CN110317878B - 一种用于膀胱癌诊治监测的长链非编码rna及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明通过lncRNA表达芯片检测了膀胱癌病人样本中lncRNA的表达谱，分析发现了十余种和膀胱癌发生发展密切相关的lncRNA，在膀胱细胞系T24中对其依次进行敲低抑制，分析抑制各个lncRNA序列后T24细胞对DDP的药物敏感性，其中发现了一条国内外均未报道过的lncKMU15，敲低后对DDP的IC50明显降低，敏感性显著增强，通过实验验证发现的表达量与肿瘤的分期与分级存在非常显著的正相关性，与膀胱癌患者的总生存率及无瘤生存率均存在负相关性，这一新型的lncRNA‑KMU15，将为探索新型无创分子诊断技术实现灵敏的膀胱癌早期筛查及术后监测体系提供全新的可能性。

Description

一种用于膀胱癌诊治监测的长链非编码RNA及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种长链非编码RNA及其应用，具体而言，本发明涉及一种长链非编码RNA在制备膀胱癌预后、复发或者化疗敏感性监测中的应用。

背景技术

膀胱癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤，在我国的肿瘤发病率排行榜上高居第八位。即使在医疗发达的欧美地区，膀胱癌死亡率也位于各种患癌症病人死亡率的前十位，严重威胁着人类健康和社会经济发展。因此，膀胱癌不但是病人个体和家庭沉重的心理负担和经济负担，同时更是我国经济发展的严峻社会负担。但是目前膀胱癌研究领域存在许多问题，主要体现在膀胱癌早期诊断技术缺乏特异性和灵敏性，手术切除肿瘤后膀胱癌的复发率高。由于膀胱癌术后的高复发性，且复发后化疗耐药性增强，生存率降低，因此建立良好完善的膀胱癌治疗后监测体系，对改善膀胱癌患者预后情况具有重要的临床意义。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,1ncRNA)被定义为长度大于200nt，缺乏开放阅读框的一类不编码蛋白质的RNA分子，参与调控基因沉默、基因组印记、转录激活和抑制等多种重要的生物学过程。近年来研究发现，lncRNA的异常表达可能与细胞永生化和无限生长现象密切关联，提示lncRNA在肿瘤发生及进展过程中扮演着重要角色。大量研究结果也表明lncRNA可以通过调控靶基因的表达水平，影响肿瘤的发生、发展、侵袭、转移等过程。因此研究肿瘤中lncRNA的作用模式，对提高诊断的准确率以及寻找新的基因治疗靶点具有重要意义。

自1965年Rosenberg证实了顺式二氯二氨铂(DDP)的抗癌活性后,于1971年获得了临床抗癌疗效,至1978年得到批准被称为第一代抗癌铂。此后,围绕临床应用发现 DDP的肾脏毒性、胃肠反应和神经毒性及耐药性等问题,展开了铂类抗癌新药的研究。在过去的20多年中大约合成了3000多个铂类配合物但是,作为抗癌药进入临床试验的仅有28个,其中18个经过不同阶段的临床试验后因抗癌活性不强或毒性大等原因而最终被放弃。被保留的10个铂配合物中的DDP、卡铂(carboplatin,CBDCA)分别于1978、1985 年批准后在世界多国有产品上市；1995年日本批准奈达铂(nedaplatin)上市；1996年草酸铂(oxaliplatin)经法国批准；SKI 2053R(sunpla,丙二酸铂)1999年在韩国批准上市。

发明内容

本发明通过lncRNA表达芯片检测了膀胱癌病人样本中lncRNA的表达谱，分析发现了十余种和膀胱癌发生发展密切相关的lncRNA，在膀胱细胞系T24中对其依次进行敲低抑制，分析抑制各个lncRNA序列后T24细胞对DDP的药物敏感性。其中发现了一条国内外均未报道过的lncRNA，敲低后对DDP的IC50明显降低，敏感性显著增强，我们将其命名为lncRNA-KMU15。通过实验验证发现lncRNA-KMU15的表达量与肿瘤的分期与分级存在非常显著的正相关性，与膀胱癌患者的总生存率及无瘤生存率均存在负相关性。这一新型的lncRNA-KMU15，将为探索新型无创分子诊断技术实现灵敏的膀胱癌早期筛查及术后监测体系提供全新的可能性。

发明人对膀胱癌组织采用上海康成生物工程有限公司代理的ArrayStar公司的lncRNA 芯片产品(Human LncRNA Microarray V3.0 Service)进行检测，从表达谱中找出高表达最显著的前10个LncRNA序列，在膀胱细胞系T24中对其依次进行敲低抑制，分析抑制各个lncRNA序列后T24细胞对DDP的药物敏感性。结果证明第3段lncRNA(在此命名为lncKMU15)敲低后对DDP的IC50明显降低，敏感性显著增强。用RNAfold web server软件对lncKMU15序列进行分析模拟，推测该lncRNA的空间结构模式图。收集不同分期、分级的膀胱癌组织，检测这些肿瘤标本的lncKMU15相对表达量。结果显示 lncKMU15的表达量与肿瘤的分期与分级存在非常显著的正相关性。同时发现lncKMU15 的表达与膀胱癌患者的总生存率及无瘤生存率均存在负相关性。lncRNA-KMU15作为膀胱癌的新靶点，在监测膀胱癌的复发、转移、临床预后和药物治疗提供理论基础。

本发明的目的是提供一种新的与膀胱癌恶性程度、预后及化疗敏感性密切相关的lncRNA序列。在一个具体的实施中，所述的化疗药物是铂类药物，优选为顺铂；在另外一个具体的实施例中，所述的预后是指对化疗药物的敏感性，所述的化疗药物是铂类药物，优选为顺铂；在一个具体的实施例中，所述的lncRNA-KMU15的序列为SEQ ID NO:1所示，或者与SEQ ID NO:1所示的序列具有99％同源性且来源于人类的lncRNA。

本发明的另外一个方面是lncRNA-KMU15在制备预测肿瘤药物敏感性的产品中的应用。在一个具体的实施例中，所述的肿瘤为膀胱癌；在另外一个具体的实施例中，所述的药物是指铂类药物，优选为顺铂；在一个具体的实施例中，所述的lncRNA-KMU15的序列为SEQ ID NO:1所示，或者与SEQ ID NO:1所示的序列具有99％同源性且来源于人类的lncRNA。

本发明的另外一个方面是检测lncRNA-KMU15的试剂在制备预测肿瘤药物敏感性的产品中的应用。在一个具体的实施例中，所述的肿瘤为膀胱癌；在另外一个具体的实施例中，所述的药物是指铂类药物，优选为顺铂；在一个具体的实施例中，所述的lncRNA的序列为 SEQ ID NO:1所示，或者与SEQ ID NO:1所示的序列具有99％同源性且来源于人类的lncRNA；在另外一个具体的实施例中，所述的检测试剂为引物、探针等。

本发明的另外一个方面提供了所述lncRNA-KMU15序列的检测应用方法，根据该序列制备用于膀胱癌辅助检测试剂。在一个具体的实施例中，所述的lncRNA的序列为SEQ IDNO:1所示，或者与SEQ ID NO:1所示的序列具有99％同源性且来源于人类的lncRNA；在另外一个具体的实施例中，所述的检测试剂为引物、探针等；在另外的一个实施例中，所述的检测方法为qRT-PCR的方法，其中使用的内参为GRPDH；具体的，所述lncRNA的检测引物为SEQID NO:5-6所示，所述的内参检测引物为SEQ ID NO:7-8所示。

本发明根据所述lncRNA-KMU15，根据其序列，在体内外同时进行实验验证其对膀胱癌预后监测及化疗增敏的效果。

本发明的另外一个方面是提供了lncRNA-KMU15的抑制剂。在一个具体的实施例中，所述的抑制剂为所述lncRNA-KMU15的反义核酸片段；在另外一个具体的实施例中，所述的反义核酸片段为干扰RNA序列；在另外一个具体的实施例中，所述的干扰RNA序列为 SEQID NO:2所示。在另外的一个具体实施例中，本发明还制备了一种针对lncRNA-KMU15 敲除效果较好的shRNA：shlncKMU15-1，提供了lncRNA-KMU15敲低载体构建的方法，设计lncRNA-KMU15基因的慢病毒干涉序列，构建出了稳定低表达lncRNA-KMU15的膀胱癌细胞。

本发明的另外一个方面是提供lncRNA-KMU15的抑制剂在制备提高膀胱癌药物敏感性试剂中的应用。在一个具体的实施例中，所述的药物为是铂类药物，优选为顺铂；在另外一个具体的实施例中，所述的lncRNA-KMU15的序列为SEQ ID NO:1所示，或者与SEQ IDNO:1所示的序列具有99％同源性且来源于人类的lncRNA；在一个具体的实施例中，所述的抑制剂为所述lncRNA-KMU15的反义核酸片段shlncKMU15-1；在另外一个具体的实施例中，所述的反义核酸片段为干扰RNA序列；在另外一个具体的实施例中，所述的干扰RNA 序列为SEQ ID NO:2所示。

附图说明

图1膀胱癌标本的lncRNA芯片进行测序分析，从表达谱中找出高表达最显著的前10 个LncRNA序列，在膀胱细胞系T24中对其依次进行敲低抑制，分析抑制各个lncRNA序列后T24细胞对DDP的药物敏感性。结果证明第3段lncRNA(在此命名为lncKMU15) 敲低后对DDP的IC50明显降低，敏感性显著增强。

图2 A.EJ、T24及5637耐药的膀胱癌细胞注射至裸鼠皮下后，在DDP或DOC维持下，lncRNA-KMU15的表达量在肿瘤组织中均显著上升。

B&C.收集不同分期、分级的膀胱癌组织，检测这些肿瘤标本的lncKMU15相对表达量。结果显示lncKMU15的表达量与肿瘤的分期与分级存在非常显著的正相关性。

D.收集膀胱癌患者的临床病例资料，根据lncKMU15表达量的高低将患者分为lncKMU15高表达和低表达2组，并绘制2组患者的整体生存曲线。结果指出lncKMU15 的表达与膀胱癌患者的总生存率存在负相关性。

E.收集2例膀胱癌患者的原发及复发肿瘤标本，比较原发肿瘤与复发肿瘤细胞间lncKMU15的相对表达量有无差异。结果说明lncKMU15在复发肿瘤标本中的表达量显著升高。

F.收集2例膀胱癌患者原位和淋巴结转移的组织，比较其lncKMU15的相对表达量有无差异。结果说明lncKMU15在淋巴结转移组织中的表达量明显升高。

图3 A.将设计好的3条慢病毒干扰载体及空载体shCtrl分别转染至膀胱癌细胞T24 及5637中，提取细胞RNA检测lncRNA-KMU15的表达量以比较敲低效果。qRT-PCR检测结果表明，shlncRNA KMU15-1的敲除效果最好，与对照组的lncRNA-KMU15表达量比较具有更加显著的抑制作用。

B.提取6例膀胱癌患者临床肿瘤标本的原代细胞进行培养并使用shlncRNAKMU15-1 敲低。细胞耐药性检测我显示，lncRNA KMU15-1敲低后6组膀胱癌细胞对DDP的敏感性显著增强。

具体实验方式

实施例1：膀胱癌组织的lncRNA芯片表达分析

一、材料和方法

1.材料

组织样本来自于3对膀胱癌患者的住院病例手术切除样本，每对包含膀胱癌组织和配对的癌旁组织。

2.方法

(1)肿瘤组织和正常组织总RNA的提取：按Qiagen公司的RNA提取试剂盒(RNeasyMicro Kit，货号74004)说明书提取膀胱癌组织和癌旁组织的总RNA。

(2)对样品RNA进行荧光标记(ArrayStar Human LncRNA Microarray V3.0Service)

(3)反转录合成第一链cDNA：以Total RNA为起始，含有T7启动子序列的 Oligo(dT)Primer为引物，使用CbcScript酶合成第一链cDNA。

(4)合成第二链cDNA：DNA聚合酶以RNA片段为引物，合成第二链cDNA，并纯化双链cDNA。

(5)体外转录合成cRNA：以cDNA为模板，利用T7Enzyme Mix合成cRNA。

(6)随机引物反转录：取1ug cRNA，用随机引物进行反转录。

(7)杂交与清洗：cDNA溶于杂交液中45℃杂交过夜，用SSC的液体中洗5分钟，玻片甩干后即可用于扫描。

(8)芯片扫描，图像分析，差异基因筛选：芯片用Agilent Microarray Scanner(Agilent p/n G2565BA)进行扫描，并转化为数字信号。将原始数据输入到6eneSpring GX软件中，进行差异基因筛选。

(9)从表达谱中找出高表达最显著的前10个LncRNA序列，在膀胱细胞系T24中对其依次进行敲低抑制，采用顺铂对T24细胞进行处理，检测不同实验组T24细胞对顺铂的 IC50值的变化。

二、结果

根据膀胱癌标本lncRNA芯片测序分析结果，从表达谱中找出高表达最显著的前10个 LncRNA序列，结果证明第3段lncRNA(在此命名为lncRNA-KMU15)敲低后对顺铂的 IC50明显降低，敏感性显著增强。本发明通过以下实施进行指标的重复验证。参见图1。

实施例2：体内实验发现lncRNA-KMU15在化疗耐药的膀胱癌细胞系中高表达及与临床分期、预后的相关性

一、实验材料

EJ、T24和5637耐药的膀胱癌细胞，分别注射到裸鼠皮下，对lncRNA-KMU15在不同化疗敏感性细胞中的表达差异进行体内验证。膀胱癌患者不同分期、分级的膀胱癌组织。原发和复发后再次手术切除的膀胱癌肿瘤组织。膀胱癌患者的原位和淋巴结转的肿瘤组织。

二、实验方法和结果

1.膀胱癌细胞皮下注射裸鼠转移模型：碘伏消毒裸鼠皮肤，EJ、T24和5637的耐药细胞株按常规计数后，使用EDTA/胰酶进行消化，离心后用生理盐水重悬。于每只裸鼠左腋皮下注射入膀胱癌细胞。

2.观察裸鼠致瘤情况。一周2次观察裸鼠的状态及饮食情况，于10天开始见有皮下成瘤，期间以DDP(5mg/kg)和DOC(3mg/kg)维持处理，30天后取出实验组小鼠皮下肿瘤细胞和对照组小鼠皮下癌旁组织细胞。

3.应用实时定量PCR检测各组细胞的lncRNA-KMU15的相对表达量。

(1)总RNA的提取：25cm²培养瓶中加入1ml Trizol液，反复吹打裂解细胞。将上述含有细胞的Trizol裂解液转入DEPC水预处理过的EP管中，在室温15-30℃下放置5 分钟，按照每1ml Trizol加0.2ml氯仿的比例加入氯仿，剧烈震荡15秒钟，在室温下(15℃ -30℃)放置2～3分钟后，12000rpm(2℃-8℃)离心15分钟。，在室温下(15℃-30℃) 放置10分钟，然后12000rpm(2℃-8℃)离心10分钟；小心地弃去上清，按照每1ml Trizol加1ml 75％乙醇进行洗涤，涡旋混合，12000rpm(2℃-8℃)离心5分钟，弃上清。重复洗涤一次。让沉淀的RNA在室温下自然干燥或置于真空下干燥，用40μl的 Rnase-free water溶解RNA沉淀。

(2)cDNA第一链的合成:将模板RNA在冰上解冻；引物、10×RT mix(其中包含RNasin和DTT)、超纯dNTP混合液、RNase-free ddH2O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，短暂离心收集残留在管壁的液体。把 RNA在65℃条件下热变性5分钟后，立即置于冰上冷却。

按照表中的逆转录体系在冰上配制如下反应液20μl，彻底混匀，简短离心。

将反应液轻轻地搅拌均匀后，按以下温度进行反应。

37℃,15min；50℃,5min；98℃,5min；4℃,hold。

反应结束后，在4℃或-20℃条件下保存cDNA。

(3)荧光定量PCR检测细胞标志基因的表达

检测用引物序列如下所示(选用GAPDH作为内参基因)：

(4)RT-PCR反应设定：反应之前混匀Mix、ROX染料、模板和引物；根据实际需要在冰上按下表比例调整反应体积，将上述混合液加入96孔板后，用封板膜密封PCR板，轻轻震荡，1000r/min短暂离心1min。

(5)qPCR反应条件如下：

上述反应条件需要在LightCycler 480机器上设置好后扩增PCR等待反应结果(图2 A)。

4.收集40例处于不同分级、分期的膀胱癌组织。其中处于G1级者20例，G2级者 12例，G3级者8例；26例为Ta-T1期，14例为T2-T4期。通过qRT-PCR分别检测上述膀胱癌组织中lncRNA-KMU 15的相对表达量(图2 B-C)。

5.收集lncRNA-KMU15高表达和低表达的2组膀胱癌患者的肿瘤组织及临床病例随访资料各110例，绘制2组患者的总体生存曲线(图2 D)。

6.收集2例原发和复发后再次手术切除的膀胱癌肿瘤组织，通过上述qRT-PCR分别检测其组织细胞中lncRNA-KMU15的相对表达量(图2 E)。

7.收集2例膀胱癌患者原位和淋巴结转移的组织，通过上述qRT-PCR分别检测其组织细胞中lncRNA-KMU15的相对表达量(图2 F)。

8.荧光定量结果采用2(-ΔΔCt)法计算不同组织之间的基因表达变化。

结果显示，各组耐药的肿瘤细胞中lncRNA-KMU15的表达量都有显著上升。在不同分期、分级的膀胱癌组织中，lncRNA-KMU15的表达量与肿瘤的分期与分级存在非常显著的正相关性。而通过比较原发和复发后再次手术切除的肿瘤组织中lncRNA-KMU15的表达情况，发现相较于原发肿瘤，LncRNA-KMU15在复发肿瘤中的表达显著增高。此外， lncRNA-KMU15在淋巴结转移组织中的表达量也明显升高。

实施例3：lncRNA-KMU15敲低载体构建

一、实验方法

1.慢病毒干涉载体pSicoR-GFP酶切回收

pSicoR-GFP载体用Hpa I和Xho I酶、缓冲液(custmart)在37℃条件下酶切过夜，酶切体系:

2.设计lncRNA KMU15基因的慢病毒干涉序列

(1)设计干涉序列KMU原始序列

设计干涉序列的网址:http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/。按照慢病毒干涉载体pSicoR-GFP载体的要求体外合成引物序列。选取评分最高的三条干涉序列，根据设计好的shRNA合成引物：

(2)引物离心，加水溶解引物，使其终浓度为10μmol，取10μl F+10μl R，95℃5min，室温冷却2h。

(3)活化片段

37℃反应30min，70℃反应10min，灭活PNK激酶，置于凉水中放凉。

(4)连接：向10μl活化的片段里加入1μl酶切处理的pSicoR-GFP空载体，1μlligase，不加1μl 5×ligase buffer，16-20℃凉水中放置30min，使活化片段与载体连接。

3.转化

取出一支制备的100μl的TOP10大肠杆菌感受态细胞，置于冰上融化待用；连接产物加入TOP10大肠杆菌感受态细胞中，冰上放置30min，调整水浴锅温度为42℃，将加入连接体系的TOP10大肠杆菌感受态细胞放入水浴锅静置45s后迅速拿出，插入冰上放置 2min。加入1ml的无菌LB液体培养基(无抗性)，放入37℃摇床，200rpm,45min；吸取100μl混合液体涂于氨苄青霉素抗性的平板，倒置于37℃孵箱，过夜培养；次日，用白枪头挑去平板上单克隆菌落，每个产物挑选6-8个克隆，加入到20μl含氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，吹打混匀后行琼脂糖电泳鉴定，选取阳性菌落摇菌扩增，提取质粒，进行测序再次鉴定是否连接成功。

4.琼脂糖电泳

将制胶板洗净，水平放置在工作台上，调整好上样梳的高度。称取2g琼脂糖于100ml 1×TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解。冷却至45-50℃时加入0.5μg/ml的溴化乙锭溶液5ul中染色5min，倒入制胶板中。待凝胶凝固后，小心拔去上样梳。将电泳样品与DNA染料混合后将样品依次点入加样孔中，每孔加入10ul样本。将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动，200V跑胶12min。电泳完成后切断电源，取出凝胶，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并拍照记录。

5.质粒提取

将吸附柱放入收集管中，加入500μl的平衡液BL至吸附柱CP3中，12,000rpm离心1min。在离心管中加入1-5ml过夜培养的菌液，12,000rpm离心1min。事先加入RNaseA处理溶液P1，取250μl处理过的P1加入留有菌体沉淀的离心管，用移液器轻轻吹打细菌悬液。向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，12,000 rpm离心10min。P3加入后应立即混合。将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱 CP3中，再将吸附柱放入收集管中。12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。向吸附柱CP3中加入600μl事先加入无水乙醇的漂洗液 PW，12,000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，以免后续酶切、PCR等实验受漂洗液中残留乙醇的影响。将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。将DNA产物保存在-20℃，以防DNA降解。也可将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中，增加质粒的回收率。

6.慢病毒包装

6.1准备慢病毒质粒系统

慢病毒载体系统包括慢病毒干涉载体(pSicoR-GFP-shLncRNA KMU15)、包装质粒RRE (pLP1)和REV(pLP2)，包膜质粒VSVG(pLP/VSVG)四个质粒。pLP1、pLP2、pLP/VSVG 质粒干粉后先5000pm离心1min,然后加入20μl ddH2O溶解质粒,暂时不用可置于 -20℃。取2μl质粒转化至50μl TOP10感受态中，离心后将其涂至含100μg/ml Amp 的LB固体平板上。将涂好的平板正向放置于培养箱37℃培养1-2h，再倒置培养12-16h。挑取单菌落，接种于含100pg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养12-16h。从培养好的菌液中提取pLP1、pLP2、pLP/VSVG质粒，行后续实验，余菌种用含10％甘油的LB液体培养基保存于-20℃备用。质粒DNA的纯度能够影响的病毒上清滴度，影响转染效率，尽量保证质粒DNA的OD260/OD280比值为1.8-2.0之间，浓度为0.1-3ug/ μl。

6.2 293T细胞转染

培养293T细胞，进行细胞计数后按照104/孔的密度均匀接种于6孔板内。选择生长状态良好，长至80％-90％的细胞进行转染，使用的293T细胞传代次数不超过20代。将细胞分为两组进行转染，实验组(shlncRNA KMU15)利用pSicoR-GFP-shLncRNA KMU15 重组慢病毒干涉载体进行转染，对照组(Nagetive control，NC)利用pSicoR-GFP空载体进行转染。

准备DNA-lipofectamine 3000复合物。每皿细胞准备以下两个体系：

A：

B：

轻柔混匀以上两个体系，并分别在室温静置5min；将体系a和b混合，手指轻弹混匀室温静置20min,使其充分形成DNA-lipofectamineTM 3000复合物，期间培养基中可能会出现浑浊现象，但是不影响转染。

在DNA-lipid复合物形成过程中，将已生长至80％-90％的293T细胞更换9mL新鲜的无血清的生长培养基。将DNA-LipofectamineTM 3000复合物加入到培养皿中。轻缓混匀培养基，避免293T细胞悬浮，将细胞置于37℃,5％CO2细胞培养箱中培养8-10h。用10ml10％FBS高糖DMEM完全培养基更换含有DNA-lipofectamineTM 3000复合物的培养基。注意更换培养基时沿壁加入，动作轻柔，防止细胞漂浮。转染48h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，收上清于15ml无菌离心管中。4℃，1000rpm离心 5min去除细胞碎片，0.45um滤膜过滤，4℃保存备用。

6.3构建稳定低表达lncRNA KMU15的膀胱癌细胞

胰酶消化生长状况良好的EJ细胞接种于六孔板，长至70％左右，将低表达lncRNAKMU15的毒液添加到六孔板里，24h后换液，48h后倒置荧光显微镜下观察绿色蛋白表达情况，若绿色荧光较弱，传代时继续加毒液感染直至绿色荧光表达90％以上，或进行绿色荧光蛋白流式分选，提取RNA。

二、结果

qRT-PCR检测结果表明，无论是T24细胞还是5637细胞，相较于空载体对照组，shlncRNA KMU15转染组细胞中lncRNA-KMU15的表达均出现明显下调，并且结果还显示，shlncRNA KMU15-1的敲除效果最好，与对照组的lncRNA-KMU15表达量比较具有更加显著的抑制作用。随后提取6例膀胱癌患者临床肿瘤标本的原代细胞进行培养并使用 shlncRNA-KMU15-1敲低。细胞耐药性检测显示，lncRNA-KMU15-1敲低后6组膀胱癌细胞对DDP的IC50显著降低，其对DDP的敏感性显著增强。参见图3。

序列表

<110> 昆明医科大学第二附属医院

<120> 一种用于膀胱癌诊治监测的长链非编码RNA的发明及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 855

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

attacaggtg agagccacct tgcctagccc cagtcactgt tgaggtcacc attttaaagc 60

tgaggaaaca tgctcagcat ggcagcagaa gctctggcag tttctgtgtg tctggcccca 120

gctgcccagg ccccctgaac ctgaggggcc ttgctctggc cctggggttg gcctgggttt 180

ggcacctggc gctcgggccc ctgagggctt gcagtagggg agcagtggct tttttgagtt 240

gaatttagta gggctggact cctttcctgt cctttctgca ggtaaaggag atgagcagcg 300

ttgctctggt acgcagagaa gcttccagac actcctgggt tgcacgatag attaagtaat 360

tctactgatg ggcaccagct ccatgccagg acccagggct ccaaagccat ttccaggata 420

aatgcaggct ctgagagcga gtgccacgga tgactcctcc atggccgcac tttcttcaca 480

ttggctcctg tgagcttcct caacgctttc gaagctggcc ccgcttctgt ccactctgca 540

gagtgaacgt tgaggcctgc gaggtccctg ccatgcctgt ctcctcctcc cagcagtagt 600

gtgagctctg ctccgggatc aaggccagat ctttgcagcc catgtgcttg gctccctcag 660

ctgagcctca ggacgtgggt cctcagtttg tgctgtgcag cgtgaggggc cacactgcag 720

tcaagccagc tgggtgcaaa cagcagcttt tcttctactt ggtggccctc cttgggaagg 780

tccctctgct cctgtaactt catttcctca ttgataacaa agaaaaaaac agatcatatt 840

gcctgttgta aggat 855

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgccagagct tctgctgcca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccagccctac taaattcaac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggaaatggc tttggagccc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccccagtcac tgttgaggtc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agcttcgaaa gcgttgagga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcaccgtcaa ggctgagaac 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tggtgaagac gccagtgga 19

Claims (4)

1.一种lncRNA-KMU15，其序列为SEQIDNO:1所示。

2.权利要求1所述的lncRNA-KMU15在制备检测膀胱癌化疗药物敏感性制剂中的用途，其中所述的化疗药物为顺铂。

3.特异性检测权利要求1中所述lncRNA-KMU15的试剂在制备预测肿瘤化疗药物敏感性的产品中的应用；其中所述的肿瘤为膀胱癌，所述的化疗药物为顺铂；其中所述的特异性检测lncRNA-KMU15的试剂为引物对，所述的引物对如SEQIDNO:5-6所示。

4.权利要求1所述的lncRNA-KMU15表达的抑制剂在制备提高膀胱癌细胞对于顺铂的敏感性试剂中的应用，其特征在于，所述的抑制剂为干扰RNA序列，所述的干扰RNA序列为SEQIDNO:2所示。

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