CN117210393A - 一种用于构建心力衰竭细胞模型的人心肌细胞及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于构建心力衰竭细胞模型的人心肌细胞及其应用,属于生物医学技术领域。该用于构建心力衰竭细胞模型的人心肌细胞为人心肌细胞CaMKIIδT287D‑CM,该细胞于2023年8月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号:GDMCC NO:63739。本发明将CaMKIIδ第287位的苏氨酸突变成为天冬氨酸,使CaMKIIδ的蛋白激酶活性持续激活,该人心肌细胞CaMKIIδT287D‑CM能够模拟心衰患者心肌细胞的表型,包括心肌细胞重构、心肌细胞肥厚、心肌细胞的凋亡与坏死、钠/钾离子通道的功能异常以及心率失常等,该突变株可以作为研究心力衰竭的理想的心肌细胞模型。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,更具体的说是涉及一种用于构建心力衰竭细胞模型的人心肌细胞及其应用。
背景技术
心力衰竭(heart failure),简称心衰,是一类复杂的心血管疾病,其基本定义是心脏功能受损,而不能向外周组织和器官提供足够的血液及氧气来满足它们的代谢需求。心衰有两种表现形式:心脏收缩功能不全和心脏舒张功能不全。冠心病、心肌病、心脏瓣膜狭窄、心率失常、肺动脉高压等疾病均能引起收缩功能不全,损坏整个心脏或心脏的某一区域,导致心脏不能正常地收缩;高血压控制不佳则是舒张功能不全最常见的原因。
心衰可见于任何年龄人群(甚至是儿童),常见于老年人。纽约心脏协会将心衰分为四个等级:I级-一般体力活动不会引起过度疲劳、气短,或能够感觉到心跳(心悸);Ⅱ级-一般体力活动会引起疲劳、气短、心悸或胸闷不适(心绞痛);Ⅲ级-休息时较舒适,但一般体力活动会引起疲劳、气短,和心悸或胸闷不适(心绞痛);Ⅳ级-休息时出现症状,任何体力活动后加重。
心衰是发达国家人口死亡的主要原因之一,其确诊后一年的致死率高达20%-30%,患者5年的生存率仅为50%。在美国,约510万的人口正在面临心衰的威胁,而且每年有约55万的新增病例;在中国,《中国心血管健康与疾病报告2020》预计心衰病人达到890万人,且患病率逐年上升。较高的患病率严重影响了病人的生活质量,也耗费了巨大的社会资源,据美国心脏协会预计,到2030年对心衰病人的医疗护理费用将高达700亿美元。近年来,尽管随着医疗技术,特别是针对心衰的药物的发展,心衰病人的总体死亡率已经降低,但是晚期心衰病人的死亡率依然很高。目前对于心衰的治疗策略还是早发现,早干预,早治疗。因此,开发一种人心力衰竭的细胞模型,对于研究心衰发生和发展的分子机制,继而筛选具有能够应用于早期筛查的标志物以及应用于治疗的新型药物尤为重要。
干细胞是一类未充分分化、具有再生各种组织器官的潜在功能的细胞,理论上干细胞能够分化成人体中各种类型的细胞。利用干细胞可以长期自我分化和自我更新的特性,可以将干细胞定向分化为特定的组织或器官(如心肌细胞或心肌组织)。干细胞依照不同的标准能够分为不同的类型,目前在研究中常用的有胚胎干细胞和间充质干细胞。
近年的研究表明,钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin–dependentkinase II,CaMKII)在心脏疾病的病理反应机制中扮演了一个重要角色。CaMKII是一类丝氨酸/苏氨酸激酶,其蛋白二级结构由催化结构域(catalytic domain),调节结构域(regulatory domain)和结合结构域(association domain)构成,一个CaMKII单体通过其结合结构域与其他五个单体结合,形成一个六聚体的环形结构,而两个这样的六聚体叠加组装就形成了具有活性的全酶。CaMKII有α,β,γ和δ四种亚型(isoform),其中CaMKIIδ亚型(由CAMK2D基因编码)是心脏中表达的最主要的CaMKII。在CaMKIIδ的调节结构域中有许多氨基酸可以进行翻译后修饰,包括第280位的丝氨酸(O-糖基化),第281和282位的甲硫氨酸(氧化),以及第287位的苏氨酸(磷酸化),这些位点的修饰对调节CaMKIIδ的功能起到了重要的作用。CaMKIIδ的活性依赖于钙/钙调蛋白激活。被激活前,CaMKIIδ单体的构象处于“自抑制(autoinhibition)”状态,并抑制了催化活性;钙/钙调蛋白的结合使CaMKIIδ单体的构象发生变化并使其磷酸化位点能被相邻CaMKIIδ单体的催化中心磷酸化(这就是所谓的“自磷酸化,autophosphorylation”),这种构象的变化进而改变了自抑制结构对催化中心的抑制作用,最终激活蛋白激酶的活性,直接磷酸化靶蛋白。在心肌肥厚以及心衰的动物模型中,CaMKIIδ的表达以及活性都显著升高,在人的丧失功能的心脏样本中也能观察到类似的结果;同时,在小鼠心脏中过表达CaMKIIδ会造成心肌肥厚或者心衰,而针对CaMKII的选择性抑制剂则能够减缓或遏制心衰表型的形成。这些结果充分说明了CaMKIIδ的活性在心衰的发生发展过程中起到了关键作用。事实上,CaMKIIδ在心衰致病的通路中是一个“承上启下”的节点蛋白:CaMKIIδ能接收上游的病理或外界刺激状态下心肌应激反应信号(钙离子和活性氧浓度升高等)并使之级联扩增,造成下游的细胞凋亡,细胞肥大,电生理功能异常等表型,这些心肌细胞的失能或凋亡导致心衰的最终发生。
发明内容
本发明利用基因组编辑工具,在人源iPSC(hiPSC)中将CaMKIIδ第287位的苏氨酸突变成为天冬氨酸,获得携带纯合突变的CaMKIIδT287D-hiPSC,并使之定向分化成为心肌细胞,获得人心肌细胞CaMKIIδT287D-CM,该细胞于2023年8月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号:GDMCC NO:63739。保藏单位地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明中,将CaMKIIδ第287位的苏氨酸突变成为天冬氨酸,使CaMKIIδ的蛋白激酶活性持续激活,该人心肌细胞CaMKIIδT287D-CM能够模拟心衰患者心肌细胞的表型,包括心肌细胞重构、心肌细胞肥厚、心肌细胞的凋亡与坏死、钠/钾离子通道的功能异常以及心率失常等,该突变株可以作为研究心力衰竭的理想的心肌细胞模型。
该模型与传统模型相比具有以下优势:
1)传统的心衰细胞模型,通常是基于HEK293细胞(人胚胎肾细胞),C2C12细胞(小鼠成肌细胞),或者新生小鼠心肌细胞建立,但这些细胞都不是人源心肌细胞,不能准确反映人的心肌细胞的生理特性,使用这些细胞模型进行药物筛选,很有可能得到失真甚至错误的实验数据,为后续的研发带来损失;我们研发的人源心肌细胞模型则能够准确反映人的心肌细胞的生理指标;
2)目前还没有针对第286位苏氨酸(对应于人CaMKIIδ的第287位苏氨酸)突变的小鼠模型的报道,这是由于该突变导致CaMKIIδ持续激活进而发生胚胎致死效应,因此动物模型不能顺利建立;
3)如果使用模式生物(如小鼠)进行药物筛选,不但成本高昂,费时费力,而且不能进行高通量规模化的测试;本发明使用的细胞模型则能够在高通量自动化检测平台上进行检测,高效快捷且成本较低。
本发明使用由血液细胞诱导而成的诱导多能干细胞(iPSC),相对于胚胎干细胞和间充质干细胞,iPSC有以下优点:①不涉及使用胚胎干细胞的伦理道德问题;②制备时取材简单,血液和尿液中的细胞均可诱导成iPSC;③拥有干细胞的所有特性,且可以大规模扩增培养,冻存后的复苏效率高。
附图说明
图1为实施例1中利用CRISPR/Cas9技术在hiPSC中编辑CAMK2D基因时使用的gRNA的设计示意图。上:在CAMK2D基因11号外显子设计gRNA;下:图中标出的代表突变位点,“*”标注的是引入的同义突变,“_”标注的是目的突变;
图2为实施例1中使用的进行基因编辑的PX458-CAMK2D287质粒图谱;
图3为实施例2中获得单克隆PCR鉴定电泳结果图;
图4为实施例2中获得PCR鉴定正确单克隆细胞基因测序结果。
图5为实施例3中突变细胞株潜在脱靶位点预测以及利用桑格测序验证潜在脱靶位点未发生突变。
图6为实施例3中CaMKIIδT287D-CM和Wildtype-CM的肌节结构及肌节长度统计。
图7为实施例3中的利用western blot验证CaMKIIδT287D-CM中的CaMKIIδ激酶活性。
图8为实施例3中的利用免疫荧光染色和流式细胞术证明CaMKIIδT287D-CM呈现细胞肥大表型。
图9为实施例3中的利用流式细胞术证明CaMKIIδT287D-CM呈现凋亡表型。
图10为实施例3中的CaMKIIδT287D-CM的代谢和增殖表型。
图11为实施例3中的CaMKIIδT287D-CM的衰老表型。
图12为实施例3中的CaMKIIδT287D-CM的自噬表型。
图13为实施例3中的CaMKIIδT287D-CM的钠离子通道功能异常。
图14为实施例3中的CaMKIIδT287D-CM的钙离子通道功能异常。
图15为实施例3中的CaMKIIδT287D-CM对LCZ696的反应。
图16为实施例6中的CaMKIIδT287D-CM在无糖培养液中培养5天后细胞活性显著降低。
具体实施方式
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明,下面将结合附图,对本发明作进一步的说明。
本发明利用基因组编辑工具在hiPSC中将CaMKIIδ第287位的苏氨酸突变成为天冬氨酸,并将该突变hiPSC定向分化成为人源心肌细胞,构建人源心衰细胞模型CaMKIIδT287D-CM。获得的人心肌细胞CaMKIIδT287D-CM于2023年8月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号:GDMCC NO:63739。
本发明提供一种构建人源心衰细胞模型CaMKIIδT287D-CM的方法,并利用该模型进行心衰标志物、抑制心肌细胞凋亡和肥大基因的筛选、以及药物筛选的应用。
本发明的整体思路:
1、构建切割CAMK2D的gRNA、Cas9二合一表达载体,合成包含突变位点的DNA片段。
2、制备CaMKIIδ第287位的苏氨酸突变成为天冬氨酸的CaMKIIδT287D-hiPSC,进而将其分化成为人源心肌细胞CaMKIIδT287D-CM。
3、检测CaMKIIδT287D-CM的表型。
4、利用CaMKIIδT287D-CM进行心衰标志物筛选。
5、利用CaMKIIδT287D-CM进行相关基因筛选。
6、利用CaMKIIδT287D-CM进行药物筛选。
实施例1-2实验方案:采用CRISPR/Cas9技术,通过同源重组将突变引入CAMK2D基因中。过程如下:设计靶向人CAMK2D基因突变位点的gRNA并构建gRNA表达载体;合成包含目的突变的单链寡核苷酸(single-stranded oligodeoxynucleotide,ssODN),将CaMKIIδ的287位氨基酸由苏氨酸Thr突变为天冬氨酸Asp,同时对第284-286位氨基酸密码子进行同义突变;将制备好的表达载体与ssODN按比例转染hiPSC,经过流式细胞仪筛选、单克隆细胞扩增、挑取单克隆、PCR鉴定和桑格测序确定获得正确突变细胞株。
实施例1:构建靶向人CAMK2D基因突变位点的gRNA、Cas9二合一表达载体
商品化的PX458-EF1a-pSpCas9(BB)-2A-GFP质粒(Addgen,75232)购自Addgene;所有限制性内切酶、T4连接酶均购自ThermoFisher Scientific;质粒小量提取纯化试剂盒、质粒大量提取试剂盒、DNA凝胶回收与纯化试剂盒和PCR纯化回收试剂盒均购自Axygen;化学感受态细胞DH5α菌株购自上海生工生物工程有限公司。
如图1所示,gRNA序列设计:从NCBI网站查询人CAMK2D基因的编码区序列,选择CAMK2D基因(NM_001321571.2)第11号外显子设计CRISPR/Cas9基因编辑系统的gRNA序列。所述11号外显子突变位点附近部分核酸序列如下:
CAACGTTCTACTGTTGCTTCCATGATGCACAGACAGGAGACTGTAGACTGCTTGAAGAAATTTAATGCTAGAAGAAAACTAAAG(SEQ ID NO:1),使用在线软件CRISPOR(http://crispor.tefor.net/)设计gRNA并挑选评分较高gRNA,得到第11号外显子的gRNA序列(GCTTCCATGATGCACAGAC,SEQID NO:2)。
gRNA oligo退火:在设计好的gRNA序列5’端加上BbsⅠ限制性内切酶酶切位点,在南京金斯瑞生物科技有限公司合成相应的DNA片段,序列见表1。
表1gRNA的Oligo序列
序列名称 | 序列(5’-3’) | |
CAMK2D287-gRNA-F | caccGCTTCCATGATGCACAGAC | SEQ ID NO:3 |
CAMK2D287-gRNA-R | aaacGTCTGTGCATCATGGAAGC | SEQ ID NO:4 |
使用ddH2O将oligo干粉稀释后,如下表配制oligo退火体系,混匀后使用PCR仪通过逐步降温的方式,合成两端带有BbsI内切酶黏性末端的DNA链。降温的程序为:95℃5min,之后每秒降低1℃,直至降至25℃,取出放置于-20℃冰箱保存备用。
PX458-EF1a-pSpCas9(BB)-2A-GFP载体(下面简写为PX458)酶切:使用BbsI内切酶将载体切开,酶切体系如下:
充分混匀后放置于37℃水浴2h,之后取2μl与DNA loading buffer混合后进行琼脂糖凝胶电泳验证成功切开。使用DNA凝胶回收与纯化试剂盒对酶切后的产物进行纯化回收,获得PX458线性载体。
连接转化:将线性载体与oligo退火产物连接,连接体系如下:
充分混匀后16℃过夜连接,之后进行转化。转化步骤为:从-80℃冰箱中取出1支感受态细胞放于冰上解冻,全部连接产物与50μl感受态细胞轻柔混匀,在冰上放置30min后放置于42℃水浴锅中热激30s,立即置于冰上5min,在超净工作台中向上述混合物中加入400μl灭菌后的无抗生素LB液体培养基,轻轻吹打混匀后置于摇床中37℃,170rpm孵育1h。孵育结束后在超净工作台中吸取150μl加入到氨苄浓度为150μg/mL的LB固体培养基中进行涂板,之后倒置于37℃培养箱中过夜培养。
挑菌验证:向1.5ml离心管中加入1ml含有氨苄的LB液体培养基,挑取若干单克隆菌落,恒温摇床37℃、200rpm振荡培养6h,再取200ul菌液加入5ml含有氨苄的LB液体培养基,恒温摇床37℃、200rpm振荡过夜培养。小量提取质粒,选择hU6-F为测序引物,送测序验证是否连接成功。将测序正确的菌落进行扩大培养,使用质粒大量提取试剂盒提取确定连接成功的质粒PX458-CAMK2D287,质粒PX458-CAMK2D287的图谱如图2所示。
ssODN的设计与合成:根据CAMK2D基因序列和目的突变,设计ssODN(CTCTTCTTCTAGCAACGTTCTACTGTTGCTTCCATGATGCACAGGCAAGAAGACGT AGACTGCTTGAAGAAATTTAATGCTAGAAGAAAACTAAAGGTA,SEQ ID NO:5),其中,为了便于使用PCR方法对基因编辑结果进行鉴定,将CAMK2D基因编码的284-286位氨基酸密码子进行同义突变,即第284位的氨基酸密码子由AGA突变为AGG,第285位的氨基酸密码子由CAG突变为CAA,第286位的氨基酸密码子由GAG突变为GAA。由南京金斯瑞生物科技有限公司合成ssODN。
实施例2:制备CaMKIIδ第287位的苏氨酸突变成为天冬氨酸的CaMKIIδT287D-hiPSC,进而将其分化成为人源心肌细胞CaMKIIδT287D-CM
2.1hiPSC培养:将hiPSC(DYR0100,ATCC)接种于Matrigel基质(康宁,354277)包被的平板上,然后用StemFlex培养基(Gibco,A3349401)进行培养。StemFlex培养基每两天更换一次,hiPSC每隔3天传代一次,或在细胞培养达到80-90%汇合度时传代。传代过程中用1×DPBS(Gibco,14040133)冲洗1次,然后在室温下使用1×DPBS(Gibco,14190144)稀释的0.5mM EDTA(Invitrogen,15575020)处理10min。传代比为1:3-1:6。
2.3转染:接种hiPSC细胞到六孔板中,用StemFlex培养基进行培养,待细胞汇合度达到40%-50%时用1μM的L755507(MCE,HY-19334)处理6h后,按照-LT1(Mirus,MIR 2300)说明书操作将PX458-CAMK2D287和ssODN按质量比2:1共转染hiPSC。
2.4转染24h后,将培养液更换成新鲜培养液。转染48-72h后,使用倒置荧光显微镜观察绿色荧光表达情况,并使用流式细胞仪(FACSAria IIU,BD Biosciences)分选带有绿色荧光的细胞,接种到10cm培养皿中培养,7-10天后使用枪头吸取单克隆细胞接种于96孔细胞培养板,待克隆培养至细胞密度80%左右,将克隆消化后分成两份,一份用于PCR鉴定,一份进行扩大培养。
2.5PCR鉴定:提取每个单克隆细胞DNA,根据基因序列和替换序列区域设计3个引物,其中CAMK2D-Mut-F和CAMK2D-GT-R用于鉴定是否发生突变。同时使用3个引物进行PCR扩增。对于引入正确突变的克隆,其PCR结果应有404bp和181bp两条带(如图3所示)。选择PCR鉴定正确的单克隆继续进行测序。引物序列如表2。
表2PCR鉴定的引物序列
PCR反应程序为:95℃5min;95℃30sec,56℃30s,72℃1min,循环30次;72℃10min。PCR反应体系如下表,PCR结果(图4)显示克隆D7有2条大小正确条带,基因测序结果显示克隆D7成功引入目的突变。
2.6CaMKIIδT287D-CM的制备:在RPMI1640分化培养基[RPMI1640培养基(HyClone,SH30027.01)+0.1%牛血清白蛋白(Sigma,A1470)+1%非必需氨基酸(Invitrogen,11140050)+1%PS(Invitrogen,10378016)+L-抗坏血酸2-磷酸镁(Sigma,A8960,终浓度为213μg/mL)]中,添加CHIR99021(Tocris,4423,终浓度为10mM),处理CaMKIIδT287D-hiPSC 24小时,然后用RPMI1640分化培养基培养细胞48h。在分化第4天,在RPMI1640分化培养基中添加IWP2(Tocris,3533,终浓度5μM)后处理细胞,48h后换用RPMI1640分化培养基。在随后的实验中,用RPMI1640培养基加入3%的血清替代物(Gibco,10828-028)后培养心肌细胞。Wildtype-CM由未经基因编辑的hiPSC分化获得,其制备流程与CaMKIIδT287D-CM的制备流程一致。
实施例3:检测CaMKIIδT287D-CM的表型
3.1检测基因组编辑是否存在脱靶效应:使用gRNA设计网站预测潜在脱靶位点(图5a),提取CaMKIIδT287D-hiPSC的基因组DNA作为PCR模板,设计引物将包含潜在脱靶位点的DNA片段扩增后进行桑格测序,验证这些区域是否出现突变。结果显示所有预测的潜在脱靶位点没有出现突变(图5b)。
3.2检测CaMKIIδT287D-CM的肌节结构:利用免疫荧光染色技术对CaMKIIδT287D-CM和野生型人源心肌细胞(Wildtype-CM)的肌节进行染色,使用Cardiac Troponin TMonoclonal antibody(Invitrogen,MA5-12960)和Monoclonal Anti-α-Actinin(Sarcomeric)antibody(Sigma-Aldrich,A7811)作为一抗,Goat anti-Mouse IgG(H+L)Cross-Adsorbed Secondary Antibody,Alexa FluorTM488(Invitrogen,A-11001)或Goatanti-Mouse IgG(H+L)Cross-Adsorbed Secondary Antibody,Alexa FluorTM555(Invitrogen,A-21422)作为二抗。如图6a所示,CaMKIIδT287D-CM的肌节发育程度比Wildtype-CM的成熟,其肌节长度显著高于Wildtype-CM的肌节长度(CaMKIIδT287D-CMvs.Wildtype-CM:1.64μm vs.1.36μm;**,p<0.001;n=60cells;图6b)。
3.3验证CaMKIIδT287D-CM中的CaMKIIδ激酶活性:以往的研究表明,CaMKIIδ激酶活性的持续上升会导致兰尼碱受体2(ryanodine receptor 2,RYR2)第2808位、第2814位的丝氨酸以及受磷蛋白(Phospholamban,PLN)第17位的苏氨酸的磷酸化水平上调,同时也会磷酸化HDAC4后使其出核,导致胞质中HDAC4的水平上升。为了验证CaMKIIδT287D-CM中的CaMKIIδ激酶活性是否上升,利用western blot检测CaMKIIδT287D-CM和Wildtype-CM的RYR2第2808位、第2814位的丝氨酸、PLN第17位的苏氨酸的磷酸化水平;使用细胞质/细胞核分离试剂盒(Thermo Scientific,78833)提取胞质蛋白后,利用western blot检测CaMKIIδT287D-CM和Wildtype-CM的HDAC4的蛋白水平。使用的一抗信息如下【检测目标,稀释浓度,种属,公司,货号】:RYR2-pSer2808,1:500,rabbit,Badrilla,A010-30AP;RYR2-pSer2814,1:1000,rabbit,Badrilla,A010-31AP;Vinculin,1:5000,mouse,Abcam,ab11194;PLN-pThr17,1:500,rabbit,Badrilla,A010-13AP;HDAC4,1:500,rabbit,Abcam,ab12172;GAPDH,1:1000,mouse,Abcam,ab8245。二抗信息如下:goat anti-rabbit,1:15,000,LI-COR,926–32211;goat anti-mouse,1:15,000,LI-COR,926–32220。实验结果:由两株CaMKIIδT287D-hiPSC单克隆细胞制备的CaMKIIδT287D-CM(CaMKIIδT287D-CM#1和CaMKIIδT287D-CM#2),其RYR2第2808位、第2814位的丝氨酸、PLN第17位的苏氨酸的磷酸化水平显著高于Wildtype-CM的水平(RYR2-pSer2808:#1是WT的5.11倍,#2是WT的3.30倍;RYR2-pSer2814:#1是WT的9.16倍,#2是WT的4.18倍;PLN-pThr17:#1是WT的10.67倍,#2是WT的12.35倍;图7a和图7b),且胞质内的HDAC4的蛋白水平显著高于Wildtype-CM胞质内的HDAC4的蛋白水平(CaMKIIδT287D-CM是Wildtype-CM的1.69倍,图7c和图7d)。**,p<0.001。
3.4CaMKIIδT287D-CM呈现细胞肥大表型。本实验使用两种药物处理细胞作为相应的对照组,其中苯肾上腺素(phenylephrine,PE)是诱导心肌细胞肥大的经典药物,Autocamtide 2-相关抑制肽(Autocamtide 2-related inhibitory peptide,AIP)是一种高效特异的CaMKII抑制剂,通过与CaMKII的自磷酸化位点结合起到抑制作用。在本实验中,通过两种方法证明CaMKIIδT287D-CM与Wildtype-CM相比呈现显著的细胞肥大表型:(1)利用免疫荧光染色技术对CaMKIIδT287D-CM和Wildtype-CM的肌节进行染色(一抗:CardiacTroponin T Monoclonal antibody(Invitrogen,MA5-12960);二抗:Goat anti-Mouse IgG(H+L)Cross-Adsorbed Secondary Antibody,Alexa FluorTM555(Invitrogen,A-21422)),在荧光显微镜下拍照后,利用Image J软件分析图片中红色细胞的面积大小,结果显示CaMKIIδT287D-CM的平均细胞面积显著高于Wildtype-CM的平均细胞面积(CaMKIIδT287D-CMvs.Wildtype-CM:2240.05μm2 vs.1248.32μm2;**,p<0.001;n=20images;图8d和图8e);(2)利用流式细胞术分析细胞的体积分布情况(图8a、图8b及图8c)。将细胞体积分化小型、中型、大型三种范围,流式细胞分析结果显示,CaMKIIδT287D-CM在大型细胞的比例高于PE处理的Wildtype-CM和Wildtype-CM的比例(CaMKIIδT287D-CM vs.PE vs.Wildtype-CM:17.60%vs.9.24%vs.5.44%);使用AIP处理CaMKIIδT287D-CM后,其大型细胞的比例降低(CaMKIIδT287D-CM vs.AIP vs.Wildtype-CM:18.70%vs.13.20%vs.9.11%)。以上结果表明,CaMKIIδT287D-CM呈现明显的细胞肥大表型。
3.5CaMKIIδT287D-CM呈现细胞凋亡表型。利用Apoptosis/Necrosis Detection Kit(Abcam,ab176749)结合流式细胞术检测分化45-50天的CaMKIIδT287D-CM和Wildtype-CM,CaMKIIδT287D-CM中坏死/凋亡的细胞比例显著高于Wildtype-CM的相应比例(CaMKIIδT287D-CM vs.Wildtype-CM:20.65%vs.1.60%;n=3;**,p<0.001;图9)。
3.6代谢与增殖。利用ATP Determination Kit(Invitrogen,A22066)检测分化45-50天的CaMKIIδT287D-CM和Wildtype-CM中的ATP浓度,利用Amplex Red Glucose/GlucoseOxidase Assay Kit(Invitrogen,A22189)检测分化45-50天的CaMKIIδT287D-CM和Wildtype-CM的D-葡萄糖消耗量,利用Bromo-2′-deoxy-uridine Labeling and Detection Kit I(Roche,11296736001)检测分化30-35天的CaMKIIδT287D-CM和Wildtype-CM的增殖情况。结果显示,CaMKIIδT287D-CM的胞内ATP浓度与Wildtype-CM的相比显著降低(CaMKIIδT287D-CMvs.Wildtype-CM:2.17nM vs.3.60nM;n=3;*,p<0.01;图10a);CaMKIIδT287D-CM的D-葡萄糖消耗量与与Wildtype-CM的相比显著上升(CaMKIIδT287D-CM vs.Wildtype-CM:15.27μg/wellvs.9.76μg/well;n=3;*,p<0.01;图10b);CaMKIIδT287D-CM的BrdU阳性细胞比例与Wildtype-CM的相比显著降低(CaMKIIδT287D-CM vs.Wildtype-CM:0.011vs.0.058;n=5000-7000细胞;**,p<0.001;图10c和图10d),提示CaMKIIδT287D-CM的增殖能力减弱。
3.7衰老与自噬。利用Senescenceβ-Galactosidase Staining Kit(CellSignaling,9860)检测分化45-50天的CaMKIIδT287D-CM和Wildtype-CM的细胞衰老情况,利用CYTO-ID Autophagy detection kit(Enzo,ENZ-51031-0050)检测分化45-50天的CaMKIIδT287D-CM和Wildtype-CM的细胞自噬情况。结果显示,分化45-50天的CaMKIIδT287D-CM中的β-Galactosidase的阳性细胞比例显著高于同期培养的Wildtype-CM的比例(CaMKIIδT287D-CMvs.Wildtype-CM:0.474vs.0.047;n=7000-9000细胞;**,p<0.001;图11),提示CaMKIIδT287D-CM中衰老的细胞比例显著上升;在自噬实验中,分化45-50天的CaMKIIδT287D-CM中的自噬标志物的阳性细胞比例显著高于同期培养的Wildtype-CM的比例(CaMKIIδT287D-CMvs.Wildtype-CM:11.17%vs.2.30%;n=3;**,p<0.001;图12),提示CaMKIIδT287D-CM中发生自噬的细胞比例显著上升。
3.8电生理表型。利用膜片钳技术检测分化45-50天的CaMKIIδT287D-CM和Wildtype-CM的钠电流,利用钙成像技术检测CaMKIIδT287D-CM和Wildtype-CM的胞内钙浓度以及细胞收缩情况,利用免疫荧光染色技术检测分化45-50天的CaMKIIδT287D-CM和Wildtype-CM的细胞的钠离子通道蛋白Nav1.5的表达情况,利用实时定量PCR技术检测两种细胞中Nav1.5编码基因SCN5A的表达水平。结果显示,分化45-50天的CaMKIIδT287D-CM与同期培养的Wildtype-CM相比,钠离子通道电流密度降低(CaMKIIδT287D-CM vs.Wildtype-CM:-43.8±4.2pA/pFvs.-177.8±26.9pA/pF;p=0.000016;图13a),稳态失活曲线左移(CaMKIIδT287D-CMvs.Wildtype-CM:-87.2±1.4mV vs.-81.4±1.1mV;p=0.0033;图13b)。针对Nav1.5的免疫荧光染色显示,CaMKIIδT287D-CM的Nav1.5表达比Wildtype-CM的表达降低(图13c),针对SCN5A基因的实时定量PCR结果显示,CaMKIIδT287D-CM的SCN5A表达水平比Wildtype-CM的降低了40倍(p<0.001;图13d)。以上结果提示,CaMKIIδT287D-CM中SCN5A基因的表达下降导致其钠电流及钠离子通道相关功能异常。
在自发收缩时(图14a),分化45-50天的CaMKIIδT287D-CM与同期培养的Wildtype-CM相比,钙瞬变幅值显著上升(CaMKIIδT287D-CM vs.Wildtype-CM:2.45vs.1.83;n=17;p<0.001;图14d),达峰时间显著缩短(CaMKIIδT287D-CM vs.Wildtype-CM:0.43s vs.0.68s;n=17;p<0.001;图14b),钙瞬变衰减时间缩短(CaMKIIδT287D-CM vs.Wildtype-CM:1.69svs.3.22s;n=17;p<0.001;图14c);采用10mM的咖啡因诱发钙瞬变(图14e),分化45-50天的CaMKIIδT287D-CM与同期培养的Wildtype-CM相比,钙瞬变幅值显著上升(CaMKIIδT287D-CMvs.Wildtype-CM:3.50vs.1.93;n=15;p<0.001;图14f),钙瞬变衰减时间缩短(CaMKIIδT287D-CM vs.Wildtype-CM:6.00s vs.14.85s;n=15;p<0.001;图14g);在采用0.1Hz的频率刺激两组细胞时,Wildtype-CM能够以0.1Hz的频率进行收缩,但是CaMKIIδT287D出现心率失常的表型(图14h,黑色箭头)。以上数据提示CaMKIIδT287D-CM的舒张功能异常。
3.9对药物的反应性。使用化合物LCZ696(商品名“诺欣妥”,目前治疗心衰的一线用药)处理CaMKIIδT287D-CM,检测CaMKIIδT287D-CM对药物的反应性。LCZ696是由valsartan和sacubitril以1:1的摩尔比组成的化合物,是血管紧张素受体-脑啡肽酶双抑制剂(ARNi),2017年被批准在中国上市,用于射血分数降低的成人慢性心衰患者,以降低其心血管死亡和心衰住院的风险。在该实验中,使用LCZ696(10μM)处理CaMKIIδT287D-CM作为实验组,使用HDAC的选择性抑制剂MC1568(5μM)、β受体选择性拮抗剂Atenolol(10μM)处理CaMKIIδT287D-CM作为对照组,使用等体积DMSO处理CaMKIIδT287D-CM作为对照组,处理时间均为48小时;使用Apoptosis/Necrosis Detection Kit(Abcam,ab176749)结合流式细胞术检测各组细胞存活情况。如图15a的结果显示,LCZ696组的活细胞比例是DMSO组的2.03倍,MC1568组与DMSO组相比没有显著差异,Atenolol组与DMSO组相比没有显著差异(n=3;**,p<0.001)。
使用LCZ696(10μM)处理CaMKIIδT287D-CM作为实验组,使用等体积DMSO处理CaMKIIδT287D-CM以及等体积DMSO处理Wildtype-CM作为对照组,处理时间均为48小时;使用RayBioHuman/Mouse/Rat Angiotensin II EIA Kit(RayBiotech,EIA-ANGII-1)检测细胞培养上清中的血管紧张素II含量。如图15b的结果显示,Wildtype-CM+DMSO组的血管紧张素II浓度与CaMKIIδT287D-CM+DMSO组的相比显著降低(2.83pg/mL vs.13.55pg/mL;n=3;#,p<0.05);CaMKIIδT287D-CM+LCZ696组的血管紧张素II浓度与CaMKIIδT287D-CM+DMSO组的相比显著降低(4.93pg/mL vs.13.55pg/mL;n=3;#,p<0.05)。
以上结果提示,CaMKIIδT287D-CM对LCZ696有良好的反应性。
实施例4:利用CaMKIIδT287D-CM进行标志物筛选
我们在检测CaMKIIδT287D-CM的表型时发现,在分化30天时,CaMKIIδT287D-CM处于成熟期;在分化45天时,CaMKIIδT287D-CM处于肥大期;在分化45-60天时,CaMKIIδT287D-CM处于凋亡期。根据这一特性,我们选择分化30天、45天、60天三个时间点进行转录组学、蛋白质组学检测,分析这三个时间点CaMKIIδT287D-CM和Wildtype-CM在基因表达水平、蛋白丰度、蛋白磷酸化水平的异同,识别心力衰竭、心肌肥大的候选标志物。
4.1转录组学分析。同步制备CaMKIIδT287D-CM和Wildtype-CM,在分化的30天、45天、60天收集细胞,每组3个生物学重复,共18个样本,提取总RNA,送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行转录组测序。数据筛选条件可以根据不同的研究目的设定。为了方便描述,命名规则见下表。以下举例一筛选条件:
①表达上调的基因:p<0.001,且0.75<DEV30<1.25,且DEV45>2;②表达下调的基因:p<0.001,且0.75<DEV30<1.25,且DEV45<-2。
按照此条件筛选出来的候选基因有:①表达上调的基因按照DEV45降序排列前5项:
基因名 | DEV30 | DEV45 |
KCNIP2 | 1.035 | 5.273 |
CAPN3 | 1.223 | 5.119 |
ACTN3 | 1.131 | 4.713 |
ANKRD45 | 1.162 | 4.647 |
RALYL | 0.993 | 4.386 |
②表达下调的基因按照DEV45升序排列前5项:
基因名 | DEV30 | DEV45 |
CCL7 | 1.168 | -7.029 |
PKHD1L1 | 0.758 | -5.947 |
IL1B | 0.916 | -5.748 |
DCN | 0.772 | -5.056 |
TMEM154 | 0.760 | -5.019 |
4.2蛋白组学分析。在分化30天和45天这两个时间点收集细胞样品;在收集心肌细胞之前,使用AIP对CaMKIIδT287D-CM和Wildtype-CM进行处理。在后续的分析中,加入使用AIP处理的心肌细胞作为一种对照组,可以有效地排除由非CaMKIIδ激酶活性引起的变化,提高数据分析的效能。为了分析CaMKIIδ激酶活性对蛋白在细胞核质间转运的影响,在提取心肌细胞的蛋白时使用NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent Kit(ThermoScientific,78833)分别提取细胞质蛋白和细胞核蛋白。在提取过程中会特别注意加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂,防止在蛋白提取过程中出现的蛋白降解和磷酸化现象。
使用高性能质谱仪分析蛋白样品。主要使用质谱仪来分析蛋白样品的两部分内容:①利用非标记(label free)定量蛋白质组学技术进行蛋白质的相对定量分析;②利用同位素标记磷酸化蛋白质组学技术分析磷酸化位点。实验①可以使我们知道实验组与对照组之间有差异表达的蛋白(如相同时间点的突变型vs.野生型,突变型vs.突变型+抑制剂,不同时间点的突变型vs.突变型,等等);实验②不但可以分析实验组与对照组之间磷酸化修饰的差异,还可以识别新的磷酸化位点,即识别CaMKIIδ新的底物。如下表所示,一共需要对48个样品进行蛋白质的相对定量分析,24个样品进行磷酸化修饰位点的分析。
实施例5:利用CaMKIIδT287D-CM进行相关基因筛选
我们在检测CaMKIIδT287D-CM的表型时发现,在分化30天时,CaMKIIδT287D-CM处于成熟期;在分化45天时,CaMKIIδT287D-CM处于肥大期;在分化45-60天时,CaMKIIδT287D-CM处于凋亡期。根据这一表型,使用两种不同的文库筛选抑制CaMKIIδT287D-CM凋亡和肥大的相关基因。文库①:使用gRNA pooled library in lentiGuide-Puro(Addgene,1000000049)包装慢病毒,该gRNA文库针对人基因组中20000余个基因设计了gRNA,每个基因平均设计了3个gRNA序列,在适当条件下能够保证在被感染的细胞中分别敲除每一个基因;另外在该系统中,需要使用强力霉素(doxycycline)诱导Cas9的表达,才能启动基因编辑。慢病毒制备完毕后,感染1×108的CaMKIIδT287D-hiPSC,24小时后在培养液中加入嘌呤霉素去除没有被感染的细胞,筛选3天后换回常规培养液,然后分化成为CaMKIIδT287D-CM;在分化的20-23天,在培养液中添加强力霉素(2μg/mL,Sigma,D9891)诱导Cas9表达,3天后换回常规培养液,正常培养至后续实验。文库②:使用自制的转录因子文库包装慢病毒,该文库包含2500余个人类转录因子基因的cDNA序列,并带有嘌呤霉素抗性基因的筛选标记。慢病毒生产完毕后,感染1×107的分化20-23天的CaMKIIδT287D-CM,24小时后在培养液中加入强力霉素(2μg/mL,Sigma,D9891)诱导转录因子的表达,诱导过程是3天一个周期,即使用含有强力霉素的培养液培养3天,换回常规培养液培养3天,再使用含有强力霉素的培养液培养3天,如此循环至后续实验。
使用流式细胞仪按照不同的筛选条件分选收集细胞。条件①:在分化的60天,使用Dead Cell Apoptosis Kit(Invitrogen,V13242)对CaMKIIδT287D-CM进行染色,分选收集FITC阳性的细胞、FITC+PI双阳性细胞、FITC+PI双阴性细胞。条件②:在分化的60天,按照实施例3.4的参数分选收集小型、中型、大型细胞。对于收集获得的各组细胞,使用GeneJETGenomic DNA Purification Kit(Thermo Scientific,K0721)提取基因组DNA。
针对文库①,使用以下引物扩增gRNA片段:
KOv1-vector-F:TTGTGGAAAGGACGAAACACCG(SEQ ID NO:9);
KOv1-vector-R:TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGT(SEQ ID NO:10)。
(该序列来自文献【Datlinger,P.,et al.,Pooled CRISPR screening withsingle-cell transcriptome readout.Nat Methods,2017.14(3):p.297-301.】)
针对文库②,使用特定引物扩增转录因子cDNA片段。
将各组PCR扩增产物进行深度测序,具体信息如下:
实验组名称 | 文库 | 筛选条件 | 样本数 |
KO1 | 文库① | 条件①,FITC阳性细胞 | 3 |
KO2 | 文库① | 条件①,FITC+PI双阳性细胞 | 3 |
KO3 | 文库① | 条件①,FITC+PI双阴性细胞 | 3 |
KO4 | 文库① | 条件②,小型细胞 | 3 |
KO5 | 文库① | 条件②,中型细胞 | 3 |
KO6 | 文库① | 条件②,大型细胞 | 3 |
TF1 | 文库② | 条件①,FITC阳性细胞 | 3 |
TF2 | 文库② | 条件①,FITC+PI双阳性细胞 | 3 |
TF3 | 文库② | 条件①,FITC+PI双阴性细胞 | 3 |
TF4 | 文库② | 条件②,小型细胞 | 3 |
TF5 | 文库② | 条件②,中型细胞 | 3 |
TF6 | 文库② | 条件②,大型细胞 | 3 |
分析测序数据结果,对各组中的gRNA和转录因子的reads进行分析,确定抑制CaMKIIδT287D-CM凋亡和肥大的相关基因。
实施例6:利用CaMKIIδT287D-CM进行药物筛选
6.1CaMKIIδT287D-CM的代谢缺陷。我们在检测CaMKIIδT287D-CM的表型时发现,分化45天-50天的CaMKIIδT287D-CM在一种无糖培养液中培养5天,细胞活性下降90%以上,而同期培养的Wildtype-CM的细胞活性没有显著变化(图16)。其中,无糖培养液的配方是:无糖DMEM培养液(Gibco,11966-025)加入0.1% BSA(Sigma,A1470),1×Linoleic Acid-OleicAcid-Albumin(Sigma,L9655),Sodium DL-lactate(Sigma,L4263,终浓度为2mM)。常规培养液的配方见实施例2.6。使用PrestoBlueTMCell Viability Reagent(Invitrogen,A13262)检测心肌细胞活性。如图16所示,Wildtype-CM在常规培养液、无糖培养液、无糖培养液+化合物(说明:化合物A可以是很多物质。本实施例实验用到的是MONTELUKAST SODIUM/孟鲁司特)中培养5天,细胞活性没有显著变化。CaMKIIδT287D-CM在常规培养液中培养5天,细胞活性没有显著变化;在无糖培养液、无糖培养液+化合物中培养5天,细胞活性没有显著变化,细胞活性显著降低(无糖培养液:Day 5比Day 0下降了91.71%;无糖培养液+化合物A:Day 5比Day 0下降了79.23%;**,p<0.001;n=8),但是化合物使CaMKIIδT287D-CM在无糖培养液中的细胞活性上升了1.92倍。该结果说明无糖培养液培养5天是一个合适的筛选条件。
6.2利用CaMKIIδT287D-CM对候选化合物进行筛选。高通量的筛选可以在96孔板或384孔板中进行,以下以384孔板为例描述筛选过程。
(a)将分化35-40天的CaMKIIδT287D-CM消化后传代至384孔板,每孔细胞数为4000个细胞。24小时后换成常规培养液培养。
(b)72小时后,根据以下两种筛选条件换液,筛选条件①:无糖培养液;筛选条件②:常规培养液。每孔70-100微升体积。合理设置实验组、对照组、空白组,人工或使用自动化上样设备往孔板中添加相应化合物(待筛选的药物)。
(c)5天后,使用PrestoBlueTMCell Viability Reagent检测细胞活性,使用能适配384孔板的全波长酶标仪读取各孔的相对荧光单位。
(d)分析数据,得到结论。
上述药物筛选的过程可理解为:检测方(如药厂)将待筛选的药物添加到CaMKIIδT287D-CM中共培养测试,若筛选条件①+药物组的细胞活性显著高于筛选条件①+对照组(通常添加DMSO作为对照试剂)的细胞活性,此药物就有抑制心肌细胞凋亡的良好潜力,可以进行进一步的具体分析。该方法适合对大量药物/化合物进行初筛,可在短时间内获得初筛结果。
Claims (6)
1.人心肌细胞CaMKIIδT287D-CM,该细胞于2023年8月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号:GDMCC NO:63739。
2.如权利要求1所述的人心肌细胞CaMKIIδT287D-CM在构建心力衰竭模型中的应用。
3.如权利要求1所述的人心肌细胞CaMKIIδT287D-CM构建的心力衰竭模型在心力衰竭、心肌肥大标志物筛选中的应用。
4.如权利要求1所述的人心肌细胞CaMKIIδT287D-CM构建的心力衰竭模型在抑制心肌细胞凋亡或心肌肥大的基因筛选中的应用。
5.如权利要求1所述的人心肌细胞CaMKIIδT287D-CM构建的心力衰竭模型在治疗心力衰竭的药物筛选中的应用。
6.如权利要求3所述的应用,其特征在于,该应用包括如下步骤:
分化CaMKIIδT287D-CM和未经基因编辑的hiPSC分化获得人心肌细胞,在分化30天、45天、60天三个时间点的进行转录组学、蛋白质组学检测,分析这三个时间点两种心肌细胞在基因表达水平、蛋白丰度、蛋白磷酸化水平的异同,识别心力衰竭、心肌肥大的候选标志物。
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