CN112451672B - Dnmt1蛋白抑制剂在制备逆转mtx耐药肿瘤细胞耐药性的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了DNMT1蛋白抑制剂在制备逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的药物中的应用，属于医药技术领域。本发明针对MTX耐药且DHFR基因高度扩增的恶性肿瘤细胞，以DNMT1为靶点，降低DHFR基因的扩增程度，减少细胞内的DMs，同时，干扰DNMT1可抑制DNA双链断裂的损伤应答信号，消减HR和A‑EJ对DSBs的修复作用从而逆转肿瘤耐药，提高肿瘤治疗的效率。本发明为MTX作为主要治疗药物且易产生耐药性的恶性肿瘤的生物治疗提供新的靶向性治疗方案，并揭示肿瘤耐药细胞中DNMT1参与DMs形成以及肿瘤耐药的机制，有助于更全面解析因DSBs引发的肿瘤发生发展及耐药的过程，为逆转肿瘤耐药提供新策略。此外，本发明对于深入了解化疗耐药的本质以及寻找个体化治疗的耐药靶点也具有非常积极的意义。

Description

DNMT1蛋白抑制剂在制备逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的药物 中的应用

技术领域

本发明涉及DNMT1蛋白抑制剂在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，特别涉及DNMT1蛋白抑制剂在制备通过降低细胞对DNA双链断裂损伤修复能力，下调DHFR基因扩增，进而逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，本发明属于医药技术领域。

背景技术

氨甲蝶呤(Methotrexate，MTX)作为一种抗代谢类抗肿瘤药物，广泛应用于急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、绒毛膜上皮癌、乳腺癌、头颈部癌、膀胱癌和肺癌等疾病的治疗。MTX可通过竞争性地抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)活力，使二氢叶酸生成四氢叶酸的合成受损，导致DNA的合成受抑制，最终引起细胞死亡。但部分患者会在MTX治疗过程中产生获得性耐药，导致化疗失败。而MTX的主要靶酶DHFR的活性增高及其基因的扩增是使肿瘤对MTX产生耐药的主要机制之一。

基因扩增是染色体限制性区域拷贝数的增加，普遍存在于多种肿瘤中。细胞遗传学分析表明，基因扩增主要以染色体上的均质染色区(homogeneously staining regions,HSRs)和染色体外的双微体(double minute chromosomes,DMs)两种形式存在，其所承载的癌基因或耐药基因对肿瘤的进展与耐药具有驱动作用。关于DMs 的形成机制主要包括复制叉断裂模型、染色体环出模型、“断裂-融合-桥”模型和“易位-断裂-扩增”模型。虽然DMs的形成机制目前还存在较多的争议，但其先决条件是DNA双链的断裂，而双链的断裂损伤后修复会促进DMs产生。DNA双链断裂 (double-strand breaks,DSBs)是一种最严重的DNA损伤，为了维持基因组的完整性和稳定性，生物体进化出完善的DNA损伤应答(DNA damageresponse，DDR) 来修复DNA双链损伤。这一过程是由受影响的细胞触发的、特定的、复杂的、相互关联的信号级联网络，包括感知和传递损伤信号给效应蛋白、阻滞细胞周期、激活DNA修复途径和细胞死亡。

细胞中主要存在三种DSBs的修复途径，同源重组(homologous recombination，HR)、非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)和选择性非同源末端连接(alternative non-homologous end joining，A-EJ)。前期研究已经表明HR、NHEJ、 A-EJ多条修复途径都能促进双微体形成，因此抑制单一修复途径效果有限，而如果在DNA损伤应答过程修复途径抑制下游多个通路，则会加大其治疗效果。

DNMT1是哺乳动物中发现的第一个DNA甲基化转移酶，是DNA进行复制、修复后维持新链DNA上正常甲基化的关键酶。目前众多研究均表明DNMT1也可以不依赖其甲基化催化功能直接参与DNA损伤应答多个环节，如损伤信号感知、修复途径、周期调控及凋亡。DNMT1参与DNA损伤应答过程，紫外线辐射后 DNMT1迅速被招募到DNA损伤位点，与DNA双链断裂标志物γH2AX共定位，而 DNMTs其他成员DNMT3a或DNMT3b却未被招募到损伤位点，这提示DNMT1可以参与DNA损伤应答。另一项研究证实DNMT1在射线诱导的DNA双链断裂发生后1分钟就可在损伤位点检测到，而DNMT1招募到损伤位点这一过程不需要 DNMT1甲基化酶催化活性结构域，DNMT1参与DNA损伤应答通过PCNA结合域发挥作用且不依赖其甲基化酶活性。DNMT1在射线诱导的DNA双链断裂发生后1 分钟就可在损伤位点检测到，而且DNMT1在DNA双链断裂处可以持续存在长达3 个小时，这表明DNMT1在DNA损伤应答过程中除了检测DNA双链断裂还参与到 DNA损伤应答下游相关通路中。免疫荧光实验表明DNMT1表现出与DDR感应蛋白γH2AX和p-ATM明显发生共定位，并且DNMT1缺乏的细胞在应对损伤时表现出明显的p-ATM和γH2AX抑制，而γH2AX和p-ATM对HR通路关键蛋白BRCA1 的招募及磷酸化必不可少，提示DNMT1可以调控同源重组修复通路。在另外一项关于转录导致的DNA损伤研究，DNMT1与HR通路关键蛋白BRCA1进行互作，因此DNMT1很可能直接通过BRCA1互作参与同源重组修复。另外有研究表明，细胞中DNMT1与A-EJ通路PARP1蛋白互作，因此DNMT1也有可能参与A-EJ 通路。

本发明以DDR关键蛋白DNMT1为靶点进行干扰后发现，干扰DNMT1能够抑制DNA损伤应答过程，抑制DSBs的修复，减少DMs的形成，导致细胞内DHFR 基因拷贝数减少，细胞对MTX的耐药能力降低，进而逆转MTX耐药肿瘤细胞的耐药情况。因此，DNMT1有望成为治疗MTX耐药肿瘤及其他含基因扩增的肿瘤的新靶点。

发明内容

本发明的目的在于针对肿瘤化疗药物MTX常因在治疗过程中产生耐药而导致化疗失败的现象，提供以DNMT1蛋白为靶点逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的方法。

为了达到上述目的，本发明发明人前期构建人结肠癌细胞系HT29 MTX耐药的进化模型。本发明选用的细胞为对MTX的耐受程度为10^-4mol/L的人结肠癌细胞，此时细胞中同时存在DMs和HSRs两种扩增形式，且以DMs为主。

本发明的技术方案是利用Western Blot检测HT29亲本及HT29MTX耐药细胞中DDR关键蛋白DNMT1的表达水平。随后应用慢病毒载体在含DMs的MTX耐药细胞中稳定转染shDNMT1，建立DM-shDNMT1细胞系；并利用Western Blot检测干扰DNMT1后检测DNA损伤应答通路其他关键蛋白表达变化。随后利用 Realtime PCR和Western Blot检测干扰DNMT1后细胞中DHFR基因拷贝数、蛋白表达水平变化以及与DHFR位于同一扩增子上的其他7个与DMs和HSR形成相关基因：MSH3、ZFYVE16、XRCC4、POLK、CAST、CCNH和GLRX扩增水平的改变；并利用FISH技术检测干扰DNMT1后DHFR的DMs数目是否发生变化。接下来利用报道质粒系统检测干扰DNMT1后DNA双链断裂(double-strand breaks, DSBs)修复通路：同源重组(homologousrecombination,HR)、非同源末端连接 (non-homologous end joining,NHEJ)及选择性非同源末端连接(alternative non-homologous end joining,A-EJ)修复能力的改变。最后利用MTS法检测干扰 DNMT1后细胞对MTX敏感程度的变化。

本发明在含DMs的MTX耐药细胞中，发现干扰DNMT1可抑制HR和A-EJ 对DSBs的修复，进而减少DMs的形成。提示DNMT1在基因扩增的过程中发挥重要作用。干扰DNMT1可提高含DMs的MTX耐药细胞对MTX的敏感性，提示 DNMT1在肿瘤对MTX耐药进程中至关重要，为以DNMT1为靶点逆转肿瘤细胞对 MTX的耐药性提供科学依据。

具体的，本发明采用了以下技术手段：

1.细胞培养构建进化模型

用浓度逐渐增加的MTX连续培养人结肠癌HT29细胞，筛选出一系列HT29 MTX耐药细胞，待每个浓度梯度细胞对相应药物浓度耐受后，继续培养5个月直至其稳定耐药，然后再用其进行后续试验。

2.DDR关键蛋白的表达分析

提取细胞总蛋白，应用Western Blot方法检测DNMT1及DDR关键蛋白在HT29 亲本及含DMs的MTX耐药细胞中的表达情况。与HT29亲本细胞相比，对MTX 的耐受程度为10^-4mol/L的含DMs的HT29 MTX耐药细胞中DNMT1高表达。

3.在HT29 DMs的MTX耐药细胞中稳定干扰DNMT1的细胞系构建

确定含DMs的HT29 MTX耐药细胞对嘌呤霉素的敏感性，选择适当的嘌呤霉素浓度作为稳定转染时的药物筛选浓度。将处于对数生长期的含DMs的HT29 MTX 耐药细胞接种于24孔培养板，待细胞长至80％时，进行稳定转染。分别转染对照组慢病毒Control shRNA及干扰组慢病毒DNMT1 shRNA。培养72小时后，每个孔中加入相应浓度的嘌呤霉素进行稳定筛选，连续换液培养。将含双微体的HT29 MTX 耐药细胞的对照组克隆命名为DM-shControl，干扰组克隆命名为DM-shDNMT1。

4.检测DNMT1蛋白表达情况鉴定稳定干扰细胞系的干扰效果

应用Western Blot方法检测DNMT1在含DMs的HT29 MTX耐药细胞的对照细胞系及干扰DNMT1的细胞中的表达情况。经检测，干扰克隆中DNMT1的表达量明显低于对照克隆中的表达量，表明我们成功地在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中建立了稳定干扰DNMT1的敲减细胞系。

5.在HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰DNMT1后基因扩增的变化

(1)利用Real-time PCR技术检测干扰DNMT1前后DHFR基因拷贝数的变化，发现与对照组相比，在稳定干扰DNMT1的细胞中中DHFR基因拷贝数明显下降。并应用Western Blot比较了干扰DNMT1前后DHFR蛋白表达水平的变化，发现与DM-shControl克隆相比，DHFR蛋白在DM-shDNMT1细胞中的表达情况明显下降。

(2)采用Real-timePCR技术分析除DHFR外的其他7个与DMs和HSR形成相关基因的拷贝数变化情况，发现稳定干扰DNMT1后，MSH3、ZFYVE16、POLK、 XRCC4、GLRX、CAST和CCNH的拷贝数均发生明显下降。表明在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中，DNMT1可能参与DMs的形成。

(3)应用FISH技术分析DM-shControl和DM-shDNMT1克隆中期染色体核型。我们将DHFR基因的BAC DNA标记为带有红色信号的荧光探针，并分别与 DM-containing control和DM-shDNMT1细胞中期核型特异性杂交。随后我们统计在两组克隆核型中含有DHFR信号的DMs的数目。发现干扰DNMT1后，含DMs的HT29 MTX耐药细胞中含DHFR的DMs数目显著下降。

6.在HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰DNMT1后DSBs修复能力变化

(1)我们随后应用Western Blot技术检测各修复通路蛋白在细胞中的表达水平，发现与对照组相比，干扰DNMT1后细胞中HR通路关键蛋白BRCA1及A-EJ 关键蛋白PARP1表达显著降低，NHEJ通路KU70/80等蛋白表达水平无明显变化，提示在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰DNMT1可抑制HR及A-EJ通路但可能不影响NHEJ通路。

(2)我们应用DR-GFP报告质粒检测HR修复能力，DR-GFP报告质粒由两个GFP表达序列串联组成，第一个GFP的表达序列中插入了一段I-Sce Ⅰ的酶切识别位点序列，而第二个GFP的序列缺少5′端和3′端，因而均不能表达GFP绿色荧光蛋白。随后通过质粒转染使细胞中表达I-Sce Ⅰ，此时第一个GFP被切断，并可以利用第二个GFP的同源序列进行同源重组修复，并表达GFP。随后用流式细胞仪检测GFP绿色荧光，通过测定GFP阳性细胞比率，以判断细胞同源重组修复能力。在转染DR-GFP报告质粒的细胞系中，首先利用siRNA技术瞬时敲减DNMT1，对照组命名为si-Control，DNMT1敲减组命名为si-DNMT1。转染I-Sce Ⅰ质粒，应用流式细胞仪检测，HT29 MTX耐药细胞的GFP阳性表达率明显下降，表明抑制 DNMT1可降低HR通路的修复能力。

(3)我们选用EJ2-GFP对A-EJ修复能力进行检测。EJ2-GFP报告质粒的N 末端标记了的一个GFP融合序列，N末端和GFP中间隔有一个紧随终止密码子的 I-Sce Ⅰ识别位点，同时在I-Sce Ⅰ识别位点和终止密码子两侧有8个碱基的微同源序列。当转入I-Sce Ⅰ质粒后，可以使I-Sce Ⅰ位点被识别且被切断形成DNA双链断裂，如果细胞通过选择性非同源末端连接进行修复，被标记的N末端和GFP可连接并恢复编码框序列，从而表达GFP绿色荧光蛋白。结果表明敲减DNMT1可降低细胞 A-EJ修复能力。

(4)我们应用报道质粒EJ5-GFP来检测抑制DNMT1后细胞NHEJ能力的变化。在质粒EJ5-GFP中，GFP的编码区域和启动子被一个puro基因隔开，因而该质粒无法表达GFP。但是该puro基因两侧各有一个I-Sce Ⅰ识别位点，若细胞中表达I-Sce Ⅰ且诱导DSBs，细胞可通过NHEJ途径修复该DSBs，并表达GFP。我们在HT29 MTX耐药细胞中稳定转染EJ5-GFP质粒，比较干扰DNMT1前后细胞GFP 表达比率的变化，结果显示与si-Control相比，si-DNMT1组NHEJ修复能力无明显变化。表明DNMT1不参与NHEJ修复过程。

7.HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰DNMT1细胞对MTX的敏感性增强

我们采用MTS法比较了MTX对干扰DNMT1前后含DMs的细胞的IC₅₀值(半数致死浓度)，结果显示在HT29 MTX耐药细胞中，对照组克隆的IC₅₀值是DNMT1 干扰组的1.41倍，说明抑制DNMT1后细胞对MTX的敏感性增加。表明DNMT1 有望成为逆转MTX耐药肿瘤细胞的新靶点。

在上述研究的基础上，本发明提出了DNMT1蛋白抑制剂在制备逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的药物中的应用。

其中，优选的，所述的DNMT1蛋白抑制剂为在转录水平上抑制DNMT1蛋白表达的药物。

其中，优选的，所述的药物为含有DNMT1 shRNA的干扰载体。

其中，优选的，所述的含有DNMT1 shRNA的干扰载体为含有DNMT1 shRNA 的慢病毒载体。

其中，优选的，所述的DNMT1 shRNA的靶序列为SEQ ID NO.1所示。

其中，优选的，所述的肿瘤细胞为含双微体且DHFR基因高度扩增的MTX耐药细胞。

其中，优选的，所述的肿瘤细胞为含双微体且DHFR基因高度扩增的人结肠癌 HT29MTX耐药细胞。

其中，优选的，所述的肿瘤细胞对MTX耐受程度为10^-4mol/L。

其中，优选的，所述的药物通过降低DHFR基因的扩增程度，减少细胞内的 DMs，同时抑制DNA双链断裂的损伤应答信号，消减HR和A-EJ对DSBs的修复作用从而逆转肿瘤耐药，提高肿瘤治疗的效率。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明为MTX作为主要治疗药物且易产生耐药性的恶性肿瘤的生物治疗提供新的靶向性治疗方案，为有效地对抗MTX耐药提供了科学的依据。本发明针对MTX 耐药且DHFR基因高度扩增的恶性肿瘤细胞，以DNMT1为靶点，降低基因扩增程度，消减细胞内的DMs，抑制细胞对DSBs的修复从而逆转肿瘤耐药，提高肿瘤治疗的效率。进而全面揭示肿瘤耐药细胞中DNMT1参与DMs形成以及和肿瘤耐药的机制，有助于更全面了解因DSBs引发的肿瘤发生发展及耐药的过程，为逆转肿瘤耐药提供新策略。

附图说明

图1为DDR关键蛋白在HT29亲本及含DMs的HT29 MTX耐药细胞中的表达情况的Western Blot图及柱状图；

图2为鉴定HT29 MTX耐药细胞稳定干扰克隆的干扰效果的Western Blot图及柱状图；

图3为在HT29 MTX耐药细胞中干扰DNMT1导致5号染色体同一扩增子内 DMs和HSR形成相关基因扩增程度下降的实时定量PCR柱状图；

图4为在HT29 MTX耐药细胞中干扰DNMT1导致细胞内含DHFR基因的双微体数目下降的荧光原位杂交图(A)及统计图(B)；

图5为在HT29 MTX耐药细胞中干扰DNMT1导致细胞内DHFR蛋白表达量下降的Western Blot图及柱状图；

图6为在HT29 MTX耐药细胞中干扰DNMT1导致细胞内HR通路蛋白表达变化的Western Blot图及柱状图；

图7为为质粒DR-GFP的结构示意图(A)及在HT29 MTX耐药细胞中瞬时转染siRNA后DNMT1干涉效果的Western Blot图(B)，在HT29 MTX耐药细胞中干扰DNMT1导致HR修复能力下降的柱状图(C)；

图8为在HT29 MTX耐药细胞中干扰DNMT1导致细胞内A-EJ通路蛋白表达变化的Western Blot图及柱状图；

图9为质粒EJ2-GFP的结构示意图(A)及在HT29 MTX耐药细胞中干扰 DNMT1导致A-EJ修复能力下降的柱状图(B)；

图10为HT29 MTX耐药细胞中干扰DNMT1导致细胞内NHEJ通路蛋白表达变化的Western Blot图及柱状图；

图11为质粒EJ5-GFP的结构示意图(A)及在HT29 MTX耐药细胞中干扰 DNMT1导致NHEJ修复能力下降的柱状图(B)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，以便更明确的阐述其优点和特点。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1.细胞培养

将人结肠癌细胞系HT29用浓度梯度递增的MTX进行连续培养，筛选出一系列HT29MTX耐药细胞，待每个浓度梯度细胞对相应药物浓度耐受后，继续培养5 个月直至其稳定耐药后，继续后续实验。

HT29亲本及耐药细胞在含15％胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，耐药细胞系培养基中添加相应浓度的MTX。所有细胞均培养在5％CO₂、37℃恒温细胞培养箱中。

2.DDR关键蛋白在HT29亲本细胞及MTX耐药细胞中的表达水平

通过Western Blot检测HT29亲本细胞及对MTX的耐受程度为10^-4mol/L的含 DMs的HT29 MTX耐药细胞中DDR通路蛋白DNMT1的表达水平。

(1)细胞总蛋白的提取

取处于对数生长期的细胞，弃掉培养基，用4℃预冷的PBS冲洗细胞3次，吸净残余PBS。将细胞培养皿置于冰上，按RIPA buffer：蛋白酶抑制剂：磷酸酶抑制剂的体积比为100:10:1的比例配制细胞裂解液，取适量加入细胞中作用3分钟。用细胞刮刮下细胞并收集细胞悬液至1.5ml的Eppendorf管中。涡旋15后置于冰上，超声涡旋裂解后静置10分钟，期间每5分钟涡旋一次。12000转/分，4℃离心20 分钟。将上清收集于新的Eppendorf管，用BCA法测定蛋白浓度，并用RIPA buffer 将样品调至统一浓度，加入1/4蛋白体积的5×loadingbuffer，于沸水中变性5分钟，保存于-20℃冰箱。

(2)SDS-PAGE凝胶电泳

按甲叉双丙烯酰胺：丙烯酰胺＝1:29的比例配置30％凝胶储备液，并利用此储备液制作SDS-PAGE胶，根据目的蛋白的大小配制不同浓度分离胶。将蛋白样品混匀，瞬时离心后上样。配制电泳液(10×电泳液100ml+10％SDS 10ml+去离子水定容至1000ml)，先以80伏恒压进行电泳，当蛋白marker进入分离胶后，将电压调至120伏，恒压电泳至与目的蛋白分子量接近的marker条带达到分离胶1/3处，停止电泳。

(3)湿转法转膜

取10×电泳液100ml、200ml甲醇，用去离子水定容至1000ml配制成转膜缓冲液。取下凝胶放于转膜缓存液中。根据凝胶大小剪取PVDF膜，并在甲醇中浸泡30秒进行PVDF膜激活。按阴极、海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵、阳极的顺序组装转膜装置，并将其转移至含转膜缓冲液的转膜槽中，转膜槽中放冰盒降温，300毫安恒流转膜。

(4)免疫反应

转膜结束后，将PVDF膜放于杂交盒中，加入TBS-T于摇床上洗膜3次，每次 5～10分钟，弃掉TBS-T。用TBS-T配制成浓度为5％的脱脂奶粉溶液作为封闭液，将封闭液加至杂交盒中，保证液面完全覆盖PVDF膜，摇床上室温封闭1～2小时。弃掉封闭液，加入稀释好的一抗，4℃摇床杂交过夜。第2天回收一抗，用TBS-T 洗膜3次，每次10分钟，随后加入稀释的二抗，室温避光杂交1小时，回收二抗并用TBS-T洗膜3次，最后应用Odyssey InfraredImaging System扫膜并获得结果图像。

结果表明，与HT29亲本细胞相比，DNMT1在HT29 MTX耐药细胞中的蛋白表达水平显著增加。提示DNMT1与耐药及基因扩增可能相关(图1)。

3.在MTX耐药细胞中构建稳定干扰DNMT1的细胞系

(1)确定HT29 MTX耐药细胞对嘌呤霉素的敏感性

将HT29-DMs细胞计数并按每孔10⁵个细胞的密度种于12孔板。待细胞贴壁后更换培养基，分别按终浓度为0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5 μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL、1.0μg/mL、1.1μg/mL和1.2 μg/mL加入相应嘌呤霉素。观察发现含双微体的HT29-DMs细胞在嘌呤霉素浓度为 0.8μg/mL时，第7天恰好全部死亡。因而分别选择终浓度为0.8μg/mL嘌呤霉素处理含有双微体的转染细胞。

(2)稳定转染

选用复能公司提供的病毒进行转染，DNMT1 shRNA慢病毒载体名称为：HSH011492-2-LVRH1GP(OS213314)，其靶序列为：ccgaagtcaaaccaaagaacc(SEQ ID NO.1所示)。该病毒在感染宿主细胞后，不会感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。使用时按如下操作进行病毒转染实验：使用生物安全柜进行病毒转染操作。病毒操作前穿好实验服，带口罩和手套。操作病毒时十分小心尽量不产生气雾或飞溅。并准备1％的SDS，如果操作时工作台有病毒污染，立即用1％的SDS溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头，离心管，培养板等其他物品使用84消毒液稀释后浸泡处理。操作后废弃的含病毒的培养基中加入84消毒液(1:20左右)，浸泡一天后丢弃。操作完成脱掉手套后，用肥皂和水清洗双手。

病毒转染前一天分别取生长情况良好的含均质染色区和含双微体的HT29 MTX 耐药细胞，胰酶消化处理后用培养基制成单细胞悬液。将细胞30％～50％左右的融合度种入24孔板中，过夜培养，第二日弃掉旧培养基，加入新鲜培养基485μl。冰浴融化阴性对照慢病毒、DNMT1敲减慢病毒，按照病毒转染HT29细胞的MOI值 (MOI＝10)计算出转染时每孔需加慢病毒15μl，混匀后孵箱中培养，感染16小时后换液，加入新鲜培养基继续培养至72小时，在荧光显微镜下观察转染效率，加嘌呤霉素筛选估计慢病毒感染效率。分别选0.5μg/mL和0.8μg/mL的终浓度作为含均质染色区和含双微体的细胞稳定转染时的适宜药物筛选浓度。

将含双微体的HT29 MTX耐药细胞的对照组克隆命名为DM-shControl，干扰组克隆命名为DM-shDNMT1。

4.检测DNMT1蛋白表达情况鉴定稳定干扰细胞系的干扰效果

由于DNMT1是DDR通路中参与蛋白之一，并且在HT29耐药细胞中蛋白表达水平升高，因此我们通过shRNA慢病毒载体在HT29 MTX耐药细胞中构建稳定干扰DNMT1的细胞系。并利用Western Blot技术检测DNMT1蛋白的干涉效果。如图2所示，与对照相比，DNMT1的蛋白表达水平在shDNMT1干扰组显著下降，表明我们成功地在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中建立了稳定干扰DNMT1的细胞系。

5.在HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰DNMT1后基因扩增的变化

(1)为明确DNMT1是否与DMs的形成相关联，我们在含DMs的HT29 MTX 耐药细胞中，利用Real-time PCR技术检测了干扰DNMT1前后DHFR基因拷贝数的变化。

a细胞基因组DNA提取

应用QIAmp DNA mini kit试剂盒，按照操作流程进行DNA提取。取数量不超过5×10⁶的生长情况良好的细胞，PBS冲洗3次、胰酶消化并用培养基制备细胞悬液，1000转/分离心5分钟，弃掉上清并用PBS冲洗沉淀，再次离心。弃上清得到细胞沉淀。将细胞沉淀弹开并加入200μl PBS、20μl蛋白酶K和200μl Buffer AL 混匀后56℃水浴10分钟。随后加入200μl无水乙醇，涡旋混匀。将液体吸出并加入到QIAmp mini离心柱中，8000转/分离心1分钟后更换收集管。向柱子中加入500μl Buffer AW1离心后更换收集管，条件同上。再加入500μlBuffer AW2，14000转/分全速离心3分钟。将柱子转移至新的1.5ml Eppendorf管中，加适量Buffer AE，室温孵育3分钟后8000转/分离心1分钟，Eppendorf管中离心得到的液体即为基因组 DNA。测定DNA浓度并统一配平至50ng/μl。

Real-time PCR

20μL PCR反应体系：

PCR的反应条件：

95℃6分钟，95℃20秒，Tm20秒，72℃20秒，进行45个循环反应；融解曲线为95℃5秒，65℃1分钟，97℃。

进行三次独立重复实验，应用2^-ΔΔt法分析实验结果，并用内参基因ACTIN对目的基因结果进行归一化处理，最后用t检验进行统计分析。比较sh-Control和sh-DNMT1组中目的基因的基因扩增量的变化，用倍数表示其差异结果。计算P值，当P<0.05时，两组具有统计学差异。

结果如图3所示，与对照组相比，在稳定干扰DNMT1的克隆中DHFR基因拷贝数显著降低。

(2)本发明发明人前期对HT29亲本及HT29 MTX耐药细胞进行array CGH 芯片分析，发现HT29 MTX耐药细胞中基因DHFR、MSH3、ZFYVE16、POLK、 XRCC4、GLRX、CAST和CCNH共定位于5号染色体上的同一扩增子上，且这些基因存在于HSR上，而基因MSH3、ZFYVE16和DHFR也存在于DMs上，PLK2 未在HT29MTX耐药细胞中发生扩增，选取该基因作为阴性对照。为进一步明确 DNMT1与HSR和DMs形成的关联，我们采用Real-time PCR技术分析了除DHFR外的其他8个同HSR和DMs形成相关基因的拷贝数变化情况，其中Real-timePCR 结果如图6所示，稳定干扰DNMT1后，MSH3、ZFYVE16、POLK、XRCC4、GLRX、 CAST和CCNH的拷贝数均未发生明显下降。表明在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中，DNMT1可能参与DMs的形成而不参与HSR形成。

(3)在含DMs的HT29MTX耐药细胞中，干扰DNMT1使DMs和HSR上扩增基因拷贝数下降，为进一步明确干扰DNMT1是否会影响DMs数目。我们应用 FISH技术分析了DM-containing control和DM-shDNMT1克隆的中期染色体核型。我们将DHFR基因的BACDNA标记为带有红色信号的荧光探针，并分别与 DM-containing control和DM-shDNMT1克隆的中期核型特异性杂交。随后我们在两组克隆核型中随机选取至少50个，统计其中含有DHFR信号的DMs的数目。

a 中期染色体核型制备

培养细胞至有丝分裂旺盛时期，向细胞中加入秋水仙素使其终浓度为0.20 μg/mL，作用1小时。收集上清液至离心管中，PBS冲洗细胞后用胰酶消化，将离心管中的上清液和消化完成的细胞以1000转/分速度离心5分钟。细胞沉淀弹开后加入8ml37℃预热的低渗液(0.075mol/L的KCl溶液)，置于37℃水浴锅中作用13分钟。随后向离心管中加入1ml固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)，1500转/分离心6分钟。弃上清，将沉淀弹开后加入10ml固定液，室温固定1小时以后再离心，条件同上。重复上步，之后再次弃掉上清液，弹开细胞沉淀并加入适宜量的固定液，将胞悬液垂直的滴在预冷的载玻片上。将玻片放于室温老化两天后储存于 -20℃。

b BAC DNA的提取

制备LB培养液：200ml去离子水溶解酵母提取物1g、胰蛋白胨2g和NaCl2 g，配置好的LB进行高温高压灭菌，待LB降温至室温后加入终浓度为25μg/mL 的氯霉素。将BAC菌液加入LB中，37℃、220转/分摇菌16个小时左右。应用无内毒素质粒大提试剂盒，根据说明书步骤提取BAC DNA。首先向吸附柱中加入2.5ml平衡液，8000转/分离心2分钟。将过夜培养的菌液加至离心管中，室温8000转/分离心3分钟收集菌液，可通过多次离心的方法将菌体收集至一个离心管中。弃上清，向菌体沉淀中加8ml P1，充分涡旋振荡菌体沉淀。随后向离心管中加入8ml P2，多次翻转裂解菌体，室温放置5分钟。之后再加入8ml P4，翻转8次，室温放置10分钟，8000转/分离心10分钟，将上清转移至过滤器中。并向滤液中加入0.3倍体积的异丙醇，混匀后将溶液倒入吸附柱中。8000转/分离心2分钟，弃掉废液。将吸附柱转移至新的离心管中，并加入10ml漂洗液， 8000转/分离心2分钟，重复此步骤，随后向吸附柱中加入3ml无水乙醇，8000 转/分离心2分钟弃废液。最后将吸附柱转移至一个新的50ml离心管中，向吸附柱中滴加1～2ml洗脱缓冲液，室温放置5分钟后8000转/分离心2分钟。离心管中收集得到的液体即为BAC DNA。应用紫外分光光度计测定BAC DNA的浓度，并将原液稀释至40～60ng/μl储存于-20℃冰箱。

c FISH探针标记：

以上述得到的BAC DNA为模板，用随机引物法标记探针：向1μl BAC DNA 中加入4μl随机引物，将混合物于95℃ PCR仪中反应10分钟后立即置于冰上2 分钟。之后逐步加入1.6μl缺T的dNTPs、3.2μl Cy3/Cy5/Green dUTP和0.2μl Klenow fragment。将混合液放入37℃水浴锅中反应3小时，之后加入1μl Stop Buffer终止反应。

取3μl标记好的探针，加入3μl ssDNA，3μl小时uman Cot Ⅰ，41μl去离子水，5μl3mol/L的醋酸钠和110μl预冷的无水乙醇。混和好后放置于-80℃冰箱沉淀20分钟，12000转/分离心10分钟，小心吸净上清后加入110μl预冷的75％乙醇进行沉淀洗涤，12000转/分再次离心10分钟，吸净上清，避光干燥5～10分钟。向沉淀中加入9μl杂交液后37℃反应2小时以溶解探针。随后将探针转移至75℃水浴锅反应8分钟使其变性，变性后立即放于冰上2分钟，随后再次转移至37℃水浴锅反应30分钟，进行探针预复性。

d FISH玻片处理流程

用钻石笔圈出滴有染色体中期核型的区域，随后将玻片放入1×PBS中洗5分钟，再逐步放入75％、85％和100％的乙醇中各3分钟进行梯度脱水。玻片吹干后，将 100μl RNase工作液加到核型区域，盖上PE手套小块后，将玻片放入湿盒并置于 37℃孵箱反应40分钟。随后移去PE手套，用2×SSC Ⅰ溶液清洗玻片2次，每次洗3分钟；再将玻片逐步放入75％、85％和100％的乙醇中各3分钟。吹干玻片再向核型区域上加入100μl胃蛋白酶工作液，用PE手套小块覆盖反应区域，将玻片放入湿盒并放入置于37℃孵箱反应15分钟。随后将玻片放入1×PBS中洗5分钟，再将玻片放入1％多聚甲醛中固定10分钟，而后再次用1×PBS洗玻片5分钟，随后将玻片逐步放入75％、85％和100％的乙醇中各3分钟进行梯度脱水。吹干玻片后将玻片放入75℃甲酰胺溶液中反应3分钟。随后再将玻片放入4℃预冷的 2×SSC Ⅰ溶液中洗两次并将玻片逐步放入75％、85％和100％的乙醇中各3分钟。

e FISH杂交流程

将9μl预复性的探针滴加到标记好中期核型的区域，并盖上20mm×20mm的盖玻片，用rubber cement封片，并将封好的片子放于湿盒中，并放入37℃孵箱中。

隔天反应结束后，揭掉rubber cement封片剂，将玻片放入44℃的50％甲酰胺溶液中晃动至盖玻片脱落，计时15分钟。之后用2×SSC Ⅰ溶液洗两次玻片，并将玻片逐步放入75％、85％和100％的乙醇中各3分钟进行脱水处理，并吹干玻片。在标记区域滴加5μl DAPI进行染色，并在标记区域盖上24mm×32mm规格的盖玻片。最后用荧光显微镜观察中期核型。

f FISH图-像采集

利用MetaMorp小时

Imaging System采集并分析图像。

结果如图4所示，干扰DNMT1后，含DMs的HT29 MTX耐药细胞中含DHFR 的DMs数目显著下降。

(4)为明确在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中，抑制DNMT1是否会影响DHFR的蛋白表达水平，我们应用Western Blot比较了干扰DNMT1前后DHFR蛋白表达水平的变化(抗体稀释比例为DHFR，1:1000。GAPDH，1:10000)。结果如图5所示，与DM-shControl相比，DHFR蛋白在DM-shDNMT1细胞中的表达情况明显下降。

6.稳定干扰DNMT1后修复通路蛋白表达变化

我们随后应用Western Blot技术检测各修复通路蛋白在细胞中的表达水平，发现与对照组相比，干扰DNMT1后细胞中HR通路关键蛋白BRCA1(图6)及A-EJ 关键蛋白PARP1表达显著降低(图8)，NHEJ通路KU70/80等蛋白表达水平无明显变化(图10)，提示在含DMs的HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰DNMT1可抑制HR及A-EJ通路但可能不影响NHEJ通路。

7.在HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰DNMT1后DSBs修复能力变化

(1)HR是细胞修复DSBs的主要途径之一，也是参与双微体形成的重要修复通路。为检验干扰DNMT1后是否会影响HR途径对DSBs的修复。因此我们应用 DR-GFP报告质粒检测同源重组的修复能力，DR-GFP报告质粒由两个GFP表达序列串联组成，第一个GFP的表达序列中插入了一段I-Sce Ⅰ的酶切识别位点序列，而第二个GFP的序列缺少5′端和3′端，因而均不能表达GFP绿色荧光蛋白(图7A)。随后通过质粒转染使细胞中表达I-Sce Ⅰ，此时第一个GFP被切断，并可以利用第二个GFP的同源序列进行同源重组修复，并表达GFP。随后用流式细胞仪检测GFP 绿色荧光，通过测定GFP阳性细胞比率，以判断细胞同源重组修复能力。在转染DR-GFP报告质粒的细胞系中，首先利用siRNA技术瞬时敲减DNMT1，对照组命名为si-Control，DNMT1敲减组命名为si-DNMT1，敲减效果如图7B所示。随后转染I-SceⅠ质粒，应用流式细胞仪检测，结果表明敲减DNMT1后细胞中GFP阳性表达比率明显下降(图7C)，表明抑制DNMT1可降低HR通路的修复能力。

a 含报道质粒系统细胞系的构建

将生长状态良好的HT29 MTX耐药细胞按5×10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞生长贴壁后进行转染。首先配制混合液A(10μl LIPO2000和240μl Opti-MEM)和250μl混合液B(5μg质粒DNA和Opti-MEM)，室温放置5分钟；随后将混合液A加入混合液B中，缓慢混匀并在室温下放置20分钟。弃掉 6孔板中的培养基并加入新鲜培养基1.5ml。最后向6孔板中逐滴加入混合液，培养24小时后更换新鲜培养基。72小时后待细胞状态稳定后，用嘌呤霉素对转染细胞进行筛选，连续培养获得稳定表达报道质粒的细胞系。

b 瞬转siRNA

将生长状态良好的含上述报道质粒的细胞3×10⁵个/孔的密度接种于12孔板中。同时配制混合液A(2μl DharmaFECT 1 Transfection Reagent和98μl Opti-MEM) 和混合液B(2μl siRNA和98μl Opti-MEM)，室温放置5分钟；随后将混合液 A加入混合液B中，缓慢混匀并在室温下放置20分钟。随后将混合液加入到12 孔板中的细胞悬液中，培养24小时后将12孔板中的细胞转移至6孔板。

c 共转染I-Sce Ⅰ质粒和siRNA

配制混合液A(10μl LIPO2000和240μl Opti-MEM)和250μl混合液B(5μl siRNA、5μg I-Sce Ⅰ质粒和Opti-MEM)，室温放置5分钟；随后将混合液A加入到混合液B中，缓慢混匀并在室温下放置20分钟。弃掉6孔板中的培养基后加入新鲜培养基1.5ml。最后向6孔板中逐滴加入混合液，培养24小时后更换新鲜培养基。I-Sce Ⅰ表达后可识别报道质粒上相应的酶切位点并产生DNA双链断裂。

d 流式分析

I-Sce Ⅰ质粒和siRNA共转染后72小时，用胰酶消化6孔板中的细胞，收集细胞沉淀，用PBS冲洗细胞沉淀2次后，用1ml PBS重悬细胞沉淀。应用流式细胞仪检测含有绿色荧光蛋白信号的细胞，比较si-Control和si-DNMT1两组细胞绿色荧光蛋白表达阳性率，进而明确干扰DNMT1后细胞对DNA双链断裂修复能力的变化。

(2)A-EJ是不依赖于KU蛋白的新型DSBs修复途径，A-EJ易在修复过程中产生错误，易提高基因组的不稳定性并促进肿瘤发生，研究表明A-EJ修复途径参与DMs形成。因此我们选用EJ2-GFP对选择性非同源末端连接的修复能力进行检测。EJ2-GFP报告质粒的N末端标记了的一个GFP融合序列，N末端和GFP中间隔有一个紧随终止密码子的I-Sce Ⅰ识别位点，同时在I-Sce Ⅰ识别位点和终止密码子两侧有8个碱基的微同源序列。当转入I-Sce Ⅰ质粒后，可以使I-Sce Ⅰ位点被识别且被切断形成DNA双链断裂，如果细胞通过选择性非同源末端连接进行修复，被标记的N末端和GFP可连接并恢复编码框序列，从而表达GFP绿色荧光蛋白(图 9)。我们利用稳定表达EJ2-GFP报告质粒的HT29 MTX耐药细胞评估敲减DNMT1 后，细胞的选择性非同源末端连接修复能力。结果如图9所示，si-DNMT1组较 si-Control组阳性细胞比率明显下降。说明敲减DNMT1可降低细胞非同源末端连接修复能力。此结果与Western Blot结果一致，提示抑制DNMT1影响选择性非同源末端连接修复通路。

(3)为进一步验证敲减DNMT1对非同源末端连接修复能力的影响，我们应用 EJ5-GFP绿色荧光蛋白的质粒系统，检测抑制DNMT1前后细胞非同源末端连接修复功能的变化。在EJ5-GFP报告质粒中，GFP的编码区域和启动子被一个puro基因隔开，因而该质粒无法正常表达GFP。但是该puro基因两侧各有一个I-Sce Ⅰ识别位点，当细胞中表达I-Sce Ⅰ后就会诱导puro基因两侧产生DNA双链断裂，此时细胞可通过非同源末端连接途径修复该DNA双链断裂，组成完整的GFP序列，表达GFP绿色荧光蛋白(图11A)。我们在含双微体的HT29 MTX耐药细胞中稳定转染 EJ5-GFP质粒，比较敲减DNMT1前后细胞GFP表达比率的变化，从而判断非同源末端连接修复能力的变化。结果如图11B所示，与si-Control相比，si-DNMT1组细胞非同源末端连接修复能力变化不显著。此结果与Western blot结果一致，说明在 MTX耐药的双微体细胞模型中DNMT1不参与非同源末端连接修复。

8.HT29 MTX耐药细胞中稳定干扰DNMT1细胞对MTX的敏感性增强

DHFR基因的扩增是细胞发展为MTX耐药的主要原因，在含双微体的HT29 MTX耐药细胞中稳定敲减DNMT1，可导致DHFR拷贝数和蛋白表达水平下降，为了明确敲减DNMT1是否会改变细胞对MTX的敏感性，我们采用MTS法比较了敲减DNMT1前后细胞对MTX药物的IC₅₀值(致死浓度)，结果如表1所示，在含双微体的MTX耐药细胞中，敲减DNMT1后，细胞对MTX的敏感性增加1.41倍。表明DNMT1有望成为逆转MTX耐药肿瘤细胞的新靶点。

MTS法评估细胞半数致死浓度方法如下：

将对数生长期的细胞用胰酶消化，用培养基重悬细胞并计数，以每孔5000 个细胞的密度将细胞接种于96孔板中。应用倍比稀释法配制连续浓度梯度的含 MTX培养基，并将相应药物浓度的培养基加入到96孔板中，每个药物浓度设置 6个副孔。连续培养细胞72小时后，吸净96孔板中的培养基，向每个孔加入100μl 培养基及20μl MTS混合液，在37℃孵箱中孵育2～4小时后，应用酶标仪检测每个孔在OD492nm处的吸光值。根据未加MTX的对照孔和加入MTX的加药孔的吸光度值，计算出MTX不同浓度对细胞的生长抑制率，最后根据抑制率算出MTX对细胞的半数致死浓度IC₅₀，结果如表1。

表1.在HT29 MTX耐药细胞中干扰DNMT1导致细胞对MTX敏感性增加的统计表

*P<0.05。

序列表

<110> 哈尔滨医科大学

<120> DNMT1蛋白抑制剂在制备逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的药物中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

ccgaagtcaa accaaagaac c 21

Claims (3)

1.含有DNMT1 shRNA的干扰载体在制备逆转MTX耐药肿瘤细胞耐药性的药物中的应用，所述的肿瘤细胞为含双微体且DHFR基因高度扩增的人结肠癌HT29 MTX耐药细胞，所述的肿瘤细胞对MTX耐受程度为10^-4mol/L。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的含有DNMT1 shRNA的干扰载体为含有DNMT1 shRNA的慢病毒载体。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的DNMT1 shRNA的靶序列为SEQ IDNO.1所示。

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