CN114470209A - Trim2在防治猪流行性腹泻病毒感染中的应用 - Google Patents

Trim2在防治猪流行性腹泻病毒感染中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114470209A
CN114470209A CN202210075326.5A CN202210075326A CN114470209A CN 114470209 A CN114470209 A CN 114470209A CN 202210075326 A CN202210075326 A CN 202210075326A CN 114470209 A CN114470209 A CN 114470209A
Authority
CN
China
Prior art keywords
trim2
gene
epidemic diarrhea
porcine epidemic
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210075326.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114470209B (zh
Inventor
王洁茹
谢胜松
赵书红
杨钰青
王重龙
潘孝成
戴银
刘海龙
李新云
沈学怀
尹磊
殷冬冬
赵瑞宏
周学利
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University, Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Anhui Academy of Agricultural Sciences filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN202210075326.5A priority Critical patent/CN114470209B/zh
Publication of CN114470209A publication Critical patent/CN114470209A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114470209B publication Critical patent/CN114470209B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明提供了一种三结构域蛋白2(TRIM2)的应用，特异性靶向敲除该基因，以抑制其蛋白表达，可抑制猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)侵染宿主细胞，从而防止PEDV感染所引发的猪流行性腹泻病。因此，TRIM2可作为制备防治猪流行性腹泻病的药物或制造抗猪流行性腹泻病的基因编辑动物潜在靶标分子，具有重要的经济价值。

Description

TRIM2在防治猪流行性腹泻病毒感染中的应用
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及TRIM2基因作为靶分子在猪流行性腹泻病防治中的应用。
背景技术
猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性、高度传染性猪肠道疾病。主要特征为引起感染猪呕吐、水样腹泻及严重脱水。各年龄及品种的猪均易感，尤新生仔猪受害最为严重，病死率可高达80-100％，临床上与TGEV、PCV-2等病毒混合感染严重。
目前猪流行性腹泻缺乏高效防控手段的根本原因在于PEDV致病机制不清楚，缺乏关键有效的基因靶点。因此，寻找新的治疗靶点对宿主靶向抗病毒药物开发尤为重要。
而TRIM蛋白家族在不同的生物学过程中发挥着重要的作用，可以协调靶蛋白的泛素化以组装信号复合物、介导蛋白水解降解、改变亚细胞定位或调节宿主的转录本或蛋白质组成、抗病毒。其中N端E3泛素连接酶和C末端球状折叠结构B-Box区是TRIM抗病毒活性的关键区域。TRIM2属于细胞质丝状 TRIMs亚组，其丝状结构可能参与病毒颗粒的货物运输。Sarute团队首次报道 TRIM2能够抑制沙粒病毒的进入，表明TRIM2能够参与对病毒复制至关重要的细胞途径。然而TRIM2作为抗病毒新成员与猪流行性腹泻抗病性间的关系尚未见报道。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明目的在于提供TRIM2在猪流行性腹泻的预防和治疗中的应用，用于解决上述技术问题。
本发明目的之一在于：TRIM2基因作为靶分子，在制备预防或治疗猪流行性腹泻病的药物中的应用。
优选地，通过靶向编辑抑制TRIM2基因表达。
优选地，抑制TRIM2基因表达的物质包括：针对TRIM2实施的基因靶向敲除的sgRNA或其表达载体、小分子抑制剂、用于RNA干扰的dsRNA、反义寡核苷酸中任一种。
优选地，所述sgRNA序列为：5’-ATCCTAGACCACTGACATGG-3’。
本发明目的之二在于：一种用于预防或治疗猪流行性腹泻病药物的药盒，包含靶向敲除TRIM2基因的sgRNA或其表达载体，CRISPR/Cas9质粒，该药盒可用于制备防治猪流行性腹泻病的药物。
本发明目的之三在于：一种TRIM2基因的抑制剂，包括：上述靶向TRIM2 基因的sgRNA或其表达载体，CRISPR/Cas9质粒。
本发明目的之四在于：上述药盒和/或上述抑制剂在制备防治猪流行性腹泻病的药物中的应用。
本发明目的之五在于：TRIM2基因作为靶点在制备抗流行性腹泻病毒感染的基因编辑细胞或动物模型中的应用。
本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术采用上述sgRNA敲除TRIM2基因，从而抑制TRIM2基因转录或蛋白表达，进而可以抑制猪流行性腹泻病毒感染及复制能力。
本发明首先通过构建的绿猴全基因组CRISPR/Cas9敲除文库筛选猪流行性腹泻病毒复制必需宿主因子，筛选到在不同PEDV感染条件下，针对TRIM2 基因的不同sgRNA测序总读数排序位列第1。
进一步的，提供了在绿猴肾细胞(Vero)中TRIM2的表达水平和猪流行性腹泻病毒感染具有相关性。根据本发明的实施例，在感染猪流行性腹泻病毒后 Vero细胞中TRIM2基因的表达水平显著提高，且随着感染时间延长而升高。
进一步的，本发明发现TRIM2与猪流行性腹泻病毒复制具有相关性。根据本发明的实验，当敲除Vero细胞的TRIM2基因时，可以降低猪流行性腹泻病毒的感染率。
在本发明中，所述猪流行性腹泻病毒具体为JS-A毒株(NCBI ID： MH748550)。
本发明的有益效果在于：本发明证实了TRIM2与猪流行性腹泻病毒侵染及增殖具有明显的相关性，即猪流行性腹泻病毒感染后可以上调绿猴肾细胞中 TRIM2蛋白的表达水平从而有利于病毒的胞内增殖和进一步感染。当抑制 TRIM2蛋白的表达时可以有效降低猪流行性腹泻病毒的感染和胞内复制能力。本发明证实了TRIM2可以作为一种有效防治猪流行性腹泻的重要靶点。
附图说明
图1为实施例1中构建的绿猴全基因组CRISPR/Cas9敲除质粒文库的丰度检测结果图。
图2为实施例1中构建的全基因组细胞突变体文库的丰度检测结果图。
图3为实施例2中利用荧光定量PCR技术检测PEDV感染不同时间点 TRIM2在Vero细胞中的表达水平；其中，β-actin为内参基因。对照组表示未感染PEDV的Vero细胞。
图4为实施例3中利用TA克隆测序的TRIM2敲除细胞株的基因型。其中，WT为野生型细胞，TRIM2-KO为采用CRISPR/Cas9慢病毒策略构建的TRIM2 基因敲除细胞，+1bp代表插入1个碱基，PAM代表protospacer adjacent motif 的缩写。
图5为实施例3中利用Western blot技术检测TRIM2敲除细胞株的蛋白表达水平。其中，β-actin为内参基因，kDa表示千道尔顿。
图6为实施例4中利用EdU细胞增殖实验评估TRIM2基因敲除对细胞增殖的影响；其中，WT为野生型细胞，TRIM2-KO代表TRIM2基因敲除细胞。蓝色荧光为DAPI染色的细胞核，红色荧光为EdU染色阳性细胞。
图7为实施例4中提供的PEDV感染TRIM2基因敲除细胞24h细胞存活状态成像结果图。
图8为实施例5中利用绝对荧光定量PCR技术检测PEDV(MOI＝0.01)感染24小时后TRIM2基因敲除细胞中病毒量的变化。
图9为实施例5中利用免疫荧光实验检测PEDV在病毒感染复数(MOI) 为0.01的感染条件下，24小时后TRIM2敲除细胞中N蛋白的表达变化；其中， hpi为病毒感染时间。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1：利用全基因组CRISPR/Cas9敲除文库筛选PEDV复制必需宿主因子
1.1构建Vero细胞全基因组CRISPR/Cas9敲除细胞库
收集来自NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Ensemble(www.ensembl.org)数据库绿猴的全基因组注释信息，利用sgRNAcas9软件设计基于Vero细胞株的CRISPR/Cas9敲除文库(VeroCKO，Vero Genome-scale CRISPR Knock-Outlibrary)。文库包含75608个gRNAs，其中一个基因设计4 条sgRNA，并设计1000条阴性对照sgRNA；送公司合成寡核酸探针混池。
通过PCR扩增和Gibson assembly连接VeroCKO文库到 lenti-u6-sgRNA-EGFP载体上，随后二代高通量测序计算文库在全基因组覆盖度达到99.34％，靶向基因75109条(如图1所示)。
进一步将质粒文库经慢病毒包装感染Vero-Cas9细胞，构建全基因组敲除突变体细胞库，二代高通量测序鉴定慢病毒敲除载体库丰度，与设计相比， sgRNA覆盖率达到83.69％，靶向基因63699条，成功构建了VeroCKO突变体细胞库(如图2所示)。
1.2CRISPR/Cas9敲除文库筛选和鉴定参与猪流行性腹泻病毒复制所需的宿主因子
sgRNA慢病毒文库感染Vero-Cas9细胞7d后，通过PEDV-JS-A (MOI＝0.00001)感染3d后，同时设置对照组，当对照组细胞全部死亡时，敲除细胞库组有少量的细胞存活。收集敲除细胞库组存活的细胞团继续培养11d 后，待细胞生长出现克隆状细胞团，且均表达GFP荧光，完成第一轮筛选。
随后以MOI为0.0001的PEDV-JS-A再次感染第一轮筛选的存活细胞，对存活细胞设计特定引物，通过PCR扩增回收目的基因片段进行高通量测序，获得抗PEDV关键宿主基因数据。结果发现在不同PEDV感染条件下，针对TRIM2 基因的不同sgRNA测序总读数，其排序位列第1。
实施例2：PEDV感染Vero细胞后TRIM2基因高表达
利用相对荧光定量PCR比较PEDV感染野生型细胞(WT)前后， TRIM2mRNA的表达水平变化情况。PEDV以MOI为0.01感染对数期生长的野生型Vero细胞，12、24和36小时后收集细胞提取总RNA检测TRIM2的mRNA 表达量变化，以β-actin为内参基因；其中，
TRIM2引物序列如下：
TRIM2-F：GTATGAACCAGCACCAG；
TRIM2-R GAAGTGTCGAGACAGGGGA。
结果发现PEDV感染后，Vero中TRIM2的mRNA表达水平相比感染前显著上调，且具有时间依赖性(如图3所示)。
实施例3：TRIM2敲除细胞株的基因型和蛋白表达检测
3.1靶向TRIM2基因的特异sgRNA设计与表达载体构建
从Ensemble数据库下载TRIM2基因(登录号：ENSCSAG00000003302)。利用sgRNAcas9软件设计sgRNA，再根据特异性评估结果，选择靶向TRIM2 基因外显子的sgRNA，挑选的sgRNA的序列为：
TRIM2-sgRNA：5’-ATCCTAGACCACTGACATGG-3’。
其中，识别靶点的PAM序列为“GGG”(如图4所示)。构建sgRNA慢病毒载体，引物对如下：
TRIM2-sgr-F：5’-CACCGATCCTAGACCACTGACATGG-3’；
TRIM2-sgr-R：5’-AAACCCATGTCAGTGGTCTAGGATC-3’。
将合成的寡核苷酸引物稀释并变性与退火，与通过Bsmb1(NEB)酶切且纯化回收的线性化lenticrispr v2载体连接，反应体系和条件为：引物对各5μL，退火反应：95℃，10min；65℃，30min；冷却至4℃。
与BbsI酶切线性化的lenticrispr v2载体连接，其反应体系为：1μL引物对， 50ng线性化载体，5μL ligation Mix，加ddH2O补齐至10μL。16℃连接1.5h。
产物转化DH5a大肠杆菌中，37℃过夜培养。挑取单克隆并扩大培养进行菌液PCR检测，将检测结果为阳性的菌液后送公司进行测序，使用去内毒素试剂盒提取质粒，将构建成功的sgRNA慢病毒表达载体命名为“lenticrispr-TRIM2-KO”。
3.2构建与鉴定TRIM2基因敲除细胞株
利用三质粒系统包装靶向TRIM2基因的sgRNA慢病毒。目标质粒为 lenticrispr-TRIM2-KO，辅助系统质粒为psPAX2和pMD2.G，三者的比例为 pMD2.G：psPAX2：目的质粒＝1：2：3。
所有质粒均采用OMEGA公司的无内毒素质粒小提中量试剂盒(Endo-free PlasmidDNAMini Kit II，货号#D6950-01)进行提取。慢病毒包装采用的细胞转染试剂为jePRIME，细胞株为HEK293T细胞。
随后，复苏Vero细胞株，sgRNA慢病毒感染48h后，挑选和富集阳性表达细胞，并挑取一定数量的单克隆细胞进行扩大培养。
随后检测基因和蛋白表达水平，利用软件设计sgRNA靶向基因组区域，引物对如下：
TRIM2-PCR-F：5’-TGCTTTGAAACCCAGCGAAC-3’；
TRIM2-PCR-R：5’-GGAGGTCAGCCTGTGAAACT-3’。
利用TA克隆检测TRIM2基因缺失情况，参考天根DNA提取试剂盒的方法(KG203)提取单克隆细胞的DNA，进行PCR反应，体系如下：5μL 10×Buffer； dNTPs；1μL10μmol/LTRIM2-PCR-F；1μL 10μmol/L TRIM2-PCR-R；0.5U LaTaq 酶；～200ngDNA模板；补加H2O至50μL。反应条件为：95℃，5min；(95℃， 30s；60℃，30s；72℃，45s)，进行35个循环，72℃，5min；15℃，2min。
反应完成后，利用DNA产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，然后连接进pMD19-TVector载体中，转化DH5a大肠杆菌，涂氨苄抗性的平皿，37℃过夜培养后，挑取5～10个单克隆细菌扩大培养和送公司测序。
结果：测序数据与野生型(WT)的对照组比对，发现第3号菌液“TRIM2-KO”中，对应的基因编辑细胞株TRIM2基因存在1个碱基插入(如图4所示)，表明该基因缺失。
接着，利用Western blot技术，对基因编辑细胞中TRIM2基因蛋白的表达水平进行检测。提取细胞总蛋白，分别利用TRIM2抗体和β-actin内参抗体对细胞TRIM2蛋白含量进行检测。
结果：由图5可见，与对照组细胞(WT)比较，发现TRIM2-KO的基因编辑细胞株中，TRIM2的蛋白完全不表达，表明成功构建了TRIM2敲除细胞株。
实施例4：敲除TRIM2细胞正常生长且能抑制PEDV感染引起的宿主细胞病变
首先检测TRIM2敲除后是否影响Vero细胞的正常生长。在对数生长期的野生型细胞和TRIM2-KO细胞培养皿中添加50μMEdU，使EdU终浓度为1×，孵育2小时；依次用4％多聚甲醛固定细胞室温孵育15分钟，随后漂洗细胞， 0.3％TritonX-100细胞渗透剂孵育10分钟，再次漂洗细胞后用Click反应液室温避光孵育30分钟，再次漂洗细胞，最后DAPI细胞核避光染色10分钟并在荧光显微镜下观察荧光。结果发现，TRIM2基因敲除细胞增殖情况与对照组细胞无显著差异(如图6所示)。
进一步的，进行TRIM2基因敲除对PEDV诱导的细胞病变效应的抑制性分析试验，采用0.1和0.5MOI的PEDV感染野生型细胞和TRIM2基因敲除细胞， 1h后更换维持培养基继续孵育48h后，通过显微镜观察并拍摄细胞病变。
发现：当野生型细胞形成明显的合包体，细胞死亡并大面积脱落时，敲除 TRIM2基因的Vero细胞未出现合包体大量细胞存活。因此敲除TRIM2基因能够明显抑制PEDV引起的细胞病变(如图7所示)，具有抵抗PEDV感染诱导细胞死亡的能力。
实施例5：敲除TRIM2能抑制PEDV在宿主细胞内的复制
PEDV绝对荧光定量PCR标准质粒为PEDV-186片段基因全长连接 pMD18-T，倍比稀释后荧光PCR扩增，得到Ct值与病毒拷贝数的相互关系，绘制标准曲线。
引物序列如下：
PEDV-186-F：TACTAAGCGTAACATCCTGCC；
PEDV-186-R：GTAGTACCAATAACAACCGAAGC。
收集PEDV感染TRIM2敲除与野生型对照组细胞样本，利用TAKARA试剂盒(货号：9766)提取细胞感染液的病毒RNA，随后采用TAKARA公司的 PrimeScript RT reagent Kitwith gDNA Eraser试剂盒(货号：RR047A)反转录 cDNA进行荧光定量PCR扩增。
结果：对获得的绝对荧光定量PCR数据进行分析，由图8可见，PEDV感染24h后，TRIM2-KO和对照组细胞相比，PEDV-186片段基因mRNA表达水平均显著下降，说明敲除TRIM2基因后影响PEDV在宿主Vero细胞中复制。
通过免疫荧光技术，进一步比较了TRIM2基因敲除和对照组细胞中PEDV 感染后N基因的表达。用预冷的4％多聚甲醛室温静置固定后，漂洗细胞，加入预冷0.3％TritonX-100，室温静置10min后，漂洗细胞，加入封闭液，室温1-2h。漂洗细胞，然后加入PEDV-N抗体(1：100)，4℃静置过夜。漂洗细胞，随后二抗孵育(Anti-mouse IgG的稀释比例为1：1000)，摇床室温孵育1-2h，漂洗细胞，细胞核染色：加入DAPI，室温避光染色10min。弃去DAPI，漂洗细胞，在荧光显微镜下观察荧光。
结果如图9所示，与对照组相比，发现TRIM2基因敲除后，PEDV蛋白编码的N基因无法表达，表明PEDV依赖TRIM2在宿主中复制。
上述步骤中，未详尽描述、未特别指明的技术，均为现有技术中已有的常规技术手段，均可按照常规分子生物学和细胞生物学实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件进行。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.TRIM2基因作为靶分子，在制备预防或治疗猪流行性腹泻病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用通过靶向编辑抑制TRIM2基因表达。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，抑制TRIM2基因表达的物质包括：针对TRIM2实施的基因靶向敲除的sgRNA或其表达载体、小分子抑制剂、用于RNA干扰的dsRNA、反义寡核苷酸中任一种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述sgRNA序列为：5’-ATCCTAGACCACTGACATGG-3’。
5.一种用于预防或治疗猪流行性腹泻病药物的药盒，其特征在于，包含靶向敲除TRIM2基因的sgRNA或其表达载体，CRISPR/Cas9质粒。
6.一种TRIM2基因的抑制剂，其特征在于，包括：如权利要求3或4所述靶向TRIM2基因的sgRNA或其表达载体，CRISPR/Cas9质粒。
7.权利要求5所述药盒和/或权利要求6所述抑制剂在制备防治猪流行性腹泻病的药物中的应用。
8.TRIM2基因作为靶点在制备抗流行性腹泻病毒感染的基因编辑细胞或动物模型中的应用。
CN202210075326.5A 2022-01-22 2022-01-22 Trim2在防治猪流行性腹泻病毒感染中的应用 Active CN114470209B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210075326.5A CN114470209B (zh) 2022-01-22 2022-01-22 Trim2在防治猪流行性腹泻病毒感染中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210075326.5A CN114470209B (zh) 2022-01-22 2022-01-22 Trim2在防治猪流行性腹泻病毒感染中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114470209A true CN114470209A (zh) 2022-05-13
CN114470209B CN114470209B (zh) 2023-08-04

Family

ID=81472715

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210075326.5A Active CN114470209B (zh) 2022-01-22 2022-01-22 Trim2在防治猪流行性腹泻病毒感染中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114470209B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115957349A (zh) * 2022-10-08 2023-04-14 华中农业大学 激活猪的pja1基因表达的制剂在制备猪抗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3064801A1 (en) * 2017-05-25 2018-11-29 The University Of Western Ontario Porcine epidemic diarrhea virus-like particles
CN110200961A (zh) * 2019-07-22 2019-09-06 扬州大学 表没食子儿茶素没食子酸酯在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒制剂中的应用
CN110746501A (zh) * 2019-11-11 2020-02-04 南京农业大学 猪白细胞介素11在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的用途
US20200188508A1 (en) * 2017-04-13 2020-06-18 Novo Biotech Corp. Porcine epidemic diarrhea virus s protein and subunit vaccine thereof as well as method for preparing subunit vaccine and application thereof
CN113621598A (zh) * 2021-09-08 2021-11-09 南京农业大学 钙蛋白酶-1在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200188508A1 (en) * 2017-04-13 2020-06-18 Novo Biotech Corp. Porcine epidemic diarrhea virus s protein and subunit vaccine thereof as well as method for preparing subunit vaccine and application thereof
CA3064801A1 (en) * 2017-05-25 2018-11-29 The University Of Western Ontario Porcine epidemic diarrhea virus-like particles
CN110200961A (zh) * 2019-07-22 2019-09-06 扬州大学 表没食子儿茶素没食子酸酯在制备预防和/或治疗猪流行性腹泻病毒制剂中的应用
CN110746501A (zh) * 2019-11-11 2020-02-04 南京农业大学 猪白细胞介素11在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的用途
CN113621598A (zh) * 2021-09-08 2021-11-09 南京农业大学 钙蛋白酶-1在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WEI Y ET AL: "Characterization of porcine tripartite motif genes as host restriction factors against PRRSV and PEDV infection" *
XUEHUAI SHEN ET AL: "Porcine epidemic diarrhea virus infection blocks cell cycle and induces apoptosis in pig intestinal epithelial cells" *
潘孝成 等: "6 株猪流行性腹泻病毒N 基因的克隆与分析" *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115957349A (zh) * 2022-10-08 2023-04-14 华中农业大学 激活猪的pja1基因表达的制剂在制备猪抗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用
CN115957349B (zh) * 2022-10-08 2024-04-05 华中农业大学 激活猪的pja1基因表达的制剂在制备猪抗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114470209B (zh) 2023-08-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nakahama et al. Mutations in the adenosine deaminase ADAR1 that prevent endogenous Z-RNA binding induce Aicardi-Goutieres-syndrome-like encephalopathy
Sun et al. Transciptomic and histological analysis of hepatopancreas, muscle and gill tissues of oriental river prawn (Macrobrachium nipponense) in response to chronic hypoxia
US9903002B2 (en) Non-coding RNA of Salmonella and identification and use thereof
Yuan et al. Genome analysis of newly emerging goose-origin nephrotic astrovirus in China reveals it belongs to a novel genetically distinct astrovirus
KR20180118984A (ko) 위암의 생물학적 특성에 기반한 군 구분 및 예후 예측 시스템
Wang et al. Tripartite motif 16 ameliorates nonalcoholic steatohepatitis by promoting the degradation of phospho-TAK1
CN106701900B (zh) 长链非编码rna herc2p3基因及其在胃癌中的用途
Bigarré et al. Molecular identification of iridoviruses infecting various sturgeon species in Europe
Meng et al. The transcriptomic response to copper exposure by the gill tissue of Japanese scallops (Mizuhopecten yessoensis) using deep-sequencing technology
Zhang et al. GADD45β, an anti-tumor gene, inhibits avian leukosis virus subgroup J replication in chickens
CN114470209A (zh) Trim2在防治猪流行性腹泻病毒感染中的应用
Rud et al. First genetic characterization of sturgeon mimiviruses in Ukraine
US9909127B2 (en) Inhibitor for inhibiting avian influenza virus and a pharmaceutical composition containing the same
CN113637709B (zh) Kif5b基因作为靶点在抑制口蹄疫病毒复制中的应用
Xiong et al. Time-resolved and multi-tissue RNAseq provides new insights on the immune responses of European eels following infection with Aeromonas hydrophila
Fletcher et al. The genome of the oomycete Peronosclerospora sorghi, a cosmopolitan pathogen of maize and sorghum, is inflated with dispersed pseudogenes
CN111172161B (zh) 一种长非编码rna及其在诊断/治疗子痫前期中的应用
Chen et al. Histone acetyltransferase Gcn5-mediated histone H3 acetylation facilitates cryptococcal morphogenesis and sexual reproduction
Zhang et al. First Identification and Genetic Characterization of a Novel Duck Astrovirus in Ducklings in China
Sun et al. The chromosome-level genome and key genes associated with mud-dwelling behavior and adaptations of hypoxia and noxious environments in loach (Misgurnus anguillicaudatus)
Toh et al. Sequential infection of human norovirus and Salmonella enterica resulted in higher mortality and ACOD1/IRG1 upregulation in zebrafish larvae
CN116440269B (zh) Slc35a1基因作为靶点在防治猪流行性腹泻病中的应用
CN117210393A (zh) 一种用于构建心力衰竭细胞模型的人心肌细胞及其应用
CN115957349B (zh) 激活猪的pja1基因表达的制剂在制备猪抗猪流行性腹泻病毒感染药物中的应用
CN111979328B (zh) 一种预测肝癌肺转移的生物标志物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant