KR20010043090A

KR20010043090A - 신규인 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 코드화하는 ｃＤＮＡ및 그 용도

Info

Publication number: KR20010043090A
Application number: KR1020007011972A
Authority: KR
Inventors: 혼조타수쿠; 다쉬로케이; 나가무라토모유끼
Original assignee: 우에노 도시오; 오노 야꾸힝 고교 가부시키가이샤
Priority date: 1998-04-28
Filing date: 1999-04-28
Publication date: 2001-05-25
Also published as: EP1090992A1; WO1999055863A1; WO1999055864A1; KR20010043088A; US6846647B1; EP1074622A1; EP1090992A4; EP1074622A4

Abstract

본 발명은 인간의 신규인 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 코드화하는 cDNA 및

그 용도에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩티드는 혈관 평활근 세포의 증식을 억제하는 효과를 갖기 때문에, 이상 평활근의 증식이 관련된 질환, 예컨대 동맥 경화나 근종 등의 치료에 응용 가능하다. 또한, 조혈 세포 제어 활성, 조직 생성/복원 활성, 악티빈/인히빈 활성, 주화성/화학 운동성 활성, 응혈 및 혈전 활성, 수용체/리간드 활성 등을 가지고, 여러 가지의 질환 예방 및/또는 치료에 유용하다고 생각된다.

Description

신규인 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 코드화하는 ｃＤＮＡ 및 그 용도{NOVEL POLYPEPTIDE, cDNA ENCODING THE SAME AND UTILIZATION THEREOF}

＜110＞ Ono Pharmaceutical Co., Ltd.

＜120＞ Novel polypeptides, cDNA coding these polypeptides and Use thereof

＜130＞ ONF-2970PCT

＜141＞ 1999-04-28

＜150＞ JP 10-119731

＜151＞ 1998-04-28

＜160＞ 17

＜170＞ PatentIn Ver. 2.0

＜210＞ 1

＜211＞ 448

＜212＞ PRT

＜213＞ Mus musculus

＜400＞ 1

Met Pro Gly Leu Lys Arg Ile Leu Thr Val Thr Ile Leu Ala Leu Trp

-23 -20 -15 -10

Leu Pro His Pro Gly Asn Ala Gln Gln Gln Cys Thr Asn Gly Phe Asp

-5 1 5

Leu Asp Arg Gln Ser Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr

10 15 20 25

Ile Pro Glu Ala Cys Arg Gly Asp Met Met Cys Val Asn Gln Asn Gly

30 35 40

Gly Tyr Leu Cys Ile Pro Arg Thr Asn Pro Val Tyr Arg Gly Pro Tyr

45 50 55

Ser Asn Pro Tyr Ser Thr Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Pro Ala Ala Ala

60 65 70

Pro Pro Val Pro Ala Ser Asn Tyr Pro Thr Ile Ser Arg Pro Leu Val

75 80 85

Cys Arg Phe Gly Tyr Gln Met Asp Glu Gly Asn Gln Cys Val Asp Val

90 95 100 105

Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser His Gln Cys Asn Pro Thr Gln Ile Cys

110 115 120

Ile Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Thr Cys Ser Cys Thr Asp Gly Tyr Trp

125 130 135

Leu Leu Glu Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Tyr Gly Tyr

140 145 150

Cys Gln Gln Leu Cys Ala Asn Val Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Thr Cys

155 160 165

Asn Pro Gly Phe Thr Leu Asn Asp Asp Gly Arg Ser Cys Gln Asp Val

170 175 180 185

Asn Glu Cys Glu Thr Glu Asn Pro Cys Val Gln Thr Cys Val Asn Thr

190 195 200

Tyr Gly Ser Phe Ile Cys Arg Cys Asp Pro Gly Tyr Glu Leu Glu Glu

205 210 215

Asp Gly Ile His Cys Ser Asp Met Asp Glu Cys Ser Phe Ser Glu Phe

220 225 230

Leu Cys Gln His Glu Cys Val Asn Gln Pro Gly Ser Tyr Phe Cys Ser

235 240 245

Cys Pro Pro Gly Tyr Val Leu Leu Asp Asp Asn Arg Ser Cys Gln Asp

250 255 260 265

Ile Asn Glu Cys Glu His Arg Asn His Thr Cys Thr Ser Leu Gln Thr

270 275 280

Cys Tyr Asn Leu Gln Gly Gly Phe Lys Cys Ile Asp Pro Ile Ser Cys

285 290 295

Glu Glu Pro Tyr Leu Leu Ile Gly Glu Asn Arg Cys Met Cys Pro Ala

300 305 310

Glu His Thr Ser Cys Arg Asp Gln Pro Phe Thr Ile Leu Tyr Arg Asp

315 320 325

Met Asp Val Val Ser Gly Arg Ser Val Pro Ala Asp Ile Phe Gln Met

330 335 340 345

Gln Ala Thr Thr Arg Tyr Pro Gly Ala Tyr Tyr Ile Phe Gln Ile Lys

350 355 360

Ser Gly Asn Glu Gly Arg Glu Phe Tyr Met Arg Gln Thr Gly Pro Ile

365 370 375

Ser Ala Thr Leu Val Met Thr Arg Pro Ile Lys Gly Pro Arg Asp Ile

380 385 390

Gln Leu Asp Leu Glu Met Ile Thr Val Asn Thr Val Ile Asn Phe Arg

395 400 405

Gly Ser Ser Val Ile Arg Leu Arg Ile Tyr Val Ser Gln Tyr Pro Phe

410 415 420 425

＜210＞ 2

＜211＞ 1344

＜212＞ DNA

＜213＞ Mus musculus

＜400＞ 2

atgccaggat taaaaaggat actcactgtt accatcttgg cactctggct tccacatcct 60

gggaatgcac agcagcagtg cacaaacggc tttgacctgg accgccagtc aggacagtgt 120

ctagatattg atgaatgccg gaccatccct gaggcttgtc gtggggacat gatgtgtgtc 180

aaccagaatg gcgggtattt gtgcatccct cgaaccaacc cagtgtatcg agggccttac 240

tcaaatccct actctacatc ctactcaggc ccatacccag cagcggcccc accagtacca 300

gcttccaact accccacgat ttcaaggcct cttgtctgcc gctttgggta tcagatggat 360

gaaggcaacc agtgtgtgga tgtggacgag tgtgcaacag actcacacca gtgcaaccct 420

acccagatct gtatcaacac tgaaggaggt tacacctgct cctgcaccga tgggtactgg 480

cttctggaag ggcagtgcct agatattgat gaatgtcgct atggttactg ccagcagctc 540

tgtgcaaatg ttccaggatc ctattcctgt acatgcaacc ctggtttcac cctcaacgac 600

gatggaaggt cttgccaaga tgtgaacgag tgcgaaactg agaatccctg tgttcagacc 660

tgtgtcaaca cctatggctc tttcatctgc cgctgtgacc caggatatga acttgaggaa 720

gatggcattc actgcagtga tatggacgag tgcagcttct ccgagttcct ctgtcaacac 780

gagtgtgtga accagccggg ctcatacttc tgctcgtgcc ctccaggcta cgtcctgttg 840

gatgataacc gaagctgcca ggatatcaat gaatgtgagc accgaaacca cacgtgtacc 900

tcactgcaga cttgctacaa tctacaaggg ggcttcaaat gtattgatcc catcagctgt 960

gaggagcctt atctgctgat tggtgaaaac cgctgtatgt gtcctgctga gcacaccagc 1020

tgcagagacc agccattcac catcctgtat cgggacatgg atgtggtgtc aggacgctcc 1080

gttcctgctg acatcttcca gatgcaagca acaacccgat accctggtgc ctattacatt 1140

ttccagatca aatctggcaa cgagggtcga gagttctata tgcggcaaac agggcctatc 1200

agtgccaccc tggtgatgac acgccccatc aaagggcctc gggacatcca gctggacttg 1260

gagatgatca ctgtcaacac tgtcatcaac ttcagaggca gctccgtgat ccgactgcgg 1320

atatatgtgt cgcagtatcc gttc 1344

＜210＞ 3

＜211＞ 2233

＜212＞ DNA

＜213＞ Mus musculus

＜220＞

＜223＞ Clone mouse A55 derived from Day 13 mouse embryonic heart

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (75)..(1418)

＜220＞

＜221＞ sig_peptide

＜222＞ (75)..(143)

＜220＞

＜221＞ mat_peptide

＜222＞ (144)..(1418)

＜400＞ 3

aattcggcac gagccccagt cccaccgcag agcctgcctt cctcgcgtcg cttctcctcc 60

cgcgcatctt ggat atg cca gga tta aaa agg ata ctc act gtt acc atc 110

Met Pro Gly Leu Lys Arg Ile Leu Thr Val Thr Ile

-20 -15

ttg gca ctc tgg ctt cca cat cct ggg aat gca cag cag cag tgc aca 158

Leu Ala Leu Trp Leu Pro His Pro Gly Asn Ala Gln Gln Gln Cys Thr

-10 -5 -1 1 5

aac ggc ttt gac ctg gac cgc cag tca gga cag tgt cta gat att gat 206

Asn Gly Phe Asp Leu Asp Arg Gln Ser Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp

10 15 20

gaa tgc cgg acc atc cct gag gct tgt cgt ggg gac atg atg tgt gtc 254

Glu Cys Arg Thr Ile Pro Glu Ala Cys Arg Gly Asp Met Met Cys Val

25 30 35

aac cag aat ggc ggg tat ttg tgc atc cct cga acc aac cca gtg tat 302

Asn Gln Asn Gly Gly Tyr Leu Cys Ile Pro Arg Thr Asn Pro Val Tyr

40 45 50

cga ggg cct tac tca aat ccc tac tct aca tcc tac tca ggc cca tac 350

Arg Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Ser Thr Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr

55 60 65

cca gca gcg gcc cca cca gta cca gct tcc aac tac ccc acg att tca 398

Pro Ala Ala Ala Pro Pro Val Pro Ala Ser Asn Tyr Pro Thr Ile Ser

70 75 80 85

agg cct ctt gtc tgc cgc ttt ggg tat cag atg gat gaa ggc aac cag 446

Arg Pro Leu Val Cys Arg Phe Gly Tyr Gln Met Asp Glu Gly Asn Gln

90 95 100

tgt gtg gat gtg gac gag tgt gca aca gac tca cac cag tgc aac cct 494

Cys Val Asp Val Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser His Gln Cys Asn Pro

105 110 115

acc cag atc tgt atc aac act gaa gga ggt tac acc tgc tcc tgc acc 542

Thr Gln Ile Cys Ile Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Thr Cys Ser Cys Thr

120 125 130

gat ggg tac tgg ctt ctg gaa ggg cag tgc cta gat att gat gaa tgt 590

Asp Gly Tyr Trp Leu Leu Glu Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys

135 140 145

cgc tat ggt tac tgc cag cag ctc tgt gca aat gtt cca gga tcc tat 638

Arg Tyr Gly Tyr Cys Gln Gln Leu Cys Ala Asn Val Pro Gly Ser Tyr

150 155 160 165

tcc tgt aca tgc aac cct ggt ttc acc ctc aac gac gat gga agg tct 686

Ser Cys Thr Cys Asn Pro Gly Phe Thr Leu Asn Asp Asp Gly Arg Ser

170 175 180

tgc caa gat gtg aac gag tgc gaa act gag aat ccc tgt gtt cag acc 734

Cys Gln Asp Val Asn Glu Cys Glu Thr Glu Asn Pro Cys Val Gln Thr

185 190 195

tgt gtc aac acc tat ggc tct ttc atc tgc cgc tgt gac cca gga tat 782

Cys Val Asn Thr Tyr Gly Ser Phe Ile Cys Arg Cys Asp Pro Gly Tyr

200 205 210

gaa ctt gag gaa gat ggc att cac tgc agt gat atg gac gag tgc agc 830

Glu Leu Glu Glu Asp Gly Ile His Cys Ser Asp Met Asp Glu Cys Ser

215 220 225

ttc tcc gag ttc ctc tgt caa cac gag tgt gtg aac cag ccg ggc tca 878

Phe Ser Glu Phe Leu Cys Gln His Glu Cys Val Asn Gln Pro Gly Ser

230 235 240 245

tac ttc tgc tcg tgc cct cca ggc tac gtc ctg ttg gat gat aac cga 926

Tyr Phe Cys Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Val Leu Leu Asp Asp Asn Arg

250 255 260

agc tgc cag gat atc aat gaa tgt gag cac cga aac cac acg tgt acc 974

Ser Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Glu His Arg Asn His Thr Cys Thr

265 270 275

tca ctg cag act tgc tac aat cta caa ggg ggc ttc aaa tgt att gat 1022

Ser Leu Gln Thr Cys Tyr Asn Leu Gln Gly Gly Phe Lys Cys Ile Asp

280 285 290

ccc atc agc tgt gag gag cct tat ctg ctg att ggt gaa aac cgc tgt 1070

Pro Ile Ser Cys Glu Glu Pro Tyr Leu Leu Ile Gly Glu Asn Arg Cys

295 300 305

atg tgt cct gct gag cac acc agc tgc aga gac cag cca ttc acc atc 1118

Met Cys Pro Ala Glu His Thr Ser Cys Arg Asp Gln Pro Phe Thr Ile

310 315 320 325

ctg tat cgg gac atg gat gtg gtg tca gga cgc tcc gtt cct gct gac 1166

Leu Tyr Arg Asp Met Asp Val Val Ser Gly Arg Ser Val Pro Ala Asp

330 335 340

atc ttc cag atg caa gca aca acc cga tac cct ggt gcc tat tac att 1214

Ile Phe Gln Met Gln Ala Thr Thr Arg Tyr Pro Gly Ala Tyr Tyr Ile

345 350 355

ttc cag atc aaa tct ggc aac gag ggt cga gag ttc tat atg cgg caa 1262

Phe Gln Ile Lys Ser Gly Asn Glu Gly Arg Glu Phe Tyr Met Arg Gln

360 365 370

aca ggg cct atc agt gcc acc ctg gtg atg aca cgc ccc atc aaa ggg 1310

Thr Gly Pro Ile Ser Ala Thr Leu Val Met Thr Arg Pro Ile Lys Gly

375 380 385

cct cgg gac atc cag ctg gac ttg gag atg atc act gtc aac act gtc 1358

Pro Arg Asp Ile Gln Leu Asp Leu Glu Met Ile Thr Val Asn Thr Val

390 395 400 405

atc aac ttc aga ggc agc tcc gtg atc cga ctg cgg ata tat gtg tcg 1406

Ile Asn Phe Arg Gly Ser Ser Val Ile Arg Leu Arg Ile Tyr Val Ser

410 415 420

cag tat ccg ttc tgagcctctg gctaaggcct ctgacactgc ctttcaccag 1458

Gln Tyr Pro Phe

425

caccgaggga cgggaggaga aaggaaacca gcaagaatga gagcgagaca gacattgcac 1518

ctttcctgct gaatatctcc tgggggcatc agcctagcat cttgacccat atctgtacta 1578

ttgcagatgg tcactctgaa ggacaccctg ccctcagttc ctatgatgca gttatccaaa 1638

agtgttcatc ttagcccctg atatgaggtt gccagtgact cttcaaagcc ttccatttat 1698

ttccatcgtt ttataaaaaa gaaaatagat tagatttgct ggggtatgag tcctcgaagg 1758

ttcaaaagac tgagtggctt gctctcacct cttcctctcc ttcctccatc tcttgctgca 1818

ttgctgcttt gcaaaagtcc tcatgggctc gtgggaaatg ctgggaatag ctagtttgct 1878

tcttgcatgt tctgagaagg ctatgggaac acaccacagc aggatcgaag gtttttatag 1938

agtctatttt aaaatcacat ctggtatttt cagcataaaa gaaattttag ttgtctttaa 1998

aatttgtatg agtgtttaac cttttcttat tcattttgag gcttcttaaa gtggtagaat 2058

tccttccaaa ggcctcagat acatgttatg ttcagtcttt ccaacctcat cctttcctgc 2118

atcttagccc agtttttacg aagacccctt aatcatgctt tnttaagagt ttttacccaa 2178

ctgcgttgga agacagaggt atccagactg attaaataat tgaagaaaaa aaaaa 2233

＜210＞ 4

＜211＞ 423

＜212＞ PRT

＜213＞ Mus musculus

＜400＞ 4

Gln Cys Thr Asn Gly Phe Asp Leu Asp Arg Gln Ser Gly Gln Cys Leu

1 5 10 15

Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr Ile Pro Glu Ala Cys Arg Gly Asp Met

20 25 30

Met Cys Val Asn Gln Asn Gly Gly Tyr Leu Cys Ile Pro Arg Thr Asn

35 40 45

Pro Val Tyr Arg Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Ser Thr Ser Tyr Ser

50 55 60

Gly Pro Tyr Pro Ala Ala Ala Pro Pro Val Pro Ala Ser Asn Tyr Pro

65 70 75 80

Thr Ile Ser Arg Pro Leu Val Cys Arg Phe Gly Tyr Gln Met Asp Glu

85 90 95

Gly Asn Gln Cys Val Asp Val Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser His Gln

100 105 110

Cys Asn Pro Thr Gln Ile Cys Ile Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Thr Cys

115 120 125

Ser Cys Thr Asp Gly Tyr Trp Leu Leu Glu Gly Gln Cys Leu Asp Ile

130 135 140

Asp Glu Cys Arg Tyr Gly Tyr Cys Gln Gln Leu Cys Ala Asn Val Pro

145 150 155 160

Gly Ser Tyr Ser Cys Thr Cys Asn Pro Gly Phe Thr Leu Asn Asp Asp

165 170 175

Gly Arg Ser Cys Gln Asp Val Asn Glu Cys Glu Thr Glu Asn Pro Cys

180 185 190

Val Gln Thr Cys Val Asn Thr Tyr Gly Ser Phe Ile Cys Arg Cys Asp

195 200 205

Pro Gly Tyr Glu Leu Glu Glu Asp Gly Ile His Cys Ser Asp Met Asp

210 215 220

Glu Cys Ser Phe Ser Glu Phe Leu Cys Gln His Glu Cys Val Asn Gln

225 230 235 240

Pro Gly Ser Tyr Phe Cys Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Val Leu Leu Asp

245 250 255

Asp Asn Arg Ser Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Glu His Arg Asn His

260 265 270

Thr Cys Thr Ser Leu Gln Thr Cys Tyr Asn Leu Gln Gly Gly Phe Lys

275 280 285

Cys Ile Asp Pro Ile Ser Cys Glu Glu Pro Tyr Leu Leu Ile Gly Glu

290 295 300

Asn Arg Cys Met Cys Pro Ala Glu His Thr Ser Cys Arg Asp Gln Pro

305 310 315 320

Phe Thr Ile Leu Tyr Arg Asp Met Asp Val Val Ser Gly Arg Ser Val

325 330 335

Pro Ala Asp Ile Phe Gln Met Gln Ala Thr Thr Arg Tyr Pro Gly Ala

340 345 350

Tyr Tyr Ile Phe Gln Ile Lys Ser Gly Asn Glu Gly Arg Glu Phe Tyr

355 360 365

Met Arg Gln Thr Gly Pro Ile Ser Ala Thr Leu Val Met Thr Arg Pro

370 375 380

Ile Lys Gly Pro Arg Asp Ile Gln Leu Asp Leu Glu Met Ile Thr Val

385 390 395 400

Asn Thr Val Ile Asn Phe Arg Gly Ser Ser Val Ile Arg Leu Arg Ile

405 410 415

Tyr Val Ser Gln Tyr Pro Phe

420

＜210＞ 5

＜211＞ 1269

＜212＞ DNA

＜213＞ Mus musculus

＜400＞ 5

cagtgcacaa acggctttga cctggaccgc cagtcaggac agtgtctaga tattgatgaa 60

tgccggacca tccctgaggc ttgtcgtggg gacatgatgt gtgtcaacca gaatggcggg 120

tatttgtgca tccctcgaac caacccagtg tatcgagggc cttactcaaa tccctactct 180

acatcctact caggcccata cccagcagcg gccccaccag taccagcttc caactacccc 240

acgatttcaa ggcctcttgt ctgccgcttt gggtatcaga tggatgaagg caaccagtgt 300

gtggatgtgg acgagtgtgc aacagactca caccagtgca accctaccca gatctgtatc 360

aacactgaag gaggttacac ctgctcctgc accgatgggt actggcttct ggaagggcag 420

tgcctagata ttgatgaatg tcgctatggt tactgccagc agctctgtgc aaatgttcca 480

ggatcctatt cctgtacatg caaccctggt ttcaccctca acgacgatgg aaggtcttgc 540

caagatgtga acgagtgcga aactgagaat ccctgtgttc agacctgtgt caacacctat 600

ggctctttca tctgccgctg tgacccagga tatgaacttg aggaagatgg cattcactgc 660

agtgatatgg acgagtgcag cttctccgag ttcctctgtc aacacgagtg tgtgaaccag 720

ccgggctcat acttctgctc gtgccctcca ggctacgtcc tgttggatga taaccgaagc 780

tgccaggata tcaatgaatg tgagcaccga aaccacacgt gtacctcact gcagacttgc 840

tacaatctac aagggggctt caaatgtatt gatcccatca gctgtgagga gccttatctg 900

ctgattggtg aaaaccgctg tatgtgtcct gctgagcaca ccagctgcag agaccagcca 960

ttcaccatcc tgtatcggga catggatgtg gtgtcaggac gctccgttcc tgctgacatc 1020

ttccagatgc aagcaacaac ccgataccct ggtgcctatt acattttcca gatcaaatct 1080

ggcaacgagg gtcgagagtt ctatatgcgg caaacagggc ctatcagtgc caccctggtg 1140

atgacacgcc ccatcaaagg gcctcgggac atccagctgg acttggagat gatcactgtc 1200

aacactgtca tcaacttcag aggcagctcc gtgatccgac tgcggatata tgtgtcgcag 1260

tatccgttc 1269

＜210＞ 6

＜211＞ 461

＜212＞ PRT

＜213＞ Mus musculus

＜400＞ 6

Met Gly Pro Arg Ser Phe Glu Pro Met His Ser Gly Leu Cys Arg Gln

-35 -30 -25

Arg Arg Met Ile Leu Thr Val Thr Ile Leu Ala Leu Trp Leu Pro His

-20 -15 -10 -5

Pro Gly Asn Ala Gln Gln Gln Cys Thr Asn Gly Phe Asp Leu Asp Arg

-1 1 5 10

Gln Ser Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr Ile Pro Glu

15 20 25

Ala Cys Arg Gly Asp Met Met Cys Val Asn Gln Asn Gly Gly Tyr Leu

30 35 40

Cys Ile Pro Arg Thr Asn Pro Val Tyr Arg Gly Pro Tyr Ser Asn Pro

45 50 55 60

Tyr Ser Thr Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Pro Ala Ala Ala Pro Pro Val

65 70 75

Pro Ala Ser Asn Tyr Pro Thr Ile Ser Arg Pro Leu Val Cys Arg Phe

80 85 90

Gly Tyr Gln Met Asp Glu Gly Asn Gln Cys Val Asp Val Asp Glu Cys

95 100 105

Ala Thr Asp Ser His Gln Cys Asn Pro Thr Gln Ile Cys Ile Asn Thr

110 115 120

Glu Gly Gly Tyr Thr Cys Ser Cys Thr Asp Gly Tyr Trp Leu Leu Glu

125 130 135 140

Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Tyr Gly Tyr Cys Gln Gln

145 150 155

Leu Cys Ala Asn Val Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Thr Cys Asn Pro Gly

160 165 170

Phe Thr Leu Asn Asp Asp Gly Arg Ser Cys Gln Asp Val Asn Glu Cys

175 180 185

Glu Thr Glu Asn Pro Cys Val Gln Thr Cys Val Asn Thr Tyr Gly Ser

190 195 200

Phe Ile Cys Arg Cys Asp Pro Gly Tyr Glu Leu Glu Glu Asp Gly Ile

205 210 215 220

His Cys Ser Asp Met Asp Glu Cys Ser Phe Ser Glu Phe Leu Cys Gln

225 230 235

His Glu Cys Val Asn Gln Pro Gly Ser Tyr Phe Cys Ser Cys Pro Pro

240 245 250

Gly Tyr Val Leu Leu Asp Asp Asn Arg Ser Cys Gln Asp Ile Asn Glu

255 260 265

Cys Glu His Arg Asn His Thr Cys Thr Ser Leu Gln Thr Cys Tyr Asn

270 275 280

Leu Gln Gly Gly Phe Lys Cys Ile Asp Pro Ile Ser Cys Glu Glu Pro

285 290 295 300

Tyr Leu Leu Ile Gly Glu Asn Arg Cys Met Cys Pro Ala Glu His Thr

305 310 315

Ser Cys Arg Asp Gln Pro Phe Thr Ile Leu Tyr Arg Asp Met Asp Val

320 325 330

Val Ser Gly Arg Ser Val Pro Ala Asp Ile Phe Gln Met Gln Ala Thr

335 340 345

Thr Arg Tyr Pro Gly Ala Tyr Tyr Ile Phe Gln Ile Lys Ser Gly Asn

350 355 360

Glu Gly Arg Glu Phe Tyr Met Arg Gln Thr Gly Pro Ile Ser Ala Thr

365 370 375 380

Leu Val Met Thr Arg Pro Ile Lys Gly Pro Arg Asp Ile Gln Leu Asp

385 390 395

Leu Glu Met Ile Thr Val Asn Thr Val Ile Asn Phe Arg Gly Ser Ser

400 405 410

Val Ile Arg Leu Arg Ile Tyr Val Ser Gln Tyr Pro Phe

415 420 425

＜210＞ 7

＜211＞ 1383

＜212＞ DNA

＜213＞ Mus musculus

＜400＞ 7

atgggaccta gaagtttcga gccaatgcac agtggactct gcagacagag acgcatgata 60

ctcactgtta ccatcttggc actctggctt ccacatcctg ggaatgcaca gcagcagtgc 120

acaaacggct ttgacctgga ccgccagtca ggacagtgtc tagatattga tgaatgccgg 180

accatccctg aggcttgtcg tggggacatg atgtgtgtca accagaatgg cgggtatttg 240

tgcatccctc gaaccaaccc agtgtatcga gggccttact caaatcccta ctctacatcc 300

tactcaggcc catacccagc agcggcccca ccagtaccag cttccaacta ccccacgatt 360

tcaaggcctc ttgtctgccg ctttgggtat cagatggatg aaggcaacca gtgtgtggat 420

gtggacgagt gtgcaacaga ctcacaccag tgcaacccta cccagatctg tatcaacact 480

gaaggaggtt acacctgctc ctgcaccgat gggtactggc ttctggaagg gcagtgccta 540

gatattgatg aatgtcgcta tggttactgc cagcagctct gtgcaaatgt tccaggatcc 600

tattcctgta catgcaaccc tggtttcacc ctcaacgacg atggaaggtc ttgccaagat 660

gtgaacgagt gcgaaactga gaatccctgt gttcagacct gtgtcaacac ctatggctct 720

ttcatctgcc gctgtgaccc aggatatgaa cttgaggaag atggcattca ctgcagtgat 780

atggacgagt gcagcttctc cgagttcctc tgtcaacacg agtgtgtgaa ccagccgggc 840

tcatacttct gctcgtgccc tccaggctac gtcctgttgg atgataaccg aagctgccag 900

gatatcaatg aatgtgagca ccgaaaccac acgtgtacct cactgcagac ttgctacaat 960

ctacaagggg gcttcaaatg tattgatccc atcagctgtg aggagcctta tctgctgatt 1020

ggtgaaaacc gctgtatgtg tcctgctgag cacaccagct gcagagacca gccattcacc 1080

atcctgtatc gggacatgga tgtggtgtca ggacgctccg ttcctgctga catcttccag 1140

atgcaagcaa caacccgata ccctggtgcc tattacattt tccagatcaa atctggcaac 1200

gagggtcgag agttctatat gcggcaaaca gggcctatca gtgccaccct ggtgatgaca 1260

cgccccatca aagggcctcg ggacatccag ctggacttgg agatgatcac tgtcaacact 1320

gtcatcaact tcagaggcag ctccgtgatc cgactgcgga tatatgtgtc gcagtatccg 1380

ttc 1383

＜210＞ 8

＜211＞ 2429

＜212＞ DNA

＜213＞ Mus musculus

＜220＞

＜223＞ Clone mouse A55b derived from Day 13 mouse embryonic heart

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (232)..(1614)

＜220＞

＜221＞ sig_peptide

＜222＞ (232)..(339)

＜220＞

＜221＞ mat_peptide

＜222＞ (340)..(1614)

＜400＞ 8

cagcatctcg agagaggcag cagacaacct ctctaggtca tttctctttc tttttggaaa 60

gggcagcaac gttgtgcgca gtttataaaa tatcacacta catgtttttt aaatttggga 120

gactgctgac tacggcacca gcaattgctt tgctgcgacg gctgtgagac aagcagaagt 180

ctccgaacac ttctgtctgc gtttgctcta tgtgtgtgat ttacagaggg a atg gga 237

Met Gly

-35

cct aga agt ttc gag cca atg cac agt gga ctc tgc aga cag aga cgc 285

Pro Arg Ser Phe Glu Pro Met His Ser Gly Leu Cys Arg Gln Arg Arg

-30 -25 -20

atg ata ctc act gtt acc atc ttg gca ctc tgg ctt cca cat cct ggg 333

Met Ile Leu Thr Val Thr Ile Leu Ala Leu Trp Leu Pro His Pro Gly

-15 -10 -5

aat gca cag cag cag tgc aca aac ggc ttt gac ctg gac cgc cag tca 381

Asn Ala Gln Gln Gln Cys Thr Asn Gly Phe Asp Leu Asp Arg Gln Ser

-1 1 5 10

gga cag tgt cta gat att gat gaa tgc cgg acc atc cct gag gct tgt 429

Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr Ile Pro Glu Ala Cys

15 20 25 30

cgt ggg gac atg atg tgt gtc aac cag aat ggc ggg tat ttg tgc atc 477

Arg Gly Asp Met Met Cys Val Asn Gln Asn Gly Gly Tyr Leu Cys Ile

35 40 45

cct cga acc aac cca gtg tat cga ggg cct tac tca aat ccc tac tct 525

Pro Arg Thr Asn Pro Val Tyr Arg Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Ser

50 55 60

aca tcc tac tca ggc cca tac cca gca gcg gcc cca cca gta cca gct 573

Thr Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Pro Ala Ala Ala Pro Pro Val Pro Ala

65 70 75

tcc aac tac ccc acg att tca agg cct ctt gtc tgc cgc ttt ggg tat 621

Ser Asn Tyr Pro Thr Ile Ser Arg Pro Leu Val Cys Arg Phe Gly Tyr

80 85 90

cag atg gat gaa ggc aac cag tgt gtg gat gtg gac gag tgt gca aca 669

Gln Met Asp Glu Gly Asn Gln Cys Val Asp Val Asp Glu Cys Ala Thr

95 100 105 110

gac tca cac cag tgc aac cct acc cag atc tgt atc aac act gaa gga 717

Asp Ser His Gln Cys Asn Pro Thr Gln Ile Cys Ile Asn Thr Glu Gly

115 120 125

ggt tac acc tgc tcc tgc acc gat ggg tac tgg ctt ctg gaa ggg cag 765

Gly Tyr Thr Cys Ser Cys Thr Asp Gly Tyr Trp Leu Leu Glu Gly Gln

130 135 140

tgc cta gat att gat gaa tgt cgc tat ggt tac tgc cag cag ctc tgt 813

Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Tyr Gly Tyr Cys Gln Gln Leu Cys

145 150 155

gca aat gtt cca gga tcc tat tcc tgt aca tgc aac cct ggt ttc acc 861

Ala Asn Val Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Thr Cys Asn Pro Gly Phe Thr

160 165 170

ctc aac gac gat gga agg tct tgc caa gat gtg aac gag tgc gaa act 909

Leu Asn Asp Asp Gly Arg Ser Cys Gln Asp Val Asn Glu Cys Glu Thr

175 180 185 190

gag aat ccc tgt gtt cag acc tgt gtc aac acc tat ggc tct ttc atc 957

Glu Asn Pro Cys Val Gln Thr Cys Val Asn Thr Tyr Gly Ser Phe Ile

195 200 205

tgc cgc tgt gac cca gga tat gaa ctt gag gaa gat ggc att cac tgc 1005

Cys Arg Cys Asp Pro Gly Tyr Glu Leu Glu Glu Asp Gly Ile His Cys

210 215 220

agt gat atg gac gag tgc agc ttc tcc gag ttc ctc tgt caa cac gag 1053

Ser Asp Met Asp Glu Cys Ser Phe Ser Glu Phe Leu Cys Gln His Glu

225 230 235

tgt gtg aac cag ccg ggc tca tac ttc tgc tcg tgc cct cca ggc tac 1101

Cys Val Asn Gln Pro Gly Ser Tyr Phe Cys Ser Cys Pro Pro Gly Tyr

240 245 250

gtc ctg ttg gat gat aac cga agc tgc cag gat atc aat gaa tgt gag 1149

Val Leu Leu Asp Asp Asn Arg Ser Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Glu

255 260 265 270

cac cga aac cac acg tgt acc tca ctg cag act tgc tac aat cta caa 1197

His Arg Asn His Thr Cys Thr Ser Leu Gln Thr Cys Tyr Asn Leu Gln

275 280 285

ggg ggc ttc aaa tgt att gat ccc atc agc tgt gag gag cct tat ctg 1245

Gly Gly Phe Lys Cys Ile Asp Pro Ile Ser Cys Glu Glu Pro Tyr Leu

290 295 300

ctg att ggt gaa aac cgc tgt atg tgt cct gct gag cac acc agc tgc 1293

Leu Ile Gly Glu Asn Arg Cys Met Cys Pro Ala Glu His Thr Ser Cys

305 310 315

aga gac cag cca ttc acc atc ctg tat cgg gac atg gat gtg gtg tca 1341

Arg Asp Gln Pro Phe Thr Ile Leu Tyr Arg Asp Met Asp Val Val Ser

320 325 330

gga cgc tcc gtt cct gct gac atc ttc cag atg caa gca aca acc cga 1389

Gly Arg Ser Val Pro Ala Asp Ile Phe Gln Met Gln Ala Thr Thr Arg

335 340 345 350

tac cct ggt gcc tat tac att ttc cag atc aaa tct ggc aac gag ggt 1437

Tyr Pro Gly Ala Tyr Tyr Ile Phe Gln Ile Lys Ser Gly Asn Glu Gly

355 360 365

cga gag ttc tat atg cgg caa aca ggg cct atc agt gcc acc ctg gtg 1485

Arg Glu Phe Tyr Met Arg Gln Thr Gly Pro Ile Ser Ala Thr Leu Val

370 375 380

atg aca cgc ccc atc aaa ggg cct cgg gac atc cag ctg gac ttg gag 1533

Met Thr Arg Pro Ile Lys Gly Pro Arg Asp Ile Gln Leu Asp Leu Glu

385 390 395

atg atc act gtc aac act gtc atc aac ttc aga ggc agc tcc gtg atc 1581

Met Ile Thr Val Asn Thr Val Ile Asn Phe Arg Gly Ser Ser Val Ile

400 405 410

cga ctg cgg ata tat gtg tcg cag tat ccg ttc tgagcctctg gctaaggcct 1634

Arg Leu Arg Ile Tyr Val Ser Gln Tyr Pro Phe

415 420 425

ctgacactgc ctttcaccag caccgaggga cgggaggaga aaggaaacca gcaagaatga 1694

gagcgagaca gacattgcac ctttcctgct gaatatctcc tgggggcatc agcctagcat 1754

cttgacccat atctgtacta ttgcagatgg tcactctgaa ggacaccctg ccctcagttc 1814

ctatgatgca gttatccaaa agtgttcatc ttagcccctg atatgaggtt gccagtgact 1874

cttcaaagcc ttccatttat ttccatcgtt ttataaaaaa gaaaatagat tagatttgct 1934

ggggtatgag tcctcgaagg ttcaaaagac tgagtggctt gctctcacct cttcctctcc 1994

ttcctccatc tcttgctgca ttgctgcttt gcaaaagtcc tcatgggctc gtgggaaatg 2054

ctgggaatag ctagtttgct tcttgcatgt tctgagaagg ctatgggaac acaccacagc 2114

aggatcgaag gtttttatag agtctatttt aaaatcacat ctggtatttt cagcataaaa 2174

gaaattttag ttgtctttaa aatttgtatg agtgtttaac cttttcttat tcattttgag 2234

gcttcttaaa gtggtagaat tccttccaaa ggcctcagat acatgttatg ttcagtcttt 2294

ccaacctcat cctttcctgc atcttagccc agtttttacg aagacccctt aatcatgctt 2354

tnttaagagt ttttacccaa ctgcgttgga agacagaggt atccagactg attaaataat 2414

tgaagaaaaa aaaaa 2429

＜210＞ 9

＜211＞ 423

＜212＞ PRT

＜213＞ Mus musculus

＜400＞ 9

Gln Cys Thr Asn Gly Phe Asp Leu Asp Arg Gln Ser Gly Gln Cys Leu

1 5 10 15

Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr Ile Pro Glu Ala Cys Arg Gly Asp Met

20 25 30

Met Cys Val Asn Gln Asn Gly Gly Tyr Leu Cys Ile Pro Arg Thr Asn

35 40 45

Pro Val Tyr Arg Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Ser Thr Ser Tyr Ser

50 55 60

Gly Pro Tyr Pro Ala Ala Ala Pro Pro Val Pro Ala Ser Asn Tyr Pro

65 70 75 80

Thr Ile Ser Arg Pro Leu Val Cys Arg Phe Gly Tyr Gln Met Asp Glu

85 90 95

Gly Asn Gln Cys Val Asp Val Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser His Gln

100 105 110

Cys Asn Pro Thr Gln Ile Cys Ile Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Thr Cys

115 120 125

Ser Cys Thr Asp Gly Tyr Trp Leu Leu Glu Gly Gln Cys Leu Asp Ile

130 135 140

Asp Glu Cys Arg Tyr Gly Tyr Cys Gln Gln Leu Cys Ala Asn Val Pro

145 150 155 160

Gly Ser Tyr Ser Cys Thr Cys Asn Pro Gly Phe Thr Leu Asn Asp Asp

165 170 175

Gly Arg Ser Cys Gln Asp Val Asn Glu Cys Glu Thr Glu Asn Pro Cys

180 185 190

Val Gln Thr Cys Val Asn Thr Tyr Gly Ser Phe Ile Cys Arg Cys Asp

195 200 205

Pro Gly Tyr Glu Leu Glu Glu Asp Gly Ile His Cys Ser Asp Met Asp

210 215 220

Glu Cys Ser Phe Ser Glu Phe Leu Cys Gln His Glu Cys Val Asn Gln

225 230 235 240

Pro Gly Ser Tyr Phe Cys Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Val Leu Leu Asp

245 250 255

Asp Asn Arg Ser Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Glu His Arg Asn His

260 265 270

Thr Cys Thr Ser Leu Gln Thr Cys Tyr Asn Leu Gln Gly Gly Phe Lys

275 280 285

Cys Ile Asp Pro Ile Ser Cys Glu Glu Pro Tyr Leu Leu Ile Gly Glu

290 295 300

Asn Arg Cys Met Cys Pro Ala Glu His Thr Ser Cys Arg Asp Gln Pro

305 310 315 320

Phe Thr Ile Leu Tyr Arg Asp Met Asp Val Val Ser Gly Arg Ser Val

325 330 335

Pro Ala Asp Ile Phe Gln Met Gln Ala Thr Thr Arg Tyr Pro Gly Ala

340 345 350

Tyr Tyr Ile Phe Gln Ile Lys Ser Gly Asn Glu Gly Arg Glu Phe Tyr

355 360 365

Met Arg Gln Thr Gly Pro Ile Ser Ala Thr Leu Val Met Thr Arg Pro

370 375 380

Ile Lys Gly Pro Arg Asp Ile Gln Leu Asp Leu Glu Met Ile Thr Val

385 390 395 400

Asn Thr Val Ile Asn Phe Arg Gly Ser Ser Val Ile Arg Leu Arg Ile

405 410 415

Tyr Val Ser Gln Tyr Pro Phe

420

＜210＞ 10

＜211＞ 1269

＜212＞ DNA

＜213＞ Mus musculus

＜400＞ 10

cagtgcacaa acggctttga cctggaccgc cagtcaggac agtgtctaga tattgatgaa 60

tgccggacca tccctgaggc ttgtcgtggg gacatgatgt gtgtcaacca gaatggcggg 120

tatttgtgca tccctcgaac caacccagtg tatcgagggc cttactcaaa tccctactct 180

acatcctact caggcccata cccagcagcg gccccaccag taccagcttc caactacccc 240

acgatttcaa ggcctcttgt ctgccgcttt gggtatcaga tggatgaagg caaccagtgt 300

gtggatgtgg acgagtgtgc aacagactca caccagtgca accctaccca gatctgtatc 360

aacactgaag gaggttacac ctgctcctgc accgatgggt actggcttct ggaagggcag 420

tgcctagata ttgatgaatg tcgctatggt tactgccagc agctctgtgc aaatgttcca 480

ggatcctatt cctgtacatg caaccctggt ttcaccctca acgacgatgg aaggtcttgc 540

caagatgtga acgagtgcga aactgagaat ccctgtgttc agacctgtgt caacacctat 600

ggctctttca tctgccgctg tgacccagga tatgaacttg aggaagatgg cattcactgc 660

agtgatatgg acgagtgcag cttctccgag ttcctctgtc aacacgagtg tgtgaaccag 720

ccgggctcat acttctgctc gtgccctcca ggctacgtcc tgttggatga taaccgaagc 780

tgccaggata tcaatgaatg tgagcaccga aaccacacgt gtacctcact gcagacttgc 840

tacaatctac aagggggctt caaatgtatt gatcccatca gctgtgagga gccttatctg 900

ctgattggtg aaaaccgctg tatgtgtcct gctgagcaca ccagctgcag agaccagcca 960

ttcaccatcc tgtatcggga catggatgtg gtgtcaggac gctccgttcc tgctgacatc 1020

ttccagatgc aagcaacaac ccgataccct ggtgcctatt acattttcca gatcaaatct 1080

ggcaacgagg gtcgagagtt ctatatgcgg caaacagggc ctatcagtgc caccctggtg 1140

atgacacgcc ccatcaaagg gcctcgggac atccagctgg acttggagat gatcactgtc 1200

aacactgtca tcaacttcag aggcagctcc gtgatccgac tgcggatata tgtgtcgcag 1260

tatccgttc 1269

＜210＞ 11

＜211＞ 448

＜212＞ PRT

＜213＞ Homo sapiens

＜400＞ 11

Met Pro Gly Ile Lys Arg Ile Leu Thr Val Thr Ile Leu Ala Leu Cys

-20 -15 -10

Leu Pro Ser Pro Gly Asn Ala Gln Ala Gln Cys Thr Asn Gly Phe Asp

-5 -1 1 5

Leu Asp Arg Gln Ser Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr

10 15 20 25

Ile Pro Glu Ala Cys Arg Gly Asp Met Met Cys Val Asn Gln Asn Gly

30 35 40

Gly Tyr Leu Cys Ile Pro Arg Thr Asn Pro Val Tyr Arg Gly Pro Tyr

45 50 55

Ser Asn Pro Tyr Ser Thr Pro Tyr Ser Gly Pro Tyr Pro Ala Ala Ala

60 65 70

Pro Pro Leu Ser Ala Pro Asn Tyr Pro Thr Ile Ser Arg Pro Leu Ile

75 80 85

Cys Arg Phe Gly Tyr Gln Met Asp Glu Ser Asn Gln Cys Val Asp Val

90 95 100 105

Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser His Gln Cys Asn Pro Thr Gln Ile Cys

110 115 120

Ile Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Thr Cys Ser Cys Thr Asp Gly Tyr Trp

125 130 135

Leu Leu Glu Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Tyr Gly Tyr

140 145 150

Cys Gln Gln Leu Cys Ala Asn Val Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Thr Cys

155 160 165

Asn Pro Gly Phe Thr Leu Asn Glu Asp Gly Arg Ser Cys Gln Asp Val

170 175 180 185

Asn Glu Cys Ala Thr Glu Asn Pro Cys Val Gln Thr Cys Val Asn Thr

190 195 200

Tyr Gly Ser Phe Ile Cys Arg Cys Asp Pro Gly Tyr Glu Leu Glu Glu

205 210 215

Asp Gly Val His Cys Ser Asp Met Asp Glu Cys Ser Phe Ser Glu Phe

220 225 230

Leu Cys Gln His Glu Cys Val Asn Gln Pro Gly Thr Tyr Phe Cys Ser

235 240 245

Cys Pro Pro Gly Tyr Ile Leu Leu Asp Asp Asn Arg Ser Cys Gln Asp

250 255 260 265

Ile Asn Glu Cys Glu His Arg Asn His Thr Cys Asn Leu Gln Gln Thr

270 275 280

Cys Tyr Asn Leu Gln Gly Gly Phe Lys Cys Ile Asp Pro Ile Arg Cys

285 290 295

Glu Glu Pro Tyr Leu Arg Ile Ser Asp Asn Arg Cys Met Cys Pro Ala

300 305 310

Glu Asn Pro Gly Cys Arg Asp Gln Pro Phe Thr Ile Leu Tyr Arg Asp

315 320 325

Met Asp Val Val Ser Gly Arg Ser Val Pro Ala Asp Ile Phe Gln Met

330 335 340 345

Gln Ala Thr Thr Arg Tyr Pro Gly Ala Tyr Tyr Ile Phe Gln Ile Lys

350 355 360

Ser Gly Asn Glu Gly Arg Glu Phe Tyr Met Arg Gln Thr Gly Pro Ile

365 370 375

Ser Ala Thr Leu Val Met Thr Arg Pro Ile Lys Gly Pro Arg Glu Ile

380 385 390

Gln Leu Asp Leu Glu Met Ile Thr Val Asn Thr Val Ile Asn Phe Arg

395 400 405

Gly Ser Ser Val Ile Arg Leu Arg Ile Tyr Val Ser Gln Tyr Pro Phe

410 415 420 425

＜210＞ 12

＜211＞ 1344

＜212＞ DNA

＜213＞ Homo sapiens

＜400＞ 12

atgccaggaa taaaaaggat actcactgtt accattctgg ctctctgtct tccaagccct 60

gggaatgcac aggcacagtg cacgaatggc tttgacctgg atcgccagtc aggacagtgt 120

ttagatattg atgaatgccg aaccatcccc gaggcctgcc gaggagacat gatgtgtgtt 180

aaccaaaatg gcgggtattt atgcattccc cggacaaacc ctgtgtatcg agggccctac 240

tcgaacccct actcgacccc ctactcaggt ccgtacccag cagctgcccc accactctca 300

gctccaaact atcccacgat ctccaggcct cttatatgcc gctttggata ccagatggat 360

gaaagcaacc aatgtgtgga tgtggacgag tgtgcaacag attcccacca gtgcaacccc 420

acccagatct gcatcaatac tgaaggcggg tacacctgct cctgcaccga cggatattgg 480

cttctggaag gccagtgctt agacattgat gaatgtcgct atggttactg ccagcagctc 540

tgtgcgaatg ttcctggatc ctattcttgt acatgcaacc ctggttttac cctcaatgag 600

gatggaaggt cttgccaaga tgtgaacgag tgtgccaccg agaacccctg cgtgcaaacc 660

tgcgtcaaca cctacggctc tttcatctgc cgctgtgacc caggatatga acttgaggaa 720

gatggcgttc attgcagtga tatggacgag tgcagcttct ctgagttcct ctgccaacat 780

gagtgtgtga accagcccgg cacatacttc tgctcctgcc ctccaggcta catcctgctg 840

gatgacaacc gaagctgcca agacatcaac gaatgtgagc acaggaacca cacgtgcaac 900

ctgcagcaga cgtgctacaa tttacaaggg ggcttcaaat gcatcgaccc catccgctgt 960

gaggagcctt atctgaggat cagtgataac cgctgtatgt gtcctgctga gaaccctggc 1020

tgcagagacc agccctttac catcttgtac cgggacatgg acgtggtgtc aggacgctcc 1080

gttcccgctg acatcttcca aatgcaagcc acgacccgct accctggggc ctattacatt 1140

ttccagatca aatctgggaa tgagggcaga gaattttaca tgcggcaaac gggccccatc 1200

agtgccaccc tggtgatgac acgccccatc aaagggcccc gggaaatcca gctggacttg 1260

gaaatgatca ctgtcaacac tgtcatcaac ttcagaggca gctccgtgat ccgactgcgg 1320

atatatgtgt cgcagtaccc attc 1344

＜210＞ 13

＜211＞ 2328

＜212＞ DNA

＜213＞ Homo sapiens

＜220＞

＜223＞ Clone human A55 derived from human brain

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (169)..(1512)

＜220＞

＜221＞ sig_peptide

＜222＞ (169)..(237)

＜220＞

＜221＞ mat_peptide

＜222＞ (238)..(1512)

＜400＞ 13

gacccggcgc tctccccgtg tcctctccac gactcgctcg gcccctctgg aataaaacac 60

ccgcgagccc cgagggccca gaggaggccg acgtgcccga gctcctccgg gggtcccgcc 120

cgcgagcttt cttctcgcct tcgcatctcc tcctcgcgcg tcttggac atg cca gga 177

Met Pro Gly

-23

ata aaa agg ata ctc act gtt acc att ctg gct ctc tgt ctt cca agc 225

Ile Lys Arg Ile Leu Thr Val Thr Ile Leu Ala Leu Cys Leu Pro Ser

-20 -15 -10 -5

cct ggg aat gca cag gca cag tgc acg aat ggc ttt gac ctg gat cgc 273

Pro Gly Asn Ala Gln Ala Gln Cys Thr Asn Gly Phe Asp Leu Asp Arg

-1 1 5 10

cag tca gga cag tgt tta gat att gat gaa tgc cga acc atc ccc gag 321

Gln Ser Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr Ile Pro Glu

15 20 25

gcc tgc cga gga gac atg atg tgt gtt aac caa aat ggc ggg tat tta 369

Ala Cys Arg Gly Asp Met Met Cys Val Asn Gln Asn Gly Gly Tyr Leu

30 35 40

tgc att ccc cgg aca aac cct gtg tat cga ggg ccc tac tcg aac ccc 417

Cys Ile Pro Arg Thr Asn Pro Val Tyr Arg Gly Pro Tyr Ser Asn Pro

45 50 55 60

tac tcg acc ccc tac tca ggt ccg tac cca gca gct gcc cca cca ctc 465

Tyr Ser Thr Pro Tyr Ser Gly Pro Tyr Pro Ala Ala Ala Pro Pro Leu

65 70 75

tca gct cca aac tat ccc acg atc tcc agg cct ctt ata tgc cgc ttt 513

Ser Ala Pro Asn Tyr Pro Thr Ile Ser Arg Pro Leu Ile Cys Arg Phe

80 85 90

gga tac cag atg gat gaa agc aac caa tgt gtg gat gtg gac gag tgt 561

Gly Tyr Gln Met Asp Glu Ser Asn Gln Cys Val Asp Val Asp Glu Cys

95 100 105

gca aca gat tcc cac cag tgc aac ccc acc cag atc tgc atc aat act 609

Ala Thr Asp Ser His Gln Cys Asn Pro Thr Gln Ile Cys Ile Asn Thr

110 115 120

gaa ggc ggg tac acc tgc tcc tgc acc gac gga tat tgg ctt ctg gaa 657

Glu Gly Gly Tyr Thr Cys Ser Cys Thr Asp Gly Tyr Trp Leu Leu Glu

125 130 135 140

ggc cag tgc tta gac att gat gaa tgt cgc tat ggt tac tgc cag cag 705

Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Tyr Gly Tyr Cys Gln Gln

145 150 155

ctc tgt gcg aat gtt cct gga tcc tat tct tgt aca tgc aac cct ggt 753

Leu Cys Ala Asn Val Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Thr Cys Asn Pro Gly

160 165 170

ttt acc ctc aat gag gat gga agg tct tgc caa gat gtg aac gag tgt 801

Phe Thr Leu Asn Glu Asp Gly Arg Ser Cys Gln Asp Val Asn Glu Cys

175 180 185

gcc acc gag aac ccc tgc gtg caa acc tgc gtc aac acc tac ggc tct 849

Ala Thr Glu Asn Pro Cys Val Gln Thr Cys Val Asn Thr Tyr Gly Ser

190 195 200

ttc atc tgc cgc tgt gac cca gga tat gaa ctt gag gaa gat ggc gtt 897

Phe Ile Cys Arg Cys Asp Pro Gly Tyr Glu Leu Glu Glu Asp Gly Val

205 210 215 220

cat tgc agt gat atg gac gag tgc agc ttc tct gag ttc ctc tgc caa 945

His Cys Ser Asp Met Asp Glu Cys Ser Phe Ser Glu Phe Leu Cys Gln

225 230 235

cat gag tgt gtg aac cag ccc ggc aca tac ttc tgc tcc tgc cct cca 993

His Glu Cys Val Asn Gln Pro Gly Thr Tyr Phe Cys Ser Cys Pro Pro

240 245 250

ggc tac atc ctg ctg gat gac aac cga agc tgc caa gac atc aac gaa 1041

Gly Tyr Ile Leu Leu Asp Asp Asn Arg Ser Cys Gln Asp Ile Asn Glu

255 260 265

tgt gag cac agg aac cac acg tgc aac ctg cag cag acg tgc tac aat 1089

Cys Glu His Arg Asn His Thr Cys Asn Leu Gln Gln Thr Cys Tyr Asn

270 275 280

tta caa ggg ggc ttc aaa tgc atc gac ccc atc cgc tgt gag gag cct 1137

Leu Gln Gly Gly Phe Lys Cys Ile Asp Pro Ile Arg Cys Glu Glu Pro

285 290 295 300

tat ctg agg atc agt gat aac cgc tgt atg tgt cct gct gag aac cct 1185

Tyr Leu Arg Ile Ser Asp Asn Arg Cys Met Cys Pro Ala Glu Asn Pro

305 310 315

ggc tgc aga gac cag ccc ttt acc atc ttg tac cgg gac atg gac gtg 1233

Gly Cys Arg Asp Gln Pro Phe Thr Ile Leu Tyr Arg Asp Met Asp Val

320 325 330

gtg tca gga cgc tcc gtt ccc gct gac atc ttc caa atg caa gcc acg 1281

Val Ser Gly Arg Ser Val Pro Ala Asp Ile Phe Gln Met Gln Ala Thr

335 340 345

acc cgc tac cct ggg gcc tat tac att ttc cag atc aaa tct ggg aat 1329

Thr Arg Tyr Pro Gly Ala Tyr Tyr Ile Phe Gln Ile Lys Ser Gly Asn

350 355 360

gag ggc aga gaa ttt tac atg cgg caa acg ggc ccc atc agt gcc acc 1377

Glu Gly Arg Glu Phe Tyr Met Arg Gln Thr Gly Pro Ile Ser Ala Thr

365 370 375 380

ctg gtg atg aca cgc ccc atc aaa ggg ccc cgg gaa atc cag ctg gac 1425

Leu Val Met Thr Arg Pro Ile Lys Gly Pro Arg Glu Ile Gln Leu Asp

385 390 395

ttg gaa atg atc act gtc aac act gtc atc aac ttc aga ggc agc tcc 1473

Leu Glu Met Ile Thr Val Asn Thr Val Ile Asn Phe Arg Gly Ser Ser

400 405 410

gtg atc cga ctg cgg ata tat gtg tcg cag tac cca ttc tgagcctcgg 1522

Val Ile Arg Leu Arg Ile Tyr Val Ser Gln Tyr Pro Phe

415 420 425

gctggagcct ccgacgctgc ctctcattgg caccaaggga caggagaaga gaggaaataa 1582

cagagagaat gagagcgaca cagacgttag gcatttcctg ctgaacgttt ccccgaagag 1642

tcagccccga cttcctgact ctcacctgta ctattgcaga cctgtcaccc tgcaggactt 1702

gccaccccca gttcctatga tacagttatc aaaaagtatt atcattgctc ccctgataga 1762

agattgttgg tgaattttca aggccttcag tttatttcca ctattttcaa agaaaataga 1822

ttaggtttgc gggggtctga gtctatgttc aaagactgtg aacagcttgc tgtcacttct 1882

tcacctcttc cactccttct ctcactgtgt tactgctttg caaagacccg ggagctggcg 1942

gggaaccctg ggagtagcta gtttgctttt tgcgtacaca gagaaggcta tgtaaacaaa 2002

ccacagcagg atcgaagggt ttttagagaa tgtgtttcaa aaccatgcct ggtattttca 2062

accataaaag aagtttcagt tgtccttaaa tttgtataac ggtttaattc tgtcttgttc 2122

attttgagta tttttaaaaa atatgtcgta gaattccttc gaaaggcctt cagacacatg 2182

ctatgttctg tcttcccaaa cccagtctcc tctccatttt agcccagtgt tttctttgag 2242

gaccccttaa tcttgctttc tttagaattt ttacccaatt ggattggaat gcagaggtct 2302

ccaaactgat taaatatttg aagaga 2328

＜210＞ 14

＜211＞ 423

＜212＞ PRT

＜213＞ Homo sapiens

＜400＞ 14

Gln Cys Thr Asn Gly Phe Asp Leu Asp Arg Gln Ser Gly Gln Cys Leu

1 5 10 15

Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr Ile Pro Glu Ala Cys Arg Gly Asp Met

20 25 30

Met Cys Val Asn Gln Asn Gly Gly Tyr Leu Cys Ile Pro Arg Thr Asn

35 40 45

Pro Val Tyr Arg Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Ser Thr Pro Tyr Ser

50 55 60

Gly Pro Tyr Pro Ala Ala Ala Pro Pro Leu Ser Ala Pro Asn Tyr Pro

65 70 75 80

Thr Ile Ser Arg Pro Leu Ile Cys Arg Phe Gly Tyr Gln Met Asp Glu

85 90 95

Ser Asn Gln Cys Val Asp Val Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser His Gln

100 105 110

Cys Asn Pro Thr Gln Ile Cys Ile Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Thr Cys

115 120 125

Ser Cys Thr Asp Gly Tyr Trp Leu Leu Glu Gly Gln Cys Leu Asp Ile

130 135 140

Asp Glu Cys Arg Tyr Gly Tyr Cys Gln Gln Leu Cys Ala Asn Val Pro

145 150 155 160

Gly Ser Tyr Ser Cys Thr Cys Asn Pro Gly Phe Thr Leu Asn Glu Asp

165 170 175

Gly Arg Ser Cys Gln Asp Val Asn Glu Cys Ala Thr Glu Asn Pro Cys

180 185 190

Val Gln Thr Cys Val Asn Thr Tyr Gly Ser Phe Ile Cys Arg Cys Asp

195 200 205

Pro Gly Tyr Glu Leu Glu Glu Asp Gly Val His Cys Ser Asp Met Asp

210 215 220

Glu Cys Ser Phe Ser Glu Phe Leu Cys Gln His Glu Cys Val Asn Gln

225 230 235 240

Pro Gly Thr Tyr Phe Cys Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Ile Leu Leu Asp

245 250 255

Asp Asn Arg Ser Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Glu His Arg Asn His

260 265 270

Thr Cys Asn Leu Gln Gln Thr Cys Tyr Asn Leu Gln Gly Gly Phe Lys

275 280 285

Cys Ile Asp Pro Ile Arg Cys Glu Glu Pro Tyr Leu Arg Ile Ser Asp

290 295 300

Asn Arg Cys Met Cys Pro Ala Glu Asn Pro Gly Cys Arg Asp Gln Pro

305 310 315 320

Phe Thr Ile Leu Tyr Arg Asp Met Asp Val Val Ser Gly Arg Ser Val

325 330 335

Pro Ala Asp Ile Phe Gln Met Gln Ala Thr Thr Arg Tyr Pro Gly Ala

340 345 350

Tyr Tyr Ile Phe Gln Ile Lys Ser Gly Asn Glu Gly Arg Glu Phe Tyr

355 360 365

Met Arg Gln Thr Gly Pro Ile Ser Ala Thr Leu Val Met Thr Arg Pro

370 375 380

Ile Lys Gly Pro Arg Glu Ile Gln Leu Asp Leu Glu Met Ile Thr Val

385 390 395 400

Asn Thr Val Ile Asn Phe Arg Gly Ser Ser Val Ile Arg Leu Arg Ile

405 410 415

Tyr Val Ser Gln Tyr Pro Phe

420

＜210＞ 15

＜211＞ 1269

＜212＞ DNA

＜213＞ Homo sapiens

＜400＞ 15

cagtgcacga atggctttga cctggatcgc cagtcaggac agtgtttaga tattgatgaa 60

tgccgaacca tccccgaggc ctgccgagga gacatgatgt gtgttaacca aaatggcggg 120

tatttatgca ttccccggac aaaccctgtg tatcgagggc cctactcgaa cccctactcg 180

accccctact caggtccgta cccagcagct gccccaccac tctcagctcc aaactatccc 240

acgatctcca ggcctcttat atgccgcttt ggataccaga tggatgaaag caaccaatgt 300

gtggatgtgg acgagtgtgc aacagattcc caccagtgca accccaccca gatctgcatc 360

aatactgaag gcgggtacac ctgctcctgc accgacggat attggcttct ggaaggccag 420

tgcttagaca ttgatgaatg tcgctatggt tactgccagc agctctgtgc gaatgttcct 480

ggatcctatt cttgtacatg caaccctggt tttaccctca atgaggatgg aaggtcttgc 540

caagatgtga acgagtgtgc caccgagaac ccctgcgtgc aaacctgcgt caacacctac 600

ggctctttca tctgccgctg tgacccagga tatgaacttg aggaagatgg cgttcattgc 660

agtgatatgg acgagtgcag cttctctgag ttcctctgcc aacatgagtg tgtgaaccag 720

cccggcacat acttctgctc ctgccctcca ggctacatcc tgctggatga caaccgaagc 780

tgccaagaca tcaacgaatg tgagcacagg aaccacacgt gcaacctgca gcagacgtgc 840

tacaatttac aagggggctt caaatgcatc gaccccatcc gctgtgagga gccttatctg 900

aggatcagtg ataaccgctg tatgtgtcct gctgagaacc ctggctgcag agaccagccc 960

tttaccatct tgtaccggga catggacgtg gtgtcaggac gctccgttcc cgctgacatc 1020

ttccaaatgc aagccacgac ccgctaccct ggggcctatt acattttcca gatcaaatct 1080

gggaatgagg gcagagaatt ttacatgcgg caaacgggcc ccatcagtgc caccctggtg 1140

atgacacgcc ccatcaaagg gccccgggaa atccagctgg acttggaaat gatcactgtc 1200

aacactgtca tcaacttcag aggcagctcc gtgatccgac tgcggatata tgtgtcgcag 1260

tacccattc 1269

＜210＞ 16

＜211＞ 35

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence:Primer

＜400＞ 16

cgattgaatt ctagacctgc ctcgagnnnn nnnnn 35

＜210＞ 17

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Description of Artificial Sequence:mA55-R1 Primer

＜400＞ 17

cgtttgtgca ctgctgctgt gcattcc 27

26

현대 의학의 연구에서는 심장 혈관계의 질환은 죽음을 초래하는 원인이기 때문에, 심장 혈관 영역은 큰 관심을 끄는 분야이다. 심장 혈관 영역의 연구는 동맥 내막 재형성 및 동맥 리모델링에 관한 중요한 사실을 분명히 하고 있고, 쌍방 모두 동맥 경화에 있어서의 플라크 형성 및 혈관 협착에 기여한다고 생각되고 있다. 예컨대, 동맥 경화의 동물 모델에서의 혈관 손상을 주는 고콜레스테롤 혈증에 있어서 세포 레벨에서의 과정에는 3가지의 사상이 있다. 동맥벽의 병변을 형성하는 3요소는 a) 평활근 세포, 대식 세포 및 림프구의 증식, b) 결합 조직의 형성, c) 새롭게 형성된 결합 조직 매트릭스로의 지방 및 콜레스테롤의 축적이다. 이 3요소의 관여에 관한 정확한 순위 부여에는 논의가 필요하지만, 평활근 세포의 이상 분화, 탈분화, 증식이 구조적으로 혈관 장해에 기여하는 것은 분명하다. 또한, 평활근 세포의 이상 증식이 관여하는 또 하나의 중요한 조직학적 과정은 경피적 관동맥 형성술 후(Percutaneous Transuluminal Coronary Angioplasty)의 재협착이다.

혈관 형성에 있어서의 평활근이 구성하는 부분에 관한 분자를 단리하고, 상기와 같은 이상 평활근 세포의 증식을 제어하기 위해서 사용하는 것을 목적으로 하여 예의 노력했다.

종래, 어떤 특정한 폴리펩티드 또는 그것을 코드화하는 cDNA를 얻고자 하는 경우, 조직이나 세포 배양액 중에 목적으로 하는 생물 활성을 확인하고, 계속해서 폴리펩티드의 단리 정제를 거쳐 유전자를 클로닝한다고 하는 방법, 혹은 그 생물 활성을 지표로 하여 유전자를 발현 클로닝하는 방법이 일반적으로 이용되어 왔다.

그러나, 생체 내 생리 활성 폴리펩티드는 다양한 생물 활성을 가지고 있는 경우가 많기 때문에 어떤 하나의 활성을 지표로 하여 유전자를 클로닝한 결과, 그것이 이미 알려진 폴리펩티드와 동일한 것이 후에 와서 판명된다고 하는 사례가 증가하고 있다. 또한, 미량밖에 생산되지 않거나, 특별한 생리적 조건에서만 발현되는 인자도 많고, 그것이 단리, 정제 및 생물 활성의 확인을 곤란하게 하고 있다.

최근, cDNA의 제작 기술이나 시퀀스 기술은 급속히 발전하여 대량의 cDNA의 시퀀스를 신속히 행할 수 있게 되었다. 그래서 이들의 기술을 이용하여 여러 가지 세포나 조직으로부터 cDNA 라이브러리를 제작하고, 랜덤으로 cDNA를 클로닝하여 염기 배열을 결정하며, 신규인 폴리펩티드를 코드화하는 유전자를 단리하는 방법이 발전하고 있다. 이 방법은 생화학적, 유전학적인 해석을 일체 필요로 하지 않고서 유전자를 클로닝하고 그 염기 배열의 정보를 얻을 수 있다는 특징을 가지고 있지만, 목적으로 하는 유전자의 발견은 우발적 요소가 크다.

본 발명은 신규인 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 코드화하는 cDNA 및 그 용도에 관한 것이다.

도 1은 PDGF 자극에 의한 래트 대동맥 혈관 평활근 세포의 증식에 대하여 마우스 A55 단백이 억제하는 모습을 나타낸다.

도 2는 PDGF 자극에 의한 래트 대동맥 혈관 평활근 세포의 증식에 대하여 인간 A55 단백이 억제하는 모습을 나타낸다.

상세한 설명

본 발명은 실질적으로 순수한 형태인 배열 번호 1, 4, 6, 9, 11 또는 14로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드, 그 동족체, 그 배열의 단편 및 그 동족체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 이들의 폴리펩티드를 코드화하는 cDNA에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 배열 번호 2, 5, 7, 10, 12 또는 15로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 cDNA 및 배열 번호 2, 5, 7, 10, 12 또는 15로 표시되는 염기 배열에 선택적으로 하이브리다이즈하는 단편을 갖는 cDNA에 관한 것이다. 하이브리다이즈하는 cDNA에는 상기 배열의 상보 배열도 포함된다. 하이브리다이즈는 엄격한 조건에서 행해지는 것이 바람직하다.

실질적으로 순수한 형태인 배열번호 1, 4, 6, 9, 11 또는 14로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드란 일반적으로 생산시의 폴리펩티드의 90%이상. 예컨대, 95, 98 또는 99%가 배열 번호 1, 4, 6, 9, 11 또는 14로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드인 것을 의미한다.

배열 번호 1, 4, 6, 9, 11 또는 14로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드의 동족체란 일반적으로 적어도 20개, 바람직하게는 적어도 30개, 예컨대 40, 60 또는 100개의 연속한 아미노산 영역에서 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80 또는 90%, 보다 바람직하게는 95% 이상 상동성인 것으로 그러한 동족체는 이후 본 발명의 폴리펩티드로서 기재된다.

또한, 배열 번호 1, 4, 6, 9, 11 또는 14로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드의 단편, 또는 이들의 동족체의 단편이란 적어도 10아미노산, 바람직하게는 적어도 15아미노산, 예컨대 20, 25, 30, 40, 50 또는 60아미노산 부분을 의미한다.

배열 번호 2, 5, 7, 10, 12 또는 15로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 cDNA에 선택적으로 하이브리다이즈하는 cDNA란, 일반적으로 적어도 20개, 바람직하게는 적어도 30개, 예컨대 40, 60 또는 100개의 연속한 염기 배열 영역에서 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80 또는 90%, 보다 바람직하게는 95% 이상 상동성인 것으로, 그러한 cDNA는 이후 본 발명의 cDNA로서 기재된다.

배열 번호 2, 5, 7, 10, 12 또는 15로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 cDNA의 단편이란 적어도 10염기, 바람직하게는 적어도 15염기, 예컨대 20, 25, 30 또는 40염기 부분을 의미하고, 그러한 단편도 본 발명의 cDNA에 포함된다.

또한, 본 발명에는 본 발명의 cDNA로 이루어지는 복제 또는 발현 벡터가 포함된다. 벡터로서는 예컨대, ori 영역과, 필요에 따라 상기 cDNA의 발현을 위한 프로모터, 프로모터의 제어 인자 등으로 이루어지는 플러스미드, 바이러스 또는 파지 벡터를 들 수 있다. 벡터는 하나 또는 그 이상의 선택적 마커 유전자, 예컨대 암피실린 내성 유전자를 포함하고 있어도 좋다. 벡터는 생체내에 있어서, 예컨대 cDNA에 대응하는 RNA의 제조, 숙주 세포의 형질 전환에 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에는 배열 번호 2, 3, 5, 7, 8, 10, 12, 13 또는 15로 표시되는 염기 배열, 또는 이들의 오픈 리딩 프레임으로 이루어지는 cDNA를 포함하는 본 발명의 cDNA를 복제 또는 발현시키기 위한 벡터로 형질 전환된 숙주 세포도 포함된다. 세포로서는 예컨대 세균, 효모, 곤충 세포 또는 포유 동물 세포를 들 수 있다.

또한, 본 발명에는 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키기 위한 조건하에서, 본 발명의 숙주 세포를 배양함으로써 이루어지는 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법도 포함된다. 배양은 본 발명의 폴리펩티드가 발현되고, 숙주 세포에서 제조되는 조건하에서 행해지는 것이 바람직하다.

본 발명의 cDNA는 상기와 같은 벡터의 안티센스 영역에 삽입하는 것으로 안티센스 RNA를 제조할 수도 있다. 이러한 안티센스 RNA는 세포 중의 본 발명의 폴리펩티드의 레벨을 제어하는 것에 이용할 수도 있다.

본 발명은 본 발명에 있어서의 폴리펩티드의 모노크로날 또는 폴리크로날 항체도 포함한다. 또한 본 발명에 있어서의 폴리펩티드의 모노크로날 또는 폴리크로날 항체의 제조 방법도 포함한다. 모노크로날 항체는 본 발명의 벡터 또는, 그 단편을 항원으로서 이용하여 통상의 하이브리드마 기술에 의해 제조할 수 있다. 폴리크로날 항체는 숙주 동물(예컨대, 래트나 토끼 등)에 본 발명의 폴리펩티드를 접종하여 면역 혈청을 회수하는 통상의 방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명에는 본 발명의 폴리펩티드, 그 항체와 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체를 함유하는 약학적 조성물도 포함된다.

(1)의 본 발명의 폴리펩티드로서는 배열 번호 1, 4, 6, 9, 11 또는 14로 표시된 아미노산 배열로 이루어지는 것 이외에, 그 일부가 결손한 것(예컨대, 배열 번호 1중, 생물 활성의 발현에 필수적인 부분만으로 이루어지는 폴리펩티드 등), 그 일부가 다른 아미노산과 치환한 것(예컨대, 물성이 유사한 아미노산으로 치환한 것), 및 상기 본 발명의 폴리펩티드에 다른 아미노산이 부가 또는 삽입된 것도 포함된다.

잘 알려져 있는 바와 같이, 하나의 아미노산을 코드화하는 코돈은 1 내지 6종류(예컨대, Met는 1종류, Leu는 6종류) 알려져 있다. 따라서, 폴리펩티드의 아미노산 배열을 바꾸는 일없이 cDNA의 염기 배열을 바꿀 수 있다.

(2)로 특정되는 본 발명의 cDNA에는 (1)의 배열 번호 1, 4, 6, 9, 11 또는 14로 표시되는 폴리펩티드를 코드화하는 모든 염기 배열군이 포함된다. 염기 배열을 바꾸는 것에 따라 폴리펩티드의 생산성이 향상하는 경우가 있다.

(3)으로 특정되는 cDNA는 (2)로 표시되는 cDNA의 일형태이며, 천연형 배열을 나타낸다.

(4)로 표시되는 cDNA는 (3)으로 특정되는 cDNA에 천연의 비번역 부분을 더한 배열을 나타낸다.

배열 번호 3, 8 또는 13으로 표시되는 염기 배열을 갖는 cDNA의 제작은 이하의 방법에 따라서 행해진다.

처음에 효모 SST법(미국 특허 제5,536,637호에 기재)의 개요에 관해서 설명한다.

사카로마이세스·세레비제(Saccharomyces cerevisiae) 등의 효모가 자당 또는 라피노오스를 에너지원이나 탄소원으로서 이용하기 위해서는 인베르타아제를 배지 중에 분비해야 한다(인베르타아제는 라피노오스를 자당과 멜리비오스로, 자당을 프룩토오스와 글루코오스로 분해하는 효소임). 또한 수많은 이미 알려진 포유류의 시그널 펩티드는 효모의 인베르타아제를 분비시킬 수 있는 것으로 알려져 있다.

이들로부터, 효모의 인베르타아제의 분비를 가능하게 하는 신규의 시그널 펩티드를 포유류의 cDNA 라이브러리부터 라피노오스 배지 상에서의 효모의 생육을 지표에 스크리닝하는 방법으로서 본 방법은 개발되었다.

번역 개시점 ATG를 삭제한 비분비형의 인베르타아제 유전자 SUC2 (GENBANK accession No. V01311)를 효모의 발현 벡터에 내장하여 효모 SST용 벡터 pSUC2를 제작했다.

발현 벡터에는 AAH5 플러스미드(Gammerer, Methods in Enzymol. 101, 192-201, 1983) 유래의 발현용 프로모터(ADH 프로모터) 및 터미네이터(ADH 터미네이터)가 내장되고, 효모 복제 기점으로서는 2 μ ori, 효모 선택 마커에는 TRP1, 대장균 복제 기점으로서는 ColEl ori, 대장균 약제 내성 마커에는 암피실린 내성 유전자가 각각 내장되어 있다.

그 SUC2 유전자의 상류에 포유류의 cDNA를 내장하여 효모 SST cDNA 라이브러리를 조제했다. 이 라이브러리를 분비형 인베르타아제를 결손하고 있는 효모로 형질 전환했다. 내장된 포유류 cDNA가 시그널 펩티드를 코드하고 있는 경우, 효모에서 발현된 인베르타아제에 대해서도 분비 작용을 가진다고 생각되고, 그 결과 라피노오스 배지 상에서의 생육이 가능해진다.

따라서, 출현한 콜로니로부터 효모를 배양하여 플러스미드를 조제하고, 삽입물 cDNA의 염기 배열을 결정함으로써 신규 시그널 펩티드의 검색을 신속하고 또한 쉽게 했다.

효모 SST cDNA 라이브러리의 제작은

(1) 대상이 되는 세포에서 mRNA를 단리하고, 특정한 제한 효소(효소 Ⅰ) 사이트를 연결한 랜덤 프라이머를 이용하여 이중쇄 cDNA를 합성하며,

(2) 효소 Ⅰ과는 다른 특정한 제한 효소(효소 Ⅱ) 사이트를 포함하는 어댑터를 연결하여 효소 Ⅰ에서 소화한 뒤 적당한 사이즈로 분획하고,

(3) 효모 발현 벡터 내의 시그널 펩티드를 삭제한 인베르타아제 유전자의 상류에 얻어진 cDNA 단편을 연결하여 형질 전환하는 공정으로 이루어진다.

각 공정을 자세히 설명하면, 공정 (1)에서는 대상이 되는 포유류의 장기나 세포주 등에서 필요에 따라 적당한 자극제로 자극한 후, 공지의 방법(이하, 공지의 방법은 특별히 기재가 없으면 Molecular Cloning(Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. 저, Cold Spring Harbor Laboratory Press에서 1989년에 발간) 또는 Current Protocol Molecular Biology(F. M. Ausubel 등 편, John Wiley ＆ Sons, Inc. 에서 발간)에 기재의 방법에 따라서 행해짐)에 따라서 mRNA의 단리가 행해진다.

대상이 되는 조직으로서는, 마우스 태아 심장을 들 수 있다. 랜덤 프라이머를 이용하는 이중쇄 cDNA의 합성은 공지의 방법에 의해 행해진다.

어댑터에 연결되는 제한 효소(효소 Ⅰ) 사이트와 다음 공정 (2)에서 이용되는 제한 효소(효소 Ⅱ) 사이트는 서로 다른 것이라면 무엇을 이용해도 좋다. 바람직하게는 효소 Ⅰ로서 XhoI, 효소 Ⅱ로서는 EcoRI가 이용된다.

공정 (2)에서는 T4DNA 폴리머라제로 말단을 평활화하고 효소 Ⅱ 어댑터를 연결한 후, 효소 Ⅰ로 소화하여 아가로스 전기 영동(AGE)에 의해 300 내지 800 bp의 cDNA를 분획한다. 효소 Ⅱ는 상기한 바와 같이 효소 Ⅰ과 다른 것이라면 무엇이라도 좋다.

공정 (3)은 효모 발현용 플러스미드 벡터에 연결된 시그널 펩티드를 삭제한 인베르타아제의 유전자의 상류 (2)에서 얻어진 cDNA 단편을 내장하여 대장균으로 형질 전환하는 공정이다. 여기서 효모 발현용 플러스미드 벡터로서는 여러 가지의 것이 알려져 있지만, 예컨대, 대장균 내에서도 기능하는 YEp24 등이 이용되지만 적합하게는 전술한 플러스미드 pSUC2가 이용된다.

형질 전환을 위한 숙주 대장균주는 이미 많은 것이 알려져 있고, 바람직하게는 DH10B의 경쟁 셀이다. 또한 형질 전환 방법은 공지의 방법의 어느 것을 이용해도 좋지만, 바람직하게는 엘렉트로폴레이션법에 의해 행해진다. 형질 전환체는 공지의 방법에 의해 배양되어 효모 SST용의 cDNA 라이브러리를 얻을 수 있다.

이 cDNA 라이브러리에서는 모든 클론에 cDNA 단편이 도입되어 있는 것은 아니고, 또한 모두가 미지의 시그널 펩티드를 코드화하는 유전자 단편이라고는 한정하지 않는다. 그래서, 다음에 상기 라이브러리로부터 미지의 시그널 펩티드를 코드화하는 유전자 단편을 스크리닝할 필요가 있다.

그것을 위해서는, cDNA 라이브러리를 인베르타아제 유전자를 갖지 않는 효모 사카로마이세스 세레비제(예컨대 YT455주 등) 또는 인베르타아제 유전자를 인위적으로 결손시킨 주(공지의 방법에 따라 제작 가능)에 상기 cDNA 라이브러리를 도입하고 시그널 펩티드를 코드화하는 배열을 갖는 단편의 스크리닝을 행한다.

효모의 형질 전환은 공지의 방법, 예컨대 초산 리튬법에 의해서 행해진다. 형질 전환체를 선택 배지에서 생육 후, 라피노오스를 탄소원으로 하는 배지에 옮기고 생육 가능한 콜로니를 선택하여 플러스미드를 회수한다. 라피노오스를 탄소원으로 하여 효모가 생육했다는 것은 라이브러리 중에 무언가 분비 단백질의 시그널 펩티드가 내장되어 있었던 것을 나타내고 있다.

다음에, 단리한 양성 클론에 관해서 염기 배열을 결정하여 미지의 단백질을 코드화하는 것이 분명해진 cDNA에 관해서는, 그것을 프로브로 하여 전장 클론을 단리하고 전장의 염기 배열을 결정할 수 있다. 이들의 조작은 당업자에 있어서 모두 공지의 방법으로 행해진다.

배열 번호 2, 5, 7, 10, 12 또는 15로 표시되는 염기 배열이 일부, 바람직하게는 모두가 확정되면 포유류에 존재하는 본 발명의 단백질을 코드화하는 cDNA 혹은 본 발명 단백질의 동족체 및 서브셋트를 코드화하는 cDNA를 얻을 수 있다.

적당한 염기 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성하고 그것을 이용하여 포유류 유래의 cDNA 라이브러리 혹은 mRNA에서 PCR법에 의해, 혹은 적당한 염기 배열의 단편을 프로브로서 하이브리다이즈시킴으로써 다른 포유류 cDNA 라이브러리 혹은 상기 게놈 라이브러리로부터 다른 포유류형의 해당 단백질을 코드화하는 cDNA를 얻을 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 cDNA가 SST에서 얻어진 cDNA 단편의 염기 배열(또는 그 상동 배열)을 포함하고 있으면 시그널 펩티드를 코드화하고 있는 것이 되기 때문에 상기 cDNA가 전장, 또는 거의 전장인 것은 분명하다(시그널 펩티드는 예외없이 단백질의 N 말단에 존재함으로써 cDNA의 오픈 리딩 프레임의 5＇ 말단에 코드화되어 있음).

또한 공지의 방법에 따라서, 상기 cDNA를 프로브로 하여 노던(Northern) 해석에 의해서 전장의 확인을 해도 좋다. 하이브리다이즈한 밴드로부터 얻어지는 mRNA의 사이즈와 상기 cDNA의 사이즈를 비교하여 거의 동일하면 상기 cDNA는 거의 전장이라고 생각된다.

본 발명은 개시된 단백의 전장형 및 성숙형의 양방을 제공한다. 이들 단백의 전장형은 배열 번호 2, 7 또는 12로 표시되는 염기 배열의 번역되는 아미노산 배열로 확인된다. 이들의 성숙 단백은 배열 번호 3, 8 또는 13으로 표시되는 전장 DNA를 적당한 포유류의 세포 혹은 그 밖의 숙주 세포로 발현시킴에 따라 얻어진다. 성숙형의 단백의 배열은 전장형의 아미노산 배열에서 예측 가능하다.

배열 번호 2, 5, 7, 10, 12 또는 15로 표시되는 염기 배열이 일단 확정되면, 그 후는 화학 합성에 의해서, 혹은 상기 염기 배열의 단편을 화학 합성하여 이것을 프로브로서 하이브리다이즈시킴으로써 본 발명의 cDNA를 얻을 수 있다.

또한, 본 cDNA를 함유하는 벡터 cDNA를 적당한 숙주에 도입하고, 이것을 증식시킴에 따라 목적으로 하는 cDNA를 필요량 얻을 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 취득하는 방법으로서는,

(1) 생체 또는 배양 세포로부터 정제 단리하는 방법,

(2) 펩티드 합성하는 방법, 또는

(3) 유전자 재조합 기술을 이용하여 생산하는 방법,

등을 들 수 있지만, 공업적으로는 (3)에 기재한 방법이 바람직하다.

유전자 재조합 기술을 이용하여 폴리펩티드를 생산하기 위한 발현계(숙주-벡터계)로서는 예컨대, 세균, 효모, 곤충 세포 및 포유 동물 세포의 발현계를 들 수 있다.

예컨대, 대장균으로 발현시키는 경우에는 성숙 단백 부분을 코드화하는 cDN A의 5＇말단에 개시 코돈(ATG)를 부가하고, 얻어진 cDNA를 적당한 프로모터(예컨대, trp프로모터, lac프로모터, λPL프로모터, T7프로모터 등)의 하류에 접속하며, 대장균 내에서 기능하는 벡터(예컨대, pBR322, pUC18, pUC19 등)에 삽입하여 발현 벡터를 제작한다.

다음에, 이 발현 벡터로 형질 전환한 대장균(예컨대, E. Coli DH1, E. Coli JM109, E. Coli HB101주 등)을 적당한 배지에서 배양하여 그 균체에서 목적으로 하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 또한, 박테리아의 시그널 펩티드(예컨대, pelB의 시그널 펩티드)를 이용하면 페리플라즘 중에 목적으로 하는 폴리펩티드를 분비할 수도 있다. 또한, 다른 폴리펩티드와의 융합 단백질을 생산할 수도 있다.

또한, 포유 동물 세포로 발현시키는 경우에는, 예컨대, 배열 번호 2, 5, 7, 10, 12 또는 15로 표시되는 염기 배열을 적당한 벡터(예컨대, 레트로 바이러스 벡터, 파피로마 바이러스 벡터, 왁찌니어 바이러스 벡터, SV40계 벡터 등) 중의 적당한 프로모터(예컨대, SV40 프로모터, LTR 프로모터, 메탈로티오네인프로모터 등)의 하류에 삽입하여 발현 벡터를 제작한다. 다음에, 얻어진 발현 벡터에서 적당한 포유 동물 세포(예컨대, 원숭이 COS-1세포, COS-7세포, 중국 햄스터 CHO세포, 마우스 L세포 등)를 형질 전환하고 형질 전환체를 적당한 배지에서 배양함으로써, 분비 단백인 본 발명의 단백은 그 세포 상청 중에 목적으로 하는 폴리펩티드로서 발현된다. 또한, 그 밖의 폴리펩티드, 예컨대 항체의 정상 영역(Fc portion)을 코드화하는 cDNA 단편과 연결함으로써 융합 단백질을 생산할 수도 있다. 이상과 같이 하여 얻어진 폴리펩티드는 일반적인 생화학적 방법에 의해서 단리 정제할 수 있다.

발명의 개시

본 발명자들은 평활근 세포의 이상 증식에 관한 질환의 치료, 진단, 혹은 연구상 유익한 신규인 인자(폴리펩티드), 특히 분비 시그널을 갖는 분비 단백질 및 막 단백질에 착안하여 그것을 발견하도록 예의 검토를 행했다.

본 발명자들은 지금까지 조혈계나 면역계에서 작용하는 증식 분화 인자의 유전자의 클로닝을 연구해왔다. 그리고, 증식 분화 인자(예컨대, 각종 시토킨 등)와 같은 분비 단백질이나 그 리셉터와 같은 막 단백질(이하, 이들을 통합하여 분비 단백질 등이라고 함)의 대부분이 그 N 말단에 시그널 펩티드라고 불리는 배열을 가지고 있는 것에 착안하여, 시그널 펩티드를 코드화하는 유전자를 효율적이고 또한 선택적으로 클로닝하는 방법을 예의 검토했다. 그 결과, 동물 세포를 이용하여 시그널 펩티드를 코드화하는 배열을 갖는 cDNA를 간단히 선별할 수 있는 방법(시그널 시퀀스 트랩(SST)법)을 발견하였다(일본 특허 공개 공보 평6-315380호 참조).

또한 동일한 개념 하에 효모를 이용하여 더욱 효율적이고 또한 간편하게 시그널 펩티드를 코드화하는 유전자를 단리하는 방법(효모 SST법)도 개발되었다.(미국 특허 제5,536,637호 참조).

본 방법을 이용하여 마우스 태아 심장 조직 및 인간 신장 조직이 생산하고 있는 신규인 분비 단백질 및 그것을 코드화하는 cDNA를 확인하는 것에 성공하고, 전장 cDNA를 그 정보를 기초로 마우스 태아 심장 조직 및 인간 뇌 조직에서 발견하며, 또한 상기 폴리펩티드가 혈관 평활근 세포의 증식을 억제하는 효과를 갖는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명이 제공하는 cDNA 배열은 마우스 A55 클론이라고 명명되고, 마우스 태아 심장 조직으로부터 제작한 cDNA 라이브러리에서 상기 효모 SST법을 사용하여 얻은 정보를 바탕으로 단리되었다. 마우스 A55 클론은 분비 단백질(여기서는 마우스 A55 단백으로서 나타남)을 코드화하는 완전한 cDNA 배열을 포함하는 전장쇄 cDNA이다.

본 발명이 제공하는 cDNA 배열은 인간 A55 클론이라고 명명되고, 상기 효모 SST법을 사용하여 인간 신장 조직에서 얻은 정보를 바탕으로 인간 뇌 조직으로부터 제작한 cDNA 라이브러리에서 발견되었다. 인간 A55 클론은 분비 단백질(여기서는 인간 A55 단백으로서 나타남)을 코드화하는 완전한 cDNA 배열을 포함하는 전장쇄 cDNA이다.

핵산 배열 데이터베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 핵산 배열에 대하여 BLASTN 및 FASTA에 의해, 또한 아미노산 배열 데이터베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 폴리펩티드의 아미노산 배열에 대하여 BLASTX, BLASTP 및 FASTA에 의해 검색한 결과 본 발명의 폴리펩티드 마우스 및 인간 A55 및 이들을 코드화하는 핵산 배열과 일치하는 배열은 없었다. 이로부터 본 발명의 폴리펩티드는 신규의 분비 단백질인 것이 판명되었다.

또한, 본 발명자들은 상기 폴리펩티드가 혈관 평활근 세포의 증식을 억제하는 효과를 갖는 것을 확인했다. 그 때문에 상기 폴리펩티드는 이상 평활근의 증식에 관한 질환, 예컨대 동맥 경화나 경피적 관동맥 형성술(PTCA) 후의 재협착을 초래하는 혈관 내막 비후(肥厚), 근종 등의 치료에 유용하다고 생각된다.

본 발명은

(1) 배열 번호 1, 4, 6, 9, 11 또는 14로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드,

(2) 상기 (1)에 기재한 폴리펩티드를 코드화하는 cDNA,

(3) 배열 번호 2, 5, 7, 10, 12 또는 15로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 cDNA,

(4) 배열 번호 3, 8 또는 13으로 표시되는 염기 배열로 이루어지는 cDNA

에 관한 것이다.

이하에 본 발명의 A55 클론에 관한 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1 : poly(A)⁺RNA의 조제

마우스 18.5일 태아 심장 조직에서 TRIzol시약(TRIzol reagent, 등록 상표, GIBCOBRL에서 구입)을 이용하여 모든 RNA를 추출하고, mRNA 퓨리피케이션·키트(mRNA Purification Kit, 상품명, Pharmacia에서 구입)를 이용하여 poly(A)⁺RNA를 정제했다.

실시예 2 : 효모 SST cDNA 라이브러리의 제작

상기한 poly(A)⁺RNA를 주형에 XhoI부위를 연결한 랜덤 9 mer : 5'-CGAT TGAATTCTAGACCTGCCTCGAGNNNNNNNNN-3'(배열 번호 16)를 프라이머로 하고, 수퍼스크립트·플러스미드·시스템(SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning, 상품명, GIBCOBRL에서 구입)을 이용하여 이중쇄 cDNA의 합성을 행했다. EcoRI어댑터(GIBCOBRL에서 구입)를 DNA 라이게이션 키트(DNA ligation kit ver.2, 상품명, 다까라주조(주)에서 구입. 이하 cDNA의 연결은 모두 이 키트를 사용했음)를 이용하여 연결한 후, XhoI로 소화하고 아가로스 전기 영동으로 300 내지 800 bp의 cDNA를 추출하여 분획하며, pSUC2(미국 특허 5,536,637호 참조)의 EcoRI/NotI부위에 연결하고, 대장균 DH10B주에 엘렉트로폴레이션법으로 형질 전환하여 효모 SST용의 cDNA 라이브러리를 얻었다.

실시예 3 : SST에 의한 스크리닝 및 SST 양성 클론의 염기 배열의 결정

이 cDNA 라이브러리의 플러스미드를 조제하고, 초산 리튬법(Current Protocols In Molecular Biology 13. 7. 1을 참조)에 의해 효모YTK 12주를 형질 전환하며, 트립토판(Trp)을 함유하지 않은 효모 형질 전환체의 선택 배지(CMD-Trp 배지)의 플레이트 상에 놓았다. 30℃에서 48시간 인큐베이트한 후, 아큐트란·레플리카·플레이터(Accutran Replica Plater, 상품명, Schleicher ＆ Schuell에서 구입)를 이용하여 얻어진 콜로니(형질 전환체)의 복제를 라피노오스를 탄소원으로 하는 YPR 플레이트에 취하여 30℃에서 14일간 인큐베이트했다. 3일째 이후, 출현해온 각각의 콜로니를 하나씩 재차 YPR 플레이트에 스트리크하여 30℃에서 48시간 인큐베이트한 후, 싱글 콜로니를 YPD 배지에 식균하여 30℃에서 48시간 인큐베이트한 후 플러스미드를 조제했다. 계속해서 pSUC2의 클로닝 사이트의 양단 배열의 두 가지 프라이머(센스쇄는 비오틴화 프라이머)를 이용하여 공지의 방법에 따라서 PCR을 행하고, 삽입물 cDNA를 증폭한 후 다이나비드(Dynabeads, 상품명, DYNAL에서 구입)를 이용하여 비오틴화 단일쇄 cDNA를 정제하여 염기 배열의 결정을 행했다.

염기 배열의 결정은 DNA 시퀀싱·키트(DMA Sequensing kit(Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction), 상품명, Applied Biosystems Inc.에서 구입)를 이용한 형광 다이터미네이터 사이클 시퀀스법으로 반응을 행하고, 자동 DNA 시퀀서 373(Applied Biosystems Inc)으로 판독을 행했다(이하, 염기 배열 결정은 모두 이 방법으로 행함).

얻어진 염기 배열 및 추정되는 아미노산배열에 관해서 데이터베이스와의 상동성 검색을 행하고, A55라고 명명된 클론이 데이터베이스에 등록되어 있지 않은 신규의 cDNA인 것이 분명해졌다. 그래서 이 A55 클론의 단편 cDNA(이하, A55 SST 단편 cDNA라고 함)에 관해서 전장 cDNA의 클로닝을 시도했다. 또한 추정되는 아미노산 배열을 이미 알려진 시그널 펩티드와 비교함으로써 A55 SST 단편 cDNA가 기능적 또한 구조적으로도 시그널 펩티드를 갖는 것을 확인했다.

실시예 4 : 전장 cDNA의 클로닝 및 모든 염기 배열의 결정

마우스 13일 태아 심장 CDNA 라이브러리(Uni-ZAPXR)(Stratagen에서 구입)의 파지 입자를 대장균 XL1-Blue MRF*주에 감염시켜 얻어진 100만 플라크를 나일론멤브렌에 트랜스퍼했다.³²P 표식한 마우스 A55 SST 단편 cDNA를 프로브로 하여 플라크 하이브리다이제이션을 행하고 다수의 양성 플라크를 얻었다.

그 중 1플라크로부터 파지를 조제하고, 엑스어시스트·핼퍼·파지(ExAssist helper phage, Stratagene에서 구입)와 함께 대장균 XL1-Blue MRF*주(Stratagene에서 구입)에 감염시켜 파지미드(pBluescript SK(-))로 변환했다. 파지미드를 대장균 DH5a주에 감염시킨 후 형질 전환체에서 플러스미드를 조제했다. 처음에 5'측의 염기 배열을 결정하여 마우스 A55 SST 단편 cDNA의 염기 배열이 존재하는 것을 확인한 후 모든 염기 배열을 결정하여 배열 번호 3에 나타내는 배열을 얻었다.

또한, 오픈 리딩 프레임을 결정하고, 배열 번호 2에 나타내는 아미노산 번역 영역 및 배열 번호 1에 나타내는 추정 아미노산 배열을 얻었다. 본 폴리펩티드의 성숙 단백은 배열 번호 3에 표시되는(배열 번호 3의 아미노산 배열 144 내지 1418 사이의 영역) 425아미노산, 또는 배열 번호 4에 표시되는 423아미노산이라고 추정된다. 배열 번호 5는 배열 번호 4의 폴리펩티드의 번역 영역을 나타낸다.

핵산 배열 데이터베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 핵산 배열에 대하여 BLASTN 및 FASTA에 의해, 또한 아미노산 배열 데이터베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 폴리펩티드의 아미노산 배열에 대하여 BLASTX, BLASTP 및 FASTA에 의해 검색한 결과, 본 발명의 폴리펩티드(마우스 A55 폴리펩티드라고 함) 및 그것을 코드화하는 핵산 배열과 일치하는 배열은 없었다.

또한 얻어진 아미노산 배열의 소수성 플롯에 의한 해석으로부터 본 발명의 마우스 A55폴리펩티드는 막 관통 영역을 갖지 않는 것도 분명해지고, 본 발명의 마우스 A55폴리펩티드는 신규의 분비 단백질인 것이 판명되었다.

그러나, 모티브 검색의 결과로부터, A55는 6개소의 EGF 모양 도메인을 갖는 것이 판명되었다. 이 결과에 기초하여 클론 A55는 적어도 EGF 패밀리와 마찬가지인 활성을 유지할 것으로 기대된다. 또한 BLASTX, BLASTP 및 FASTA는 마우스 A55 클론(배열 번호 1의 아미노산 배열 1 내지 448 사이의 영역)과 인간 S1-5(Swiss Prot Accession HSU03877)의 아미노산 배열 1 내지 387 사이의 영역) 사이에 유사한 상동성이 있는 것을 나타내었다. 인간 S 1-5는 섬유아 세포에서 증식 억제 시기에 발현이 유도되는 분비 단백으로 세포 증식에 관련된 활성을 갖는 것이 보고되어 있다(Beata Lecka-Czemik et. al. Mo1. Cel1. Biol. 15120-128 1995). 또한 그 밖의 EGF 모양 도메인을 갖는 많은 단백 모두 상동성을 나타내었다.

실시예 5 : 마우스 A55 단백 아이소폼 유전자의 단리

전사 개시점을 결정하기 위해서 마라톤 cDNA 앰플리케이션 키트(Marathon cDNA Amplification Kit, 상품명, Clontech사에서 구입)에 의한 5＇RACE(Rapid Amplification of cDNA End)법을 이용하여 5'말단 cDNA의 클로닝을 행했다. 주형 이중쇄 cDNA의 조제에는 마우스 태아 심장 조직의 poly(A)⁺RNA에서 제작했다.

전장의 염기 배열의 정보에 기초하여 프라이머 mA55-R1 : 5＇-CGTTTGTGCACTGCTGCTGTGCATTCC-3'(배열 번호 17)를 제작하고, 상기 키트에 첨부된 어댑터 프라이머로 PCR을 행했다. 증폭된 cDNA를 아가로스 전기 영동으로 분획 후, pGEM-T Vector(상품명, Promega에서 구입)에 연결하고, 대장균 DH5α로 형질 전환하여 플러스미드를 조제하며 모든 염기 배열을 결정했다. 그 결과, 배열 번호 3으로 표시된 번역 개시점 ATG를 포함하는 5＇말단 배열과 다른 5'말단 배열을 갖는 클론을 발견하였다(배열 번호 7 및 8).

염색체 유전자의 해석으로부터, 배열 번호 8로 표시된 클론은 배열 3으로 표시된 클론의 엑손 1부분이 약 400 염기 하류에 존재하는 별도의 엑손을 이용하고 있고 선택적 스플라이싱에 의해서 생긴 클론인 것이 판명되었다. 그 결과 상기 클론은 배열 번호 1로 표시된 N 말단의 6아미노산이 19아미노산으로 치환된 이소형 단백(배열 번호 6에 나타냄)을 코드화하는 것이 판명되었다.

본 폴리펩티드의 성숙 단백은 배열 번호 8에 표시되는(배열 번호 8의 아미노산 배열 340 내지 1614 사이의 영역) 425 아미노산 또는, 배열 번호 9에 표시되는 423 아미노산이라고 추정된다. 배열 번호 10은 배열 번호 9의 폴리펩티드의 번역 영역을 나타낸다.

실시예 6 : 인간 A55 유전자의 염기 배열의 결정

실시예 4의 상동성 검색의 과정에서, 본 발명자들은 마우스 A55의 염기 배열의 5＇말단과 상동성을 갖는 인간 EST 배열(GENBANK Accession H17726)을 발견했다.

그래서, 본 발명자들은 GENBANK Accession H17726에 기재된 염기 배열을 갖는 인간 뇌 cDNA 라이브러리 유래의 클론(C1one ID 50483)을 아메리칸 타입·컬쳐컬렉션(ATCC)에서 입수하여 마우스 A55와 마찬가지의 방법으로 모든 염기 배열을 결정했다. 그 결과, 배열 번호 13에 나타내는 염기 배열을 얻은 후, 다시 오픈 리딩 프레임을 결정하여 배열 번호 12에 나타내는 아미노산 번역 영역 및 배열 번호 11에 나타내는 추정 아미노산 배열을 얻었다.

이상으로부터, 상기 인간 클론은 전장인 것, 및 마우스 A55에 대하여 DNA (아미노산 번역 영역) 레벨에서 89.3%, 아미노산 레벨에서 94.2% 일치하고 있는 것이 판명되어 마우스 A55에 대한 인간 카운터 파트인 것이 시사되었다(이하, 상기 인간 클론을 인간 A55라고 함). 본 폴리펩티드의 성숙 단백은 배열 번호 13에 표시되는(배열 번호 13의 아미노산 배열 238 내지 1512 사이의 영역) 425 아미노산, 또는 배열 번호 14에 표시되는 423 아미노산이라고 추정된다. 배열 번호 15는 배열 번호14의 폴리펩티드의 번역 영역을 나타낸다.

이 인간 A55에 관해서도 핵산 배열 데이터베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 핵산 배열에 대하여 BLASTN 및 FASTA에 의해, 또한 아미노산 배열 데이터베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 폴리펩티드의 아미노산 배열에 대하여 BLASTX, BLASTP 및 FASTA에 의해 검색했지만, 마우스 A55와 마찬가지로 일치하는 배열은 없었다. 이로부터, 본 발명의 폴리펩티드도 신규의 분비 단백질인 것이 판명되었다.

실시예 7 : 포유 동물 세포를 이용한 마우스 A55 단백의 발현

배열 번호 3으로 표시된 마우스 전장 cDNA를 포유 동물 세포용 발현 벡터 pNotS(Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19,4485-4490(1991) 참조)에 연결하고, 마우스 A55 단백 발현용 플러스미드 pNotS-mA55를 구축했다. pNotS 및 pNotS -mA55를 리포펙틴(상품명, GIBCOBRL에서 구입)을 이용하여 293T세포(ATCC CRL-1573 293세포에 SV40T 항원을 도입한 세포주)에 도입하고, 19 시간 후에³⁵S-메티오닌(Met)을 첨가한 Met 프리의 배지로 교환하여 30분간 라벨한 후, Met를 포함하는 배지에서 5시간 배양을 행했다. 세포 상청을 회수 후, 센트리콘-10(상품명, Amicon에서 구입)으로 약 10배로 농축하여 SDS-PAGE를 행했다. 아크릴아미드겔을 건조시킨 후,³⁵S로 라벨된 단백질의 발현을 BAS2000(후지 필름)을 이용하여 검출했다.

그 결과 pNotS-mA55를 도입한 293T세포의 배양 상청에는 발현 벡터 pNotS만을 도입한 293T세포의 배양 상청에는 인정되지 않는 밴드가 60 내지 70 kDa 부근에 검출되었다. 이것에서 재조합 마우스 A55 단백이 발현되어 배양 상청 중에 분비하고 있는 것이 확인되었다.

이 마우스 A55 재조합 단백의 분자량은 아미노산 조성으로부터 계산되는 마우스 A55의 분자량 48 kDa보다도 크고, 마우스 A55 단백에는 2개소의 N형 당부가 부위와 O형 당쇄가 부가할 수 있는 Ser 및 Thr 잔기가 다수 존재함으로써 N형 및 O형 당쇄가 부가되어 있을 것으로 예상되었다.

실시예 8 : 마우스 A55 단백에 의한 래트 혈관 평활근 세포 증식 저해 작용의 측정

신생 화학 실험 강좌 10「혈관 내피와 평활근」(일본 생화학회 편)에 기재의 방법에 따라 래트의 심장으로부터 횡격막에 이르는 대동맥에서 혈관 평활근 세포를 단리하여 초대 배양을 행했다.

인간 PDGF-BB(GENZYME사 제조) 1, 3 또는 10 ng/ml과 동시에, 실시예 7의 방법으로 pNotS 또는 pNotS-mA55를 도입한 293T세포의 배양 상청을 모든 배지량의 10%가 되도록 첨가하고, 세포 증식 ELISA, BrdU 발색 키트(상품명, 베링거만하임에서 구입)의 방법에 따라서 혈관 평활근 세포의 BrdU의 혼합을 측정했다.

그 결과, 도 1에 도시한 바와 같이, 래트 혈관 평활근 세포는 pNotS만을 도입한 293T세포의 배양 상청을 첨가한 경우는 무첨가의 경우와 비교하여 무영향이었지만, pNotS-mA55를 도입한 293T세포의 배양 상청을 첨가한 경우는 유의인 BrdU의 혼합 억제가 인정되었다.

또한 PDGF를 1, 3, 10 ng/ml의 농도로 첨가하여 농도 의존적으로 래트 혈관 평활근 세포에 있어서의 BrdU의 혼합을 상승시킨 경우에 있어서도, pNotS만을 도입한 293T세포의 배양 상청을 동시에 첨가한 경우는 무첨가의 경우와 비교하여 무영향이었지만, pNotS-mA55을 도입한 293T세포의 배양 상청을 첨가한 경우에는 유의인 BrdU의 혼합 억제가 인정되었다(도 1 참조).

이로부터, 재조합 마우스 A55 단백은 혈관 평활근 세포에 대하여 증식 억제 활성을 갖는 것이 분명해졌다.

실시예 9 : 포유 동물 세포를 이용한 인간 A55 단백의 발현

배열 번호 13으로 표시된 인간 전장 cDNA를 포유 동물 세포용 발현 벡터 pNotS(kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490(1991)참조)의 하류에 연결하여 인간 A55 단백 발현용 플러스미드 pNotS-hA55를 구축했다. pNotS 및 pNotS -hA55를 리포펙틴(상품명, GIBCOBRL에서 구입)을 이용하여 Cos1세포에 도입하고, 24시간 후에 Met 프리의 배지로 교환한 후,³⁵S-Met,³⁵S-Cys를 첨가하여 5시간 배양을 행했다. 세포 상청을 회수 후, 센트리콘-10(상품명, Amicon에서 구입)으로 약 10배로 농축하여 SDS-PAGE를 행했다. 아크릴아미드겔을 건조시킨 후,³⁵S로 라벨된 단백질의 발현을 BAS2000(후지 필름)을 이용하여 검출했다.

그 결과, pNotS-hA55를 도입한 Cos1세포의 배양 상청에는 발현 벡터만을 도입한 Cos1세포의 배양 상청에는 인정되지 않는 밴드가 60 내지 70 kDa 부근에 검출되었다. 이로부터 재조합 인간 A55 단백이 발현되어 배양 상청 중에 분비하고 있는 것이 확인되었다. 또한 마우스 A55와 마찬가지로 인간 A55 단백도 당쇄가 부가되어 있을 것으로 예상되었다.

실시예 10 : 인간 A55 단백에 의한 래트 혈관 평활근 세포주 증식 저해 작용의 측정

배열 번호 13의 238번째에서 1515번째의 DNA 및 배열 번호 15로 표시된 cDNA에 스톱코돈를 부가한 DNA를 각각, 꿀벌의 멜라틴의 시그널 펩티드에 계속해서 6개의 히스티딘 잔기가 연속한 태그 배열 및 엔테로키나아제 절단 배열을 코드화하는 DNA의 3＇하류에 연결하여, 포유 동물 세포용 발현 벡터 pNotS의 프로모터의 하류에 삽입하고 인간 A55 단백 발현용 플러스미드를 구축했다. 발현 벡터만을 및 인간 A55 단백 발현용 벡터를 리포펙틴(상품명, GIBCOBRL에서 구입)을 이용하여 Cos1세포에 도입하고, 세포 상청을 회수 후, 엔테로키나아제로 소화하여 니켈컬럼으로 절단된 링커 배열을 제거했다. 또한 센트리콘10(상품명, Amicon에서 구입)으로 원래의 배양 상청에 대하여 약 10배로 농축했다.

래트 혈관 평활근 세포주(ATCC CRL-144)를 96구멍 플레이트에 놓고 10% 혈청 존재 하에서 24시간 배양한 후, 각종 농도(1, 10 또는 50 ng/ml)의 인간 PDGF-BB(GENZYME사 제조)를 포함하는 무혈청 배지로 교환하여 24시간 인큐베이트했다. 그 때 동시에 상기한 방법으로 처리한 발현 벡터만을 또는 인간 A55 단백 발현용 벡터를 도입한 Cos1세포의 배양 상청을 배지량의 10%가 되도록 첨가했다. 24시간 배양 후에³H-티미딘 0.5 mCi/구멍을 첨가하여 4시간 배양 후에 세포에 혼합된³H를 측정했다. 그 결과 도 2에 도시한 바와 같이, PDGF를 1, 10, 50 ng/ml의 농도로 첨가하고, 농도 의존적으로 래트 평활근 세포주에 있어서의³H-티미딘의 혼합을 상승시킨 경우에 있어서, 발현 벡터만을 도입한 Cos1세포의 배양 상청을 동시에 첨가한 경우는 무첨가의 경우와 비교하여 무영향이었지만 인간 A55 단백 발현용 벡터를 도입한 Cos1세포의 배양 상청을 첨가한 경우에는 현저한³H-티미딘의 혼합 저하가 인정되었다(도 2 참조).

또한, 별도의 래트 혈관 평활근 세포주(ATCC CRL-1476 및 CRL-2018)와 인간 혈관 평활근 세포주(ATCC CRL-1999)에 있어서도 마찬가지의 활성이 인정받았다. 이로부터, 재조합 인간 A55 단백은 마우스 A55 단백과 마찬가지로 혈관 평활근 세포에 대한 증식 저해 활성을 갖는 것이 분명해졌다.

또한, 배양 상청을 첨가하여 24시간 배양 후에 세포를 현미경 하에서 관찰하면 pNotS-hA55을 도입한 Cos1세포의 배양 상청을 첨가한 경우에만 혈관 평활근 세포의 형태 변화가 인정되었다. 그러나, 마찬가지의 실험에 있어서 멜라노마 세포주 SK-MEL-28의 형태에는 무영향이었다. 또한 인간 A55 단백은 케모카인JE 및 KC의 발현을 유도하는 것도 분명해졌다.

실시예 11 : 항 A55 단백 폴리크로날 항체의 제작

고상법에 의해 합성한 3종류의 마우스 A55 부분 펩티드

RTNPVYRGPYSNPYSTSYSG(71-90)(배열 번호 1의 48 내지 67)

GAYYIFQIKSGNEGREFYMR(376-395)(배열 번호 1의 353 내지 372)

MTRPIKGPRDIQLDLEMITVN(406-426)(배열 번호 1의 383 내지 403)

을 면역원으로 하여 토끼에게 면역하여 항체가의 측정 후 혈청을 채취했다. 얻어진 혈청을 각각 면역원으로 한 펩티드 단편을 결합시킨 어피니티 컬럼에 의해 항 마우스 A55 단백 폴리크로날 항체를 정제했다.

실시예 7과 동일한 방법으로 조제한 배양 상청을 SDS-PAGE에 건 후, 단백을 아크릴아미드겔로부터 이모비론P(PVDF막, 상품명, 밀리포아에서 구입)에 트랜스퍼했다. 제작한 항 마우스 A55 폴리크로날 항체를 일차 항체로 하여 ECL 키트(상품명, 아마샴에서 구입)를 이용하여 발색하고 재조합 마우스 A55 단백을 검출했다.

그 결과, 마우스 A55 발현 벡터 pNotS-mA55를 도입한 세포의 배양 상청에는 실시예 7에서 기재한³⁵S라벨의 실험과 동일한 위치인 60 kDa 부근에 단일의 밴드가 검출되었다. 한편 발현 벡터 pNotS만을 도입한 세포의 상청에는 60 kDa 부근에 밴드는 검출되지 않았다. 이로부터 얻어진 폴리크로날 항체는 마우스 A55 단백을 특이적으로 인식하고 있는 것이 확인되었다.

본 발명의 폴리펩티드 및 그것을 코드화하는 cDNA는 하나 혹은 그 이상의 효과 혹은 생물 활성(이하에 열거하는 분석(assay)에 관련되는 것을 포함함)을 나타내는 것이 생각된다.

본 발명의 단백에 관해서 기술되는 효과 혹은 생물 활성은 그 단백의 투여 혹은 사용에 의해, 혹은, 그 단백을 코드화하는 cDNA의 투여 혹은 사용(예컨대, 유전자 요법이나 cDNA 도입에 알맞은 벡터)에 의해 제공된다. 또한, 본 발명자들은 본 발명의 폴리펩티드가 혈관 평활근 세포의 증식을 억제하는 효과를 갖는 것을 확인했다. 그 때문에, 본 발명의 폴리펩티드를 이용하여 평활근의 이상 증식이 관계하는 질환, 예컨대 동맥 경화나 경피적 관동맥 형성술(PTCA) 후의 재협착을 가져오는 혈관 내막 비후, 근종 등의 치료에 응용 가능하다고 생각된다.

본 발명은 이에 한정되는 것이 아니지만, 이하의 활성을 나타낼 가능성이 있다.

[시토킨 활성 및 세포 증식/분화 활성]

본 발명의 단백은 시토킨 활성 및 세포 증식(유도 혹은 억제)/분화 활성(유도 혹은 억제)을 나타낼 가능성, 혹은 어떤 세포 집단에 다른 시토킨의 생산을 유도 혹은 억제한다고 생각된다.

모든 이미 알려진 시토킨을 포함한 현재 발견되어 있는 많은 단백성 인자는 인자에 의존한 하나 혹은 그 이상의 세포 증식 분석법으로 활성을 나타내왔기 때문에, 이들의 분석은 시토킨 활성의 편리한 확인법으로서 기능한다. 본 발명의 단백의 활성은 많은 종래의 인자 의존성 세포주의 세포 증식 분석 중의 어느 하나에 의해서 증명될 수 있다.

[면역 자극/억제 활성]

본 발명의 단백은 면역 자극 활성 및 면역 억제 활성도 나타낸다고 생각된다.

또한, 어떤 단백은 예컨대, T림프구 및 B림프구 혹은 어느 쪽인가 한쪽의 성장 및 증식을 제어(자극 혹은 억제)하는 것이나, 마찬가지로 NK세포나 다른 집단의 세포 상해성 활성에 영향을 줌에 따라 여러 가지 면역 부전 및 질환(severe combined immunodeficiency(SCID)를 포함함)의 치료에 효과를 나타낸다고 생각된다.

이들의 면역 부전은 유전성인 경우도 있고, 예컨대 HIV 같은 바이러스나, 마찬가지로 세균이나 곰팡이의 감염이 원인으로 발생하는 경우도 있다. 혹은, 자기 면역 질환에 유래할 가능성도 있다.

보다 구체적으로는, 인간 면역 부전 바이러스(HIV), 간염 바이러스(hepatitis viruses), 헤르페스 바이러스(herpes viruses), 미코박테리아(mycobacteria), 리슈마니아(leshmania), 말라리아(malaria) 및 칸디다(candida)와 같은 여러 가지 곰팡이 감염을 포함한, 바이러스, 세균, 곰팡이 혹은 다른 감염에 의한 감염증의 원인을 본 발명의 단백을 이용함에 따라 치료할 수 있다고 생각된다. 물론, 이 관련에서 본 발명의 단백은 면역 시스템이 증대하고 있는 것이 일반적으로 시사되는 장소, 즉 암 치료의 개소에 있어서 효과를 나타낸다고 생각된다.

본 발명의 단백은 알레르기 반응 및 천식이나 다른 호흡기계 질환과 같은 상황의 치료에도 효과를 나타낸다고 생각된다. 면역 억제가 요구되는 것 같은 다른 상태(예컨대, 천식이나 관련 호흡기 질환을 포함함)에도 본 발명의 단백을 이용하여 치료할 수 있다고 생각된다.

본 발명의 단백은 예컨대, 패혈병성 쇼크 혹은 전신성 염증 반응 증후군(SIRS)과 같은 감염, 염증성 대장염, 클론병, 혹은 IL-11에 의해 효과가 증명된 TNF나 IL-1과 같은 시토킨의 과잉 생산에서 유래되는 것 같은 감염에 관련된 만성 혹은 급성의 염증을 억제할 가능성도 있다.

[조혈 세포 제어 활성]

본 발명의 단백은 조혈 세포의 제어에, 또한 그에 따라 골수구 모양 세포 혹은 림프구 모양 세포의 결핍에 대한 치료에도 효과를 나타낸다고 생각된다. 콜로니 형성 세포 혹은 인자 의존성 세포주의 원조 하에서의 극히 약한 생물 활성 조차도 조혈 세포의 제어에 관계되는 것을 시사한다. 그 생물 활성이란 다음에 드는 예 모두 혹은 그 어느 하나로 비유되는 바와 같은 것에 관계되는 것이다. 적혈구 전구 세포만의 성장 및 증식을 지지, 혹은 다른 시토킨과의 조합, 또한, 그것이 시사하는 유효성, 예컨대 여러 가지 빈혈의 치료, 혹은 적혈구 전구 세포 및 적혈구 혹은 그 어느 쪽인가의 생산을 자극하는 방사선 요법/화학 요법과 조합한 사용;

과립구 및 단구/대식 세포와 같은 골수구의 성장 및 증식을 지지(즉, 고전적인 CSF활성), 화학 요법에 따른 골수 억제를 막기 위한 화학 요법과의 병용;

거핵구의 성장 및 증식 및 그것에 계속되는 혈소판의 성장 및 증식의 지지, 그에 의하여 혈소판 감소증과 같은 여러 가지 혈소판 장해를 방어 및 치료를 가능하게 하는 혈소판 수혈 시 혹은 상보적으로 일반적 사용:

상기 조혈 세포의 몇 가지인가 혹은 모든 세포로 성숙 가능한 조혈간 세포의 성장 및 증식의 지지, 따라서, 여러 가지 간세포 장해(한정은 되지 않지만, 재생 불량성 빈혈 및 발작성 야간 혈색소뇨증을 포함한 이식으로 일반적으로 치료되는 것 과 같은 것)에 치료적 효과를 발견할 수 있다, 또한, 정상 세포 혹은 유전자 요법을 위해서 유전적으로 조작된 세포를 생체내 혹은 생체외(즉, 골수 이식에 따름) 어느 쪽 인가로 방사선 요법/화학 요법 후의 간세포 분획의 재구축을 행하는 것도 마찬가지이다.

여러 가지의 조혈 간세포주의 증식과 분화에 대한 적절한 분석은 상기에 기재되어 있다.

본 발명의 단백은 다른 방법 중에서 이하의 방법에 의해 측정하는 것이 가능하다.

[조직 생성/수복 활성]

본 발명의 단백은 손상 치유 및 조직 복원, 또한, 화상, 절개, 및 궤양의 치료와 마찬가지로, 뼈, 연골, 힘줄, 인대 및 신경 조직 성장 혹은 재생 중 어느 하나에 사용된다고 생각된다.

뼈를 정상적으로 형성하지 않는 환경에서의 연골 및 뼈 혹은 어느 하나의 성장을 유도하는 것 같은 본 발명의 단백은 인간 및 다른 동물의 골절 및 연골 손상 혹은 결손의 치유에 적용된다. 본 발명의 단백을 사용하고 있는 제제는 개방 골절과 마찬가지로 폐쇄 골절의 접골, 또한 인공 관절의 고정의 개량에도 예방적으로 사용할 수 있다고 생각된다.

뼈 형성제에 의해 유도된 신생 뼈 형성은 선천성, 외상성, 암절제술에 의해 유발한 두개 안면의 결손의 복원에 공헌한다. 또한, 미용 성형 외과 분야에도 유효하다.

본 발명의 단백은 치근막증의 치료 및 다른 이의 복원에도 사용된다고 생각된다. 그러한 약품은 뼈 형성 세포를 끌어 당겨 그 세포의 증식을 자극하고, 그 전구 세포의 분화를 유도하는 환경을 제공한다고 생각된다.

본 발명의 단백은 뼈 및 연골 혹은 어느 하나의 복원을 자극하는 것을 통해서, 혹은, 염증 혹은 염증 과정에서 통하게 되는 조직 파괴(콜라게나아제 활성이나 파골 세포의 활성)의 과정을 저지함으로써 골다공증 및 골관절염의 치료에 유효하다고 생각된다.

본 발명의 단백에 기인한다고 생각되는 조직 재생 활성의 별도의 카테고리는 힘줄/인대 형성이다. 본 발명의 단백은 힘줄/인대 모양 조직 혹은 다른 조직이 정상적으로 형성되지 않는 환경에서 그러한 조직 형성을 유도하는 것이지만, 인간 및 다른 동물에게 있어서의 힘줄/인대의 열상, 기형 및 다른 힘줄/인대의 장해의 치유에 적용할 수 있다.

힘줄/인대 모양 조직을 유도하는 단백을 사용하고 있는 제제는 뼈 혹은 다른 조직으로의 힘줄/인대의 고정의 개량 및 힘줄/인대 조직의 결손의 복원에서의 사용은 물론, 힘줄 혹은 인대의 손상의 방어에 대하여 예방적 사용도 생각된다.

본 발명의 구성물에 의해 유도된 신생 힘줄/인대 모양 조직 형성은 선천성, 외상, 혹은 다른 기원의 힘줄 혹은 인대 결손의 복원에 공헌한다. 또한, 힘줄 혹은 인대의 접착 혹은 복원이라는 미용 성형 외과에서도 유효하다.

본 발명의 구성물은 힘줄/인대 형성 세포를 끌어당기고 그 세포의 증식을 자극하여 그 전구 세포의 분화를 유도하는 환경을 제공한다고 생각된다. 혹은, 조직 복원을 다하기 위해서 생체내로의 반환에 대비하여 생체외로 힘줄/인대 세포 혹은 그 전구 세포를 유도한다.

본 발명의 구성물은 건염, 카팔 터널 신드롬(Carpal tunnel syndrome), 및 다른 힘줄 혹은 인대 결손의 치료에도 유효하다. 상기 구성물에는 적당한 매트릭스 및 캐리어와 마찬가지로 당업자에게 잘 알려져 있는 시퀀스터링(Sequestering)제도 포함된다.

본 발명의 단백은 신경 세포의 증식 및, 신경 및 뇌 조직의 재생, 즉, 신경 세포 혹은 신경 조직의 변성, 죽음, 혹은 외상을 포함하는 기계적 및 외상적 장해와 마찬가지로 중추 및 말초 신경계 질환 및 신경병의 치료에 대해서도 효과를 나타낸다고 생각된다.

보다 구체적으로는, 어떤 단백은 말초 신경 장해, 말초 신경증 및 국소적 신경증과 같은 말초 신경계의 질환 및 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌친튼병, 근위축성 측삭 경화증 및 샤이-드래거(Shy-Drager) 신드롬과 같은 중추 신경계 질환의 치료에 유효하다고 생각된다.

또한, 본 발명에 따라 치료될 수 있는 조건에는 척수 장해, 두부 외상 및 뇌졸중 등의 뇌혈관 질환과 같은 기계적 및 외상적 장해를 포함한다. 화학 요법 혹은 다른 치료로부터 기인하는 말초 신경증도 본 발명의 단백을 이용하여 치료 가능하다.

본 발명의 단백은 예컨대, 췌장, 간장, 장, 신장, 피부, 내피를 포함하는 장기, 평활, 골격 혹은 심장 근육, 및 혈관 내피를 포함하는 혈관 조직과 같은 다른 조직을 생성하는 활성, 혹은 그러한 조직을 구성하는 세포의 증식을 촉진 또는 억제하는 활성을 나타낼 가능성도 기대된다. 요구되는 효과의 일부는 정상 조직을 재생시키는 섬유성 반흔의 억제에 의해서도 담당된다고 생각된다.

본 발명의 단백은 소화관 보호 혹은 재생 및 폐 혹은 간장의 섬유화, 여러 가지 조직의 재환류 손상 및 전신성 시토킨 장해에 기인하는 상태에 대한 치료에도 유효하다고 생각된다.

[악티빈/인히빈 활성]

본 발명의 단백은 악티빈/인히빈에 관련된 활성을 나타낸다고 생각된다. 악티빈은 여포 자극 호르몬(FSH)의 방출을 자극하는 활성으로 특징지어지지만, 인히빈은 여포 자극 호르몬(FSH)의 방출을 억제하는 활성으로 특징지어진다. 따라서, 본 발명의 단백은 단독 혹은 인히빈α패밀리의 멤버와의 헤테로다이머로, 포유류 동물의 암컷의 수정율을 감소시키고 수컷의 정자 형성을 감소시키는 인히빈의 활성에 기초하는 피임 조절제로서 유효하다고 생각된다. 충분량의 다른 인히빈의 투여에 의해서 포유 동물의 불임을 유도 가능하다.

한편, 본 발명의 단백은 인히빈β그룹의 다른 단백 서브 유닛과의 호모다이머 혹은 헤테로다이머로, 전뇌하수체의 세포로부터 여포 자극 호르몬(FSH) 방출을 자극하는 악티빈 분자의 활성에 기초한 치료적인 불임 유도로서 유효하다고 생각된다(미국 특허 제4,798,885호 참조). 본 발명의 단백은 소, 양 및 돼지와 같은 가축의 생애 출산 능력 가능한 기간을 연장시키기 때문에 성적으로 미숙한 포유류 동물에 있어서의 임신 개시를 빠르게 하는 것에 유효하다고 생각된다.

[주화성/화학 운동성 활성]

본 발명의 단백은 예컨대, 단구, 호중구, T세포, 마스트 세포, 호산구 및 내피 세포 혹은 그 어느 하나를 포함한 포유 동물의 세포에 대하여(예컨대, 케모카인으로서 작용함) 주화성/화학 운동성 활성을 갖는다고 생각된다.

주화성/화학 운동성 단백은 반응이 요구되는 부위로, 요구되는 세포 집단을 고정화 혹은 끌어당기기 위해 사용하는 것이 가능하다. 주화성/화학 운동성 단백은 국소적인 감염과 마찬가지로, 창상 및 다른 외상의 치료에 특별한 우위성을 제공한다. 예컨대, 림프구, 단구, 혹은 호중구를 종양 혹은 감염 부위로 끌어당기는 것은 종양 혹은 감염 부위에 대한 면역 응답을 개선하는 결과가 된다고 생각된다.

단백이나 펩티드는 혹시 그것이 직접 혹은 간접적으로 특수한 세포 집단에 대하여 지시된 방향 혹은 운동을 자극 가능하면, 그러한 세포 집단에 대한 주화성 활성을 유지하고 있다. 바람직하게는 그 단백이나 펩티드는 세포의 지시된 운동을 직접적으로 자극하는 활성을 유지한다.

특별한 단백이 어느 집단의 세포에 대하여 주화성 활성을 유지하는가 아닌가는 어떤 이미 알려진 세포 주화성의 분석법에 그러한 단백 혹은 펩티드를 사용해도 용이하게 결정할 수 있다.

[응혈 및 혈전 활성]

본 발명의 단백은 응혈 혹은 혈전 활성도 나타낸다고 생각된다. 결과로서, 그러한 단백은 여러 가지 응고 장해(혈우병과 같은 유전성 장해를 포함함)의 치료에 유효하다고 예기된다. 혹은, 외상, 수술 혹은 다른 원인에 의해 생긴 창상의 치료에 있어서의 응고 및 다른 응혈 사상을 촉진시키는 것이 예기된다. 본 발명의 단백은 혈전의 형성의 용해 혹은 억제 및 혈전 혹은 졸중 등에 의해 생기는 상태의 치료 및 예방에도 효과가 있다고 생각된다.

[수용체/리간드 활성]

본 발명의 단백은 수용체, 수용체/리간드 혹은 수용체/리간드의 인히비터 혹은 아고니스트로서의 활성을 나타낼 가능성도 있다. 그러한 수용체 및 리간드의 예로서, 시토킨 수용체 및 그 리간드, 수용체 키나아제 및 그 리간드, 수용체 포스파타아제 및 그 리간드, 세포간 상호 작용에 관련된 수용체(셀렉틴(Selectin), 인테그린(integrin), 및 그 리간드, 수용체 키나아제를 포함하는 세포 접착 분자 등) 및 그 리간드 및 항원 제시, 항원 인식 및 세포성 및 액성 면역 반응의 발달에 관계되는 수용체/리간드의 조합을 들 수 있지만 본 발명을 제한할만한 것은 아니다.

수용체 및 리간드는 그 상호 작용에 대한 가능한 펩티드 혹은 소분자의 인히비터의 스크리닝에도 유효하다. 본 발명의 단백(수용체 및 리간드의 단편을 포함하지만, 제한되는 것은 아님)은 그 자신 수용체/리간드의 상호 작용의 인히비터로서 유효하다고 생각된다.

[영양제로서의 이용]

본 발명의 단백은 영양원 또는 영양 보급제로서도 사용할 수 있다. 이러한 사용에는 제한은 되지 않지만, 단백, 아미노산의 보급, 탄소원, 질소원으로서의 사용, 탄수화물원으로서의 사용이 포함된다. 그러한 경우에 있어서, 본 발명의 단백은 각 생물의 음식물에 첨가할 수 있고, 또한 분말이나 정제, 용액, 현탁액, 캡슐 등의 제형과 같이 분리한 개체 또는 액체의 상태로 복용할 수 있다. 미생물의 경우 본 발명의 단백을 배양액 중에 첨가할 수도 있다.

[카드헤린/종양 전이 억제 활성]

카드헤린은 칼슘 의존성 접착 분자이며, 개체 발생에 있어서 특별히 특이적으로 세포종을 인식할 때에 주요한 역할을 다 하는 것이 분명해지고 있다. 통상의 카드헤린 발현의 흠실 또는 변화에 의해, 종양의 증식 또는 전이에 이어지는 세포 접착성의 변화가 일어날 수 있다. 카드헤린의 기능 부전은 또한 낭창성 천포창이나 낙엽성 천포창(자기 면역 발반 피부병), 클론병, 몇 개의 발생 이상과 같은 인간의 별도의 질병에도 관련하고 있다.

카드헤린 수퍼 패밀리의 멤버는 40을 넘고, 개개에 다른 발현 패턴을 나타낸다. 카드헤린 수퍼 패밀리의 모든 멤버는 공통의 보존된 세포 외 리피트(카드헤린 도메인)를 갖지만, 분자의 별도의 부위에 있어서는 구조상의 차이가 인정된다.

카드헤린 도메인은 칼슘과 결합하여 카드헤린 사이에서 4차 구조를 형성하기 때문에 칼슘은 접착에 필수적이다. 최초의 카드헤린 도메인의 수 개의 아미노산만이 호모피릭인 접착에 필수적이다.

이 인식 부위의 수식에 의해 카드헤린의 특이성을 바꾸는 것이 가능하므로 이변 분자는 그 자신만을 인식하는 것은 아니고 다른 카드헤린과도 결합 가능해진다. 또한 몇 개의 카드헤린은 다른 카드헤린과 헤테로피릭인 접착을 한다.

E-카드헤린은 카드헤린 수퍼 패밀리의 멤버의 하나로 상피 세포계에서 발현하고 있다. 만약 E-카드헤린의 발현이 종양으로 보이지 않는 경우, 병리학적으로는 악성 세포가 침윤하여 암이 전이한다. 암 세포주에 E-카드헤린의 유전자를 트랜스펙터한 경우, 세포의 형태가 통상으로 되돌아가고 세포 사이나 기질로의 접착성이 유지되며 세포 증식 속도가 지연되고 기반 비의존적인 세포 증식이 극적으로 감소함으로써 암에 따른 변화가 원래로 돌아간다. 이렇게 도입한 E-카드헤린의 발현에 의해 암의 진행이 낮은 스테이지로 되돌아간다. 또한 별도의 카드헤린은 별도의 조직 유래의 암에 있어서 동일한 침윤 억제의 기능을 가진다고 생각된다. 그래서 카드헤린 활성을 갖는 본 발명의 단백과 그것을 코드화하는 본 발명의 유전자는 암의 치료에 이용할 수 있다. 이러한 단백 또는 유전자를 암 세포에 도입하는 것은 통상의 카드헤린의 발현을 공급함으로써, 암 세포에 있어서 보이는 변화를 감소 또는 배제할 수 있다.

암 세포는 또 다른 조직의 카드헤린의 발현을 나타내는 경우가 있다. 그 결과 이러한 세포는 체내의 다른 조직에 침윤, 전이할 수 있게 된다. 이러한 세포에 있어서, 카드헤린 활성을 갖는 본 발명의 단백과 그것을 코드화하는 본 발명의 유전자는 이소 발현된 카드헤린으로 치환될 수 있다. 그 결과, 통상의 세포의 접착성을 유지하고 전이성을 감소 또는 배제한다.

또한, 카드헤린 활성을 갖는 본 발명의 단백과 그것을 코드화하는 본 발명의 유전자는 카드헤린을 인식하여 결합하는 항체의 생산에 이용할 수 있다. 이러한 항체는 암 세포에 이소 발현된 카드헤린의 결합을 블록하는 것에 사용할 수 있어 암의 형성을 방해한다. 이러한 항 카드헤린 항체는 또한 암의 등급, 병리학적 타입, 예후에 대하는 마커로서 사용할 수 있다. 즉, 보다 암이 진행하고 있으면 카드헤린의 발현은 보다 낮을 것이고, 카드헤린 발현의 감소는 카드헤린에 결합하는 항체를 이용함으로써 검출할 수 있다.

또한, 카드헤린 활성을 갖는 본 발명의 단백의 단편, 바람직하게는 카드헤린 인식 부위의 10개의 펩티드 및 이러한 본 발명의 단백 단편을 코드화하는 유전자는 카드헤린과 결합하고, 바람직하지 못한 효과를 가져오는 카드헤린의 결합을 방해함으로써 카드헤린의 기능을 블록하는 것에도 사용할 수 있다. 또한 카드헤린 활성을 갖는 본 발명의 단백의 단편, 바람직하게는 암 환자에서 안정되어 순환하고 있는 트런게이트한 가용화 카드헤린 단편 및 그러한 본 발명의 단백 단편을 코드화하는 유전자는 고유의 세포 사이의 접착을 억제하는 것에 사용할 수 있다.

[종양 억제 활성]

상기한 면역학적 처치 또는 종양의 예방의 활성에 더하여, 본 발명의 단백은 별도의 항종양 활성을 나타낼 가능성이 있다. 단백은 직접적으로, 또는 예컨대 ADCC를 통해서와 같은 간접적으로 종양의 증식을 억제한다고 생각된다. 또한 단백은 종양 조직 또는 종양 전구 조직에 작용함으로써, 종양의 증식을 지지하기 위해서 필요한 조직의 형성을 억제(예컨대, 혈관 신생을 억제함)함으로써, 종양의 증식을 억제하는 별도의 인자, 활성 물질 또는 세포종을 생산함으로써, 종양의 증식을 촉진하는 인자, 활성 물질 또는 세포종을 제거 또는 억제함으로써 종양 억제 활성을 나타낼 가능성이 있다.

[그 밖의 활성]

본 발명의 단백(폴리펩티드)은 이하에 나타내는 부가적인 활성 혹은 효과의 하나 혹은 그 이상을 나타낸다고 생각된다: 세균, 바이러스, 곰팡이 및 다른 기생충을 포함하는 감염성의 물질을 살상한다;

신장, 체중, 털의 색, 눈의 색, 피부 혹은 다른 조직의 색소 침착, 혹은 기관의 크기(예컨대 흉부 증량 혹은 감량) 등, 신체적 특징을 억제 혹은 촉진하는 효과를 미치게 한다;

식이 지방, 단백, 혹은 탄수화물의 분해에 효과를 나타낸다;

식욕, 성욕, 스트레스, 인식(인식 장해), 울병, 폭력 행동을 포함하는 행동 특징에 효과를 미치게 한다;

진통 효과 혹은 다른 아픔을 감소시키는 효과를 제공한다;

배성간세포의 조혈계 이외의 다른 계통으로의 분화 및 증식을 촉진한다;

효소의 경우, 그 효소의 흠실을 보충하고, 또한 관련 질환을 치료한다.

상기 활성을 갖는 단백은, 예컨대, B세포, T세포, 비만 세포의 증식 또는 세포사, 면역 글로불린의 클래스 스위치 촉진에 의한 클래스 특이적 유도, B세포의 항체 생산 세포로의 분화, 과립구 전구 세포의 증식 또는 분화, 세포사, 단구·대식 세포 전구 세포의 증식 또는 분화, 세포사, 호중구, 단구·대식 세포, 호산구, 호염기구의 증식 또는 기능 항진, 세포사, 거핵구 전구 세포의 증식 또는 세포사, 호중구 전구 세포의 증식 또는 분화, 세포사, B 또는 T전구 세포의 증식 또는 분화, 세포사, 적혈구의 생산 촉진, 적혈구, 호중구, 호산구, 호염기구, 단구·대식 세포, 비만 세포, 거핵구 전구 세포의 증식 지지, 호중구, 단구·대식 세포, B세포 또는 T세포의 유주 촉진, 가슴선 세포의 증식 또는 세포사, 지방 세포의 분화 억제, 내츄럴 킬러 세포의 증식 또는 세포사, 조혈 간세포의 증식 또는 세포사, 간세포 및 각종 조혈 전구 세포의 증식 억제, 간엽계 간세포로부터의 골아 세포, 연골 세포로의 분화 촉진 또는 증식, 세포사, 혹은 파골 세포의 활성화나 단구로부터 파골 세포로의 분화 촉진에 의한 뼈 흡수 촉진의 작용을 본 발명의 폴리펩티드만으로, 또한 리간드 셀렉터 사이의 결합을 통해, 혹은 다른 분자와 상승적으로 작용함으로써 가진다고 생각된다.

또한, 본 발명의 펩티드는 신경계에도 작용하는 것이 예측되기 때문에, 각종 신경 전달 물질 작동성 신경 세포로의 분화 및 이들의 생존 유지 또는 세포사, 그리어 세포의 증식 촉진 또는 세포사, 신경 돌기의 신장, 신경절 세포의 생존 유지 또는 세포사, 아스트로사이트의 증식 또는 분화 촉진 또는 세포사, 말초 신경의 증식 또는 생존 유지, 세포사, 슈완 세포의 증식 또는 세포사, 운동 신경의 증식 또는 생존 유지, 세포사의 작용도 있다고 생각된다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 초기 배의 발생 과정에 있어서, 외배엽 유도 작용에 의한 표피, 뇌, 등뼈, 신경의 기관 형성, 중배엽 유도 작용에 의한 배삭 결합 조직(뼈, 근육, 힘줄), 혈구 세포, 심장, 신장, 생식소의 기관 형성, 혹은 내배엽 유도 작용에 의한 소화기계 장기(위, 장, 간장, 췌장), 호흡기계(폐, 기관)의 형성에 촉진적 또는 억제적으로 작용한다고 생각되고, 성체에 있어서도 상기 기관의 증식 혹은 증식 억제 작용을 갖는다고 생각된다.

따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 그 자신으로 면역계 또는 신경계 혹은 뼈대사의 기능의 저하 또는 항진에 관한 질환, 또는 조혈계 세포의 발육 부전 또는 이상 증식, 예컨대, 염증성 질환(류머티즘, 궤양성 대장염 등), 골수 이식 후의 조혈 간세포의 감소증, 암, 백혈병에 대한 방사선 조사 또는 화학 요법제 투여 후의 백혈구, 혈소판, B세포 또는 T세포의 감소증, 빈혈, 감염증, 암, 백혈병, 에이즈(AIDS), 뼈대사 이상(골다공증 등), 동맥 경화, 각종 변성 질환(알츠하이머병, 다발성 경화증 등), 혹은 신경 손상의 예방 또는 치료약으로서 이용할 것이 기대된다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 기관의 분화, 증식 작용을 갖는다고 생각되므로 각 기관(표피, 뼈, 근육, 힘줄, 심장, 신장, 위, 장, 간장, 췌장, 폐, 기관 등)의 조직 복원제로서 이용할 것도 기대된다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드의 폴리크로날 항체 또는 모노크로날 항체를 이용하여, 생체에 있어서의 상기 폴리펩티드의 정량이 행할 수 있고, 이에 따라서 본 발명의 폴리펩티드와 질환의 관계의 연구 혹은 질환의 진단 등에 이용할 수 있다. 폴리크로날 항체 및 모노크로날 항체는 본 발명의 폴리펩티드 혹은 그 단편을 항원으로서 이용하여 공지의 방법에 의해 제작할 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드를 이용함으로써, 예컨대 어피니티 컬럼을 제작하여, 본 발명의 폴리펩티드와 결합하는 이미 알려진 또는 미지의 단백(리간드)의 확인, 정제 혹은 그 유전자 클로닝을 행할 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드를 이용하여, 예컨대 웨스트-웨스턴법에 의해, 또는 본 발명의 cDNA(바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 cDNA)를 이용하여, 예컨대 효모2-하이브리드법에 의해 본 발명의 폴리펩티드와 상호 작용하는 분자의 확인, 유전자 클로닝을 행할 수도 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드를 이용함에 따라 본 발명의 폴리펩티드 리셉터 아고니스트, 안타고니스트 및 수용체-시그널 전달 분자 사이의 억제제 등의 스크리닝을 행할 수도 있다.

스크리닝은 예컨대, 이하의 방법에 의해 행할 수 있다. 즉,

a) 본 발명의 폴리펩티드, 스크리닝해야 할 화합물 및 세포를 포함하는 반응 혼합물을 세포가 본 발명의 펩티드에 의해 정상적으로 자극되는 조건하에 함께 하고(상기 반응 혼합물은 세포가 증식함에 따라서 세포 중에 도입되는 표식 및 본 발명의 펩티드의 기능을 효과적으로 관찰시키기 위한 본 발명의 펩티드 이외의 펩티드를 포함함); 이어서

b) 세포의 증식의 정도를 측정하여 대상 화합물이 유효한 안타고니스트 또는 아고니스트인가 어떤가를 결정한다.

보다 상세하게는 이하와 같이 하여 행해진다. 즉:

래트 혈관 평활근 세포주(ATCC CRL-1444 또는 CRL-1476)를 플레이트에 놓고 10% 혈청 존재 하에서 24시간 배양한 후, 바람직하게는 1, 10 또는 50 ng/ml 농도의 인간 PDGF-BB(GENZYME사 제조)를 포함하는 무혈청 배지로 교환한다. A55 단백의 안타고니스트 활성을 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우는, 그 때 A55 단백과 스크리닝해야 할 화합물을 동시에 첨가한 후 24시간 배양 후에³H-티미딘을 첨가하고, 그 4시간 배양 후에 세포에 혼합된³H를 측정함으로써 A55 단백의³H-티미딘 혼합 억제 활성을 억게하는 화합물을 스크리닝할 수 있다. A55 단백의 아고니스트 활성을 갖는 화합물을 스크리닝하는 경우는 상기 세포에 스크리닝해야 할 화합물을 첨가한 후, 24시간 배양 후에³H-티미딘을 첨가하고 그 4시간 배양 후에 세포에 혼합된³H를 측정함으로써³H-티미딘 혼합 억제 활성을 갖는 화합물을 스크리닝할 수 있다.

본 발명의 cDNA는 많은 유용성이 기대되는 본 발명의 폴리펩티드를 생산할 때의 중요하고 또한 필수적인 주형이 될 뿐만 아니라, 유전병의 진단이나 치료(유전자 결손증의 치료 또는 안티센스 DNA(RNA)에 의해서 폴리펩티드의 발현을 정지시킴에 의한 치료 등)에 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 cDNA를 프로브로 하여 게놈성 DNA를 분리할 수 있다. 마찬가지로 하여 본 발명 cDNA와 상동성이 높은 마우스 혹은 인간의 관련 폴리펩티드 유전자, 또한 마우스 혹은 인간 이외의 생물에 있어서의 본 발명 폴리펩티드와 상동성이 높은 폴리펩티드의 유전자를 분리하는 것도 가능하다.

[의약품으로의 적용]

상기한 질환에 적응하기 위해서, 본 발명의 폴리펩티드, 혹은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체는 통상, 전신적 또는 국소적으로, 일반적으로는 경구 또는 비경구의 형태로 투여된다. 바람직하게는 경구 투여, 정맥 내 투여 및 뇌실 내 투여이다.

투여량은 연령, 체중, 증상, 치료 효과, 투여 방법, 처리 시간 등에 따라 다르지만, 통상, 성인 1인당 일회에 있어 100 μg에서 100 mg의 범위로, 하루 일회에서 수회 경구 투여되거나, 또는 성인 1인당 일회에 있어 10 μg에서 100 mg의 범위로, 하루 일회에서 수회 비경구 투여된다.

물론 상기한 바와 같이 투여량은 여러 가지의 조건에 의해 변동하기 때문에, 상기 투여량보다 적은 량으로 충분한 경우도 있고, 또한 범위를 넘어서 필요한 경우도 있다.

본 발명 화합물을 투여하는 때에는, 경구 투여를 위한 고체 조성물, 액체 조성물 및 그 밖의 조성물, 비경구 투여를 위한 주사제, 외용제, 좌제 등으로서 이용된다.

경구 투여를 위한 고체 조성물에는, 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 과립제 등이 포함된다. 캡슐에는 소프트 캡슐 및 하드 캡슐이 포함된다.

이러한 고체 조성물에 있어서는 하나 또는 그 이상의 활성 물질이, 적어도 하나의 불활성인 희석제(예컨대, 락토오스, 만니톨, 글루코오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 전분, 폴리비닐피롤리돈, 메타규산알루민산마그네슘 등)로 혼합된다. 조성물은 통상법에 따라서, 불활성인 희석제 이외의 첨가물, 예컨대, 윤활제(스테아린산 마그네슘 등), 붕괴제(섬유소 글리콜산칼슘 등), 안정화제(인간 혈청 알부민, 락토오스 등), 용해 보조제(아르기닌, 아스파라긴산 등)를 함유하고 있어도 좋다.

정제 또는 환제는 필요에 따라 백당, 젤라틴, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스푸탈레이트 등의 위용성 혹은 장용성 필름으로 피막해도 좋고, 또한 2이상의 층으로 피막해도 좋다. 또한 젤라틴과 같은 흡수될 수 있는 물질의 캡슐도 포함된다.

경구 투여를 위한 액체 조성물은 약학적으로 허용되는 유탁제, 용액제, 현탁제, 시럽제, 엘릭시르제 등을 포함하고, 일반적으로 이용되는 불활성인 희석제(예컨대, 정제물, 에탄올 등)를 포함하고 있어도 좋다. 이러한 조성물은 불활성인 희석제 이외에 습윤제, 현탁제와 같은 보조제, 감미제, 풍미제, 방향제, 방부제를 함유하고 있어도 좋다.

경구 투여를 위한 그 밖의 조성물로서는, 하나 또는 그 이상의 활성 물질을 포함하여, 그 자체 공지의 방법에 의해 처방되는 스프레이제가 포함된다. 이 조성물은 불활성인 희석제 이외에 아황산수소나트륨과 같은 안정제와 등장성을 주는 것 같은 안정화제, 염화나트륨, 시트르산나트륨 혹은 시트르산과 같은 등장제를 함유하고 있어도 좋다. 스프레이제의 제조 방법은 예컨대 미국 특허 제2,868,691호 및 동 제3,095,355호 명세서에 자세히 기재되어 있다.

본 발명에 의한 비경구 투여를 위한 주사제로서는 무균의 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제, 유탁제를 포함한다. 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제로서는 하나 또는 그 이상의 활성 물질이 적어도 하나의 불활성인 희석제와 혼합된다. 수성의 희석제로서는 예컨대 주사용 증류수 및 생리 식염수를 들 수 있다. 비수성의 희석제로서는 예컨대 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 에탄올과 같은 알콜류, 폴리소르베이트80(등록 상표) 등을 들 수 있다.

이러한 조성물은 또한, 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제(예컨대, 인간 혈청 알부민, 락토오스 등), 용해 보조제(예컨대, 아르기닌, 아스파라긴산 등)와 같은 보조제를 포함하고 있어도 좋다.

Claims

실질적으로 순수한 형태인 배열 번호 11 또는 14로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드, 그 동족체, 그 단편 또는 그 단편의 동족체로 이루어지는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 배열 번호 11 또는 14로 표시되는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드.
제1항에 기재된 폴리펩티드를 코드화하는 cDNA.
제3항에 있어서, 배열 번호 12 또는 15로 표시되는 염기 배열로 이루어지거나, 또는 그 배열에 선택적으로 하이브리다이즈하는 단편으로 이루어지는 cDNA.
제3항에 있어서, 배열 번호 13으로 표시되는 염기 배열로 이루어지거나, 또는 그 배열에 선택적으로 하이브리다이즈하는 단편으로 이루어지는 cDNA.
제3항내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 cDNA로 이루어지는 복제 또는 발현 벡터.
제6항 기재의 복제 또는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드를 발현시키기 위한 조건하에서 제7항 기재의 숙주 세포를 배양함으로써 이루어지는 상기 폴리펩티드의 제조 방법.
제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드의 모노크로날 또는 폴리크로날 항체.
제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드 또는 제9항 기재의 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체를 함유하는 것을 특징으로 하는 이상 평활근의 증식이 관계된 질환의 치료에 유효한 약학적 조성물.
제11항에 있어서, 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체를 함유하는 것을 특징으로 하는 동맥 경화 또는 경피적 관동맥 형성술(PTCA) 후의 재협착을 가져오는 혈관 내막 비후, 근종의 치료에 유효한 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드를 이용하여, 상기 폴리펩티드에 대한 안타고니스트 또는 아고니스트로서의 활성을 갖는 화합물을 스크리닝하는 방법.