CN110713544B

CN110713544B - 融合基因plekha6-ntrk3及其在lch中的应用

Info

Publication number: CN110713544B
Application number: CN201810772018.1A
Authority: CN
Inventors: 蔡娇阳; 沈树红; 殷敏智; 李彦欣; 黄霞
Original assignee: Shanghai Childrens Medical Center Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Shanghai Childrens Medical Center Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2018-07-13
Filing date: 2018-07-13
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2038-07-13
Also published as: CN110713544A

Abstract

本发明涉及朗格汉斯细胞组织细胞增生症中PLEKHA6‑NTRK3融合基因及其用途。具体地，本发明公开了一种新的融合基因及其编码的融合蛋白。本发明融合蛋白由C末端的NTRK3结构域和N末端的PLEKHA6结构域构成。本发明还公开了该融合基因、融合蛋白在检测朗格汉斯细胞组织细胞增生症疾病中的应用。

Description

融合基因PLEKHA6-NTRK3及其在LCH中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体地涉及一种新的融合基因PLEKHA6-NTRK3及其在LCH中的应用。

背景技术

朗格汉斯细胞组织细胞增生症(LCH)是最常见的组织细胞增多症，伴有RAS-RAF-MEK-ERK(MAPKinase，MAP激酶)细胞信号传导通路的组成性激活，其特征是具有丰富CD1a⁺CD207⁺组织细胞的炎性病变，损害受影响的组织。LCH被认为是肿瘤性疾病，也被认为是免疫性疾病，而其发病机制仍不明确。

2010年，首先在LCH细胞中发现V-Raf鼠科肉瘤病毒癌基因同源物B1(BRAF^V600E)突变的高发(约55％的LCH)，其导致了病理组织细胞中MAPKinase RAS-RAF-MEK-ERK细胞信号传导通路的激活。BRAF^V600E突变的LCH患者对BRAF抑制剂的反应证实，BRAF^V600E是LCH中的驱动突变。然而，研究人员发现，没有BRAF^V600E突变的LCH患者，病理组织细胞中的ERK通路也是激活的。随后，进一步鉴定了MAPKinase通路相关基因的突变，包括MAP2K1突变(10-20％的LCH11-13)，BRAF激酶结构域中的β3-αC环缺失(6％的LCH)，报告还涉及ARAF和14MAP3K1突变的病例。此外，发现LCH中涉及BRAF、ALK和NTRK1的复发性激酶融合体可以激活MAPKinase通路。

然而，LCH的发病机制目前仍不明确，为了进一步分析LCH中病理性MAPKinase激活的机制，本领域迫切需要在LCH分子筛选组中增加新突变，以更好地检测和研究LCH。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的融合基因PLEKHA6-NTRK3及其在LCH中的应用。

本发明的目的HIA在于提供诱发LCH疾病的全新的融合致病基因，为诊断试剂盒和治疗提供新靶点。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的融合蛋白，所述融合蛋白是由PLEKHA6蛋白的片段与NTRK3蛋白的片段构成的融合蛋白，其中，PLEKHA6蛋白的片段来自PLEKHA6蛋白N端序列且位于所述融合蛋白的N端；而所述的NTRK3蛋白的片段来自NTRK3蛋白且位于所述融合蛋白的C端。

在另一优选例中，所述的PLEKHA6蛋白的片段包含从PLEKHA6蛋白N端起10-200个，较佳地20-100个，更佳地30-50个氨基酸。

在另一优选例中，所述的PLEKHA6蛋白的片段包含PLEKHA6蛋白的第1-3个外显子对应的氨基酸。

在另一优选例中，所述的PLEKHA6蛋白的片段包含从PLEKHA6蛋白的N端起第1个氨基酸至第34个氨基酸。

在另一优选例中，所述的NTRK3蛋白的片段包含从NTRK3蛋白C端起200-800个，较佳地300-400个氨基酸。

在另一优选例中，所述的NTRK3蛋白的片段由NTRK3蛋白的第14个外显子至终止密码子之间的所有的氨基酸序列构成。

在另一优选例中，所述的NTRK3蛋白的片段包含NTRK3蛋白的第14-20个外显子对应的氨基酸。

在另一优选例中，所述的NTRK3蛋白的片段包含从NTRK3蛋白的N端起第466个氨基酸至第839个氨基酸。

在另一优选例中，所述的融合蛋白中含有以下特征性序列：

SEQ ID NO.:2中第20-50位所示的氨基酸序列，较佳地为SEQ ID NO.:2第30-40位所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的PLEKHA6蛋白的片段的序列为SEQ ID NO.:2中第1-34位所示。

在另一优选例中，所述的NTRK3蛋白的片段的序列为SEQ ID NO.:2中第35-408位所示。

在另一优选例中，所述融合蛋白的结构如式II所示：

A2-B2(式II)

式中，

A2为来自PLEKHA6蛋白的N端(氨基端)的氨基酸序列，

B2为来自NTRK3蛋白的C端(羧基端)的氨基酸序列；

“-”为位于元件A2和元件B2之间的肽键。

在另一优选例中，元件A2为Genebank登录号NP_055750.2中第1-n1位所示的PLEKHA6氨基酸序列，其中30≤n1≤50的正整数。

在另一优选例中，n1＝34。

在另一优选例中，元件B2为Genebank登录号NP_001012338.1中第m1-839位所示的NTRK3氨基酸序列，其中，1≤m1≤600，较佳地400≤m1≤500。

在另一优选例中，m1＝466。

在另一优选例中，B2元件保留或具有NTRK3蛋白的活性。

在另一优选例中，所述元件A2衍生自哺乳动物(如人)的PLEKHA6蛋白。

在另一优选例中，所述元件B2衍生自哺乳动物(如人)的NTRK3蛋白。

在另一优选例中，所述融合蛋白选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性，如98％以上，99％以上)的多肽，且所述多肽具有激活MAPKinase通路生长的活性；

(C)将SEQ ID NO:2中任一所示氨基酸序列经过1-15个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有激活MAPKinase通路的活性的衍生多肽。

在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在另一优选例中，所述的融合蛋白具有激活MAPKinase通路的功能或活性。

在另一优选例中，所述的融合蛋白具有促进细胞生长的活性，较佳地所述的生长为异常生长。

在另一优选例中，所述的融合蛋白具有诱导LCH发病的活性。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述序列编码本发明第一方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：DNA序列、RNA序列。

在另一优选例中，所述的DNA序列选自下组：基因组序列、cDNA序列。

在另一优选例中，所述的多核苷酸为mRNA或cDNA，并且所述多核苷酸具有式I所示结构：

A1-B1 (式I)

式中，

A1为编码上述A2元件的核苷酸序列；

B1为编码上述B2元件的核苷酸序列；

“-”为元件A1和元件B1之间的连接键。

在另一优选例中，所述的多核苷酸具有式I所示结构：

A1’-B1’ (式I)

式中，

A1’为编码PLEKHA6蛋白的片段的核苷酸序列；

B1’为编码NTRK3蛋白的片段的核苷酸序列；

“-”为元件A1’和元件B1’之间的连接键。

在另一优选例中，元件A1为PLEKHA6-mRNA中Exon1-3的碱基序列。

在另一优选例中，元件B1为外显子NTRK3-mRNA中Exon14-20的碱基序列。

在另一优选例中，所述元件A1为SEQ ID NO.:1中第1-432位所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述元件B1为SEQ ID NO.:1中第1868-3127位所示的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体为慢病毒载体。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在本发明的第五方面，提供了一种产生本发明第一方面所述融合蛋白的方法，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出本发明第一方面所述的融合蛋白；和

分离所述融合蛋白。

在本发明的第六方面，提供了一种特异性抗体，所述抗体能够特异性地与本发明第一方面所述融合蛋白结合，且所述抗体既不与PLEKHA6蛋白结合也不与NTRK3蛋白结合。

在另一优选例中，所述的特异性抗体结合于所述融合蛋白的特定结合表位，所述特定结合表位为SEQ ID NO.:2中第30-40位的氨基酸序列。

在本发明的第七方面，提供了一种本发明第六方面所述特异性抗体的用途，所述特异性抗体用于制备抑制MAPKinase通路激活的药物。

在另一优选例中，所述的药物还用于抑制细胞异常生长和/或治疗LCH。

在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，包括：

本发明第六方面所述的特异性抗体；和药学上可接受的载体。

在本发明的第九方面，提供了一种非诊断性和非治疗性的、检测待测样本中存在PLEKHA6-NTRK3基因的方法，所述的融合基因编码本发明第一方面所述的融合蛋白，并且所述方法包括步骤：

(1)提供一上游引物和一下游引物，

其中，所述上游引物结合于PLEKHA6蛋白的片段的编码区或其上游的5’UTR序列；

所述下游引物结合于NTRK3蛋白的片段的编码区或其下游的3’UTR序列；

(2)将待测样本作为模板，用所述上游引物和下游引物进行PCR扩增，从而获得扩增产物；和

(3)对所述扩增产物进行检测，从而确定所述待测样本中PLEKHA6-NTRK3基因的存在与否和/或数量。

在另一优选例中，所述的上游引物结合于SEQ ID NO.:1中第1-432位所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的下游引物结合于SEQ ID NO.:1中第1868-3127位所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的上游引物的序列如SEQ ID NO.:3所示(5'-ACCACCAACAGTGACATACC-3')。

在另一优选例中，所述的下游引物的序列如SEQ ID NO.:4所示(5'-AGTCCTCCTCACCACTGAT-3')。

在另一优选例中，所述的检测选自下组：电泳、荧光检测、测序、探针杂交、或其组合。

在另一优选例中，所述的探针杂交中探针特异性结合于SEQ ID NO.:1中第400-500位，较佳地第420-450位所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的待测样本为mRNA或cDNA。

在另一优选例中，所述的检测包括：普通PCR，5’RACE和/或测序。

在另一优选例中，所述PLEKHA6-NTRK3基因未发生融合样本为或来自：正常样本，和/或LCH组织样本。

在本发明的第十方面，提供了一种检测试剂，所述的检测试剂包括：

(i)一上游引物和一下游引物(引物对)，

所述下游引物结合于NTRK3蛋白的片段的编码区或其下游的3’UTR序列；和

(ii)任选的特异性探针。

在本发明的第十一方面，提供了一种含有本发明第十方面所述检测试剂的试剂盒。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括选自下组的一种或多种试剂：

(i)用于样本RNA提取和cDNA合成的试剂；

(ii)用于PCR的试剂；

(iii)用于杂交的试剂。

在本发明的第十二方面，提供了一种本发明第一方面所述的融合蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第六方面所述的抗体或本发明第十方面所述的检测试剂的用途，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于(i)检测待测样本中PLEKHA6-NTRK3基因是否融合和/或确认PLEKHA6-NTRK3基因的融合位点；(ii)检测LCH发病风险、(iii)对LCH患者进行分型；和/或(iv)判断LCH患者是否适合用PLEKHA6-NTRK3基因或蛋白的抑制剂进行治疗。

在另一优选例中，如果待测样本的融合基因PLEKHA6-NTRK3mRNA的量A高于对照值C，则适合对该LCH患者用PLEKHA6-NTRK3基因或蛋白的抑制剂进行治疗。

在另一优选例中，所述对照值C为不存在融合基因PLEKHA6-NTRK3的LCH患者中的检测值，较佳地，对照值C为0。

在另一优选例中，所述的检测试剂(或所述融合蛋白)带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在本发明的第十三方面，提供了一种体外非治疗性的抑制MAPKinase通路激活的方法，包括步骤：

在添加本发明第一方面所述融合蛋白抑制剂的条件下，培养细胞，从而抑制细胞的MAPKinase通路激活；或

降低融合基因PLEKHA6-NTRK3的表达或降低本发明第一方面所述融合蛋白的蛋白量或活性。

在另一优选例中，将所述细胞与包含本发明第一方面所述融合蛋白抑制剂的溶液进行接触或混合，然后进行培养。

在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：抗体、小分子化合物、核酸、或其组合。

在另一优选例中，所述细胞包括成纤维细胞。

在另一优选例中，所述的抑制剂是本发明第六方面所述的特异性抗体。

在另一优选例中，与野生型相比，融合基因PLEKHA6-NTRK3的表达降低10％，较佳地降低20％，更佳地降低30％，更佳地降低40％，更佳地降低50％，更佳地降低60％，更佳地降低70％，更佳地降低80％，更佳地降低90％，最佳地，融合基因PLEKHA6-NTRK3完全不表达。

在另一优选例中，与野生型相比，本发明第一方面所述融合蛋白的活性降低10％，较佳地降低20％，更佳地降低30％，更佳地降低40％，更佳地降低50％，更佳地降低60％，更佳地降低70％，更佳地降低80％，更佳地降低90％，最佳地，完全没有本发明第一方面所述融合蛋白的活性。

在本发明的第十四方面，提供了一种确定测试物是否是本发明第一方面所述的融合蛋白的抑制剂或促进剂的方法，包括步骤：

(a)在测试组中，在培养体系中，在测试物存在下，培养表达本发明第一方面所述融合蛋白(即PLEKHA6-NTRK3融合蛋白)的测试细胞；并且在不存在所述测试物且其它条件相同的对照组中，培养相同细胞；

(b)检测测试组中所述测试细胞中所述PLEKHA6-NTRK3融合基因或其蛋白的表达量E1或其活性A1；并与对照组中所述相同细胞中所述PLEKHA6-NTRK3融合基因或其蛋白的的表达量E2或活性A2进行比较；

其中，如果所述表达量E1显著低于所述表达量E2或所述活性A1显著低于所述活性A2，则表示所述待测试物是本发明第一方面所述融合蛋白活性的抑制剂；

如果所述表达量E1显著高于所述表达量E2或所述活性A1显著高于所述活性A2，则表示所述待测试物是本发明第一方面所述融合蛋白的促进剂。

在另一优选例中，所述的“显著低于”指E1/E2或A1/A2的比值≤1/2，较佳地≤1/3，更佳地≤1/4。

在另一优选例中，所述的“显著低于”指表E1/E2或A1/A2的比值≥2，较佳地≥3，更佳地≥4。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(c)：对步骤(b)确定的融合蛋白抑制剂进一步测试其对MAPKinase通路激活的抑制作用。

在另一优选例中，所述的测试物包括：抗体、化合物、核酸。

在另一优选例中，所述测试物为抗体，并且步骤(c)中包括测定所述抗体是否能够抑制测试细胞的生长(包括体外细胞实验、或动物实验)。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断和治疗性的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了89名LCH患者的特异性测序数据。其中，图1A显示了测序信息的统计图表，图1B显示了BRAF外显子15中的突变位点，图1C显示了MAP2K1外显子2和3中的突变位点，图1D显示了融合基因PLEKHA6-NTRK3的mRNA表达水平。

图2显示了携带有融合基因PLEKHA6-NTRK3的患者的临床信息。其中，图2A左图显示全身磁共振成像(MRI)显示T12椎体楔形，诊断显示有软组织肿块，图2A右图显示经过一年的治疗后，MRI显示病变消失；图2B显示了典型的异常组织细胞的形态学(H&E)；图2C显示患者的异常组织细胞上表达有CD1a+，S100+，Langerin+；图2D显示了患者的治疗方案。

图3显示了融合基因PLEKHA6-NTRK3的质粒设计。

图4显示融合基因PLEKHA6-NTRK3激活ERK通路并促进细胞生长。其中，图4A显示融合基因PLEKHA6-NTRK3激活NIH 3T3细胞中的RAS-RAF-MEK-ERK通路，图4B显示融合基因PLEKHA6-NTRK3促进细胞生长，图4C显示了RAS-RAF-MEK-ERK通路激活图示。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种新的融合基因PLEKHA6-NTRK3，其可以激活RAS-RAF-MEK-ERK通路并促进细胞生长，在朗格汉斯细胞组织细胞增生症的发生中具有驱动作用。具体地，本发明通过Sanger测序分析了89例LCH患者的BRAF和MAP2K1突变，其中18例患者的上述两个基因突变均为阴性。在这些阴性病例中，发明人选取合适标本进行了全基因组测序，显示在一例病例中存在从PLEKHA6的内含子19到NTRK3的内含子3的易位。发明人发现这种易位可能导致新的融合突变PLEKHA6-NTRK3。实验表明，NIH3T3细胞中PLEKHA6-NTRK3突变体的过表达可以激活MAPKinase通路，促进细胞生长。上述结果表明，本发明发现的融合基因PLEKHA6-NTRK3可用作LCH的检测标志物和治疗靶点。在此基础上，本发明人完成了本发明。

简言之，本发明的发明人为了分析LCH中病理性ERK激活的机制，对在上海儿童医学中心诊断的89名儿科LCH患者进行了Sanger测序，以特异性检测BRAFV600E和MAP2K1突变。对双阴性病例进行全基因组测序以进一步揭示LCH的潜在发病机制，并且在一例中鉴定了涉及PLEKHA6和NTRK3的新型易位。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

如本文所用，术语“本发明蛋白”、“本发明融合蛋白”、“PLEKHA6-NTRK3融合蛋白”可互换使用，指由PLEKHA6和NTRK3两者融合形成的融合蛋白。优选地，该术语为本发明第一方面中所述的融合蛋白。

如本文所用，术语“本发明融合基因”、“PLEKHA6-NTRK3融合基因”可互换使用，指编码本发明所述PLEKHA6-NTRK3融合蛋白的核酸序列。该术语不仅包括DNA形式，还包括RNA形式；不仅包括基因组序列，还包括cDNA序列。

PLEKHA6基因和蛋白

在本发明中，PLEKHA6基因可来自非人哺乳动物(如灵长目或啮齿动物)或人。一种代表性的PLEKHA6基因所编码的PLEKHA6蛋白的氨基酸序列见Genebank登录号NP_055750。以人PLEKHA6基因为例，其长度为158814bp。PLEKHA6为Pleckstrin同源结构域(PH结构域)，存在于第二信使系统的蛋白质中，例如，异源三聚体G蛋白的βγ亚基或蛋白激酶C。能够整合在参与细胞内信号传导的多种蛋白质中或作为细胞骨架的组分。该结构域可进一步结合生物膜内的磷脂酰肌醇脂质，可将蛋白质靶向细胞区室或使其能够与信号转导途径的其他组分相互作用。

NTRK3基因和蛋白

在本发明中，NTRK3基因可来自非人哺乳动物(如灵长目或啮齿动物)或人。一种代表性的NTRK3基因所编码的NTRK3蛋白的氨基酸序列见Genebank登录号NP_001012338.1。以人NTRK3基因为例，其长度为397017bp，NTRK3是受体酪氨酸激酶家族成员，在神经系统以及许多其他非神经元细胞类型和组织中有丰富的表达。位于细胞膜上，其细胞外结构域与配体结合而被激活，激活后能够将磷酸基团添加到靶蛋白质或“底物”上的某些酪氨酸上。

MAPKinase通路

哺乳类动物细胞中，与ERK相关的细胞内信号转导途径被认为是经典MAPK信号转导途径(即MAPKinase通路)。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一个高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，介导由多种细胞表面受体转导的细胞内信号，是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者。范围广泛的胞外刺激物，包括细胞因子、生长因子、G蛋白耦连受体的配体等都能刺激ERK通路使其活化，进而调节基因表达以参与细胞生长、增值和分化等多种生物学反应。

融合蛋白、基因和转录本

本发明人通过Exon array分析、5’RACE及测序分析，首次证实了PLEKHA6-NTRK3融合基因的存在，NTRK3基因exon14融合到了PLEKHA6基因exon3上，从而产生了一个新的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所述。

在本发明中，术语“PLEKHA6-NTRK3蛋白”、“PLEKHA6-NTRK3多肽”或“融合蛋白PLEKHA6-NTRK3”可互换使用，都指具有人融合蛋白PLEKHA6-NTRK3氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的融合蛋白PLEKHA6-NTRK3。

在本发明中，代表性的所述PLEKHA6-NTRK3融合蛋白是由PLEKHA6蛋白的片段与NTRK3蛋白的片段构成的融合蛋白，其中，PLEKHA6蛋白的片段来自PLEKHA6蛋白并且位于所述融合蛋白的N端；而所述的NTRK3蛋白的片段来自于NTRK3蛋白并且位于所述融合蛋白的C端。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的PLEKHA6-NTRK3蛋白或多肽”是指PLEKHA6-NTRK3多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化PLEKHA6-NTRK3蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。PLEKHA6-NTRK3多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人PLEKHA6-NTRK3蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人PLEKHA6-NTRK3蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“人PLEKHA6-NTRK3多肽”指具有人PLEKHA6-NTRK3蛋白活性的SEQ ID NO:2序列的多肽。该术语还包括具有与人PLEKHA6-NTRK3蛋白相同功能的、SEQ IDNO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人PLEKHA6-NTRK3蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人PLEKHA6-NTRK3DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人PLEKHA6-NTRK3多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人PLEKHA6-NTRK3多肽或其片段与其他多肽所形成的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人PLEKHA6-NTRK3多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人PLEKHA6-NTRK3多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供人PLEKHA6-NTRK3蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人PLEKHA6-NTRK3多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人PLEKHA6-NTRK3蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明蛋白的制备

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的人PLEKHA6-NTRK3核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或PLEKHA6-NTRK3蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的PLEKHA6-NTRK3多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人PLEKHA6-NTRK3多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

检测用途

本发明还涉及定性、定量和定位检测人PLEKHA6-NTRK3蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括免疫测定等。试验中所检测的人PLEKHA6-NTRK3蛋白水平，可以用作解释人PLEKHA6-NTRK3蛋白在各种疾病(如LCH)中的重要性和用于诊断PLEKHA6-NTRK3蛋白起作用的疾病。

一种检测检测样品中是否存在PLEKHA6-NTRK3蛋白的方法是利用PLEKHA6-NTRK3蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与PLEKHA6-NTRK3蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在PLEKHA6-NTRK3蛋白。

PLEKHA6-NTRK3蛋白的多聚核苷酸可用于PLEKHA6-NTRK3蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，PLEKHA6-NTRK3蛋白的多聚核苷酸可用于检测PLEKHA6-NTRK3蛋白的表达与否或在疾病状态下PLEKHA6-NTRK3蛋白的异常表达。如PLEKHA6-NTRK3DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断PLEKHA6-NTRK3蛋白的表达异常。杂交技术包括：Southern印迹法、Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。

用PLEKHA6-NTRK3蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测PLEKHA6-NTRK3蛋白的转录产物。

特异性抗体

另一方面，本发明还包括对本发明融合蛋白DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于本发明融合蛋白产物或片段。较佳地，指那些能与本发明融合蛋白基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体，尤其是该特异性抗体不识别PLEKHA6天然蛋白，也不识别NTRK3天然蛋白。

本发明还提供了一种特别优选的特异性抗体，它识别和结合本发明融合蛋白的特定结合表位，即SEQ ID NO.:2的第30-40位。

本发明中抗体包括那些能够结合并抑制本发明融合蛋白的分子，也包括那些并不影响本发明融合蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的本发明融合蛋白基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的本发明融合蛋白基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达本发明融合蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断本发明融合蛋白功能的抗体以及不影响本发明融合蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用本发明融合蛋白基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与本发明融合蛋白基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗本发明融合蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的本发明融合蛋白。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与本发明融合蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断本发明融合蛋白的产生或活性。

抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如本发明融合蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭本发明融合蛋白阳性的细胞。

多克隆抗体的生产可用本发明融合蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

融合蛋白的抑制剂及其用途

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与PLEKHA6-NTRK3蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

典型地，本发明的抑制剂的例子包括(但并不限于)：下调本发明融合蛋白表达量或活性的化合物(如特异性针对启动子或特征性序列的miRNA，shRNA或siRNA)，或抑制其下游效应子(如ERK1/2)的活性的化合物，如selumetinib、SL327、PD98059等等。

本发明蛋白抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可用于抑制肿瘤细胞的生长。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，例如，用于LCH的治疗。在使用本发明PLEKHA6-NTRK3蛋白的抑制剂时，还可同时使用其他药物辅助治疗。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明PLEKHA6-NTRK3的抑制剂(如抗体或小分子化合物，如selumetinib、SL327、PD98058，等等)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。

本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约100毫克/千克体重。此外，本发明的抑制剂还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的PLEKHA6-NTRK3的拮抗剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约100毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明人首次发现了一种新的融合基因PLEKHA6-NTRK3，并在实验中发现该基因可以激活RAS-RAF-MEK-ERK通路并促进细胞生长。

(b)本发明的融合基因可以作为LCH的检测标志物和治疗靶点

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

通用材料与方法

患者和样本

2008年9月至2015年3月期间，上海儿童医学中心(SCMC)经组织学证实患有LCH的89例儿科患者，发病年龄2个月至13岁。男女比例为2：1，与以前的报道一致。LCH患儿中涉及骨骼的约占91％，其次是软组织(8％)，肝脏(8％)，皮肤(6％)和淋巴结(6％)及其他器官。分析所有患者的临床分期数据，大多数患者为SS-LCH(85％)(表2)。

表2 LCH患者的临床特征

*诊断的中位年龄(岁)

桑格测序

进行桑格测序以评估MAP2K1基因的外显子2和3以及BRAF外显子15中热点突变BRAFV600E的突变情况。从石蜡包埋的组织中提取DNA。将样品在二甲苯中脱蜡并通过系列乙醇洗涤再水化，随后置于蛋白酶K缓冲液中37℃过夜，使用苯酚-氯仿提取DNA，空气干燥并重悬于水。然后对DNA进行常规PCR。使用正向引物5'-GCTCTGATAGGAAAATGAGATC(SEQ IDNO.:5)-3'和反向引物5'-ACTGATGGGACCCACTCCATC-3'(SEQ ID NO.:6)扩增BRAF外显子15的139个碱基对(bp)。对于MAP2K1基因，使用正向引物5'-CTCTAGCCTCCCACTTTGAT-3'(SEQID NO.:7)和反向引物5'-CTCACCTTTCTGGCCATGAC-3’(SEQ ID NO.:8)扩增外显子2的342碱基对(bp)；使用正向引物5'-CTCCCTCTACCTTAAAGAGC-3'(SEQ ID NO.:9)和反向引物5'-TGTCACATACCATGTGCTCC-3’(SEQ ID NO.:10)扩增外显子3的260个碱基对(bp)。

利用Taq Hot Start Version聚合酶(TaKaRa Bio，Osaka，Japan)进行PCR扩增，条件如下：94℃2分钟，随后94℃30秒，59℃30秒，72℃30秒，共35个循环，最后72℃延伸5分钟。使用如上所示的相同引物组对PCR产物进行测序。

全基因组测序(WGS)

1.文库准备

用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific)检测DNA浓度，并用Covaris S220Sonicator(Covaris)剪切成平均尺寸为350bp的目标片段。使用样品纯化珠(Illumina)纯化片段化的DNA。根据Illumina提供的方案，用TruSeq Nano DNA样品制备试剂盒(Illumina)制备接头-连接子(Adapter-ligated)文库。

2.Illumina测序和分析

用Qubit 2.0荧光计dsDNA HS Assay(Thermo Fisher Scientific)检测富集的测序文库的DNA浓度。用Agilent BioAnalyzer 2100(Agilent)分析所得测序文库的片段尺寸分布。利用HiSeq PE Cluster Kit(Illumina)和Illumina cBOT簇生成系统，将上述文库用于簇形成。按照Illumina提供的2x150双末端测序方案，用Illumina HiSeq系统进行末端配对测序。

通过使用ANNOVAR和Manta软件比较配对的肿瘤和正常的基因组来分析体细胞SNV，缺失和结构突变。

免疫组化

根据赫尔辛基宣言，所有与人体组织相关的工作都是经上海交通大学批准，按照机构审查委员会批准的协议进行的，研究人员获得了受试者的书面同意书(如有必要)。人体组织标本来自上海交通大学医学院，上海儿童医学中心(中国上海)。用抗CD1a(Abcam，ab201337)，CD207(EPR15863)，S100(ab868)的抗体对石蜡包埋的鉴定为人LCH样本的组织切片进行染色。根据阳性细胞的百分比将IHC染色评分为0-3。

细胞培养

在补充有10％FBS，100U/ml青霉素G和100μg/ml链霉素的DMEM中培养HEK293T细胞和鼠成纤维细胞NIH 3T3细胞。37℃，5％CO₂条件下孵育细胞。

构建和感染

利用RT-PCR技术，利用从初级石蜡包埋的组织中分离的RNA，将PLEKHA6-NTRK3融合转录本的完整编码序列克隆至LVX-puro载体(上海GeneChem)中，并通过DNA测序进行验证。此外，将来自人cDNA文库的NTRK3结构域，PLEKHA6结构域和整个NTRK3克隆到相同载体中。

利用包装质粒PSPAX₂和PMD₂G，将慢病毒构建体转染到HEK293T细胞中，利用脂质体转染法产生复制缺陷型病毒。48小时后收集上清液并利用100kd柱(Amicon纯化系统，MILLIPORE)浓缩，将病毒转导入补充有8μg/ml聚凝胺(Sigma)的NIH 3T3细胞中。感染后24小时更换培养基，利用1ug/ml嘌呤霉素筛选puro阳性细胞。

蛋白印迹

利用裂解缓冲液收获细胞。对细胞裂解物进行SDS-PAGE，转移到硝酸纤维素膜上并用下列抗体进行免疫印迹：Erk(细胞信号传导#4695)，phospho-Erk(细胞信号传导#4370)，Actin(HuaAn M1210-2)。使用奥德赛系统(LI-COR Biosciences)分析免疫印迹。

增长曲线

根据该方法比较具有PLEKHA6-NTRK3，NTRK3结构域，PLEKHA6结构域，完整NTRK3的细胞系，以及转导的表达puro的对照细胞的细胞生长曲线。简而言之，将5E4细胞接种于12孔板的每个孔中，并通过每24小时的细胞计数，用excel软件绘制6天内的生长曲线。

统计分析

数据表示为平均值±SD。所有分析都是双尾的，并且当P值小于0.05时认为是统计学显著的。

实施例1

LCH患儿中新融合基因PLEKHA6-NTRK3的检测

发明人进行了桑格测序，用于特异性评估89名儿科LCH患者中BRAF V600E和MAP2K1基因的突变情况。

结果显示，89例患儿中有37例(41.6％)携带BRAF V600E突变，有34例(38.2％)检出MAP2K1突变，并且其与BRAF突变是互相排斥的(图1A，B，C)。其余18名儿科LCH患者为BRAFV600E阴性和MAP2K1阴性，发明人对其中既有血液样本又有石蜡包埋组织的病例进行了全基因组测序(WGS)，以寻找额外的异常基因组改变。在患儿中鉴定出一个新的融合基因PLEKHA6-NTRK3(89例中有1例，1.1％)。

实施例2

患者的临床表现

包含融合基因PLEKHA6-NTRK3的患者为33个月大的男性患者，间歇性腰痛病史超过1个月，体格检查显示脊柱外观无畸形，脊柱活动正常，无明显局限性，同时胸腰段局部棘突轻度压痛。该患者没有其他的先天异常，家族史也不明显。全身磁共振成像(MRI)显示T12椎体楔形，有软组织肿块(图2A)，腹部B超显示肝门静脉胰腺淋巴结为1.5×0.7cm，1.7×0.11cm。

患者在手术过程中同时进行了软组织肿块的活检。形态学上，活检标本由异常的组织细胞组成，细胞为小椭圆形细胞，胞质轻度嗜酸性，细胞核皱缩，极少异型性，可见嗜酸性粒细胞浸润(图2B)。患者证实患有SS-LCH，免疫组织化学检测显示组织细胞CD1a，langerin(CD207)和S100阳性(图2B)。

患者的治疗方案是根据LCH-II(B组)研究调整的SCMC-LCH-2011风险组的化疗。患者接受了连续的泼尼松(4周内每天40mg/m²，2周内减量)，长春新碱(7周内每周1.5mg/m²)和依托泊苷(100mg/m²/d，1-3天，每2次8周)治疗。继续治疗是6-硫鸟嘌呤(每天40mg/m²)和泼尼松脉冲(每天40mg/m²，1-5天，每3周)和长春新碱(1.5mg/m²/d，每3周一次)(图2D)。经过一年的治疗后，MRI复查显示患者恢复健康。

实施例3

融合基因PLEKHA6-NTRK3的功能分析

为了进一步评估PLEKHA6-NTRK3表达的作用，根据WGS结果，对患者和cDNA库中的PLEKHA6-NTRK3，C末端NTRK3结构域，N末端PLEKHA6结构域和完整NTRK3的序列进行RT-PCR，并与LVX-puro质粒载体结合(图3)。分别用包装有编码PLEKHA6-NTRK3，NTRK3结构域，PLEKHA6结构域，完整NTRK3的慢病毒和空载体转导鼠成纤维细胞NIH 3T3细胞。

与对照NIH 3T3细胞以及转导空载体，NTRK3结构域，PLEKHA6结构域和完整NTRK3的细胞系相比，转导PLEKHA6-NTRK3的细胞系的p-ERK更高，表明特异性激活融合基因MAP激酶通路(图4A)。该通路的激活与许多细胞功能有关，如细胞生长，增殖。事实上，结果显示转导PLEKHA6-NTRK3的NIH 3T3的细胞具有显著促进生长的能力(图4B)。这一结果表明NTRK3的异常表达可激活MAP激酶通路从而诱导LCH(图4C)。

讨论

本发明提供了一种新的融合基因PLEKHA6-NTRK3，该突变组成性激活MAPKinaseRAS-RAF-MEK-ERK细胞信号传导通路，以促进细胞生长。因此，本发明缩小了LCH分子谱的未知部分，可以将其添加到LCH分子筛选组中以更好地定义其在LCH中的发病率。

在本研究中，BRAF V600E和MAP2K1的突变率分别为41.6％和38.2％(图1A，B，C)，分别高于先前报道的亚洲患者的突变率。BRAF V600E突变是LCH中最重要且频率最高的基因组改变，其次是MAP2K1突变。两种突变都可以组成性激活MAPKinase细胞信号传导途径，其是涉及细胞生长，增殖和分化等许多细胞功能的关键调节剂。除LCH外，这两种突变与几种人类癌症相关，包括黑素瘤,毛细胞白血病等。BRAF抑制剂Vemurafenib已用于治疗LCH，研究表明，Vemurafenib和MEK激酶抑制剂可有效用于黑色素瘤的联合治疗。所有这些都表明RAS-RAF-MEK-ERK通路在癌症发生中起重要作用。

在BRAF V600E阴性和MAP2K1阴性患者中检测到的新的融合基因PLEKHA6-NTRK3，其与RAS-RAF-MEK-ERK通路相关，因为其可特异性激活该通路(图4A)。已发现涉及BRAF，ALK和NTRK1的复发性激酶融合与LCH的发病机制有关，并且在许多其他肿瘤中已检测到涉及NTRK3的融合基因。例如，融合基因ETV6-NTRK3与先天性成纤维细胞性肾瘤相关，并报道为人类分泌型乳腺癌的主要因素，靶向NTRK3的多个融合基因如EML4-NTRK3可能贡献于先天性纤维肉瘤的发展。发明人预测,这种易位可能会导致一种新的融合突变PLEKHA6-NTRK3，这可能是朗格汉斯细胞组织细胞增生症的一种驱动因素。

LCH被认为是肿瘤性疾病，也被认为是免疫性疾病，而其发病机制仍不明确。本发明发现新的致病基因有利于阐明该病的发病机制。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心

<120> 融合基因PLEKHA6-NTRK3及其在LCH中的应用

<130> P2018-957

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1693

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcctgggaaa gatgctggat cctgcagtaa ccacaacagc atcctctccc tgcgccaggg 60

acctgccagc cggagagatg actgattaga tcagattaga tccggagccc cgctctgcag 120

aagggggccc caggggcggg ggaggaggac cccagctggc ctgagctggg gggaggggtg 180

ccttggggct cgcagagtta gagctttcca gcgcggggat cacacctcag aagccgccac 240

aatgaaagac ggaacacatt tctacaccca gtgactggcc aggtcccaga ggaaaacaaa 300

aaatttgact tgaaaatatc gaccttggac atgtccaata aaacaggtgg gaaacgcccg 360

gctaccacca acagtgacat acccaaccac aacatggtgt ccgaggtccc tccagagcgg 420

cccagcgtcc ggggtcccgt ggctgtcatc agtggtgagg aggactcagc cagcccactg 480

caccacatca accacggcat caccacgccc tcgtcactgg atgccgggcc cgacactgtg 540

gtcattggca tgactcgcat ccctgtcatt gagaaccccc agtacttccg tcagggacac 600

aactgccaca agccggacac gtatgtgcag cacattaaga ggagagacat cgtgctgaag 660

cgagaactgg gtgagggagc ctttggaaag gtcttcctgg ccgagtgcta caacctcagc 720

ccgaccaagg acaagatgct tgtggctgtg aaggccctga aggatcccac cctggctgcc 780

cggaaggatt tccagaggga ggccgagctg ctcaccaacc tgcagcatga gcacattgtc 840

aagttctatg gagtgtgcgg cgatggggac cccctcatca tggtctttga atacatgaag 900

catggagacc tgaataagtt cctcagggcc catgggccag atgcaatgat ccttgtggat 960

ggacagccac gccaggccaa gggtgagctg gggctctccc aaatgctcca cattgccagt 1020

cagatcgcct cgggtatggt gtacctggcc tcccagcact ttgtgcaccg agacctggcc 1080

accaggaact gcctggttgg agcgaatctg ctagtgaaga ttggggactt cggcatgtcc 1140

agagatgtct acagcacgga ttattacagg gtgggaggac acaccatgct ccccattcgc 1200

tggatgcctc ctgaaagcat catgtaccgg aagttcacta cagagagtga tgtatggagc 1260

ttcggggtga tcctctggga gatcttcacc tatggaaagc agccatggtt ccaactctca 1320

aacacggagg tcattgagtg cattacccaa ggtcgtgttt tggagcggcc ccgagtctgc 1380

cccaaagagg tgtacgatgt catgctgggg tgctggcaga gggaaccaca gcagcggttg 1440

aacatcaagg agatctacaa aatcctccat gctttgggga aggccacccc aatctacctg 1500

gacattcttg gctagtggtg gctggtggtc atgaattcat actctgttgc ctcctctctc 1560

cctgcctcac atctcccttc cacctcacaa ctccttccat ccttgactga agcgaacatc 1620

ttcatataaa ctcaagtgcc tgctacacat acaacactga aaaaaggaaa aaaaaagaaa 1680

gaaaaaaaaa ccc 1693

<210> 2

<211> 408

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Asn Lys Thr Gly Gly Lys Arg Pro Ala Thr Thr Asn Ser Asp

1 5 10 15

Ile Pro Asn His Asn Met Val Ser Glu Val Pro Pro Glu Arg Pro Ser

20 25 30

Val Arg Gly Pro Val Ala Val Ile Ser Gly Glu Glu Asp Ser Ala Ser

35 40 45

Pro Leu His His Ile Asn His Gly Ile Thr Thr Pro Ser Ser Leu Asp

50 55 60

Ala Gly Pro Asp Thr Val Val Ile Gly Met Thr Arg Ile Pro Val Ile

65 70 75 80

Glu Asn Pro Gln Tyr Phe Arg Gln Gly His Asn Cys His Lys Pro Asp

85 90 95

Thr Tyr Val Gln His Ile Lys Arg Arg Asp Ile Val Leu Lys Arg Glu

100 105 110

Leu Gly Glu Gly Ala Phe Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Cys Tyr Asn

115 120 125

Leu Ser Pro Thr Lys Asp Lys Met Leu Val Ala Val Lys Ala Leu Lys

130 135 140

Asp Pro Thr Leu Ala Ala Arg Lys Asp Phe Gln Arg Glu Ala Glu Leu

145 150 155 160

Leu Thr Asn Leu Gln His Glu His Ile Val Lys Phe Tyr Gly Val Cys

165 170 175

Gly Asp Gly Asp Pro Leu Ile Met Val Phe Glu Tyr Met Lys His Gly

180 185 190

Asp Leu Asn Lys Phe Leu Arg Ala His Gly Pro Asp Ala Met Ile Leu

195 200 205

Val Asp Gly Gln Pro Arg Gln Ala Lys Gly Glu Leu Gly Leu Ser Gln

210 215 220

Met Leu His Ile Ala Ser Gln Ile Ala Ser Gly Met Val Tyr Leu Ala

225 230 235 240

Ser Gln His Phe Val His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu Val

245 250 255

Gly Ala Asn Leu Leu Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ser Arg Asp

260 265 270

Val Tyr Ser Thr Asp Tyr Tyr Arg Leu Phe Asn Pro Ser Gly Asn Asp

275 280 285

Phe Cys Ile Trp Cys Glu Val Gly Gly His Thr Met Leu Pro Ile Arg

290 295 300

Trp Met Pro Pro Glu Ser Ile Met Tyr Arg Lys Phe Thr Thr Glu Ser

305 310 315 320

Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Ile Leu Trp Glu Ile Phe Thr Tyr Gly

325 330 335

Lys Gln Pro Trp Phe Gln Leu Ser Asn Thr Glu Val Ile Glu Cys Ile

340 345 350

Thr Gln Gly Arg Val Leu Glu Arg Pro Arg Val Cys Pro Lys Glu Val

355 360 365

Tyr Asp Val Met Leu Gly Cys Trp Gln Arg Glu Pro Gln Gln Arg Leu

370 375 380

Asn Ile Lys Glu Ile Tyr Lys Ile Leu His Ala Leu Gly Lys Ala Thr

385 390 395 400

Pro Ile Tyr Leu Asp Ile Leu Gly

405

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accaccaaca gtgacatacc 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtcctcctc accactgat 19

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctctgatag gaaaatgaga tc 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actgatggga cccactccat c 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctctagcctc ccactttgat 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctcacctttc tggccatgac 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctccctctac cttaaagagc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgtcacatac catgtgctcc 20

Claims

1.一种分离的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是由PLEKHA6蛋白的片段与NTRK3蛋白的片段构成的融合蛋白，其中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。

3.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的载体或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

5. 一种产生权利要求1所述融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：

在适合表达的条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞，从而表达出权利要求1所述的融合蛋白；和

分离所述融合蛋白。

6.一种检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂包括：

(i) 一上游引物和一下游引物，

其中，所述上游引物结合于如权利要求2所述的多核苷酸中编码PLEKHA6蛋白片段的核苷酸序列，所述下游引物结合于如权利要求2所述的多核苷酸中编码NTRK3蛋白片段的核苷酸序列；和

(ii) 任选的特异性探针。

7.一种含有权利要求6所述检测试剂的试剂盒。

8. 一种权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2所述的多核苷酸的用途，其特征在于，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于(i)检测待测样本中PLEKHA6-NTRK3基因是否融合和/或确认PLEKHA6-NTRK3基因的融合位点；和/或(ii) 对LCH患者进行分型。

9.一种体外非治疗性的抑制MAPKinase通路激活的方法，其特征在于，包括步骤：

在添加权利要求1所述融合蛋白抑制剂的条件下，培养细胞，从而抑制细胞的MAPKinase通路激活；或降低权利要求1所述融合蛋白的表达量或活性。