JP2003510077A - Prv−1遺伝子とその使用 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本明細書は、PRV−1タンパク質をコードし、配列番号1を必ず含有しているヌクレオチド配列について記載しており、さらにこの遺伝子の検出方法、すなわち該遺伝子によってコードされているmRNAおよび該遺伝子によってコードされているポリペプチドの検出方法についても記載している。
Description
【0001】
(技術分野)
本発明はPRV−1遺伝子をコードするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配
列を含む組み換えDNA、該組み換えDNAを含むベクター、およびこれらのベ
クターで形質転換した細胞に関するものであり、さらにPRV−1ポリペプチド
、該ポリペプチドに対する抗体、該PRV−1ポリペプチドを検出するための方
法および、PRV−1ポリペプチドあるいはPRV−1ポリペプチドを標的とす
る抗体を含有する薬剤に関する。
列を含む組み換えDNA、該組み換えDNAを含むベクター、およびこれらのベ
クターで形質転換した細胞に関するものであり、さらにPRV−1ポリペプチド
、該ポリペプチドに対する抗体、該PRV−1ポリペプチドを検出するための方
法および、PRV−1ポリペプチドあるいはPRV−1ポリペプチドを標的とす
る抗体を含有する薬剤に関する。
【0002】
(背景技術)
真性赤血球増加症(真性多血症)(polycythemia rubra vera)は、polycythe
mia veraあるいはp.veraとも呼ばれ、赤血球系細胞、顆粒球細胞および巨大核細
胞の形成が増加する悪性血液疾患である。この疾病はクローン化する過程に原因
があり、造血前駆細胞の1つが変異する結果として生じる。ドイツでは、真性赤
血球増加症の症例は住民100万人につき4〜6人の割合でみられる。治療せず
放置しておくと、18ヶ月以内に死に至る。瀉血や化学療法による治療を行った
場合、平均生存期間は13年以上となる。
mia veraあるいはp.veraとも呼ばれ、赤血球系細胞、顆粒球細胞および巨大核細
胞の形成が増加する悪性血液疾患である。この疾病はクローン化する過程に原因
があり、造血前駆細胞の1つが変異する結果として生じる。ドイツでは、真性赤
血球増加症の症例は住民100万人につき4〜6人の割合でみられる。治療せず
放置しておくと、18ヶ月以内に死に至る。瀉血や化学療法による治療を行った
場合、平均生存期間は13年以上となる。
【0003】
真性赤血球増加症は、臨床学的な判定により診断が下される。臨床上の症状と
しては、3分の2の患者に頭痛、かゆみ、脾腫、3分の1の患者に出血、血栓症
、高血圧がみられ、又、尿酸生成増加による痛風や敗血症性潰瘍を生じることも
ある。臨床検査上最も重要な所見としては、ヘモグロビン値、ヘマトクリット値
、赤血球数および総赤血球量の増加が見られることであり、また多くの場合で、
好中性顆粒球増多症または血小板増多症の増加が見られる。判定条件の大部分が
かなり不明瞭である一方で、全ての患者がこれらの判定条件を満たすわけではな
いので、しばしば真性赤血球増加症と、例えば慢性顆粒球性白血病や本態性血小
板増多症等の他の骨髄増殖性疾患と区別するのが困難であり、従って診断を確実
にするのは難しい。現在まで、真性赤血球増加症の分子レベルでの原因は、全く
解明されていない。真性赤血球増加症は治療をしないと深刻な症状の進行をたど
るため、正確な診断が大切である。
しては、3分の2の患者に頭痛、かゆみ、脾腫、3分の1の患者に出血、血栓症
、高血圧がみられ、又、尿酸生成増加による痛風や敗血症性潰瘍を生じることも
ある。臨床検査上最も重要な所見としては、ヘモグロビン値、ヘマトクリット値
、赤血球数および総赤血球量の増加が見られることであり、また多くの場合で、
好中性顆粒球増多症または血小板増多症の増加が見られる。判定条件の大部分が
かなり不明瞭である一方で、全ての患者がこれらの判定条件を満たすわけではな
いので、しばしば真性赤血球増加症と、例えば慢性顆粒球性白血病や本態性血小
板増多症等の他の骨髄増殖性疾患と区別するのが困難であり、従って診断を確実
にするのは難しい。現在まで、真性赤血球増加症の分子レベルでの原因は、全く
解明されていない。真性赤血球増加症は治療をしないと深刻な症状の進行をたど
るため、正確な診断が大切である。
【0004】
(発明の開示)
本発明の目的は、それゆえ真性赤血球増加症の原因を分子レベルで見つけるこ
とであり、真性赤血球増加症の診断を可能にすることであった。
とであり、真性赤血球増加症の診断を可能にすることであった。
【0005】
この目的は、健康な対照被験者ではみられない、真性赤血球増加症と関連して
特異的に発現される遺伝子を単離することによって達成された。該遺伝子はPR
V−1(polycythemia rubra vera)遺伝子と呼ばれる。
特異的に発現される遺伝子を単離することによって達成された。該遺伝子はPR
V−1(polycythemia rubra vera)遺伝子と呼ばれる。
【0006】
類似のヌクレオチド配列が国際出願WO 98/50552に開示されている
。
。
【0007】
発明の主要部分の1つとしては、PRV−1遺伝子をコードしており、かつ配
列番号1を必ず含有するポリヌクレオチドに関するものである。本発明のポリヌ
クレオチドはシングルストランドのDNAあるいはダブルストランドのDNAで
あってもよいし、RNAであってもよい。本発明のポリヌクレオチドがRNAで
ある場合、ヌクレオチド‘U’はヌクレオチド‘T’の代わりとなるということ
は当業者には明白である。‘ポリヌクレオチド’は15あるいはそれ以上のヌク
レオチドを含む核酸を意味すると理解されている。
列番号1を必ず含有するポリヌクレオチドに関するものである。本発明のポリヌ
クレオチドはシングルストランドのDNAあるいはダブルストランドのDNAで
あってもよいし、RNAであってもよい。本発明のポリヌクレオチドがRNAで
ある場合、ヌクレオチド‘U’はヌクレオチド‘T’の代わりとなるということ
は当業者には明白である。‘ポリヌクレオチド’は15あるいはそれ以上のヌク
レオチドを含む核酸を意味すると理解されている。
【0008】
(発明を実施するための最良の形態)
本発明に係るヌクレオチド配列は図1に描写されている。本発明は、図1に示
されている配列に相当するポリヌクレオチドに関するものであり、また少し異な
るヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにも関連するものである。本願明
細書における、少し異なるヌクレオチド配列というのは、ほんの少し、好ましく
は50以下、特に好ましくは25以下のヌクレオチドが置換されていてもよい配
列を意味し、さらにこのように少し異なるヌクレオチド配列によってコードされ
る遺伝子の機能は影響されてないと理解されることとする。当業者には、アミノ
酸をコードしている元のトリプレットは同じアミノ酸をコードする他のトリプレ
ットで置換えてもよいという事実はよく知られている。これに加えて、ほとんど
重要ではない領域は小さい範囲で、欠失および/または変異されていてもよい。
特に好ましい態様では、ポリヌクレオチドは配列番号1記載の36番〜1346
番の塩基からなるヌクレオチド、すなわちPRV−1遺伝子をコードしている領
域を含む。他の態様では、ポリヌクレオチドは配列番号1記載の36番〜126
2番あるいは36番〜1238番の塩基からなるヌクレオチドを含む。この領域
はおそらくPRV−1ポリペプチドの活性領域をコードしている。 結局、本発明におけるポリヌクレオチドは配列番号1記載の39番〜1346
番、39番〜1262番あるいは39番〜1238番の塩基からなるヌクレオチ
ドを含んでもよいため、スタートするメチオニンをコードするコドンは存在しな
い。好ましい態様としては、配列番号1記載の99番〜1346番、99番〜1
262番あるいは99番〜1238番の塩基からなるヌクレオチドを含むポリヌ
クレオチドが挙げられる。この結果、PRV−1ポリペプチドのシグナルペプチ
ドをコードする5´末端のコドンは存在しない。
されている配列に相当するポリヌクレオチドに関するものであり、また少し異な
るヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにも関連するものである。本願明
細書における、少し異なるヌクレオチド配列というのは、ほんの少し、好ましく
は50以下、特に好ましくは25以下のヌクレオチドが置換されていてもよい配
列を意味し、さらにこのように少し異なるヌクレオチド配列によってコードされ
る遺伝子の機能は影響されてないと理解されることとする。当業者には、アミノ
酸をコードしている元のトリプレットは同じアミノ酸をコードする他のトリプレ
ットで置換えてもよいという事実はよく知られている。これに加えて、ほとんど
重要ではない領域は小さい範囲で、欠失および/または変異されていてもよい。
特に好ましい態様では、ポリヌクレオチドは配列番号1記載の36番〜1346
番の塩基からなるヌクレオチド、すなわちPRV−1遺伝子をコードしている領
域を含む。他の態様では、ポリヌクレオチドは配列番号1記載の36番〜126
2番あるいは36番〜1238番の塩基からなるヌクレオチドを含む。この領域
はおそらくPRV−1ポリペプチドの活性領域をコードしている。 結局、本発明におけるポリヌクレオチドは配列番号1記載の39番〜1346
番、39番〜1262番あるいは39番〜1238番の塩基からなるヌクレオチ
ドを含んでもよいため、スタートするメチオニンをコードするコドンは存在しな
い。好ましい態様としては、配列番号1記載の99番〜1346番、99番〜1
262番あるいは99番〜1238番の塩基からなるヌクレオチドを含むポリヌ
クレオチドが挙げられる。この結果、PRV−1ポリペプチドのシグナルペプチ
ドをコードする5´末端のコドンは存在しない。
【0009】
本発明に係るポリヌクレオチドはPRV−1遺伝子の断片であってもよい。一
般に、該断片は100を越えるヌクレオチドを有し、好ましくは300を越える
ヌクレオチドを有する。該断片はプライマーやプローブとして、特にPCRに用
いてもよい。この場合、該断片は目的に合わせて切断してもよい。通常、プライ
マーの長さは10〜30ヌクレオチドであり、プローブは15〜50ヌクレオチ
ドである。
般に、該断片は100を越えるヌクレオチドを有し、好ましくは300を越える
ヌクレオチドを有する。該断片はプライマーやプローブとして、特にPCRに用
いてもよい。この場合、該断片は目的に合わせて切断してもよい。通常、プライ
マーの長さは10〜30ヌクレオチドであり、プローブは15〜50ヌクレオチ
ドである。
【0010】
PRV−1遺伝子は内在性遺伝子であり、健康な個体で発現する場合は数個の
器官に限定して発現する。通常、該遺伝子は造血器官、すなわち骨髄や胎児の肝
臓で主に発現し、脾臓においては弱い発現がみられるが、心臓、筋肉、膵臓ある
いは肝臓では発現しない。真性赤血球増加症罹患患者では、この遺伝子は特に造
血細胞で非常に強く、過剰に発現している。
器官に限定して発現する。通常、該遺伝子は造血器官、すなわち骨髄や胎児の肝
臓で主に発現し、脾臓においては弱い発現がみられるが、心臓、筋肉、膵臓ある
いは肝臓では発現しない。真性赤血球増加症罹患患者では、この遺伝子は特に造
血細胞で非常に強く、過剰に発現している。
【0011】
PRV−1遺伝子は図2で示されるタンパク質配列を表すタンパク質をコード
している。シグナルペプチドは全ての表面分子のタンパク質配列中に存在し、通
常タンパク質が製造される際に取り除かれ、ハイフンによって分けられている。
該タンパク質は配列番号2を有する。本発明の他の側面としては、従って(イ)
配列番号2を有する本質的に純粋なポリペプチド、あるいは(ロ)配列番号2を
有しているがシグナルペプチド(すなわち配列番号2記載の22番〜437番の
アミノ酸)を欠いているポリペプチドが挙げられる。他の態様としては、配列番
号2記載の1番〜409番、22番〜409番、1番〜401番あるいは22番
〜401番(おそらく該タンパク質の活性領域である)からなるアミノ酸を含む
ポリペプチドが挙げられる。
している。シグナルペプチドは全ての表面分子のタンパク質配列中に存在し、通
常タンパク質が製造される際に取り除かれ、ハイフンによって分けられている。
該タンパク質は配列番号2を有する。本発明の他の側面としては、従って(イ)
配列番号2を有する本質的に純粋なポリペプチド、あるいは(ロ)配列番号2を
有しているがシグナルペプチド(すなわち配列番号2記載の22番〜437番の
アミノ酸)を欠いているポリペプチドが挙げられる。他の態様としては、配列番
号2記載の1番〜409番、22番〜409番、1番〜401番あるいは22番
〜401番(おそらく該タンパク質の活性領域である)からなるアミノ酸を含む
ポリペプチドが挙げられる。
【0012】
生物学的活性に関しては、本発明に係るポリペプチドはグリコシル化されてい
るのが好ましく、もっとも好ましくはN−グリコシル化されていることである。
PRV−1ポリペプチドのアミノ酸Asn−46、Asn−189、およびAs
n−382(アミノ酸の番号は配列番号2における番号に相当する)のうち少な
くとも1つのアミノ酸でグリコシル化されていればよい。本発明はまた、N−グ
リコシル化された本発明に係るポリペプチドの断片も含んでいる。該断片はアミ
ノ酸を50以上、好ましくは100以上、最も好ましくは150以上有するもの
が好ましい。他の態様としては、ポリペプチドがO−グリコシル化されているも
のが挙げられる。
るのが好ましく、もっとも好ましくはN−グリコシル化されていることである。
PRV−1ポリペプチドのアミノ酸Asn−46、Asn−189、およびAs
n−382(アミノ酸の番号は配列番号2における番号に相当する)のうち少な
くとも1つのアミノ酸でグリコシル化されていればよい。本発明はまた、N−グ
リコシル化された本発明に係るポリペプチドの断片も含んでいる。該断片はアミ
ノ酸を50以上、好ましくは100以上、最も好ましくは150以上有するもの
が好ましい。他の態様としては、ポリペプチドがO−グリコシル化されているも
のが挙げられる。
【0013】
特定のアミノ酸を、タンパク質の生物学的活性を損なわない範囲で他のアミノ
酸で置換してもよいことは、当業者には明らかである。そのような、本発明に係
るポリペプチドを変異させたものも本発明の課題の一部分を構成する(変異型)
。アミノ酸の置換はタンパク質の生物学的活性に否定的な影響を与えるものであ
ってはならない。当業者は置換するアミノ酸を選択する際、よく知られている法
則を用いてよい。
酸で置換してもよいことは、当業者には明らかである。そのような、本発明に係
るポリペプチドを変異させたものも本発明の課題の一部分を構成する(変異型)
。アミノ酸の置換はタンパク質の生物学的活性に否定的な影響を与えるものであ
ってはならない。当業者は置換するアミノ酸を選択する際、よく知られている法
則を用いてよい。
【0014】
調製する方法によるが、PRV−1ポリペプチドは、例えばグリコシルホスフ
ァチジルイノシトールアンカー(glycosylphosphatidylinositol anchor)を有
していてもよい。グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーは配列番号2
の407番〜409番のアミノ酸に相当するアミノ酸に結合する。GPI(グリ
コシルホスファチジルイノシトール)アンカーは脂質を用いてタンパク質を細胞
膜の外側に結合させるのに用いられる。結果的にはまだ説明されるに至っていな
いが、GPIとリンクしたタンパク質は培地中にしばしば放出される。これは‘
シェディング(Shedding)’と呼ばれる。これまで、これは特別なプロ
セスであるのか否か、すなわちそのようなタンパク質は制御された方法で酵素に
よって膜から切り取られるのか、あるいはアンカーの非特異的な喪失を示してい
るのか否か明らかにされていない。PRV−1は、おそらく細胞膜上および細胞
外の両方で見られる。膜に結合しない分泌型の方が、成長因子や成長阻害剤とし
てのポリペプチドの効果においておそらくより重要である。というのはこの形態
は、成長因子として拡散して他の細胞に到達することができるためである。
ァチジルイノシトールアンカー(glycosylphosphatidylinositol anchor)を有
していてもよい。グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーは配列番号2
の407番〜409番のアミノ酸に相当するアミノ酸に結合する。GPI(グリ
コシルホスファチジルイノシトール)アンカーは脂質を用いてタンパク質を細胞
膜の外側に結合させるのに用いられる。結果的にはまだ説明されるに至っていな
いが、GPIとリンクしたタンパク質は培地中にしばしば放出される。これは‘
シェディング(Shedding)’と呼ばれる。これまで、これは特別なプロ
セスであるのか否か、すなわちそのようなタンパク質は制御された方法で酵素に
よって膜から切り取られるのか、あるいはアンカーの非特異的な喪失を示してい
るのか否か明らかにされていない。PRV−1は、おそらく細胞膜上および細胞
外の両方で見られる。膜に結合しない分泌型の方が、成長因子や成長阻害剤とし
てのポリペプチドの効果においておそらくより重要である。というのはこの形態
は、成長因子として拡散して他の細胞に到達することができるためである。
【0015】
C末端のアミノ酸を処理することによって、タンパク質が細胞膜に結合するの
に影響を与えることができるということは、当業者には明らかなことである。こ
れは特にPRV−1ポリペプチドあるいは該ポリペプチドの断片を発現すること
を目的とした、決められたDNAコンストラクトの調製に関する。これらのアミ
ノ酸をコードしているコドンは変異させてもよいし、欠失させてもよい。
に影響を与えることができるということは、当業者には明らかなことである。こ
れは特にPRV−1ポリペプチドあるいは該ポリペプチドの断片を発現すること
を目的とした、決められたDNAコンストラクトの調製に関する。これらのアミ
ノ酸をコードしているコドンは変異させてもよいし、欠失させてもよい。
【0016】
該遺伝子はuPAR/Ly6ファミリーの表面レセプターをコードしている。
このレセプターファミリーは細胞分裂を促進させる分裂誘発性シグナルを変換す
ることができる。従って、PRV−1遺伝子がとりわけ真性赤血球増加症患者の
骨髄細胞上で過剰発現すると、これらの細胞は過剰増殖すると仮定される。
このレセプターファミリーは細胞分裂を促進させる分裂誘発性シグナルを変換す
ることができる。従って、PRV−1遺伝子がとりわけ真性赤血球増加症患者の
骨髄細胞上で過剰発現すると、これらの細胞は過剰増殖すると仮定される。
【0017】
PRV−1は健康な個体の顆粒白血球あるいは例えば慢性顆粒球性白血病、急
性顆粒球性白血病、本態性血小板増多症または二次性赤血球増多症等の、他の骨
髄増殖性疾患患者では発現しないことが分かっている。
性顆粒球性白血病、本態性血小板増多症または二次性赤血球増多症等の、他の骨
髄増殖性疾患患者では発現しないことが分かっている。
【0018】
PRV−1遺伝子でコードされているポリペプチドを分析方法および検出方法
に用いることができるようにするため、ポリペプチドを便宜上組み換えDNAか
ら生成する。該組み換えDNAは、好ましくは配列番号1のヌクレオチド配列を
含む組み換えDNA、あるいは少なくともPRV−1遺伝子のコーディング領域
、つまり配列番号1の36番〜1346番または少なくとも39番〜1262番
か39番〜1238番からなるヌクレオチドを含む組み換えDNAで、機能的に
プロモーターに結合している組み換えDNAである。しかしながら、組み換えD
NAは配列番号1の断片のみを含有しているものでもよい。
に用いることができるようにするため、ポリペプチドを便宜上組み換えDNAか
ら生成する。該組み換えDNAは、好ましくは配列番号1のヌクレオチド配列を
含む組み換えDNA、あるいは少なくともPRV−1遺伝子のコーディング領域
、つまり配列番号1の36番〜1346番または少なくとも39番〜1262番
か39番〜1238番からなるヌクレオチドを含む組み換えDNAで、機能的に
プロモーターに結合している組み換えDNAである。しかしながら、組み換えD
NAは配列番号1の断片のみを含有しているものでもよい。
【0019】
本発明はさらにPRV−1ポリペプチドまたはその断片の組み換えDNAを含
有するベクターに関するものであり、また該ベクターでトランスフェクトまたは
形質転換した宿主細胞に関するものである。宿主細胞は例えば大腸菌等のバクテ
リアなどの原核細胞でもよい。しかしながら、原核細胞で発現するポリペプチド
はグリコシル化されない。従って、真核細胞が好ましく、真核細胞は発現したタ
ンパク質を翻訳後にグリコシル化することができ、タンパク質を他の方法で修飾
することができる。真核性宿主細胞の例としては、組み換えバキュロウイルスで
感染させて発現させるのに用いられるSf9細胞等の昆虫細胞や、293細胞、
COS細胞、CHO細胞やヒーラ(HeLa)細胞等の哺乳類の細胞が挙げられ
るが、これらの例に限定されることはない。宿主細胞として酵母細胞を用いるこ
ともできる。グリコシル化のパターンは宿主細胞によって異なってもよいことは
当業者には明らかである。従って、発現産物の生物学的活性は変化してもよい。
タンパク質の生物学的活性が保持されるような方法で発現産物をグリコシル化す
る宿主細胞を用いることが特に好ましい。
有するベクターに関するものであり、また該ベクターでトランスフェクトまたは
形質転換した宿主細胞に関するものである。宿主細胞は例えば大腸菌等のバクテ
リアなどの原核細胞でもよい。しかしながら、原核細胞で発現するポリペプチド
はグリコシル化されない。従って、真核細胞が好ましく、真核細胞は発現したタ
ンパク質を翻訳後にグリコシル化することができ、タンパク質を他の方法で修飾
することができる。真核性宿主細胞の例としては、組み換えバキュロウイルスで
感染させて発現させるのに用いられるSf9細胞等の昆虫細胞や、293細胞、
COS細胞、CHO細胞やヒーラ(HeLa)細胞等の哺乳類の細胞が挙げられ
るが、これらの例に限定されることはない。宿主細胞として酵母細胞を用いるこ
ともできる。グリコシル化のパターンは宿主細胞によって異なってもよいことは
当業者には明らかである。従って、発現産物の生物学的活性は変化してもよい。
タンパク質の生物学的活性が保持されるような方法で発現産物をグリコシル化す
る宿主細胞を用いることが特に好ましい。
【0020】
本発明の他の側面としては、本発明に係るポリペプチドを調製するための方法
に関する。この方法では、本発明のポリペプチドをコードするDNAは宿主細胞
で発現する。続いて、発現したポリペプチドが宿主細胞によって培地に分泌され
るか細胞内に保持されるかによって、培地または細胞を、ポリペプチド単離のた
めに選んで用いる。その後、本発明に係るポリペプチドを現在知られている方法
、例えばクロマトグラフィー法を用いて濃縮および/または精製する。タンパク
質を精製する方法は、例えばR.スコープス(Scopes)著「タンパク質精製法−
理論と実際−(第3版)」(1994)シュプリンガーフェアラーク(Springer Ver
lag)出版に述べられている。特に好ましい態様の1つとして、本発明に係る方
法は、グリコシル化されたポリペプチドが濃縮され、および/または精製される
工程を含んでいる。この工程は本発明に係るポリペプチドが本質的に精製される
前であっても、すでに精製された後のどちらに行われてもよい。後者の場合、精
製されたポリペプチドがグリコシル化された部分は分離され、単離される。この
方法の最も好ましい態様としては、N−グリコシル化されたポリペプチドが特異
的に単離されることである。この方法の他の態様としては、配列番号2のAsn
−46、Asn−189およびAsn−382のアミノ酸のうち少なくとも1つ
がグリコシル化されているポリペプチドが単離されることである。
に関する。この方法では、本発明のポリペプチドをコードするDNAは宿主細胞
で発現する。続いて、発現したポリペプチドが宿主細胞によって培地に分泌され
るか細胞内に保持されるかによって、培地または細胞を、ポリペプチド単離のた
めに選んで用いる。その後、本発明に係るポリペプチドを現在知られている方法
、例えばクロマトグラフィー法を用いて濃縮および/または精製する。タンパク
質を精製する方法は、例えばR.スコープス(Scopes)著「タンパク質精製法−
理論と実際−(第3版)」(1994)シュプリンガーフェアラーク(Springer Ver
lag)出版に述べられている。特に好ましい態様の1つとして、本発明に係る方
法は、グリコシル化されたポリペプチドが濃縮され、および/または精製される
工程を含んでいる。この工程は本発明に係るポリペプチドが本質的に精製される
前であっても、すでに精製された後のどちらに行われてもよい。後者の場合、精
製されたポリペプチドがグリコシル化された部分は分離され、単離される。この
方法の最も好ましい態様としては、N−グリコシル化されたポリペプチドが特異
的に単離されることである。この方法の他の態様としては、配列番号2のAsn
−46、Asn−189およびAsn−382のアミノ酸のうち少なくとも1つ
がグリコシル化されているポリペプチドが単離されることである。
【0021】
顆粒白血球から単離されたPRV−1ポリペプチドまたは組換えて製造された
PRV−1ポリペプチドは真性赤血球増加症を診断および治療するために用いて
もよい。
PRV−1ポリペプチドは真性赤血球増加症を診断および治療するために用いて
もよい。
【0022】
治療法の可能性の1つとしては、‘アンチセンス治療法’が挙げられる。この
方法は、‘アンチセンス’RNA分子、つまりPRV RNAに相補的なRNA
を用いる方法である。PRV−1のRNAは配列5´−AAAAGCAGAAA
GAGATTACCAGCC−3´(配列番号3)を開始部分に有するため、こ
の配列に対する必要なアンチセンスRNAは下記のヌクレオチド配列:5´−G
GCTGGTAATCTCTTTCTGCTTTT−3´(配列番号4)を有す
る。このアンチセンスRNAをベクターに組込み、真性赤血球増加症細胞に導入
する。このRNAを例えばトランスフェクション法によって導入する。この形質
転換に用いられるベクターは特異的に真性赤血球増加症細胞に導入されるように
配置されているのが好ましい。アンチセンスRNAが発現することによりPRV
−1mRNAはポリペプチドに翻訳されなくなる。この方法で処理された細胞は
いかなるPRV−1タンパク質をも形成することができない。
方法は、‘アンチセンス’RNA分子、つまりPRV RNAに相補的なRNA
を用いる方法である。PRV−1のRNAは配列5´−AAAAGCAGAAA
GAGATTACCAGCC−3´(配列番号3)を開始部分に有するため、こ
の配列に対する必要なアンチセンスRNAは下記のヌクレオチド配列:5´−G
GCTGGTAATCTCTTTCTGCTTTT−3´(配列番号4)を有す
る。このアンチセンスRNAをベクターに組込み、真性赤血球増加症細胞に導入
する。このRNAを例えばトランスフェクション法によって導入する。この形質
転換に用いられるベクターは特異的に真性赤血球増加症細胞に導入されるように
配置されているのが好ましい。アンチセンスRNAが発現することによりPRV
−1mRNAはポリペプチドに翻訳されなくなる。この方法で処理された細胞は
いかなるPRV−1タンパク質をも形成することができない。
【0023】
本発明は従って、PRV−1ポリペプチドまたはそのエピトープが検出され、
またその発現の程度が決定されることにより特徴付けられる、真性赤血球増加症
を検出するための方法に関するものでもある。
またその発現の程度が決定されることにより特徴付けられる、真性赤血球増加症
を検出するための方法に関するものでもある。
【0024】
例えば顆粒白血球等、骨髄以外の成熟細胞上でレセプターが過剰発現するとい
うことは、真性赤血球増加症が存在することを強く示唆している。この過剰発現
は便宜上、PRV−1レセプターに対する抗体を用いた免疫測定法により検出さ
れる。適した試験方法としては、公知の免疫測定方法に手を加えたものがあげら
れ、PRV−1ポリペプチド特異的抗体を、固化されたあるいは液状の他の標識
された抗体と合わせて利用したものが挙げられる。ラベリングは自体公知の方法
により行われ、例えば放射性同位体を用いて蛍光法や発光法によってラベリング
を行ったり、酵素を用いて染色反応によって行ったり、あるいは測定に適した他
の方法を用いて行われる。これらの変形法は当業者に知られているため、ここで
はこれ以上の詳細な説明は必要ではない。本発明によると、ELISA法が特に
好ましい。
うことは、真性赤血球増加症が存在することを強く示唆している。この過剰発現
は便宜上、PRV−1レセプターに対する抗体を用いた免疫測定法により検出さ
れる。適した試験方法としては、公知の免疫測定方法に手を加えたものがあげら
れ、PRV−1ポリペプチド特異的抗体を、固化されたあるいは液状の他の標識
された抗体と合わせて利用したものが挙げられる。ラベリングは自体公知の方法
により行われ、例えば放射性同位体を用いて蛍光法や発光法によってラベリング
を行ったり、酵素を用いて染色反応によって行ったり、あるいは測定に適した他
の方法を用いて行われる。これらの変形法は当業者に知られているため、ここで
はこれ以上の詳細な説明は必要ではない。本発明によると、ELISA法が特に
好ましい。
【0025】
PRV−1レセプターを特異的に検出するために必要な抗体は自体公知の方法
と同様の方法で調製される。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のど
ちらも適しているが、どちらかといえばモノクローナル抗体を用いるのが好まし
い。
と同様の方法で調製される。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のど
ちらも適しているが、どちらかといえばモノクローナル抗体を用いるのが好まし
い。
【0026】
タンパク質から得られるペプチドも抗体を調製するのに用いてもよい。本発明
の内容に範囲内においては、以下の配列を有するペプチドを用いて成功した。 a)KVSDLPRQWTPKN(34番〜46番のアミノ酸)[配列番号5]お
よび、 b)SAREKRDVQPPASQH(391番〜405番のアミノ酸)[配列
番号6]
の内容に範囲内においては、以下の配列を有するペプチドを用いて成功した。 a)KVSDLPRQWTPKN(34番〜46番のアミノ酸)[配列番号5]お
よび、 b)SAREKRDVQPPASQH(391番〜405番のアミノ酸)[配列
番号6]
【0027】
ポリクローナル抗体は、通常適切な宿主(ウサギ)をPRV−1ポリペプチド
で免疫すると免疫学的支持体(アジュバント)に適切に結合し、免疫反応を誘発
することにより製造される。モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術を用いて
自体公知の方法により生産することができる。抗体はアフィニティ精製により精
製してもよい。抗体の調製および精製は例えば、ハーロウ(Harlow)およびレー
ン(Lane)著「抗体:研究室マニュアル」、コールド・スプリング・ハーバー研
究所出版等に記載されている。
で免疫すると免疫学的支持体(アジュバント)に適切に結合し、免疫反応を誘発
することにより製造される。モノクローナル抗体はハイブリドーマ技術を用いて
自体公知の方法により生産することができる。抗体はアフィニティ精製により精
製してもよい。抗体の調製および精製は例えば、ハーロウ(Harlow)およびレー
ン(Lane)著「抗体:研究室マニュアル」、コールド・スプリング・ハーバー研
究所出版等に記載されている。
【0028】
さらに、そのようなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体はPRV−
1を標的しており、真性赤血球増加症を治療するのに用いてもよい。
1を標的しており、真性赤血球増加症を治療するのに用いてもよい。
【0029】
他の態様としては、PRV−1レセプターはRT−PCR法を用いて検出して
もよい。RT−PCR法を行うために、一般的には顆粒白血球であるPRV−1
過剰発現細胞から、RNAをまず単離する。そして逆転写はRTプライマーを用
いて自体公知の方法により行う。RTプライマーは下記のヌクレオチド配列(配
列番号7)を有するプライマーであるのが好ましい。 配列番号7: ATTAGGTTATGAGGTCAGAGGGAGGTT
もよい。RT−PCR法を行うために、一般的には顆粒白血球であるPRV−1
過剰発現細胞から、RNAをまず単離する。そして逆転写はRTプライマーを用
いて自体公知の方法により行う。RTプライマーは下記のヌクレオチド配列(配
列番号7)を有するプライマーであるのが好ましい。 配列番号7: ATTAGGTTATGAGGTCAGAGGGAGGTT
【0030】
このようにして、特異的PRV−1RNAをDNAに変換する。このDNAを
自体公知の方法でPCR法により増幅させる。下記の2つのプライマーを増幅サ
イクルに用いるのが好ましい。 センスプライマーとして(配列番号8): GCAGAAAGAGATTACCAGCCACAGACGG アンチセンスプライマーとして(配列番号9): GAATCGTGGGGGTAATAGAGTTAGCAGG
自体公知の方法でPCR法により増幅させる。下記の2つのプライマーを増幅サ
イクルに用いるのが好ましい。 センスプライマーとして(配列番号8): GCAGAAAGAGATTACCAGCCACAGACGG アンチセンスプライマーとして(配列番号9): GAATCGTGGGGGTAATAGAGTTAGCAGG
【0031】
当業者は他の適切なプライマーを見つけるために、開示されている配列を容易
に用いてよい。
に用いてよい。
【0032】
RNAを該方法の開始物質として用いるため、PCRシグナルはPRV−1遺
伝子が発現している場合にのみポジティブである。上記で説明したように、これ
は患者が真性赤血球増加症に罹患しているときのみのことである。PRVは健康
な個体の顆粒白血球では発現しない。従って、いかなるRT−PCRシグナルも
存在しないということは、真性赤血球増加症に罹患していないことを示す。RT
−PCR法の定量化はタクマン(TaqMan)(商標登録)テクノロジーのものを用
いて行われるのが好ましい。この定量化にはプライマーに加えてプローブが必要
となる。プローブの好ましい配列としては、5´−TTCTTGTTGAACC
ACACCAGACAAATCGG−3´(配列番号10)が挙げられる。定量
的RT−PCRはPRV−1転写産物を検出するのに用いられ、従って本発明の
主要な一部を構成する。
伝子が発現している場合にのみポジティブである。上記で説明したように、これ
は患者が真性赤血球増加症に罹患しているときのみのことである。PRVは健康
な個体の顆粒白血球では発現しない。従って、いかなるRT−PCRシグナルも
存在しないということは、真性赤血球増加症に罹患していないことを示す。RT
−PCR法の定量化はタクマン(TaqMan)(商標登録)テクノロジーのものを用
いて行われるのが好ましい。この定量化にはプライマーに加えてプローブが必要
となる。プローブの好ましい配列としては、5´−TTCTTGTTGAACC
ACACCAGACAAATCGG−3´(配列番号10)が挙げられる。定量
的RT−PCRはPRV−1転写産物を検出するのに用いられ、従って本発明の
主要な一部を構成する。
【0033】
他の方法としては、ブロッティング法、好ましくはノーザンブロット法を用い
て真性赤血球増加症を診断することもできる。そのような方法では、RNAを顆
粒白血球から単離し、ブロッティング法、例えばノーザンブロット法を用いてP
RV−1の発現を調べる。配列番号1のcDNA配列あるいは該配列の断片もプ
ローブとして用いることができる。ハイブリダイゼーションは顆粒白血球を真性
赤血球増加症罹患患者からえたときにのみ起こる。というのは、罹患患者の顆粒
白血球上でのみ発現しているためである。ハイブリダイゼーションが起こらない
ということは、その個体から得られた顆粒白血球が、真性赤血球増加症に罹患し
ていないことを示唆している。
て真性赤血球増加症を診断することもできる。そのような方法では、RNAを顆
粒白血球から単離し、ブロッティング法、例えばノーザンブロット法を用いてP
RV−1の発現を調べる。配列番号1のcDNA配列あるいは該配列の断片もプ
ローブとして用いることができる。ハイブリダイゼーションは顆粒白血球を真性
赤血球増加症罹患患者からえたときにのみ起こる。というのは、罹患患者の顆粒
白血球上でのみ発現しているためである。ハイブリダイゼーションが起こらない
ということは、その個体から得られた顆粒白血球が、真性赤血球増加症に罹患し
ていないことを示唆している。
【0034】
該遺伝子の断片をノーザンブロットハイブリダイゼーションに用いることもで
きる。そのような断片は通常100を越える、好ましくは300を越える塩基を
有している。代わりに、様々な異なった遺伝子断片をノーザンブロット法のプロ
ーブとして用いることができ、制限酵素を用いて遺伝子を切断することにより調
製することができる。断片がcDNA由来のものである場合、該断片はダブルス
トランドで存在するため、シングルストランドに分離されてハイブリダイゼーシ
ョンに供される。適切な断片の例としては、420塩基対〜831塩基対のBa
mHI−PstI断片や831塩基対〜1900塩基対のPstI−PstI断
片が挙げられる。
きる。そのような断片は通常100を越える、好ましくは300を越える塩基を
有している。代わりに、様々な異なった遺伝子断片をノーザンブロット法のプロ
ーブとして用いることができ、制限酵素を用いて遺伝子を切断することにより調
製することができる。断片がcDNA由来のものである場合、該断片はダブルス
トランドで存在するため、シングルストランドに分離されてハイブリダイゼーシ
ョンに供される。適切な断片の例としては、420塩基対〜831塩基対のBa
mHI−PstI断片や831塩基対〜1900塩基対のPstI−PstI断
片が挙げられる。
【0035】
PRV−1mRNAつまり、PRV−1の発現はまず第1にRT−PCR反応
においてmRNAを逆転写し、次にcDNAを増幅することにより検出されても
よい。増幅されたDNAはハイブリダイゼーションのプローブで検出される。
においてmRNAを逆転写し、次にcDNAを増幅することにより検出されても
よい。増幅されたDNAはハイブリダイゼーションのプローブで検出される。
【0036】
陽性であると診断された場合、疾病は治療されなければならず、そうでなけれ
ば比較的短い期間で死に至る。治療には、PRV−1を標的とする、細胞毒性成
分が適切な部位に結合する特異的な抗体を用いることができる。
ば比較的短い期間で死に至る。治療には、PRV−1を標的とする、細胞毒性成
分が適切な部位に結合する特異的な抗体を用いることができる。
【0037】
本発明は、従ってさらに通常の賦形剤に加えて、PRV−1レセプターを標的
とする抗体を含む薬剤に関する。
とする抗体を含む薬剤に関する。
【0038】
PRV−1レセプターは真性赤血球増加症において過剰発現するため、多くの
抗体は抗PRV−1抗体と接触した場合に罹患顆粒白血球の表面に結合する。多
くの抗体がこれらの細胞に結合すると、免疫学的細胞によるこれらの顆粒白血球
の破壊が促進される。このようにして、真性赤血球増加症細胞を特異的に排除す
ることができる。
抗体は抗PRV−1抗体と接触した場合に罹患顆粒白血球の表面に結合する。多
くの抗体がこれらの細胞に結合すると、免疫学的細胞によるこれらの顆粒白血球
の破壊が促進される。このようにして、真性赤血球増加症細胞を特異的に排除す
ることができる。
【0039】
驚くべきことに、PRV−1ポリペプチドは造血性活性を発揮することが分か
っている。PRV−1ポリペプチドは特定の造血前駆細胞を促進させて赤血球系
のコロニーを形成することができる。とりわけこの機能を示すのはN−グリコシ
ル化されたPRV−1ポリペプチドである。本発明に係るポリペプチドの好まし
い例としては、N−グリコシル化されたPRV−1ポリペプチドやその断片であ
り、これらは成長因子活性を示す。
っている。PRV−1ポリペプチドは特定の造血前駆細胞を促進させて赤血球系
のコロニーを形成することができる。とりわけこの機能を示すのはN−グリコシ
ル化されたPRV−1ポリペプチドである。本発明に係るポリペプチドの好まし
い例としては、N−グリコシル化されたPRV−1ポリペプチドやその断片であ
り、これらは成長因子活性を示す。
【0040】
本発明の他の側面としては、従って、薬理学的に許容しうる賦形剤に加えてP
RV−1ポリペプチドあるいはその生物学的活性断片を含有する薬剤が挙げられ
る。PRV−1ポリペプチドは好ましくはグリコシル化されたPRV−1ポリペ
プチドであり、さらに好ましくはN−グリコシル化されたPRV−1ポリペプチ
ドあるいはその生物学的活性断片である。本発明は本発明に係るポリヌクレオチ
ドを少なくとも1つ含有する薬剤にも関する。
RV−1ポリペプチドあるいはその生物学的活性断片を含有する薬剤が挙げられ
る。PRV−1ポリペプチドは好ましくはグリコシル化されたPRV−1ポリペ
プチドであり、さらに好ましくはN−グリコシル化されたPRV−1ポリペプチ
ドあるいはその生物学的活性断片である。本発明は本発明に係るポリヌクレオチ
ドを少なくとも1つ含有する薬剤にも関する。
【0041】
本発明はさらに、PRV−1ポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片や
生物学的活性変異体の、in vivoまたはex vivoでの成長因子とし
ての使用に関する。PRV−1ポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片ま
たはその生物学的活性変異体は、骨髄および末梢血中のすべての汎血球減少症お
よび汎血球増多症(汎血球異常症、末梢血液および骨髄の細胞内成分の変化)を
治療するために用いてもよい。本発明のポリペプチドは、例えば腎不全、化学療
法または全身放射線照射(whole body radiation)の場合の貧血を治療するのに
用いたり、化学療法や全身放射線照射中の好中球減少症や血小板減少症を治療す
るのに用いてもよい。また本発明のポリペプチドは、末梢幹細胞や骨髄幹細胞を
体外で治療するのに用いてよく、これらの細胞は拡大(増幅)され、患者に戻さ
れる。さらに本発明のポリペプチドは敗血症、全身性炎症反応症候群(SIRS
)や局所的炎症反応を治療するのに用いてもよい。本発明のポリペプチドまたは
それらを含む薬剤は様々な方法で投与してもよい。投与形態としては、静脈注射
、筋肉注射、皮下注射、腹腔内注射、経口投与、経皮投与および経粘膜投与等が
挙げられる。
生物学的活性変異体の、in vivoまたはex vivoでの成長因子とし
ての使用に関する。PRV−1ポリペプチド、あるいはその生物学的活性断片ま
たはその生物学的活性変異体は、骨髄および末梢血中のすべての汎血球減少症お
よび汎血球増多症(汎血球異常症、末梢血液および骨髄の細胞内成分の変化)を
治療するために用いてもよい。本発明のポリペプチドは、例えば腎不全、化学療
法または全身放射線照射(whole body radiation)の場合の貧血を治療するのに
用いたり、化学療法や全身放射線照射中の好中球減少症や血小板減少症を治療す
るのに用いてもよい。また本発明のポリペプチドは、末梢幹細胞や骨髄幹細胞を
体外で治療するのに用いてよく、これらの細胞は拡大(増幅)され、患者に戻さ
れる。さらに本発明のポリペプチドは敗血症、全身性炎症反応症候群(SIRS
)や局所的炎症反応を治療するのに用いてもよい。本発明のポリペプチドまたは
それらを含む薬剤は様々な方法で投与してもよい。投与形態としては、静脈注射
、筋肉注射、皮下注射、腹腔内注射、経口投与、経皮投与および経粘膜投与等が
挙げられる。
【0042】
本発明に係るポリヌクレオチドは汎血球減少症や汎血球増多症(汎血球異常症
)を治療するのに用いてもよい。この場合、目的としては、PRV−1ポリペプ
チドまたはその機能的断片を罹患患者の細胞内で発現させることである。この関
係では遺伝子治療法がまず第1に用いられる。細胞は患者から単離され、本発明
に係るポリヌクレオチドでトランスフェクトされてもよい(体外操作)。そして
その細胞はその後患者の体内に戻される。また、本発明に係るポリヌクレオチド
がウイルスの媒介により標的細胞に接触する方法を用いてもよい。挿入された核
酸が発現すると造血性活性が引き起こされる。
)を治療するのに用いてもよい。この場合、目的としては、PRV−1ポリペプ
チドまたはその機能的断片を罹患患者の細胞内で発現させることである。この関
係では遺伝子治療法がまず第1に用いられる。細胞は患者から単離され、本発明
に係るポリヌクレオチドでトランスフェクトされてもよい(体外操作)。そして
その細胞はその後患者の体内に戻される。また、本発明に係るポリヌクレオチド
がウイルスの媒介により標的細胞に接触する方法を用いてもよい。挿入された核
酸が発現すると造血性活性が引き起こされる。
【0043】
驚くべきことに、高濃度ではPRV−1ポリペプチドは細胞の成長を阻害する
作用を有することも分かった。従って、例えばPRV−1タンパク質の量を増加
させると、赤血球系のコロニーおよび顆粒白血球性/単核球性コロニーの形成を
実質的に完全に停止させることが観察された。この効果は、とりわけ慢性骨髄性
白血病(CML)および真性赤血球増加症を治療する際に用いられるインターフ
ェロン−αの活性に似ている。このような内在性阻害物質は、例えばヒドロキシ
ウレア等のインターフェロン−αがまだ得られていなかった頃に用いられており
、現在もまだいくらか使用されている化学的細胞増殖抑止剤と比較すると優れた
効果を有している。インターフェロン−αの欠点は、非常に深刻な副作用がある
ことである。患者は重篤なインフルエンザにかかっているように感じる。本発明
は造血阻害物質を利用できるようにするものであり、その阻害活性は濃度依存的
である。
作用を有することも分かった。従って、例えばPRV−1タンパク質の量を増加
させると、赤血球系のコロニーおよび顆粒白血球性/単核球性コロニーの形成を
実質的に完全に停止させることが観察された。この効果は、とりわけ慢性骨髄性
白血病(CML)および真性赤血球増加症を治療する際に用いられるインターフ
ェロン−αの活性に似ている。このような内在性阻害物質は、例えばヒドロキシ
ウレア等のインターフェロン−αがまだ得られていなかった頃に用いられており
、現在もまだいくらか使用されている化学的細胞増殖抑止剤と比較すると優れた
効果を有している。インターフェロン−αの欠点は、非常に深刻な副作用がある
ことである。患者は重篤なインフルエンザにかかっているように感じる。本発明
は造血阻害物質を利用できるようにするものであり、その阻害活性は濃度依存的
である。
【0044】
本発明の他の側面としては、従って本明細書中で述べられているように、細胞
成長を阻害するためのPRV−1ポリペプチドの使用が挙げられ、特に細胞増殖
抑止剤としての使用が挙げられる。好ましくは造血細胞の成長阻害に用いられる
ポリペプチドが挙げられる。本発明は、増殖性疾患を治療する薬剤を製造するた
めの、本発明に係るポリペプチドの使用に関するものである。これらの疾患とし
ては、特に骨髄増殖性疾患、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、骨髄線維症
、CML(慢性骨髄性白血病)および全ての白血病やリンパ腫および充実性腫瘍
が挙げられる。
成長を阻害するためのPRV−1ポリペプチドの使用が挙げられ、特に細胞増殖
抑止剤としての使用が挙げられる。好ましくは造血細胞の成長阻害に用いられる
ポリペプチドが挙げられる。本発明は、増殖性疾患を治療する薬剤を製造するた
めの、本発明に係るポリペプチドの使用に関するものである。これらの疾患とし
ては、特に骨髄増殖性疾患、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、骨髄線維症
、CML(慢性骨髄性白血病)および全ての白血病やリンパ腫および充実性腫瘍
が挙げられる。
【0045】
本発明の他の側面としては、本明細書中に述べられているように、細胞成長を
阻害するためのポリヌクレオチドの使用、その生物学的活性断片や生物学的活性
変異体の使用が挙げられる。ポリヌクレオチドを適切なベクターに組込み、適切
な標的細胞に形質移入してもよい。PRV−1ポリペプチドまたはその生物学的
活性断片あるいはその生物学的活性変異体は適切な濃度において発現され、成長
阻害作用が作動する。同様に、ポリヌクレオチドをウイルスベクターに組み込み
、その後適切な標的細胞にウイルスを用いて感染させると、PRV−1が発現す
る。本発明は、例えば骨髄増殖性疾患、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、
骨髄線維症、CML(慢性骨髄性白血病)および全ての白血病やリンパ腫および
充実性腫瘍などの、増殖性疾患を治療する薬剤を製造するために、本出願に係る
ポリヌクレオチドを使用することにも関連している。
阻害するためのポリヌクレオチドの使用、その生物学的活性断片や生物学的活性
変異体の使用が挙げられる。ポリヌクレオチドを適切なベクターに組込み、適切
な標的細胞に形質移入してもよい。PRV−1ポリペプチドまたはその生物学的
活性断片あるいはその生物学的活性変異体は適切な濃度において発現され、成長
阻害作用が作動する。同様に、ポリヌクレオチドをウイルスベクターに組み込み
、その後適切な標的細胞にウイルスを用いて感染させると、PRV−1が発現す
る。本発明は、例えば骨髄増殖性疾患、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、
骨髄線維症、CML(慢性骨髄性白血病)および全ての白血病やリンパ腫および
充実性腫瘍などの、増殖性疾患を治療する薬剤を製造するために、本出願に係る
ポリヌクレオチドを使用することにも関連している。
【0046】
本発明はまた真性赤血球増加症または造血系疾患を検出するためのキットに関
する。これらのキットは本発明に係るポリヌクレオチドおよび/または本発明に
係るポリペプチドおよび/または本発明に係る1以上の抗体を含むものである。
これに加えて、該キットは容器や検出反応を行うのに適した組成物を含んでいて
もよい。そのような組成物の例としては、緩衝液、ブロッキングメンブレン用の
薬品、ハイブリダイゼーション溶液、二次抗体、検出反応用の基質溶液等が挙げ
られる。該キットは好ましくはPCR反応、RT−PCR、ノーザンブロット、
サザンブロット、ウエスタンブロットおよびELISA、RIAまたはこれらの
類似反応を行うのに用いられる。
する。これらのキットは本発明に係るポリヌクレオチドおよび/または本発明に
係るポリペプチドおよび/または本発明に係る1以上の抗体を含むものである。
これに加えて、該キットは容器や検出反応を行うのに適した組成物を含んでいて
もよい。そのような組成物の例としては、緩衝液、ブロッキングメンブレン用の
薬品、ハイブリダイゼーション溶液、二次抗体、検出反応用の基質溶液等が挙げ
られる。該キットは好ましくはPCR反応、RT−PCR、ノーザンブロット、
サザンブロット、ウエスタンブロットおよびELISA、RIAまたはこれらの
類似反応を行うのに用いられる。
【0047】
下記の実施例は以上の説明のために行われた。
〔実施例1〕PRV遺伝子の特徴付け
下記の実験はPRV遺伝子を特徴付けるために行われた:
−下記の手順は顆粒白血球を貯蔵血液または瀉血により得た真性赤血球増加症患
者の血液から単離するために用いられた。: −等量(v/v)の3%デキストランを含む0.9%NaCl溶液を血液に添加
し、混合液を20分間室温(RT)に放置した。 −混合液は2層に分離した。明るい色の上層を取り除き、室温で1800gにて
10分間遠心分離した。 −上清を捨て、細胞ペレットを同じ量(体積)の0.9%NaCl溶液で再懸濁
した。 −細胞を含むNaCl溶液を35mlずつフィコール・ハイパック(Ficoll-Hyp
aque)15mlに層状に重ねた。 −フィコール・ハイパック上の細胞を室温で1800g60分間停止させずに遠
心分離を行った。 −細胞ペレットと中間層のある2つの層が形成された。 −2層および中間層を吸引して取り除き、細胞ペレットを30秒間氷冷した0.
2%NaCl 10mlで再懸濁し、30秒後に1.6%氷冷したNaClを1
0ml素早く加えた。 −細胞を室温で1800g10分間遠心分離した。 −細胞をPBS10mlで1回洗浄し、遠心分離した。 −細胞ペレットは純粋な顆粒白血球を95〜99%含んでいた。 −RNAを通常の方法を用いてこれらの細胞から単離した。 −このRNA10mgを用いてノーザンブロット法でPRV−1の発現について
調べた。配列番号1に示されている全cDNA配列をプローブとして用いた。
者の血液から単離するために用いられた。: −等量(v/v)の3%デキストランを含む0.9%NaCl溶液を血液に添加
し、混合液を20分間室温(RT)に放置した。 −混合液は2層に分離した。明るい色の上層を取り除き、室温で1800gにて
10分間遠心分離した。 −上清を捨て、細胞ペレットを同じ量(体積)の0.9%NaCl溶液で再懸濁
した。 −細胞を含むNaCl溶液を35mlずつフィコール・ハイパック(Ficoll-Hyp
aque)15mlに層状に重ねた。 −フィコール・ハイパック上の細胞を室温で1800g60分間停止させずに遠
心分離を行った。 −細胞ペレットと中間層のある2つの層が形成された。 −2層および中間層を吸引して取り除き、細胞ペレットを30秒間氷冷した0.
2%NaCl 10mlで再懸濁し、30秒後に1.6%氷冷したNaClを1
0ml素早く加えた。 −細胞を室温で1800g10分間遠心分離した。 −細胞をPBS10mlで1回洗浄し、遠心分離した。 −細胞ペレットは純粋な顆粒白血球を95〜99%含んでいた。 −RNAを通常の方法を用いてこれらの細胞から単離した。 −このRNA10mgを用いてノーザンブロット法でPRV−1の発現について
調べた。配列番号1に示されている全cDNA配列をプローブとして用いた。
【0048】
この実験は39人の真性赤血球増加症患者と対照試料として29個の貯蔵血液
を用いて行われた。PRV−1プローブは真性赤血球増加症患者において強くハ
イブリダイズしていることが認められた。健康な対照試料ではハイブリダイズは
認められなかった。
を用いて行われた。PRV−1プローブは真性赤血球増加症患者において強くハ
イブリダイズしていることが認められた。健康な対照試料ではハイブリダイズは
認められなかった。
【0049】
〔実施例2〕PRV−1は成長因子活性を有する
胎児を妊娠13.5日の妊娠マウスから取り出し、胎児の肝臓を取り出した。
肝臓に含まれている細胞を抗体で染色し、特定の細胞について濃縮し、カラムク
ロマトグラフィーを用いて他の細胞型を取り除いた。これにより特定の造血前駆
細胞(CFU−E(colony forming units-erythroid))が濃縮された細胞混合
物が得られた。従って、胎児の肝臓では合計約2%がCFU−Eで構成されてい
るだけであるが、濃縮細胞では30〜40%がCFU−Eであった。
肝臓に含まれている細胞を抗体で染色し、特定の細胞について濃縮し、カラムク
ロマトグラフィーを用いて他の細胞型を取り除いた。これにより特定の造血前駆
細胞(CFU−E(colony forming units-erythroid))が濃縮された細胞混合
物が得られた。従って、胎児の肝臓では合計約2%がCFU−Eで構成されてい
るだけであるが、濃縮細胞では30〜40%がCFU−Eであった。
【0050】
これらのCFU−Eをレトロウイルスを用いてトランスフェクトした。これを
行うため、293−Tと呼ばれるパッケージング細胞株を、前もって48時間ト
ランスフェクトした。293−T細胞は確立されたヒト胎児腎臓の細胞株である
。293−T細胞にレトロウイルス由来のいくつかの遺伝子を安定させて導入し
た。これらの293−T細胞に2つのプラスミド、pOSおよびpKATを導入
すると、293−T細胞はマウスの胎児肝臓細胞に感染可能なレトロウイルスを
生産する。293−T細胞に空のpOSベクターとpKATを導入すると、レト
ロウイルスタンパク質のみを発現する野生型のレトロウイルスが生産される。一
方、例えばPRV−1等のヒト遺伝子をpOSベクターに組み込みクローニング
すると、細胞に感染した際にこのタンパク質を発現するレトロウイルスを生産す
る。293−T細胞はレトロウイルスを細胞培地に分泌する。
行うため、293−Tと呼ばれるパッケージング細胞株を、前もって48時間ト
ランスフェクトした。293−T細胞は確立されたヒト胎児腎臓の細胞株である
。293−T細胞にレトロウイルス由来のいくつかの遺伝子を安定させて導入し
た。これらの293−T細胞に2つのプラスミド、pOSおよびpKATを導入
すると、293−T細胞はマウスの胎児肝臓細胞に感染可能なレトロウイルスを
生産する。293−T細胞に空のpOSベクターとpKATを導入すると、レト
ロウイルスタンパク質のみを発現する野生型のレトロウイルスが生産される。一
方、例えばPRV−1等のヒト遺伝子をpOSベクターに組み込みクローニング
すると、細胞に感染した際にこのタンパク質を発現するレトロウイルスを生産す
る。293−T細胞はレトロウイルスを細胞培地に分泌する。
【0051】
2日後、レトロウイルスを含む293−Tトランスフェクト細胞から得られた
細胞培地を回収し、0.45μmフィルターで1回濾過した。胎児肝臓細胞をト
ランスフェクトするために、これらの細胞に濾過した細胞培地を混ぜた。細胞培
地はレトロウイルスを含んでおり、この混合物をポリブレンの存在下で20℃1
800rpmで2時間遠心分離した。トランスフェクトされた胎児肝臓細胞を培
地(メトカルト(Methocult)、セルシステム社製)で生育させた。培地は通常
の塩およびアミノ酸、仔牛血清に加えてエリスロポエチン(EPO)を0.00
01〜0.4 IU/mlおよびメチルセルロース(0.8%)を含有したもの
であった。 CFU−Eは造血コロニーを形成するのにEPOを必要とする。メチルセルロ
ースは培地を凝固させてゼリー状にし、このゼリー状培地に固定された個々の細
胞を、液体培地内にあるのとは対照的に動かないよう固定することができる。従
って、造血コロニーが単一細胞から形成されるか、あるいは形成されないかを観
察することができる。CFU−Eは赤血球系コロニー、すなわち赤血球細胞およ
びその前駆細胞を含有するコロニーを形成する。
細胞培地を回収し、0.45μmフィルターで1回濾過した。胎児肝臓細胞をト
ランスフェクトするために、これらの細胞に濾過した細胞培地を混ぜた。細胞培
地はレトロウイルスを含んでおり、この混合物をポリブレンの存在下で20℃1
800rpmで2時間遠心分離した。トランスフェクトされた胎児肝臓細胞を培
地(メトカルト(Methocult)、セルシステム社製)で生育させた。培地は通常
の塩およびアミノ酸、仔牛血清に加えてエリスロポエチン(EPO)を0.00
01〜0.4 IU/mlおよびメチルセルロース(0.8%)を含有したもの
であった。 CFU−Eは造血コロニーを形成するのにEPOを必要とする。メチルセルロ
ースは培地を凝固させてゼリー状にし、このゼリー状培地に固定された個々の細
胞を、液体培地内にあるのとは対照的に動かないよう固定することができる。従
って、造血コロニーが単一細胞から形成されるか、あるいは形成されないかを観
察することができる。CFU−Eは赤血球系コロニー、すなわち赤血球細胞およ
びその前駆細胞を含有するコロニーを形成する。
【0052】
3日後、成長した造血コロニーの数を数える。様々な混合物を比較する。混合
物は1つの実験につき全てを調べることはできないが、混合物1〜3は非常に似
た対照試料であるため、それぞれを混合物4と個別に比較してもよい。
物は1つの実験につき全てを調べることはできないが、混合物1〜3は非常に似
た対照試料であるため、それぞれを混合物4と個別に比較してもよい。
【0053】
混合物1:レトロウイルスでトランスフェクトされなかった細胞、
混合物2:空pOSベクターでトランスフェクトされた細胞、
混合物3:造血系活性のない‘緑色蛍光タンパク質’(GFP)でトランスフェ
クトされた細胞、 混合物4:pOS−PRV−1(ベクター+本発明に係る遺伝子)でトランスフ
ェクトされた細胞。
クトされた細胞、 混合物4:pOS−PRV−1(ベクター+本発明に係る遺伝子)でトランスフ
ェクトされた細胞。
【0054】
表1は上述したように行われた3つの実験から得られた結果を示したものであ
る。各項目の数値はコロニーの数を示している。
る。各項目の数値はコロニーの数を示している。
【0055】
【表1】
【0056】
この実験により、PRV−1でトランスフェクトされたCFU−Eは、コント
ロールである様々なCFU−Eを形成するよりも非常により多くのコロニー(約
3倍)を形成することを示している。これらの結果からPRV−1はCFU−E
の成長因子であることが分かる。
ロールである様々なCFU−Eを形成するよりも非常により多くのコロニー(約
3倍)を形成することを示している。これらの結果からPRV−1はCFU−E
の成長因子であることが分かる。
【0057】
〔実施例3〕PRV−1成長因子の溶解性
PRV−1が溶解性成長因子であるか否か、また細胞と細胞の接触が必要であ
るか否かを調べるためにさらに実験を行った。pOSおよびpKATベクターで
トランスフェクトされた後にパッケージング細胞株293−Tにより製造される
のはレトロウイルスだけではない。加えて293−T細胞はpOSでクローン化
された遺伝子、すなわち本発明ではPRV−1遺伝子、でコードされるタンパク
質も合成する。遺伝子産物が溶解性タンパク質である場合には293−Tパッケ
ージング細胞周囲の培地に分泌される。293−T細胞がpKAT無しでpOS
ベクターのみでトランスフェクトされる場合、レトロウイルスは形成されない。
細胞培地は細胞によって製造される溶解性タンパク質しか含有しない。pOS−
PRV−1トランスフェクト細胞由来で、いかなるレトロウイルスをも含有して
いない培地をCFU−Eと混合し、全てをメチルセルロース培地に置床し、形成
されたコロニーを数える。下記の結果が得られた。
るか否かを調べるためにさらに実験を行った。pOSおよびpKATベクターで
トランスフェクトされた後にパッケージング細胞株293−Tにより製造される
のはレトロウイルスだけではない。加えて293−T細胞はpOSでクローン化
された遺伝子、すなわち本発明ではPRV−1遺伝子、でコードされるタンパク
質も合成する。遺伝子産物が溶解性タンパク質である場合には293−Tパッケ
ージング細胞周囲の培地に分泌される。293−T細胞がpKAT無しでpOS
ベクターのみでトランスフェクトされる場合、レトロウイルスは形成されない。
細胞培地は細胞によって製造される溶解性タンパク質しか含有しない。pOS−
PRV−1トランスフェクト細胞由来で、いかなるレトロウイルスをも含有して
いない培地をCFU−Eと混合し、全てをメチルセルロース培地に置床し、形成
されたコロニーを数える。下記の結果が得られた。
【0058】
表2はPRV−1の溶解性を示す。各項目の数値はコロニーの数を示す。
【0059】
【表2】
【0060】
この実験でも、PRV−1含有培地で処理したCFU−Eはコントロールの細
胞と比べて非常に多くの造血コロニーを形成した。PRV−1は溶解性成長因子
であることが、この結果から結論づけられる。
胞と比べて非常に多くの造血コロニーを形成した。PRV−1は溶解性成長因子
であることが、この結果から結論づけられる。
【0061】
〔実施例4〕PRV−1は阻害効果および細胞増殖抑止効果をも有する。
この実験は、末梢血液細胞を用いて行った。少数の前駆細胞が健康な人間の末
梢血液内を循環するため、適切な培地(メチルセルロース)で末梢血管細胞由来
の造血コロニーを培養することができる。末梢静脈血40mlを健康なドナーか
ら採血した(抗凝血剤としてヘパリンまたはEDTAをまず導入しておく)。フ
ィコール/ハイパック15mlを血液に添加し、混合物を1600rpm40分
で連続して遠心分離した。これにより血液を細胞内成分に細分化する密度勾配が
形成された。遠心分離後、単核細胞とよばれるもので、幹細胞を含有するものが
血清とフィコールの間の中間層に見られる。この中間層は除去され、PBS(等
張塩溶液)で洗浄された。これにより精製された単核細胞が得られ、そのうち約
0.1%が造血系幹細胞であった。
梢血液内を循環するため、適切な培地(メチルセルロース)で末梢血管細胞由来
の造血コロニーを培養することができる。末梢静脈血40mlを健康なドナーか
ら採血した(抗凝血剤としてヘパリンまたはEDTAをまず導入しておく)。フ
ィコール/ハイパック15mlを血液に添加し、混合物を1600rpm40分
で連続して遠心分離した。これにより血液を細胞内成分に細分化する密度勾配が
形成された。遠心分離後、単核細胞とよばれるもので、幹細胞を含有するものが
血清とフィコールの間の中間層に見られる。この中間層は除去され、PBS(等
張塩溶液)で洗浄された。これにより精製された単核細胞が得られ、そのうち約
0.1%が造血系幹細胞であった。
【0062】
単核細胞を3%濃度のFCS(仔牛血清)を加えた特にリッチな培地(IMD
M)に移した。この3%FCS/IMDM培地に次にPRV−1を加えたものと
加えないものを用意した。
M)に移した。この3%FCS/IMDM培地に次にPRV−1を加えたものと
加えないものを用意した。
【0063】
IMDM中の単核細胞を7×105細胞/mlの密度で市販の培地に添加した
。該培地はステムセルテクノロジー(メトカルト(Methocult))から購入され
たものであり、IMDMおよび30%FCS、1%BSA(牛血清抗体)、メル
カプトエタノール、2mM L−グルタミン、EPO(エリスロポエチン)3I
U/mlおよび1.0%メチルセルロースを含有していた。細胞を該培地で14
日間培養した。この混合物中に存在している少数の肝細胞が、造血コロニーに成
長する。通常100〜200の造血コロニーが、用いた7×105細胞ごとに成
長する。
。該培地はステムセルテクノロジー(メトカルト(Methocult))から購入され
たものであり、IMDMおよび30%FCS、1%BSA(牛血清抗体)、メル
カプトエタノール、2mM L−グルタミン、EPO(エリスロポエチン)3I
U/mlおよび1.0%メチルセルロースを含有していた。細胞を該培地で14
日間培養した。この混合物中に存在している少数の肝細胞が、造血コロニーに成
長する。通常100〜200の造血コロニーが、用いた7×105細胞ごとに成
長する。
【0064】
PRV−1を非常に多く発現する細胞株も構築された。これらの細胞によって
生産されるPRV−1は変化しているのでリン脂質アンカーを有さない。従って
、このPRV−1発現産物は配列番号2の1〜401番のアミノ酸からなってお
り、402〜437番のアミノ酸は失われている。この変化したPRV−1は、
野生型PRV−1のようにリン脂質アンカーによって細胞膜には組込まれないが
、その代わり完全に細胞から分泌される。実施例3のように、293の細胞から
なる細胞株はいかなるレトロウイルスも生産しないが、タンパク質(PRV−1
)は発現する。
生産されるPRV−1は変化しているのでリン脂質アンカーを有さない。従って
、このPRV−1発現産物は配列番号2の1〜401番のアミノ酸からなってお
り、402〜437番のアミノ酸は失われている。この変化したPRV−1は、
野生型PRV−1のようにリン脂質アンカーによって細胞膜には組込まれないが
、その代わり完全に細胞から分泌される。実施例3のように、293の細胞から
なる細胞株はいかなるレトロウイルスも生産しないが、タンパク質(PRV−1
)は発現する。
【0065】
造血コロニーアッセイをするために、単核血液細胞を、非トランスフェクト細
胞(293)と共に48時間インキュベートしたIMDM培地に移すか、または
変化させたPRV−1(293−GPI−less−PRV−1)を発現する細
胞と共に48時間インキュベートした培地に移した。これらの細胞の造血コロニ
ー形成能を調べた。赤血球系血液細胞(赤)および骨髄性血液細胞(白)のコロ
ニー数を14日後に測定した。実験を3回繰り返し、異なった日に別のドナーの
血液を用いて行った。実験は反覆して実施し、評価された。下記の結果が得られ
た。
胞(293)と共に48時間インキュベートしたIMDM培地に移すか、または
変化させたPRV−1(293−GPI−less−PRV−1)を発現する細
胞と共に48時間インキュベートした培地に移した。これらの細胞の造血コロニ
ー形成能を調べた。赤血球系血液細胞(赤)および骨髄性血液細胞(白)のコロ
ニー数を14日後に測定した。実験を3回繰り返し、異なった日に別のドナーの
血液を用いて行った。実験は反覆して実施し、評価された。下記の結果が得られ
た。
【0066】
【表3】
【0067】
【表4】
【0068】
【表5】
【0069】
このデータから、実施例3で用いられたものよりも高い濃度のPRV−1が細
胞成長阻止効果を有することがわかる。
胞成長阻止効果を有することがわかる。
【0070】
〔実施例5〕成長因子PRV−1はN−グルコシル化されている。
顆粒白血球を真性赤血球増加症罹患患者から単離し、タンパク質抽出物を標準
的な方法でこれらの細胞から調製した。これらのタンパク質抽出物をベーリンガ
ー・マンハイム社の‘N−グリコシダーゼF脱グリコシル化キット’についての
プロトコールに従って処理した。詳しくは、‘変性用緩衝液’をタンパク質抽出
物に加え、混合物を95℃3分間加熱し、‘反応用緩衝液’またはN−グリコシ
ダーゼを加えた‘反応用緩衝液’を用いて処理した。各混合物を37℃で一晩イ
ンキュベートし、タンパク質をPAGEゲル電気泳動で分析し、次にウエスタン
ブロット分析を行った。PRV−1タンパク質は配列番号5のアミノ酸配列を有
するタンパク質を標的する抗体で検出した。顆粒白血球から精製されたPRV−
1タンパク質は60〜65kDaのサイズであるが、N−グリコシダーゼで切断
された後にはたった40kDaの大きさでしかないことが示された。このことは
、PRV−1はアスパラギン残基(アスパラギン=N)がグリコシル化されてい
ることを明らかに証明している。
的な方法でこれらの細胞から調製した。これらのタンパク質抽出物をベーリンガ
ー・マンハイム社の‘N−グリコシダーゼF脱グリコシル化キット’についての
プロトコールに従って処理した。詳しくは、‘変性用緩衝液’をタンパク質抽出
物に加え、混合物を95℃3分間加熱し、‘反応用緩衝液’またはN−グリコシ
ダーゼを加えた‘反応用緩衝液’を用いて処理した。各混合物を37℃で一晩イ
ンキュベートし、タンパク質をPAGEゲル電気泳動で分析し、次にウエスタン
ブロット分析を行った。PRV−1タンパク質は配列番号5のアミノ酸配列を有
するタンパク質を標的する抗体で検出した。顆粒白血球から精製されたPRV−
1タンパク質は60〜65kDaのサイズであるが、N−グリコシダーゼで切断
された後にはたった40kDaの大きさでしかないことが示された。このことは
、PRV−1はアスパラギン残基(アスパラギン=N)がグリコシル化されてい
ることを明らかに証明している。
【配列表】
【図1】は、PRV−1遺伝子をコードするヌクレオチド配列を示している
。
。
【図2】は、PRV−1遺伝子によってコードされているタンパク質のアミ
ノ酸配列を示している。
ノ酸配列を示している。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61P 7/04 A61P 7/10 4H045
7/06 9/12
7/10 17/04
9/12 19/06
17/04 25/04
19/06 31/04
25/04 35/00
31/04 35/02
35/00 43/00 105
35/02 C07K 14/47
43/00 105 16/18
C07K 14/47 C12Q 1/68 A
16/18 G01N 33/53 D
C12Q 1/68 M
G01N 33/53 33/566
33/577 B
33/566 C12P 21/08
33/577 C12N 15/00 ZNAA
// C12P 21/08 A61K 37/02
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ
,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML,
MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K
E,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG
,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,
RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM,AT,
AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,BZ,C
A,CH,CN,CR,CU,CZ,DE,DK,DM
,DZ,EE,ES,FI,GB,GD,GE,GH,
GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,K
E,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS
,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN,
MW,MX,MZ,NO,NZ,PL,PT,RO,R
U,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM
,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VN,
YU,ZA,ZW
Fターム(参考) 4B024 AA01 AA11 BA44 BA80 CA04
DA02 DA03 EA04 GA01 GA11
HA01 HA03 HA12 HA15
4B063 QA01 QA19 QQ01 QQ42 QQ52
QR08 QR42 QR55 QR62 QR82
QS25 QS34 QS36 QX02
4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01
DA13
4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA22
BA23 BA34 CA18 CA34 CA53
DB52 MA01 NA14 ZA081
ZA421 ZA511 ZA512 ZA531
ZA541 ZA551 ZA661 ZA891
ZA961 ZB261 ZB271 ZB351
ZC011 ZC311
4C085 AA13 AA14 BB11 CC03 CC12
DD62
4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10
BA41 CA40 DA00 DA76 EA20
EA50 FA72 FA74
Claims (24)
- 【請求項1】 下記のアミノ酸配列: 配列番号2記載の1番〜437番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の1番〜409番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の1番〜401番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜437番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜409番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜401番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を必ず1つ
含有することを特徴とするN−グリコシル化ポリペプチド、または50以上のア
ミノ酸を有するN−グリコシル化ポリペプチドの断片。 - 【請求項2】 下記のアミノ酸配列: 配列番号2記載の1番〜409番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の1番〜401番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜409番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜401番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を必ず1つ
含有することを特徴とするポリペプチド。 - 【請求項3】 請求項1記載のポリペプチドに対する抗体。
- 【請求項4】 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項3記
載の抗体。 - 【請求項5】 PRV−1ポリペプチドが請求項3または4記載の1以上の抗
体と免疫学的アッセイにおいて反応することを特徴とする、真性赤血球増加症を
検出するための方法。 - 【請求項6】 用いる抗体がポリクローナルあるいは、請求項3または4記載
のモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項5記載の方法。 - 【請求項7】 通常の賦形剤に加えて請求項3または4記載の抗体を含有する
ことを特徴とする真性赤血球増加症を治療するための薬剤。 - 【請求項8】 請求項1記載のポリペプチドまたは下記のアミノ酸配列: 配列番号2記載の1番〜437番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の1番〜409番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の1番〜401番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜437番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜409番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜401番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を必ず1つ
含有するポリペプチドと、薬学的に許容しうる賦形剤とを含有することを特徴と
する薬剤。 - 【請求項9】 下記のヌクレオチド配列: 配列番号1記載の1番〜1600番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の36番〜1346番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の36番〜1262番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の36番〜1238番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の39番〜1346番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の39番〜1262番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の39番〜1238番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の99番〜1346番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の99番〜1262番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の99番〜1238番の塩基からなるヌクレオチド配列を必ず1
つ含有するポリヌクレオチド、および薬理学的に許容しうる賦形剤を少なくとも
1つ含有することを特徴とする薬剤。 - 【請求項10】 請求項1記載のポリペプチドまたは下記のアミノ酸配列: 配列番号2記載の1番〜437番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の1番〜409番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の1番〜401番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜437番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜409番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜401番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を必ず1つ
含有するポリペプチドの使用、またはそれらの生物学的活性断片あるいは生物学
的活性誘導体の成長因子としての使用。 - 【請求項11】 骨髄および末梢血中における汎血球減少症および汎血球増多
症を治療する薬剤を製造するための、請求項1記載のポリペプチドまたは下記の
アミノ酸配列: 配列番号2記載の1番〜437番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の1番〜409番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の1番〜401番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜437番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜409番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜401番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を必ず1つ
含有するポリペプチドの使用、またはそれらの生物学的活性断片あるいは生物学
的活性誘導体の使用。 - 【請求項12】 骨髄および末梢血中における汎血球減少症および汎血球増多
症を治療する薬剤を製造するための、下記のヌクレオチド配列: 配列番号1記載の1番〜1600番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の36番〜1346番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の36番〜1262番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の36番〜1238番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の39番〜1346番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の39番〜1262番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の39番〜1238番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の99番〜1346番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の99番〜1262番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の99番〜1238番の塩基からなるヌクレオチド配列を必ず1
つ含有するポリヌクレオチドの使用、またはそれらの断片あるいは誘導体の使用
。 - 【請求項13】 ex vivoまたはin vitroにおいて内在性細胞
および/または株化細胞株を治療および/または増殖させるための、請求項1記
載のポリペプチドまたは下記のアミノ酸配列: 配列番号2記載の1番〜437番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の1番〜409番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の1番〜401番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜437番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜409番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜401番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を必ず1つ
含有するポリペプチドの使用、またはそれらの生物学的活性断片あるいは生物学
的活性誘導体の使用。 - 【請求項14】 細胞の成長を阻害するための、請求項1記載のポリペプチド
または下記のアミノ酸配列: 配列番号2記載の1番〜437番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の1番〜409番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の1番〜401番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜437番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜409番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜401番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を必ず1つ
含有するポリペプチドの使用、またはそれらの生物学的活性断片あるいは生物学
的活性誘導体の使用。 - 【請求項15】 ポリペプチドが細胞増殖抑止剤として用いられることを特徴
とする請求項14記載の使用。 - 【請求項16】 増殖性疾患を治療する薬剤を製造するための、請求項1記載
のポリペプチドまたは下記のアミノ酸配列: 配列番号2記載の1番〜437番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の1番〜409番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の1番〜401番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜437番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜409番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜401番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を必ず1つ
含有するポリペプチドの使用、またはそれらの生物学的活性断片あるいは生物学
的活性誘導体の使用。 - 【請求項17】 増殖性疾患が骨髄増殖性疾患、真性赤血球増加症、本態性血
小板血症、骨髄線維症、CML(慢性骨髄性白血病)、全ての白血病やリンパ腫
および充実性腫瘍からなる群から選択されることを特徴とする請求項16記載の
使用。 - 【請求項18】 細胞の成長を阻害するための、下記のヌクレオチド配列: 配列番号1記載の1番〜1600番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の36番〜1346番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の36番〜1262番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の36番〜1238番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の39番〜1346番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の39番〜1262番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の39番〜1238番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の99番〜1346番の塩基からなるヌクレオチド配列: 配列番号1記載の99番〜1262番の塩基からなるヌクレオチド配列: 配列番号1記載の99番〜1238番の塩基からなるヌクレオチド配列を必ず1
つ含有するポリヌクレオチドの使用、またはそれらの断片あるいは誘導体の使用
。 - 【請求項19】 増殖性疾患を治療する薬剤を製造するための、下記のヌクレ
オチド配列: 配列番号1記載の1番〜1600番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の36番〜1346番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の36番〜1262番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の36番〜1238番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の39番〜1346番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の39番〜1262番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の39番〜1238番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の99番〜1346番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の99番〜1262番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の99番〜1238番の塩基配列によってコードされるヌクレオ
チド配列を必ず1つ含有するポリヌクレオチドの使用、またはそれらの断片ある
いは誘導体の使用。 - 【請求項20】 増殖性疾患が骨髄増殖性疾患、真性赤血球増加症、本態性血
小板血症、骨髄線維症、CML(慢性骨髄性白血病)、全ての白血病やリンパ腫
および充実性腫瘍からなる群から選択されることを特徴とする請求項19記載の
使用。 - 【請求項21】 下記のヌクレオチド配列: 配列番号1記載の1番〜1600番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の36番〜1346番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の36番〜1262番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の36番〜1238番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の39番〜1346番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の39番〜1262番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の39番〜1238番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の99番〜1346番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の99番〜1262番の塩基からなるヌクレオチド配列; 配列番号1記載の99番〜1238番の塩基からなるヌクレオチド配列を必ず1
つ含むポリヌクレオチド、あるいはその断片または誘導体を少なくとも1つ含有
し、および/または請求項1記載のポリペプチドまたは下記のアミノ酸配列: 配列番号2記載の1番〜437番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の1番〜409番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の1番〜401番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜437番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜409番のアミノ酸からなるアミノ酸配列; 配列番号2記載の22番〜401番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を必ず1つ
含有するポリペプチド、またはそれらの生物学的活性断片か生物学的活性誘導体
を少なくとも1つ含有し、および/または請求項3または4記載の抗体を少なく
とも1つ含有することを特徴とする真性赤血球増加症または造血系の障害を検出
するキット。 - 【請求項22】 キットが、ELISA試験キットであることを特徴とする請
求項21記載のPRV−1タンパク質を検出するためのキット。 - 【請求項23】 キットが半定量的あるいは定量的RT−PCR分析キットで
あることを特徴とするPRV−1mRNAを検出するための請求項21記載のキ
ット。 - 【請求項24】 キットがノーザンブロットキットであることを特徴とするP
RV−1mRNAを検出するための請求項21記載のキット。
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Cited By (1)
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