔除“僵鸡”中的应用。

3.一种利用权利要求1所述分子标记剔除“僵鸡”的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取待检测鸡的DNA；

S3.根据分析结果，育种时选择保留判定为GG基因型的个体。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S2中所述正反向引物对的序列如下所示：正向引物5’到3’为SEQ ID NO:2，反向引物5’到3’为SEQ ID NO:3。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S2中所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。

6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S2中所述PCR扩增的反应体系包括DNA模板1μL、正反向引物各1μL、2×T5Super PCR Mix25μL和ddH₂O22μL。