CN109797151B

CN109797151B - Circ-CDH1抑制剂的应用

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Publication number: CN109797151B
Application number: CN201910048985.8A
Authority: CN
Inventors: 张弩
Original assignee: First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Priority date: 2019-01-18
Filing date: 2019-01-18
Publication date: 2023-03-31
Anticipated expiration: 2039-01-18
Also published as: US20200231695A1; CN109797151A; US11332540B2

Abstract

本发明属于基因工程抗体药物研制领域，涉及Circ‑CDH1抑制剂的应用。具体涉及了一种环状RNA Circ‑CDH1核酸分子及其表达的蛋白Circ‑CDH1‑28KD的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。尤其是针对Circ‑CDH1‑28KD设计了单克隆抗体Anti‑Circ‑CDH1，其能够特异性的检测细胞内源性环状RNA Circ‑CDH1编码的蛋白质的含量，同时可以显著抑制脑胶质瘤、乳腺癌等肿瘤细胞的侵袭转移，该单克隆抗体在肿瘤的临床检测及侵袭转移治疗中具有广阔的应用前景。

Description

Circ-CDH1抑制剂的应用

技术领域

本发明属于基因工程抗体药物研制领域，涉及Circ-CDH1抑制剂的应用。

背景技术

自2012年以来，在生物体内陆续发现了大量存在的环状的RNA(circula RNA，circRNA)，生物体内的环状RNA是一类具有特殊功能的RNA，而且是客观大量存在的。环状RNA由前体RNA通过剪切，然后由线性RNA的头对尾连接形成。以前的研究由于技术水平的限制，没有发现这部分环状RNA的客观存在，随着深度RNA测序及规模化生物信息技术的发展，研究者才真正发现在生物体内大量存在环状的RNA分子，环状RNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定。对于环状RNA的具体功能和作用分子机制的研究报道较少，目前只有几种假定的说法：环状RNA可以作为“sponge”海绵吸miRNA，抑制其功能；circRNA通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平；circRNA能与蛋白质结合,抑制蛋白质活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性，circRNA也可作为翻译的模板指导蛋白质的合成。

E-钙黏蛋白(E-cadherin)基因(E-cadherin gene.CDH1)是位于染色体16q22.1的一种肿瘤抑制基因。CDH1基因编码了上皮钙粘蛋白或E-钙粘蛋白。这种蛋白质存在于围绕上皮细胞的膜内，上皮细胞是沿着身体和腔肠表面排列的细胞。E-钙粘蛋白属于钙粘蛋白的蛋白质家族，其功能是帮助相邻细胞彼此粘附(细胞粘附)以形成正常的组织。E-钙粘蛋白是研究最彻底的钙粘蛋白之一。除了其在细胞粘附中的作用，E-钙粘蛋白参与细胞内化学信号传递，控制细胞成熟和运动，以及调节某些基因的活性。E-钙粘蛋白还是肿瘤抑制蛋白，它防止细胞生长和分裂太快或以不受控制的方式分裂。已经发现，多种癌症与该基因的功能丧失相关，如乳腺癌、卵巢癌、胃癌。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的抗肿瘤药物。

本发明的另一个目的在于提供Circ-CDH1-733核酸片段抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的另一个目的在于提供Circ-CDH1-28KD肽段抑制剂在制备抗肿瘤药物的应用。

本发明的另一个目的在于提供Circ-CDH1-733核酸片段和/或Circ-CDH1-28KD肽段在癌症筛查/诊断或预测中的应用。

本发明的另一个目的在于提供抗Circ-CDH1-28KD的抗体。

本发明的另一个目的在于提供Circ-CDH1-733特异性的siRNA。

本发明的另一个目的在于提供一种脑胶质瘤的治疗系统。

本发明的另一个目的在于提供针对脑胶质瘤治疗的药物研发方法。

一方面，本发明提供了Circ-CDH1-733抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，所述的Circ-CDH1-733抑制剂为Circ-CDH1-733核酸片段抑制剂或者Circ-CDH1-28KD肽段抑制剂。

非显而易见地，发明人在脑胶质细胞系U251中识别发现了一种环化模式的CDH1变异体，此环化模式的变异体是由CDH1基因的第7、8、9、10外显子通过首尾环化形成，由733个核苷酸组成。我们命名Circ-CDH1-733(见图1)，具体地，所述的Circ-CDH1-733核酸片段的序列如SEQ ID NO：1所示，其circBase ID名为：hsa_circ_0039992。通过sanger DNA测序的方法鉴定了环状RNA的准确环化接口(见图2)。CDH1形成环状RNA分子后，形成一个完整的开放阅读框，编码254个氨基酸，蛋白分子量约28KD，我们命名Circ-CDH1-28KD(见图3)，具体地，所述的Circ-CDH1-28KD肽段的序列如SEQ ID NO：2所示。

虽然，已经报道了多种肿瘤与CDH1基因的突变有关，但是，此前，从未有人发现该环状RNA Circ-CDH1-733，及其表达的蛋白的存在。更未见人报道Circ-CDH1的基因与脑胶质瘤有关。令人惊喜的是，发明人通过制备特异性的抗Circ-CDH1-28KD的单克隆抗体anti-CDH1-28或者是siRNA干扰Circ-CDH1-733，结果发现该抗体或siRNA可以显著地抑制肿瘤细胞的增长，表明了抑制该环状RNA或其表达的蛋白可以抑制肿瘤的增长。

该Circ-CDH1-733是由CDH1基因的第7、8、9、10外显子通过首尾环化形成，由733个核苷酸组成。而CDH1基因在多种肿瘤中均有转录。在这些转录CDH1基因的肿瘤中，均有可能产生Circ-CDH1-733。除了脑胶质瘤，发明人还在乳腺瘤等多种肿瘤类型中发现了Circ-CDH1-733。

其中，所述的Circ-CDH1-733核酸片段抑制剂为抑制Circ-CDH1-733核酸片段整体的或局部表达的物质。

作为一种可选的实施方案，所述的核酸效应分子为DNA、RNA、PNA或DNA-RNA-杂合体。所述核酸效应分子可以是单链的或双链的。可以使用衍生自逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒或痘苗病毒或者衍生自各种细菌质粒的表达载体来将核苷酸序列递送至所靶器官、组织或细胞群。可以使用这样的构建体来将不可翻译的正义或反义序列引入到细胞中。甚至在不存在整合到DNA中的情况下，此类载体也可以继续转录RNA分子直至它们由于内源核酸酶而丧失能力。

所述核酸效应分子可以选自能够抑制Circ-CDH1-733表达的小的抑制核酸分子，例如短干扰RNA(siRNA)，双链RNA(dsRNA)，microRNA(miRNA)，核酶，以及小发夹RNA(shRNA)，这些都能减弱或消除Circ-CHD1-733和/或Circ-CDH1-28KD肽段的表达。

这些小的抑制核酸分子可能包括第一、第二链，二者杂交彼此形成一个或多个双链区，每条链大约18～28个核苷酸的长度，大约18～23个核苷酸的长度，或者18，19，20，21，22个核苷酸的长度。另外，单链也可能包含能够相互杂交形成双链的区域，例如在shRNA分子中。

这些小的抑制核酸分子在保持这种减弱或消除Circ-CHD1-733和/或Circ-CDH1-28KD肽段的表达的能力时，可能包括修饰性核苷酸。修饰性核苷酸可用于改善体外或体内特性，如稳定性、活性和/或生物利用度。举个例子，这些修饰性核苷酸可能含有脱氧核苷酸、2’-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸、4’-三核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸和/或2’-O-甲氧乙基核苷酸等。小的抑制核酸分子，如短干扰RNA(siRNA)，也可能含有5’-和/或3’-帽结构，以此来防止核酸外切酶对其降解。

在一些实施例中，小抑制核酸分子组成的双链核酸含有两端钝、或悬垂的核苷酸。其他核苷酸可能包括会导致错位、凸起、循环、或摆动碱基对的核苷酸。小抑制核酸分子可以设计配方以便施用，例如，通过脂质体包裹，或掺入其他载体(如可生物降解聚合物水凝胶，或环糊精)。

优选地，所述的Circ-CDH1-733核酸片段抑制剂针对核酸序列SEQ ID NO：9而设计获得。

在一些实施例中，所述的Circ-CDH1-733核酸片段抑制剂为siRNA。作为优选的实施方式，所述的抑制剂系针对于Circ-CDH1-733环状接口而设计；优选地，针对Circ-CDH1-733第713位至第20位中的任意跨越接口的序列片段而设计，所述序列片段优选18个碱基以上的长度，至少与Circ-CDH1-733第716位至17位的序列互补；更优选地，所述的抑制剂系针对于Circ-CDH1-733的以下关键片段中的一个而设计，或者可选地与Circ-CDH1-733的以下序列互补：

Circ-CDH1-733第721位至第8位的片段互补，又或者Circ-CDH1-73第728位至第16位的片段互补；优选与Circ-CDH1-733第727位至第15位的片段互补。在一些优选的实施例中，其选自SEQ ID NO：6-8中的任意一条。

其中，所述的Circ-CDH1-28KD肽段抑制剂为抗体及其功能性片段、或小分子化合物。

作为优选的实施方式，所述的Circ-CDH1-28KD肽段抑制剂为抗体。所述的抗体可以为单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段(例如，Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子)。所述抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类型的。

所述抗体可以以具有或没有修饰的形式进行使用，并且可以共价地或非共价地进行标记，用例如报道基团或效应基团。

根据本发明的“抗体片段”呈现与相应的抗体基本上相同的表位结合位点，和/或具有与相应的抗体实质上相同的Circ-CDH1-28KD肽段抑制活性。

用于产生本发明的抗体的方法是本领域技术人员已知的。

在一些实施例中，所述的抗体是针对CDGGHSHRRGR(SEQ ID NO：3)氨基酸序列设计获得；是以多肽CDGGHSHRRGR(SEQ ID NO：3)作为免疫原制备单克隆抗体而得。

通过肿瘤细胞划痕实验和细胞侵袭分析，表明本发明的抗体anti-CDH1-28能很好抑制脑胶质瘤细胞的侵袭，结果参见图5、图6。

另一方面，本发明还提供了Circ-CDH1-733核酸片段和/或Circ-CDH1-28KD肽段的检测试剂在制备癌症筛选/诊断/预测/预后诊断剂或诊断系统中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种脑胶质瘤治疗系统，该系统包括

1)Circ-CDH1-733和/或Circ-CDH1-28KD检测系统；

2)用药系统；

其中，所述的检测系统为现有技术中可以检测环状RNA和其表达的肽段的检测系统，如荧光定量PCR和/或免疫组化。该检测系统用于检测Circ-CDH1-733和/或Circ-CDH1-28KD是否存在，如果存在，则接下来可以实施用药系统。

其中，所述的用药系统含有Circ-CDH1-733核酸片段和/或Circ-CDH1-28KD肽段抑制剂。

优选地，所述的Circ-CDH1-733核酸片段和/或Circ-CDH1-28KD肽段抑制剂如上文所述。

另一方面，本发明还提供了一种治疗脑胶质瘤的药物研发方法。该方法为针对Circ-CDH1-733核酸片段，设计相应的抑制剂或基因治疗工具；作为优选的实施方式，通过基因干扰、基因编辑、反义核酸序列或锁核酸(LNA)的方式实现。

另一方面，本发明还提供了另一种治疗脑胶质瘤的药物研发方法。该方法为针对Circ-CDH1-28KD，设计相应的Circ-CDH1-28KD的活性抑制剂。进一步地，所述的Circ-CDH1-28K活性抑制剂为抗体及其功能性片段、或小分子化合物；优选地，所述的Circ-CDH1-28KD活性抑制剂为抗体。

另一方面，本发明还提供了一种Circ-CDH1-733特异性的siRNA。

所述的siRNA系针对于Circ-CHD1-733环状接口而设计。优选地，针对Circ-CHD1-733第713位至第20位中的任意跨越接口的序列片段而设计；所述序列片段优选18个碱基以上的长度，至少与Circ-CHD1-733第716位至17位的序列互补。

更优选地，所述的siRNA系针对于Circ-CHD1-733的以下关键片段中的一个而设计，或者可选地与Circ-CHD1-733的以下序列互补：

包含Circ-CDH1-733第721位至第8位的序列；

或者包含Circ-CDH1-73第728位至第16位的序列；

又或者包含Circ-CDH1-73第727位至第15位的序列。

作为更优选的实施方式，所述的siRNA选自SEQ ID NO：6-8中的任意一条。

另一方面，本发明还提供了一种多肽，其特征在于序列如SEQ ID NO：3所示。

另一方面，本发明还提供了Circ-CDH1-733核酸片段或Circ-CDH1-28KD肽段，所述的核酸片段的序列如SEQ ID NO：1所示；所述的肽段的序列如SEQ ID NO：2所示。

另一方面，本发明还提供了一种抗Circ-CDH1-28KD的抗体。其采用如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列作为免疫原制备获得。所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。作为一种优选的实施方式，所述的抗体为单克隆抗体。在本发明的一个实施例中，所述的抗体是针对CDGGHSHRRGR(SEQ ID NO：3)作为免疫原制备的单克隆抗体而得命名为anti-CDH1-28。

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，所述的组合物含有上述的抗体。作为优选的实施方式，含有抗体anti-CDH1-28。当然，作为优选的实施方式，所述的药物组合物还含有药学上可接受的载体。

另一方面，本发明还提供了一种用于肿瘤诊断和/或预后判断的试剂盒，所述试剂盒含有：用于检测Circ-CDH1-733的探针，或扩增Circ-CDH1-733的引物，或者抗Circ-CDH1-28KD蛋白的抗体。作为本发明优选的实施方式，所述的Circ-CDH1-733检测试剂为针对SEQID NO：10序列(接口位置附近)。

SEQ ID NO：10

CTGAAAAGAGAGTGGAAGTGTCCGAGGACTTTGGCGTGGGCCAGGAAATCACATCCTACACTGCCCAGGAGCCAGACACATTTATGGAACAGAAAATAACGAACCTCTGTGATGGAGGTCACAGCCACAGACGCGGACGATGATGTGAACACCTACAATGCCGCCATCGCTTACACCATCCTCAGCCAAGATCCTGAGCT

另一方面，本发明还提供了一种用于肿瘤诊断和/或预后判断的系统，其含有以下构件：

a.Circ-CDH1-733的检测构件；

b.结果判断构件；所述的结果判断构件用于根据检测构件所检测的Circ-CDH1-733的表达量判断脑胶质瘤的患病风险或者预后风险；

若Circ-CDH1-733的表达量高，则判断高风险；反之则低风险。

作为一种可实施的方式，Circ-CDH1-733的表达量的高低可依据组化评分来划分。作为一种具体的组化评分方法，其步骤为：由至少两位病理科医生，在双盲条件下(不知晓任何相关临床及病理资料)各自独立判断免疫组化结果。

结果的判断：在光学显微镜下观察组织标本的着色程度。Circ-CDH1-733蛋白阳性表达主要表现为细胞膜呈现棕黄色或者棕褐色颗粒，也有少量胞浆内旱现棕黄色颗粒。高倍镜下(放大200倍)随机取4个不同的视野，计数细胞总数及核阳性细胞数，按阳性细胞所占的百分比计分：

阳性细胞率≤5％：1分；

阳性细胞率＞25％且≤50％：2分；

阳性细胞率＞50％且≤75％：3分；

阳性细胞率＞75％：4分；

同时，根据染色的强弱程度计分：

阴性：1分；

弱染色：2分；

中等强度染色：3分；

强染色：4分；

根据二者的乘积来判断结果：≤4分为(-)；＞4且≤8为(+)；＞8且≤12为(++)；＞12且≤16为(+++)。统计分析时(-)和(+)合计为阴性或弱阳性表达，(++)和(+++)合计为强阳性表达。以上结果均为在至少两位病理科医生在双盲情况下检测确定。

应用AxioVision Rel.4.6电脑图片分析系统(AxioVision Rel.4.6computerizedimage analysis system)附带的自动测量程序(Carl Zeiss，Oberkochen，Germany)定量分析免疫组织化学染色结果中目标蛋白在肿瘤组织和正常组织中的表达：着色的免疫组化切片在200x放大倍数下观察，每张切片分析10个代表性着色视野，计算平均光密度值(MOD)，以平均MOD值代表染色强度。应用，检验比较不同组间平均光密度值的差异，P≤0.05则为有统计学意义。

优选地，所述的Circ-CDH1-733的检测构件含有Circ-CDH1-733检测试剂；

优选地，所述的Circ-CDH1-733的检测试剂为用于检测Circ-CDH1-733的探针，或扩增Circ-CDH1-733的引物，或者抗Circ-CDH1-28KD蛋白的抗体。

优选地，所述的Circ-CDH1-733的表达量为环状RNA的量或者其表达的蛋白Circ-CDH1-28KD的量；

优选地，所述的Circ-CDH1-733具有SEQ ID NO：1所示的核酸序列；

优选地，所述的Circ-CDH1-28KD具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

优选地，所述的Circ-CDH1-733检测试剂为针对SEQ ID NO：10序列(接口位置附近)。

本发明中，所述的肿瘤为CDH1突变的肿瘤类型；具体地，所述的CDH1突变的肿瘤为表达环状Circ-CDH1-733并翻译相应蛋白的肿瘤；更具体地，所述的表达环状Circ-CDH1-733并翻译相应蛋白肿瘤包括但不限于：脑胶质瘤、肝癌，乳腺癌，胰腺癌、结肠癌、胃癌等中的一种或多种；特别优选地，所述的肿瘤为脑胶质瘤。

本发明的有有益效果：

1.本发明首次在肿瘤细胞中发现了CDH1的一种环化模式的变异体，Circ-CDH1-733，以及其表达的蛋白Circ-CDH1-28KD，并发现了抑制Circ-CDH1-733或Circ-CDH1-28KD可以实现对肿瘤的抑制。为肿瘤的诊断提供了新的标志物，同时，为肿瘤的治疗提供了新的靶点。

2.本发明设计合成了抗Circ-CDH1-28KD的抗体，其可以有效的抑制肿瘤细胞的增长。

附图说明

图1 CDH1环状RNA形成模式图；

图2 CDH1环状RNA测序鉴定结果；

图3 CDH1环状RNA翻译小分子蛋白模式图；

图4 Western blot检测细胞内源性Circ-CDH1-28KD蛋白存在；

图5细胞划痕实验检测单克隆抗体anti-CDH1-28抗肿瘤效果；

图6细胞侵袭分析实验检测单克隆抗体anti-CDH1-28抗肿瘤效果；

图7脑胶质瘤以及正常组织中Circ-CDH1-733的表达；

图8脑胶质瘤以及正常组织中circ-CDH1-28KD的表达。

实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

需要说明的是：本发明中，所述的Circ-CDH1-733具指环状RNA Circ-CDH1-733核酸片段，也指该环状RNA翻译的肽段Circ-CDH1-28KD。

目前，已被公开报道的一种Circ-CDH-733核酸片段为CDH1基因第7到10外显子通过首尾连接形成闭合的环形RNA分子，长度为733nt。Circ-CDH1-733核酸片段表达产物为Circ-CDH1-28KD肽段。当然，不能排除的可能性是，后续会发现其他变异体形式的Circ-CDH-733，执行着类似的机制。根据本发明的理念，这些变异体形式的针对性的抑制、调节、检测应用等，也同样是本发明的保护范围。

Circ-CDH1-733抑制剂为至少部分引起环状RNA Circ-CDH1-733的遗传信息路径阻断的物质或工具，可以在蛋白质水平(Circ-CDH1-28KD肽段)抑制，也可以在核酸水平(Circ-CDH1-733核酸片段)抑制。蛋白质水平起作用的抑制剂可以选自抗体和/或小分子化合物等。在核酸水平起作用的抑制剂例如反义分子，RNAi分子和/或核酶。

实施例1 CDH1环状RNA形成及DNA测序鉴定

通过UCSC(http://genome.ucsc.edu/)在线数据库软件分析发现CDH1基因定位于人的第16号染色体长臂chr16(q11.2)区域，基因组跨越98324bp，编码最长蛋白882个氨基酸的变异体共有16个外显子组成；根据环状RNA权威数据库circBase(http://circrna.org/)收录的CDH1环状RNA信息，发现CDH1基因的第7到10外显子通过首尾连接形成闭合的环形RNA分子，长度为733nt，命名Circ-CDH1-733(见图1)，其含有SEQ ID NO：1所示的序列；通过在环状RNA连接位点两侧设计PCR扩增引物，扩增环状RNA的环化位点两翼的序列，经过sanger DNA测序的方法，获得了Circ-CDH1-733环状RNA的准确环化位点。设计特异性PCR扩增Circ-CDH1-733的PCR引物序列如下：

SEQ ID NO：4

F1:5'GTGGGCCAGGAAATCACATC 3'，

SEQ ID NO：5

R1:5'TCACATCATCGTCCGCGTCT 3'

引物的扩增产物大小为106bp；以脑胶质瘤U251细胞3的cDNA为模板，PCR扩增目标片段的反应体系及条件描述如下PCR为30μl总体系，具体是2×PCR MIX(Vazyme公司)15μl，上下游引物(10mM)各1.5μl，cDNA模板1μl，用灭菌水补足30μl体系。反应条件为：95℃5min预变性，循环内95℃15s变性，60℃30s退火，72℃延伸25s,共40个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸5min，然后16℃保存。PCR产物经过纯化后做sanger DNA序列测定。通过sangerDNA测序的方法鉴定了环状RNA的准确环化接口(见图2)。

实施例2 CDH1环状RNA翻译小分子蛋白的预测识别及小鼠单克隆抗体制备

通过对Circ-CDH1-733环状RNA分子的核苷酸序列分析发现，RNA发生环化后可以形成一个由ATG-TGA组成的开放阅读框，通过翻译产生一个由254个氨基酸组成的新型的CDH1小蛋白，通过蛋白质分子量预测软件http://www.bio-soft.net/sms/prot_mw.html预测蛋白的分子量约28KD，命名Circ-CDH1-28KD(见图3)，其含有SEQ ID NO：2所示的序列。根据Circ-CDH1-28KD氨基酸序列的组成，设计能用于Elisa、western blot方法检测以及细胞功能测试的小鼠单克隆抗体：方法如下：通过化学合成多肽的方法，合成特异性针对环状RNA CDH1产生的多肽CDGGHSHRRGR(SEQ ID NO：3)氨基酸序列作为免疫原；单克隆抗体制备采用标准化的制备流程如下：

1.免疫5只小鼠，进行2-3次免疫；2.采集5只小鼠血清，分别做ELISA检测；3.效价合格后，经客户同意后，进行融合实验：4.选取血清效价最高的小鼠的取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合。5.有限稀释融合细胞，96孔板克隆化。6.HAT筛选杂交瘤细胞；7.免疫原检测，检测出抗原阳性1-10个阳性细胞，扩大培养至48孔板。8.挑取阳性克隆扩增，微量-80度冻存细胞。9.ELISA检测获得阳性克隆。9.每个克隆做96孔板有限稀释培养，ELISA筛选阳性亚克隆；10.阳性克隆扩增，少量-80度冻存细胞；11.选取杂交瘤细胞制备腹水，Protein A纯化腹水，获得纯化后单抗。

实施例3细胞培养及转染siRNA

脑胶质瘤细胞U251用50万个细胞接种于6孔板培养板中，24h细胞贴壁后可进行转染；转染前，将100微升无血清培养基DMEM和siNRA制备成混合液；将100微升无血清培养基DMEM和5微升liop2000脂质体均匀混合，做成脂质体混合液；将上述两种混合液等比例混合，室温放置20min；按照转染试剂(Lipofectamine^TM 2000Transfection Reagent，ThermoFisher Scientific，#11668019)操作说明书操作；最终6孔板中的孔终体积为1毫升，siNRA终浓度为100nM，转染6小时候，换成正常培养基(10％胎牛血清加90％DMEM培养基加1％青霉素链霉素)1毫升，细胞培养条件37度，5％二氧化碳。

其中，所述的siNRA的序列如下：

siRNA-1 SEQ ID NO：6

AACAGAAAAUAACGAACCUCUtt

siRNA-2 SEQ ID NO：7

AUAACGAACCUCUGUGAUGGAtt

siRNA-3 SEQ ID NO：8

AAUAACGAACCUCUGUGAUGGtt

转染siRNA后，Cir-CDH1-733的含量明显下降，其翻译的蛋白质含量亦明显下降，三条siRNA均有效，siRNA-2和siRNA-3的效果略优于siRNA-1(见图4)。

实施例4 ELISA方法检测制备的小鼠单克隆抗体的效价

化学合成的多肽CDGGHSHRRGR(SEQ ID NO：3)作为抗原，进行1:5000稀释，取100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反应板中，4℃放置过夜，小鼠单克降抗体用PBS连续稀释，然后加入反应板中，37℃恒温2h，洗涤3次，兔抗鼠IgG-HRP，用封闭液1：8000稀释，100μL/孔，37℃恒温1h，洗涤洗5次，蒸馏水洗2次；加新鲜配制的底物溶液100μL/孔，室温暗处放置20min；加50μL/孔终止液，用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值。Elisa测试制备的单克隆抗体(见表1)

表1 Elisa测试制备的单克隆抗体

	从1mg/ml开始稀释	抗体浓度(ng/ml)	抗circ-CDH1抗体
				1	1/1000	1000	3.064
2	1/2000	500	2.855
				3	1/4000	250	2.52
4	1/8000	125	2.148
				5	1/16000	62.5	1.695
6	1/32000	31.25	1.192
				7	1/64000	15.62	0.785
8	1/128000	7.81	0.45
				9	1/256000	3.9	0.28
10	1/512000	1.95	0.19

实施例5 Western blot蛋白检测

用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量法对提取的蛋白进行定量；配置5％SDS-PAGE浓缩胶、15％SDS-PAGE分离胶，上样总蛋白为15微克；采用80V 20分钟、150V 1h跑蛋白电泳；转膜采用100V转膜2h；5％的脱脂牛奶封闭1h；circ-CDH1-28KD小鼠单克隆抗体(1:2000)、β-actin抗体(abcam货号ab197345)(1:3000)；孵育4度过夜；第二天采用小鼠二抗(1:10000)常温孵育1h，TBST洗涤5遍每次5min，然后发光，显影，定影。

实验结果如图4所示：western检测在U251细胞中有circ-CDH1-28KD蛋白的表达，并且用特异的小核酸序列干扰Circ-CDH1-733表达后circ-CDH1-28KD蛋白表达明显降低。

实施例6细胞划痕实验

脑胶质瘤U251细胞按照50万个细胞铺到6孔板中，过夜培养让细胞贴壁，第二天进行细胞划痕，PBS洗细胞3次，加入细胞培养基(10％胎牛血清加90％DMEM培养基加1％青霉素链霉素)1毫升，培养基中设置分组为circ-CDH1-28KD小鼠单克隆抗体浓度0μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.8μg/ml；细胞培养条件37度，5％二氧化碳，细胞培养24小时后拍照。

实验结果见图5，添加circ-CDH1-28KD单克隆抗体后的U251细胞其移动能力明显减弱且随着抗体浓度的不断提高，单克隆抗体对U251细胞移动能力的抑制作用逐渐提高。提示circ-CDH1-28KD可作为潜在靶向目标。

实施例7细胞侵袭实验

在Transwell小室上室铺上30ugMartrigel胶，加入脑胶质瘤U251细胞20万个，培养基中设置分组为circ-CDH1-28KD小鼠单克隆浓度0μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.8μg/ml；细胞培养条件37度，5％二氧化碳，培养48小时后，乙醇固定滤膜，PE染色，拍照观察统计穿过Martrigel的细胞数。

实验结果见图6：添加circ-cdh1-28KD单克隆抗体后的U251细胞其转移能力明显减弱且随着抗体浓度的不断提高，单克隆抗体对U251细胞转移能力的抑制作用逐渐提高。

序列表

<110> 中山大学附属第一医院

<120> Circ-CDH1抑制剂的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 733

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gaacctctgt gatggaggtc acagccacag acgcggacga tgatgtgaac acctacaatg 60

ccgccatcgc ttacaccatc ctcagccaag atcctgagct ccctgacaaa aatatgttca 120

ccattaacag gaacacagga gtcatcagtg tggtcaccac tgggctggac cgagagagtt 180

tccctacgta taccctggtg gttcaagctg ctgaccttca aggtgagggg ttaagcacaa 240

cagcaacagc tgtgatcaca gtcactgaca ccaacgataa tcctccgatc ttcaatccca 300

ccacgtacaa gggtcaggtg cctgagaacg aggctaacgt cgtaatcacc acactgaaag 360

tgactgatgc tgatgccccc aataccccag cgtgggaggc tgtatacacc atattgaatg 420

atgatggtgg acaatttgtc gtcaccacaa atccagtgaa caacgatggc attttgaaaa 480

cagcaaaggg cttggatttt gaggccaagc agcagtacat tctacacgta gcagtgacga 540

atgtggtacc ttttgaggtc tctctcacca cctccacagc caccgtcacc gtggatgtgc 600

tggatgtgaa tgaagccccc atctttgtgc ctcctgaaaa gagagtggaa gtgtccgagg 660

actttggcgt gggccaggaa atcacatcct acactgccca ggagccagac acatttatgg 720

aacagaaaat aac 733

<210> 2

<211> 254

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Glu Val Thr Ala Thr Asp Ala Asp Asp Asp Val Asn Thr Tyr Asn

1 5 10 15

Ala Ala Ile Ala Tyr Thr Ile Leu Ser Gln Asp Pro Glu Leu Pro Asp

20 25 30

Lys Asn Met Phe Thr Ile Asn Arg Asn Thr Gly Val Ile Ser Val Val

35 40 45

Thr Thr Gly Leu Asp Arg Glu Ser Phe Pro Thr Tyr Thr Leu Val Val

50 55 60

Gln Ala Ala Asp Leu Gln Gly Glu Gly Leu Ser Thr Thr Ala Thr Ala

65 70 75 80

Val Ile Thr Val Thr Asp Thr Asn Asp Asn Pro Pro Ile Phe Asn Pro

85 90 95

Thr Thr Tyr Lys Gly Gln Val Pro Glu Asn Glu Ala Asn Val Val Ile

100 105 110

Thr Thr Leu Lys Val Thr Asp Ala Asp Ala Pro Asn Thr Pro Ala Trp

115 120 125

Glu Ala Val Tyr Thr Ile Leu Asn Asp Asp Gly Gly Gln Phe Val Val

130 135 140

Thr Thr Asn Pro Val Asn Asn Asp Gly Ile Leu Lys Thr Ala Lys Gly

145 150 155 160

Leu Asp Phe Glu Ala Lys Gln Gln Tyr Ile Leu His Val Ala Val Thr

165 170 175

Asn Val Val Pro Phe Glu Val Ser Leu Thr Thr Ser Thr Ala Thr Val

180 185 190

Thr Val Asp Val Leu Asp Val Asn Glu Ala Pro Ile Phe Val Pro Pro

195 200 205

Glu Lys Arg Val Glu Val Ser Glu Asp Phe Gly Val Gly Gln Glu Ile

210 215 220

Thr Ser Tyr Thr Ala Gln Glu Pro Asp Thr Phe Met Glu Gln Lys Ile

225 230 235 240

Thr Asn Leu Cys Asp Gly Gly His Ser His Arg Arg Gly Arg

245 250

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Cys Asp Gly Gly His Ser His Arg Arg Gly Arg

1 5 10

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgggccagg aaatcacatc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcacatcatc gtccgcgtct 20

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aacagaaaau aacgaaccuc u 21

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

auaacgaacc ucugugaugg a 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aauaacgaac cucugugaug g 21

<210> 9

<211> 64

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

gagccagaca catttatgga acagaaaata acgaacctct gtgatggagg tcacagccac 60

agac 64

<210> 10

<211> 200

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

ctgaaaagag agtggaagtg tccgaggact ttggcgtggg ccaggaaatc acatcctaca 60

ctgcccagga gccagacaca tttatggaac agaaaataac gaacctctgt gatggaggtc 120

acagccacag acgcggacga tgatgtgaac acctacaatg ccgccatcgc ttacaccatc 180

ctcagccaag atcctgagct 200

Claims

1.SEQ ID NO：6-8任意一条所示的siRNA在制备抗脑胶质瘤药物中的应用。

2.一种脑胶质瘤治疗系统，其特征在于，包括：

1)Circ-CDH1-733和/或Circ-CDH1-28KD检测系统；所述Circ-CDH1-733的序列如SEQIDNO：1所示，所述Circ-CDH1-28KD的序列如SEQ ID NO：2所示，

2)治疗脑胶质瘤的药物，所述治疗脑胶质瘤的药物含有SEQ ID NO：6-8任意一条所示的siRNA。

3.一种Circ-CDH1-733特异性的siRNA，所述的siRNA选自SEQ ID NO：6-8中的任意一条。

4.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物含有SEQ ID NO：6-8任意一条所示的siRNA。

5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还含有药学上可接受的载体。

6.一种多肽，其特征在于序列如SEQ ID NO：3所示。

7.如权利要求6所述的多肽，其特征在于，所述多肽作为免疫原制备单克隆抗体。