CN109706245A

CN109706245A - 针对hsa_circ_0000478基因的小干扰RNA及其应用

Info

Publication number: CN109706245A
Application number: CN201910140092.6A
Authority: CN
Inventors: 何金花; 黎毓光; 韩泽平; 左继东; 陈顺仪; 何梦玲
Original assignee: Guangzhou Panyu Central Hospital
Current assignee: Guangzhou Panyu Central Hospital
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2019-02-26
Publication date: 2019-05-03
Anticipated expiration: 2039-02-26
Also published as: CN109706245B

Abstract

本发明公开一种针对hsa_circ_0000478基因的小干扰RNA及其应用。本发明成功获得hsa_circ_0000478的siRNA，瞬时转染LOVO细胞能有效地干扰hsa_circ_0000478基因的表达，其干扰效率达到(90.25±0.96)％；转染结肠癌癌LOVO细胞的结果显示，hsa_circ_0000478基因被干扰后能明显降低LOVO细胞增殖速率、促进细胞早期凋亡、抑制细胞侵袭与迁移。本发明首次证实hsa_circ_0000478表达的敲除与结肠癌细胞增殖、侵袭、迁移以存在直接对应关系，可作为结肠癌的治疗靶点，本发明的siRNA也有望作为一种生物治疗技术应用到结肠癌的治疗中。

Description

针对hsa_circ_0000478基因的小干扰RNA及其应用

技术领域

本发明涉及小干扰RNA技术，特别涉及一种针对hsa_circ_0000478基因的小干扰RNA及其应用。具体地说，涉及一种抗结肠癌的小干扰RNA(siRNA)针对hsa_circ_0000478基因的序列，提供了一种抗结肠癌hsa_circ_0000478小干扰RNA序列，具有靶向性抑制结肠癌细胞增殖、侵袭、迁移，从而达到抑制结肠癌的发展与转移的作用。

背景技术

结肠癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一，严重威胁人类的生命和健康，其发病率居常见恶性肿瘤的第3位，其病死率也居癌症死亡的第3位。结肠癌的发生发展是一个多步骤、多阶段以及多基因参与的过程，其中基因异常表达在结肠癌发生发展过程中又起着重要作用。虽然前人在结肠癌方面已经做了大量工作，但是还未能阐明其发病机制，因此，对结肠癌发病机制的研究仍需继续深入，为结肠癌的诊断、预后判断、科学治疗提供依据，最终能够有效控制结肠癌的发病进程、改善患者的预后、减轻患者的经济负担。

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类新发现的内源性非编码RNA(non-codingRNA，ncRNA)，是RNA领域的最新研究热点。与含有5’帽状结构与3’腺苷酸尾巴的线性RNA不同，circRNA形成特殊的共价闭合环状结构，既没有5’-3’极性，亦无多聚腺苷酸尾巴。研究表明，circRNA是一类广泛存在于哺乳动物细胞中的内源性RNA分子，在转录后水平具有调控基因表达的作用。circRNA在人体细胞中广泛表达，并在肿瘤的发生过程中起着较为重要的作用。深入研究circRNA的表达及调控机制可提高相关疾病的预防和诊断水平。

hsa_circ_0000478定位于chr13:42439871-42442613，长度为345bp，来源于母基因Homo sapiens von Willebrand factor A domain containing 8(VWA8),transcriptvariant 2,NM_001009814。目前发现hsa_circ_0000478表达于肺癌，肝癌、白血病等细胞中，在肿瘤的发生与发展具有一定的作用。

小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)是生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞内存在与内源性mRNA编码区内同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象。由于siRNA能抑制特定基因的表达，应用siRNA进行基因治疗有非常广阔的临床应用前景。目前，各大生物技术公司都在积极开发这类药物，并即将进入临床试验阶段。原癌基因是细胞基因组中的正常组成成分，当受到多种因素的作用使其发生变异时，激活成为癌基因，癌基因与细胞异常增殖及癌的发生有关。可以应用siRNA技术来抑制癌基因的mRNA，从而抑制肿瘤生长，同时，还可通过siRNA技术促进癌细胞凋亡、调控细胞周期以及抑制血管生成等方面来治疗癌症。尽管RNAi技术作为肿瘤基因治疗的新型工具仍然存在着许多急待解决的问题，如怎样提高肿瘤细胞的靶向性等等。但随着科学工作者对RNAi研究的不断深入，siRNA技术将会成为一种非常有前景的肿瘤治疗手段。

因此，如果能利用RNAi技术，涉及特异性针对hsa_circ_0000478基因的siRNA，彻底研究清楚hsa_circ_0000478和结肠癌转移的组织间的关系，将会为结肠癌相关的癌症的治疗提供一种有益的途径。因此，本发明的技术目的在于利用RNAi技术研究清楚hsa_circ_0000478与结肠癌的关系。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供hsa_circ_0000478在制备结肠癌诊断试剂盒中的应用。本发明首次运用microarray技术及RT-PCR技术筛选到hsa_circ_0000478在结肠癌组织中及结肠癌细胞中呈高表达，提示其可能发挥促癌的作用。

本发明的另一目的在于提供一种hsa_circ_0000478siRNA。本发明通过大量筛选和实验工作得到针对hsa_circ_0000478的siRNA。

本发明的另一目的在于提供所述的hsa_circ_0000478siRNA的编码基因。

本发明的再一目的在于提供上述hsa_circ_0000478siRNA的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种hsa_circ_0000478在制备结肠癌诊断试剂盒中的应用。

所述的hsa_circ_0000478的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的hsa_circ_0000478的结构由如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列首尾连接成的环状结构。

本发明还提供一种结肠癌诊断试剂盒，包括扩增hsa_circ_0000478的引物。

所述的扩增引物的序列如下：

hsa_circ_0000478上游引物F：5'-cctattatgctctatcagcgct-3'(SEQ ID NO.3)；

hsa_circ_0000478下游引物R：5'-caatccggatggtcacagaa-3'(SEQ ID NO.4)；

本发明还提供一种hsa_circ_0000478siRNA(本发明的名称为si_circ_0000478)，其序列如下：

正义链序列为：5'-GCUCUAUCAGCGCUUUGAA-3'(SEQ ID NO.5)；

反义链序列为：5'-UUCAAAGCGCUGAUAGAGC-3'(SEQ ID NO.6)；

本发明提供上述的hsa_circ_0000478siRNA的编码基因，其核苷酸序列分别为：5'-GCTCTATCAGCGCTTTGAA-3'(SEQ ID NO.7)，或5'-TTCAAAGCGCTGATAGAGC-3'(SEQ IDNO.8)。

上述siRNA经Blast Search检索确认与hsa_circ_0000478以外的人类已知基因序列无同源性；

siRNA是一种片段单链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA；

上述siRNA干扰的靶序列位于hsa_circ_0000478基因序列的接头处，即：5'-GCTCTATCAGCGCTTTGAA-3'；

所述的hsa_circ_0000478基因序列如SEQ ID NO.1所示。

上述siRNA的序列；设计合成由广州吉赛生物科技术公司完成；

本发明提供上述hsa_circ_0000478siRNA在抑制结肠癌细胞中hsa_circ_0000478基因表达的应用。

优选的，所述的结肠癌细胞为结肠癌细胞LOVO。

本发明提供上述hsa_circ_0000478siRNA在制备治疗结肠癌药物中的应用。

本发明提供一种治疗结肠癌的药物，包括上述hsa_circ_0000478siRNA。

将上述siRNA序列转染宿主细胞，优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞，更优选地，所述宿主细胞为真核细胞，更优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，更优选地，所述宿主细胞为结肠癌细胞；最优选地，所述宿主细胞为结肠癌细胞LOVO。

换言之，在本发明中，分别针对在结肠癌高表达的hsa_circ_0000478基因的靶位点，委托广州吉赛生物科技术有限公司化学合成一段siRNA序列。本发明的研究发现，通过转染这种siRNA片段，可以降低hsa_circ_0000478在结肠癌细胞系中的内源性RNA高表达，从而抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移。因此，本发明首次证实hsa_circ_0000478表达的敲除与结肠癌细胞增殖、侵袭、迁移以存在直接对应的关系，hsa_circ_0000478可以作为结肠癌的治疗靶点，本发明的siRNA也有望作为一种生物治疗技术应用到结肠癌的治疗中。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明使用RNA干扰技术，成功获得hsa_circ_0000478的siRNA，瞬时转染LOVO细胞能有效地干扰hsa_circ_0000478基因的表达，通过RT-PCR检测，在瞬时转染LOVO细胞系中，hsa_circ_0000478基因的干扰效率达到(90.25±0.96)％。

(2)本发明将合成的hsa_circ_0000478siRNA序列转染结肠癌癌LOVO细胞。结果显示，hsa_circ_0000478基因被干扰后能明显降低LOVO细胞增殖速率、促进细胞早期凋亡、抑制细胞侵袭与迁移。

(3)本发明明确了hsa_circ_0000478是一种癌基因，并且通过siRNA干扰hsa_circ_0000478基因在结肠癌细胞中的表达，从而抑制了结肠癌细胞的增殖。

附图说明

图1是RT-PCR检测结肠癌细胞HCT-116，HT-29，LOVO、SW480、SW620细胞，人正常结肠上皮细胞FHC共6株细胞系中hsa_circ_0000478的表达水平的结果图。

图2是转染si_circ_0000478后，LOVO细胞内hsa_circ_0000478的相对表达水平的结果图。

图3是转染si_circ_0000478后对LOVO细胞的增殖抑制率结果图。

图4是转染si_circ_0000478后对LOVO细胞侵袭实验结果图；其中，图A是si_circ_0000478对LOVO细胞侵袭实验结果图；图B是si_circ_0000478对LOVO细胞侵袭实验结果柱状图。

图5是转染si_circ_0000478后对LOVO细胞迁移实验结果图；其中，图A是si_circ_0000478对LOVO细胞迁移实验结果图；图B是si_circ_0000478对LOVO细胞迁移实验结果统计柱状图。

图6是转染si_circ_0000478后对LOVO细胞早期凋亡的影响；其中，图A是细胞早期凋亡率分布图；图B是细胞早期凋亡率统计图。

图7是转染si_circ_0000478后对LOVO对细胞周期分布的影响；其中，图A是细胞周期分布图；图B是细胞周期百分比统计图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

基因序列，如SEQ ID NO.1所示。

>hsa_circ_0000478|NM_001009814|KIAA0564

CGCTTTGAACTTCAAGATTCAGGAAGCTCTCTACTTCCTAAAGAGATTGTAAAAGTAGAGAAGATGATGGAAAACCATGTGTCCCAAGCTTCTGTGACCATCCGGATTGCAGATAAAGAGGTGACCATTAAGGTGCCAGCCGGGACCAGGCTATTAAGTCAACCTTGTGCGTCAGACCGTTTCATACAGACTTTGAGCCATAAGCAGCTACAGGCTGAAATGATGCAGTCTCACATGGTTAAAGATATATGTTTAATTGGAGGAAAGGGTTGTGGAAAAACAGTGATCGCTAAGAACTTTGCCGATACCTTAGGATACAACATAGAACCTATTATGCTCTATCAG

实施例1hsa_circ_0000478高表达细胞系的筛选

RT-PCR及所采用的引物如下：

hsa_circ_0000478上游引物F：5'-cctattatgctctatcagcgct-3'；

hsa_circ_0000478下游引物R：5'-caatccggatggtcacagaa-3'；

产物大小：127bp；

β-actin上游引物F：5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'；

β-actin下游引物R：5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'；

产物大小：250bp；

RT(逆转录)的条件：各取5μg细胞总RNA用Geneseed@Enzyme Mix(Invitrogen公司产品)完成cDNA第一链合成。

PCR条件：取5μL逆转录合成的cDNA第一链作为模板，20μL PCR反应体系：上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、Geneseed@qPCR SYBE Green PCR Master Mix 10μL、dH₂O 4.0μL；PCR反应条件为：预变性95℃5min；变性95℃10s，退火65℃60s，延伸60℃34s，循环数40cycles；运用ABI7500 Sequence Detection System进行检测。

利用qRT-PCR(实时荧光定量RT-PCR)的方法，检测hsa_circ_0000478高表达细胞系。在结肠癌细胞HCT-116、HT-29、LOVO、SW480、SW620，人正常结肠上皮细胞FHC共6株细胞系，上述细胞均为商业化的细胞系，在HCT-116，LOVO，LOVO、SW480、SW620细胞系中hsa_circ_0000478表达呈高表达，在LOVO细胞中表达最高(见图1)。故选择hsa_circ_0000478作为干扰RNA的研究对象。

实施例2在LOVO细胞中瞬时转染siRNA(si_circ_0000478)后，hsa_circ_0000478相对表达水平的检测

转染前一天，5*10⁵个细胞接种在6孔板上，2mL完全培养基，转染前细胞汇合达到70～90％。细胞分组：空白对照组(细胞不加任何干预)，阴性对照组(只加lipofectamine脂质体，购置thermofisher scientific公司，型号11668027)，实验组在100μL无血清培养基加入2.5μL siRNA(终浓度50nM)，柔和混匀。混匀lipofectamine试剂，用100μL无血清培养基稀释4μL lipofectamine试剂，轻轻混匀，室温放置5min。将稀释好的siRNA和lipofectamine试剂混合，轻柔混匀，室温放置20min，以便形成siRNA-lipofectamine复合物。将200μL质粒-lipofectamine复合物加到已更换800μL无血清培养基的细胞孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板。细胞在37℃，5％CO₂培养箱中，培养5～6h后吸去转染培养基，更换完全培养基。

转染siRNA(si_circ_0000478)后，LOVO细胞内hsa_circ_0000478的相对表达水平的结果图如图2所示，结果说明，转染si_circ_0000478后，能够有效的降低LOVO细胞内hsa_circ_0000478的相对表达水平，干扰效率达到(90.25±0.96)％。

实施例3si_circ_0000478对LOVO增殖的影响

细胞分组同实施例2。将LOVO细胞以每孔1×10⁴个细胞接种96孔板，然后继续培养约24小时、48小时、72小时，每孔加50μL 1×MTT溶液，置入孵箱孵育4h，使MTT还原为甲臢。吸出上清液，每孔加150μL DMSO(二甲基亚砜)，使甲臢溶解，用平板摇床摇匀。用酶标仪在490nm处测每孔的光密度，进而计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率(％)＝[(空白对照组OD值-实验组OD值)/空白对照组OD值]×100％。

si_circ_0000478转染细胞(24、48、72小时)后，能有效抑制LOVO细胞增殖，其增殖抑制率分别为(10.6±0.78％、25.65±2.1％、39.25±6.3％)(见图3)。

实施例4si_circ_0000478对LOVO细胞侵袭、迁移的影响

细胞分组同实施例2，用预冷的DMEM-F12(购置Gibco公司)以1：3的体积比稀释Matrigel，取40μL加入预冷的Transwell小室中，37℃孵育2h使Matrigel凝固。吸走小室中多余的液体，并在上室、下室分别加入100μL、600μL DMEM-F12，37℃平衡过夜。细胞转染第二天，计数1×10⁵个细胞，用100μL无血清DMEM-F12培养基重悬，加入Transwell小室上室，在下室加入600μL完全培养基。在37℃，5％CO₂孵育48小时后，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，倒置显微镜下观察小室中细胞并拍照。

Transwell检测表明降低表达hsa_circ_0000478表达后细胞株侵袭、迁移能力明显低于转染阴性对照组的细胞株(分别见图4A、5A，图4B、5B)，说明降低hsa_circ_0000478可抑制肿瘤细胞的恶性度以及肿瘤细胞的转移能力。

实施例5si_circ_0000478对LOVO早期凋亡的影响

细胞分组同实施例2。

(1)将细胞培养板各组的培养基分别转移到15mL的锥形管中并置于冰上。

(2)用2mL PBS溶液轻轻润洗培养板内细胞，去除PBS溶液。加入0.5mL0.25％胰酶不含EDTA，孵育，直到显微镜下观察到细胞开始从培养板壁脱落。轻轻连续拍打使细胞从培养板壁上完全脱落。将细胞轻轻重悬于步骤(1)中的培养基或预冷的1×结合缓冲液中使得其密度大约为1×10⁶细胞/mL。将0.5mL细胞悬液从细胞培养板中(5×10⁵个细胞)转移到一个干净的离心管内。加入1.25μL Annexin V-FITC。室温(18～24℃)避光反应15分钟。室温1000×g离心5分钟，去除上清。将细胞用0.5mL预冷的1×结合缓冲液轻轻重悬。加入10μLPropidium Iodide。将样本放置在冰上避光保存。立即用流式细胞仪检测分析。

如图6、7的结果显示：si_circ_0000478能促进LOVO细胞早期凋亡。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广州市番禺区中心医院

<120> 针对hsa_circ_0000478基因的小干扰RNA及其应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgctttgaac ttcaagattc aggaagctct ctacttccta aagagattgt aaaagtagag 60

aagatgatgg aaaaccatgt gtcccaagct tctgtgacca tccggattgc agataaagag 120

gtgaccatta aggtgccagc cgggaccagg ctattaagtc aaccttgtgc gtcagaccgt 180

ttcatacaga ctttgagcca taagcagcta caggctgaaa tgatgcagtc tcacatggtt 240

aaagatatat gtttaattgg aggaaagggt tgtggaaaaa cagtgatcgc taagaacttt 300

gccgatacct taggatacaa catagaacct attatgctct atcag 345

<210> 2

<211> 345

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcuuugaac uucaagauuc aggaagcucu cuacuuccua aagagauugu aaaaguagag 60

aagaugaugg aaaaccaugu gucccaagcu ucugugacca uccggauugc agauaaagag 120

gugaccauua aggugccagc cgggaccagg cuauuaaguc aaccuugugc gucagaccgu 180

uucauacaga cuuugagcca uaagcagcua caggcugaaa ugaugcaguc ucacaugguu 240

aaagauauau guuuaauugg aggaaagggu uguggaaaaa cagugaucgc uaagaacuuu 300

gccgauaccu uaggauacaa cauagaaccu auuaugcucu aucag 345

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctattatgc tctatcagcg ct 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caatccggat ggtcacagaa 20

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcucuaucag cgcuuugaa 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

uucaaagcgc ugauagagc 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctctatcag cgctttgaa 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttcaaagcgc tgatagagc 19

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

catgtacgtt gctatccagg c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctccttaatg tcacgcacga t 21

Claims

1.hsa_circ_0000478在制备结肠癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂盒包括扩增hsa_circ_0000478的引物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述的扩增引物的序列如下：

hsa_circ_0000478上游引物F：5'-cctattatgctctatcagcgct-3'；

hsa_circ_0000478下游引物R：5'-caatccggatggtcacagaa-3'。

4.一种hsa_circ_0000478siRNA，其特征在于：

所述siRNA的序列如下：

正义链序列为：5'-GCUCUAUCAGCGCUUUGAA-3'；

反义链序列为：5'-UUCAAAGCGCUGAUAGAGC-3'。

5.根据权利要求4所述的hsa_circ_0000478siRNA，其特征在于：所述siRNA的编码基因，其核苷酸序列分别为：5'-GCTCTATCAGCGCTTTGAA-3'，或5'-TTCAAAGCGCTGATAGAGC-3'。

6.权利要求4或5所述的hsa_circ_0000478 siRNA在制备治疗结肠癌药物中的应用。

7.一种治疗结肠癌的药物，其特征在于：包括权利要求4或5所述的hsa_circ_0000478siRNA。