CN112870362B

CN112870362B - Circ-MET-1214和/或Circ-M50作为靶点在制备抗肿瘤药物中的用途

Info

Publication number: CN112870362B
Application number: CN202110172913.1A
Authority: CN
Inventors: 张弩
Original assignee: First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Priority date: 2021-02-08
Filing date: 2021-02-08
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2041-02-08
Also published as: CN112870362A

Abstract

本发明属于基因工程抗体药物研制领域，涉及Circ‑MET抑制剂的应用。具体涉及了一种环状RNA Circ‑MET核酸分子及其表达的蛋白Circ‑M50的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。尤其是针对Circ‑M50设计了单克隆抗体Anti‑Circ‑M50，其能够特异性的检测细胞内源性环状RNA Circ‑MET编码的蛋白质的含量，同时可以显著抑制脑胶质瘤等肿瘤细胞的侵袭转移，该单克隆抗体在肿瘤的临床检测及侵袭转移治疗中具有广阔的应用前景。

Description

Circ-MET-1214和/或Circ-M50作为靶点在制备抗肿瘤药物中的用途

技术领域

本发明属于基因工程抗体药物研制领域，涉及Circ-MET-1214和/或Circ-M50作为靶点在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

近年来，随着高通量测序技术以及生物信息学技术的发展，在多种生物体内发现了大量客观存在的环状RNA(circular RNA，circRNA)。生物体内的环状RNA是一类具有重要生物学功能的RNA，环状RNA由前体RNA通过反向剪形成闭合的环状结构，由于没有暴露的末端结构，所以耐受核酸外切酶RNaseR的切割，相对于线性的RNA分子，环状RNA可比较稳定的存在于生物体内，发挥其生物学功能。环状RNA发挥生物学功能的途径是多样化的，环状RNA可以通过扮演分子海绵的方式竞争性吸附微小的microRNA、竞争性结合蛋白质等方式调控细胞的分子网络，另外环状RNA也可以通过自身携带的内部核糖体插入序列原件，作为翻译的模板指导蛋白质的合成，环状RNA翻译成的蛋白质同样具有重要的生物学功能。

人的MET基因又叫HGFR(hepatocyte growth factor receptor,HGFR)，编码具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体蛋白，与配体HGF结合，可以触发受体分子的二聚化，其作用是促进细胞分裂生长，在肿瘤的发生发展过程中具有重要作用。

发明内容

一方面，本公开提供了Circ-MET-1214和/或Circ-M50作为靶点在制备治疗或预防脑胶质瘤药物中的用途。

一方面，本公开提供了Circ-MET-1214和/或Circ-M50抑制剂在制备抗脑胶质瘤药物中的用途。

在一些实施方案中，所述的抑制剂为Circ-MET-1214核酸片段抑制剂或者Circ-M50肽段抑制剂。

在一些实施方案中，所述脑胶质瘤包括星形细胞瘤；在一些实施方案中，所述星形细胞瘤包括低级别星形细胞瘤和高级别星形细胞瘤中的至少一种；在一些实施方案中，所述高级别星形细胞瘤包括胶质母细胞瘤。在一些实施方案中，所述的Circ-MET-1214核酸片段的序列如SEQ ID NO：1所示。

在一些实施方案中，所述的Circ-M50肽段的序列如SEQ ID NO：2所示。

在一些实施方案中，所述的Circ-MET-1214核酸片段抑制剂包括核酸效应分子。

在一些实施方案中，所述的核酸效应分子包括DNA、RNA、PNA或DNA-RNA-杂合体；在一些实施方案中，所述的核酸效应分子抑制Circ-MET-1214整体或局部的表达；在一些实施方案中，所述的核酸效应分子选自siRNA，dsRNA，miRNA，核酶，以及shRNA中一种；在一些实施方案中，所述的Circ-MET-1214核酸片段抑制剂针对核酸序列SEQ ID NO：6而设计获得。

在一些实施方案中，所述的Circ-MET-1214核酸片段抑制剂针对于Circ-MET-1214环状接口而设计。

在一些实施方案中，针对Circ-MET-1214第1194位至第20位中的任意跨越接口的序列片段而设计；在一些实施方案中，所述序列片段优选18个碱基以上的长度，至少与Circ-MET-1214第1197位至17位的序列互补。

在一些实施方案中，所述的抑制剂是针对于Circ-MET-1214的以下关键片段中的一个而设计，或者可选地与Circ-MET-1214的以下序列互补：

a)包含Circ-MET-1214第1204位至第10位的序列；

b)包含Circ-MET-1214第1208位至第14位的序列。

在一些实施方案中，所述Circ-MET-1214核酸片段抑制剂为siRNA。

在一些实施方案中，所述的siRNA的第一链如SEQ ID NO：7或9所示，对应的第二链依次如SEQ ID NO：8或10所示。

在一些实施方案中，所述Circ-MET-1214核酸片段抑制剂为shRNA。

在一些实施方案中，所述的shRNA选自SEQ ID NO：11或12。

在一些实施方案中，所述的Circ-M50肽段抑制剂为抗体、抗体功能性片段、或小分子化合物。

在一些实施方案中，所述的Circ-M50肽段抑制剂为抗体。

在一些实施方案中，所述的抗体是针对氨基酸序列SEQ ID NO：2或3任一条的抗体。

在一些实施方案中，所述的抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、纳米抗体、Fab抗体、Fv抗体、或单链抗体中的至少一种。

一方面，本公开提供了Circ-MET-1214核酸片段和/或Circ-M50肽段的检测试剂在制备脑胶质瘤筛选/诊断/预测/预后诊断剂或诊断系统中的应用。

在一些实施方案中，所述的Circ-MET-1214检测试剂为用于检测Circ-MET-1214的探针，或扩增Circ-MET-1214的引物，或者抗Circ-M50肽段的抗体；

在一些实施方案中，所述的Circ-MET-1214具有SEQ ID NO：1所示的核酸序列；

在一些实施方案中，所述的Circ-M50具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

一方面，本公开提供了一种脑胶质瘤治疗系统，包括：

1)Circ-MET-1214和/或Circ-M50检测系统；

2)用药系统。

在一些实施方案中，所述的用药系统含有Circ-MET-1214核酸片段和/或Circ-M50肽段抑制剂。

一方面，本公开还提供了一种治疗脑胶质瘤的药物研发方法，针对Circ-MET-1214核酸片段，设计相应的抑制剂或基因治疗工具；在一些实施方案中，通过基因干扰、基因编辑、反义核酸序列或锁核酸LNA的方式实现。

一方面，本公开提供了一种治疗脑胶质瘤的药物研发方法，针对Circ-M50，设计相应的Circ-M50的活性抑制剂。

在一些实施方案中，所述的Circ-M50活性抑制剂为抗体及其功能性片段、或小分子化合物。

在一些实施方案中，所述的Circ-M50活性抑制剂为抗体。

一方面，本公开提供了一种Circ-MET-1214特异性的siRNA，所述的siRNA含有与Circ-MET-1214片段互补的序列；所述的Circ-MET-1214如SEQ ID NO：1所示。

在一些实施方案中，所述的siRNA是针对于Circ-MET-1214环状接口而设计；优选地，针对Circ-MET-1214第1194位至第20位中的任意跨越接口的序列片段而设计；所述序列片段优选18个碱基以上的长度，至少与Circ-MET-1214第1197位至17位的序列互补；更优选地，所述的siRNA系针对于Circ-MET-1214的以下关键片段中的一个而设计，或者可选地与Circ-MET-1214的以下序列互补：

a)包含Circ-MET-1214第1204位至第10位的序列；

b)包含Circ-MET-1214第1208位至第14位的序列。

一方面，本公开提供了一种Circ-MET-1214特异性的shRNA，所述的siRNA含有与Circ-MET-1214片段互补的序列；所述的Circ-MET-1214如SEQ ID NO：1所示。

一方面，本公开提供了一种多肽，其特征在于序列如SEQ ID NO：2所示。

一方面，本公开提供了一种多肽，其特征在于序列如SEQ ID NO：3所示。

一方面，本公开提供了Circ-MET-1214核酸片段或Circ-M50肽段，所述的核酸片段的序列如SEQ ID NO：1所示；所述的肽段的序列如SEQ ID NO：2所示。

一方面，本发明提供了一种抗Circ-M50的抗体。

在一些实施方案中，所述抗Circ-M50的抗体采用如SEQ ID NO：2或3所示的氨基酸序列作为免疫原制备获得。

在一些实施方案中，所述的抗体为单克隆抗体。

一方面，本公开提供了一种药物组合物，所述的组合物含有所述的抗Circ-M50的抗体。

在一些实施方案中，所述的药物组合物还含有药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，所述的组合物用于制备治疗肿瘤的药物。

在一些实施方案中，所述的肿瘤为脑胶质瘤。

一方面，本公开提供了一种用于肿瘤诊断和/或预后判断的试剂盒，所述试剂盒含有Circ-MET-1214检测试剂。

在一些实施方案中，所述的Circ-MET-1214具有SEQ ID NO：1所示的核酸序列。

一方面，本发明提供了一种用于肿瘤诊断和/或预后判断的系统，其含有：

a.Circ-MET-1214和/或Circ-M50的检测构件；

b.结果判断构件；所述的结果判断构件用于根据检测构件所检测的待测样本的Circ-MET-1214的表达量与正常对照样本的Circ-MET-1214的表达量的偏离，判断脑胶质瘤的患病风险或者预后风险。

在一些实施方案中，所述的Circ-MET-1214的检测构件含有Circ-MET-1214检测试剂。

在一些实施方案中，所述的Circ-MET-1214检测试剂为用于检测Circ-MET-1214的探针，或扩增Circ-MET-1214的引物，或者抗Circ-M50蛋白的抗体。

在一些实施方案中，所述的Circ-MET-1214的表达量为环状RNA的量或者其表达的蛋白Circ-M50的量。

本发明突破性地发现Circ-M50在脑胶质瘤干细胞中的表达较正常细胞以及普通肿瘤细胞的表达差异性，为脑胶质瘤的靶向治疗提供了新的思路。胶质瘤干细胞具有自我更新、多向分化、少量细胞即可诱发肿瘤、放化疗抵抗的特性，被认为是恶性起源(celloforigin)和治疗后复发的根源，靶向胶质瘤干细胞有可能从根本上解决胶质瘤的治疗和复发问题。并且，现有的靶向治疗手段难以对RNA水平进行干预，大多数针对RNA水平的治疗只能在实验室内实现，距离临床应用遥远；Circ-M50的高表达是在蛋白质水平的高表达，可以针对Circ-M50开发单克隆抗体或抑制剂，有望成为新的检测和靶向治疗手段，为胶质瘤患者带来生存获益。

附图说明

图1MET环状RNA形成模式图；

图2MET环状RNA测序鉴定结果；

图3MET环状RNA翻译circ-M50蛋白质模式图，其中图a为示意图，图b为核酸序列，图c为氨基酸序列；

图4左图，qPCR检测circ-MET RNA在人不同细胞系中的表达；右图，Western blot检测Circ-M50蛋白在人细胞系中的表达；

图5敲低Circ-MET后胶质瘤干细胞活性变化；

图6敲低Circ-MET后胶质瘤干细胞EdU摄取变化；

图7A，敲低Circ-MET后胶质瘤干细胞体外成球能力变化，干细胞成球显微照片；图7B，敲低Circ-MET后胶质瘤干细胞体外成球能力变化，极限稀释法对干细胞成球能力的统计分析；

图8敲低Circ-MET后胶质瘤干细胞体内成瘤能力变化。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本申请的技术方案，具体实施例不代表对本申请保护范围的限制。其他人根据本申请理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本申请的保护范围。

需要说明的是：本发明中，所述的Circ-MET-1214具指环状RNACirc-MET-1214核酸片段，也指该环状RNA翻译的肽段Circ-M50。

本发明公开了一种Circ-MET-1214核酸片段为MET基因第2外显子通过反向剪接形成的单链闭合的RNA分子，长度为1214nt。Circ-MET-1214核酸片段表达产物为Circ-M50肽段。当然，不能排除的可能性是，后续会发现其他变异体形式的Circ-MET-1214，执行着类似的机制。根据本发明的理念，这些变异体形式的针对性的抑制、调节、检测应用等，也同样是本发明的保护范围。

Circ-MET-1214抑制剂为至少部分引起环状RNACirc-MET-1214的遗传信息路径阻断的物质或工具，可以在蛋白质水平(Circ-M50肽段)抑制，也可以在核酸水平(Circ-MET-1214核酸片段)抑制。蛋白质水平起作用的抑制剂可以选自抗体和/或小分子化合物等。在核酸水平起作用的抑制剂例如反义分子，RNAi分子和/或核酶。

如本文所使用的术语“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关联的所列项目的任何和所有可能的组合。当在两个或多个项目的列表中使用时，术语“和/或”表示所列出的项目中的任何一个可以单独使用，或者可以使用两个或多个所列出的项目的任何组合。例如，如果组合物，组合，构造等被描述为包括(或包含)组分A，B，C和/或D，则该组合物可以单独包含A；单独包含B；单独包含C；单独包含D；包含A和B的组合；包含A和C的组合；包含A和D的组合；包含B和C的组合；包含B和D的组合；包含C和D的组合；包含A，B和C的组合；包含A，B和D组合；包含A，C和D的组合；包含B，C和D组合；或A，B，C和D组合使用。

实施例1Circ-MET环状RNA形成及PCR测序鉴定

通过UCSC(http://genome.ucsc.edu/)在线数据库软件分析发现circ-MET基因定位于人的第7号染色体长臂chr7(q31.2)区域，基因组跨越1214bp，来源于人的MET基因的第二个外显子；根据环状RNA权威数据库circBase(http://circrna.org/)收录的MET产生的环状RNA信息，circ-MET环状RNA circRNA ID为hsa_circ_0082002，成熟环状RNA序列为1214nt，命名为Circ-MET-1214(见图1)，其含有SEQ ID NO:1所示的序列；通过在环状RNA反向连接位点两侧设计PCR扩增引物，扩增环状RNA的环化位点两翼的序列，经过sanger DNA测序的方法，获得了circ-MET环状RNA的准确环化位点。设计特异性扩增circ-MET的PCR扩增引物序列如下：

circ-MET-F:SEQ ID No：4：5'GATTCTGCCGAACCAATGGA 3'，

circ-MET-R:SEQ ID No：5：5'CACTCCCCATTGCTCCTCTG 3'

引物的扩增产物大小为238bp；以脑胶质瘤细胞系U373cDNA为模板，做PCR扩增；PCR扩增目标片段的反应体系及条件描述如下PCR为50μl总体系，具体是2×PCR MIX(Vazyme公司)25μl，上下游引物(10mM)各2μl，cDNA模板2μl，用灭菌水补足50μl体系。反应条件为：95℃5min预变性，循环内95℃30s变性，60℃30s退火，72℃延伸1min30s，共35个循环，PCR反应循环后72℃继续延伸5min，然后16℃保存。PCR产物经过纯化后做sanger DNA序列测定。通过sanger DNA测序的方法鉴定了环状RNA的准确环化接口(见图2)。

实施例2Circ-MET环状RNA翻译蛋白质预测分析

通过环状RNA翻译数据库circRNADb(http://reprod.njmu.edu.cn/cgi-bin/circrnadb/circRNADb.php)预测Circ-MET-1214环状RNA可能翻译蛋白质的潜能，预测发现Circ-MET-1214成熟RNA序列1214nt，包含一个开放阅读框，理论上可以翻译404个氨基酸组成的一个的蛋白质，Circ-MET-1214环状RNA翻译的蛋白质和人的MET基因翻译的蛋白质在蛋白质的C羧基末端多出来4个氨基酸(I-N-L-S：异亮氨酸Ile-天冬酰胺Asn-亮氨酸Leu-丝氨酸Ser)的尾巴，是Circ-MET-1214环状RNA特有的蛋白质的末端序列。通过蛋白质分子量预测软件(http://www.bio-soft.net/sms/prot_mw.html)预测Circ-MET-1214环状RNA翻译的新的蛋白的分子量约50KD，将其命名circ-M50(见图3)，其含有SEQ ID NO:2所示的序列。

实施例3circ-M50蛋白特异性抗体制备

基于circ-MET环状RNA可以翻译特有的一段氨基酸序列，选择circ-M50羧基末端(包含特异性的4个羧基末端氨基酸I-N-L-S：异亮氨酸Ile-天冬酰胺Asn-亮氨酸Leu-丝氨酸Ser)设计一段特异性的抗原肽，最终设计的抗原肽为YGPNHEHCFNRINLS；通过化学合成多肽的方法获得抗原肽YGPNHEHCFNRINLS(SEQ ID NO：3)，并且在多肽C端偶联KLH偶联蛋白，然后采用标准的单克隆抗体制备实验流程制备抗人的circ-M50小鼠来源的单克隆抗体。

单克隆抗体制备采用标准化的制备流程如下：

1.免疫5只小鼠，进行2-3次免疫；2.采集5只小鼠血清，分别做ELISA检测；3.效价合格后，进行融合实验：4.选取血清效价最高的小鼠的取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合；5.有限稀释融合细胞，96孔板克隆化；6.HAT筛选杂交瘤细胞；7.免疫原检测，检测出抗原阳性1-10个阳性细胞，扩大培养至48孔板；8.挑取阳性克隆扩增，微量-80度冻存细胞；9.ELISA检测获得阳性克隆；9.每个克隆做96孔板有限稀释培养，ELISA筛选阳性亚克隆；10.阳性克隆扩增，少量-80度冻存细胞；11.选取杂交瘤细胞制备腹水，ProteinA纯化腹水，获得纯化后单抗。

实施例4circ-M50蛋白特异性抗体在人细胞系中的表达检测

1、qPCR

用qPCR法检测circ-MET RNA在人正常神经胶质细胞NHA、正常神经干细胞NSC、普通胶质瘤细胞系SNB19、U251、SW1783、HS683和胶质瘤干细胞GSC387、GSC456、GSC23中的表达情况。通过Trizol法提取细胞系总RNA，取1000ng逆转录成cDNA，进一步把cDNA作为模板进行SYBR荧光染料法qPCR检测，使用SEQ ID NO：4-5的引物序列检测扩增循环数，以内参基因进行标准化和比较。

2、Western Blot

用Western blot测试实施例3制备的小鼠单克隆抗体是否能检测Circ-M50蛋白在人正常神经胶质细胞NHA、正常神经干细胞NSC、普通胶质瘤细胞系SNB19、U251、SW1783、HS683和胶质瘤干细胞GSC387、GSC456、GSC23中的表达情况。单克隆抗体蛋白检测条件及反应体系如下：RIPA蛋白裂解液提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量法对提取的蛋白进行定量；配置5％SDS-PAGE浓缩胶、12％SDS-PAGE分离胶，上样总蛋白为30微克；采用80V 20分钟、120V2小时跑蛋白电泳；转膜采用100V转100分钟；5％的脱脂牛奶封闭30min；Circ-M50单克隆抗体作为一抗，抗体终浓度为3微克/毫升、β-tubulin内参抗体1微克/毫升；抗体4度孵育过夜；第二天采用小鼠IgG二抗(二抗最终浓度0.2微克/毫升)常温孵育1h，TBST洗涤5遍每次5min，然后进行后续Western blot膜发光，胶片显影、定影。

细胞系qPCR(图4左图)和Western Blot(图4右图)实验显示，circ-MET在胶质瘤干细胞GSC456、GSC387、GSC23中高表达，其翻译的蛋白Circ-M50同样在胶质瘤干细胞中高表达。

实施例5细胞增殖实验

使用慢病毒感染的方法，将shRNA递送到细胞内稳定表达，构建稳定转染细胞株，持续敲低circ-MET。将96孔板预先用多聚鸟氨酸和层粘连蛋白包被，再铺入不同分组的细胞，每孔5000细胞，每组5个复孔，第二天细胞贴壁生长后，每天在相同时间换液为含有10％CCK-8的培养基，2小时后进行450nm的吸光度检测，最后将不同时间点的吸光度根据第一天的吸光度进行标准化。

敲低该基因circ-MET，在不同时间点进行细胞活性检测(CCK-8实验)，结果显示(图5)敲低后细胞增殖能力明显下降。

实施例6EdU摄取实验

使用慢病毒感染的方法，将shRNA递送到细胞内稳定表达，构建稳定转染细胞株，持续敲低circ-MET。将6孔板预先用多聚鸟氨酸和层粘连蛋白包被，再铺入不同分组的细胞，待细胞贴壁后，使用BeyoClick^TM EdU-594细胞增殖检测试剂盒(Beyotime)进行EdU的孵育和荧光标记，最后在荧光显微镜下检测EdU的摄取情况。

敲低该基因circ-MET，检测EdU摄取情况。如图6所示，敲低后细胞EdU摄取减少，说明增殖能力明显下降。

实施例7干细胞成瘤实验

使用慢病毒感染的方法，将shRNA递送到细胞内稳定表达，构建稳定转染细胞株，持续敲低circ-MET。将细胞进行梯度稀释，每个细胞设置5个梯度，分别每孔含20、10、5、2.5、1个细胞，每个梯度10个复孔，培养7-10天后，统计每个梯度成球的孔的数量以及成瘤体积大小差异，并使用(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)进行统计分析。

敲低该基因circ-MET，检测干细胞成瘤能力。如图7A所示，敲低后干细胞成球体积明显变小。如图7B所示，极限稀释法(Limiting Dilution Assay)显示敲低处理组干细胞成球能力明显减弱，自我更新能力受到抑制。曲线越平坦，意味着成球的孔数量越少，说明细胞成球能力减弱，自我更新能力减弱。

实施例8动物成瘤实验

使用慢病毒感染的方法，将shRNA递送到细胞内稳定表达，构建稳定转染细胞株，持续敲低circ-MET。采用异氟烷麻醉小鼠；小鼠固定于脑立体定向仪，调节门齿杆，使其顶部呈水平状；头顶皮肤消毒后沿中线切开，剥离筋膜，以无菌棉签蘸少量双氧水涂擦颅骨表面，暴露Bregrna点；根据Paxinos等所著《小鼠脑立体定位图谱》选择侧脑室定位坐标为前囟右1mm，旁开1.5mm，深1.7mm，操作脑立体定向仪使其定位在Bregma点，按所选取坐标在颅骨顶标记钻孔位置，使用0.8mm直径钻头钻孔，缓慢注入细胞悬液5UL，含有2000个肿瘤干细胞稳定株，留针5-10min。术毕继续饲养观察。在第一只小鼠因为脑肿瘤出现死亡时，同时期处死小鼠，取脑组织进行多聚甲醛固定，石蜡包埋，HE染色切片，比较肿瘤大小。

将敲低了该基因circ-MET的胶质瘤干细胞GSC456进行裸鼠颅内注射成瘤实验。如图8所示，敲低circ-MET后明显降低了胶质瘤干细胞的体内成瘤能力。

鉴于可以应用所公开的发明的原理的许多可能的实施例，应当认识到，所示的实施例仅是本申请的优选示例，而不应视为限制本申请的范围。相反，本申请的范围由所附权利要求书限定。因此，我们要求保护所有落入这些权利要求的范围和精神内的发明。

序列表

<110> 中山大学附属第一医院

<120> Circ-MET-1214和/或Circ-M50作为靶点在制备抗肿瘤药物中的用途

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1214

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Circ-MET-1214环状分子核苷酸序列

<400> 1

auaaaccucu cauaaugaag gcccccgcug ugcuugcacc uggcauccuc gugcuccugu 60

uuaccuuggu gcagaggagc aauggggagu guaaagaggc acuagcaaag uccgagauga 120

augugaauau gaaguaucag cuucccaacu ucaccgcgga aacacccauc cagaauguca 180

uucuacauga gcaucacauu uuccuuggug ccacuaacua cauuuauguu uuaaaugagg 240

aagaccuuca gaagguugcu gaguacaaga cugggccugu gcuggaacac ccagauuguu 300

ucccauguca ggacugcagc agcaaagcca auuuaucagg agguguuugg aaagauaaca 360

ucaacauggc ucuaguuguc gacaccuacu augaugauca acucauuagc uguggcagcg 420

ucaacagagg gaccugccag cgacaugucu uuccccacaa ucauacugcu gacauacagu 480

cggagguuca cugcauauuc uccccacaga uagaagagcc cagccagugu ccugacugug 540

uggugagcgc ccugggagcc aaaguccuuu caucuguaaa ggaccgguuc aucaacuucu 600

uuguaggcaa uaccauaaau ucuucuuauu ucccagauca uccauugcau ucgauaucag 660

ugagaaggcu aaaggaaacg aaagaugguu uuauguuuuu gacggaccag uccuacauug 720

auguuuuacc ugaguucaga gauucuuacc ccauuaagua uguccaugcc uuugaaagca 780

acaauuuuau uuacuucuug acgguccaaa gggaaacucu agaugcucag acuuuucaca 840

caagaauaau cagguucugu uccauaaacu cuggauugca uuccuacaug gaaaugccuc 900

uggaguguau ucucacagaa aagagaaaaa agagauccac aaagaaggaa guguuuaaua 960

uacuucaggc ugcguauguc agcaagccug gggcccagcu ugcuagacaa auaggagcca 1020

gccugaauga ugacauucuu uucggggugu ucgcacaaag caagccagau ucugccgaac 1080

caauggaucg aucugccaug ugugcauucc cuaucaaaua ugucaacgac uucuucaaca 1140

agaucgucaa caaaaacaau gugagauguc uccagcauuu uuacggaccc aaucaugagc 1200

acugcuuuaa uagg 1214

<210> 2

<211> 404

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Circ-M50 蛋白氨基酸序列

<400> 2

Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe

1 5 10 15

Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys

20 25 30

Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala

35 40 45

Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu

50 55 60

Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys

65 70 75 80

Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe

85 90 95

Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp

100 105 110

Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp

115 120 125

Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His

130 135 140

Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys

145 150 155 160

Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val

165 170 175

Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe

180 185 190

Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp

195 200 205

His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp

210 215 220

Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu

225 230 235 240

Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn

245 250 255

Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln

260 265 270

Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu

275 280 285

His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg

290 295 300

Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala

305 310 315 320

Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser

325 330 335

Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp

340 345 350

Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys

355 360 365

Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg

370 375 380

Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg

385 390 395 400

Ile Asn Leu Ser

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 抗原肽

<400> 3

Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg Ile Asn Leu Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 环状接口引物序列F

<400> 4

gattctgccg aaccaatgga 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 环状接口引物序列R

<400> 5

cactccccat tgctcctctg 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> 环状接口序列

<400> 6

tgctttaata ggataaacct ctca 24

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> si-RNA1

<400> 7

gcuuuaauag gauaaaccuc u 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 8 si-RNA1

<400> 8

agagguuuau ccuauuaaag c 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> si-RNA2

<400> 9

uaauaggaua aaccucucau a 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> si-RNA1

<400> 10

uaugagaggu uuauccuauu a 21

<210> 11

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sh-RNA1

<400> 11

ccgggcttta ataggataaa cctctctcga gagaggttta tcctattaaa gctttttg 58

<210> 12

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sh-RNA2

<400> 12

ccggtaatag gataaacctc tcatactcga gtatgagagg tttatcctat tatttttg 58

Claims

1.Circ-MET-1214抑制剂在制备抗脑胶质瘤药物中的用途，所述Circ-MET-1214抑制剂为shRNA，所述shRNA选自SEQ ID NO：11或12。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述脑胶质瘤包括星形细胞瘤。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述星形细胞瘤包括低级别星形细胞瘤和高级别星形细胞瘤中的至少一种。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述高级别星形细胞瘤包括胶质母细胞瘤。

5. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Circ-MET-1214的序列如SEQ ID NO：1所示。

6.一种多肽，其特征在于序列如SEQ ID NO：3所示。

7.一种抗脑胶质瘤的药物组合物，其特征在于，所述的组合物含有如SEQ ID NO：11或12所示的shRNA。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物用于制备治疗脑胶质瘤的药物。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述的脑胶质瘤包括星形细胞瘤。

10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述星形细胞瘤包括低级别星形细胞瘤和高级别星形细胞瘤中的至少一种。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述高级别星形细胞瘤包括胶质母细胞瘤。