KR20010072289A - 신규한 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 암호화하는 ｃＤＮＡ및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간의 신규한 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 및 그 용도에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩티드는 조혈 세포 제어 활성, 조직 생성/수복 활성, 액티빈/인히빈 활성, 주화성/화학 운동성 활성, 응혈 및 혈전 활성, 수용체/리간드 활성 등을 여러 가지 질환 예방 및/또는 치료에 유용하리라 생각된다.

Description

신규한 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 암호화하는 ｃＤＮＡ 및 그 용도{NOVEL POLYPEPTIDE, cDNA ENCODING THE SAME AND UTILIZATION THEREOF}

종래, 어떤 특정한 폴리펩티드 또는 그것을 암호화하는 cDNA를 얻고자 할 경우, 조직이나 세포 배양액 중에 목적으로 하는 생물 활성을 확인하고, 이어서 폴리펩티드의 분리 정제를 거쳐 유전자를 클로닝하는 방법, 또는 그 생물 활성을 지표로서 유전자를 발현 클로닝하는 방법이 일반적으로 이용되어 왔다. 그러나, 생체내 생리 활성 폴리펩티드는 다양한 생물 활성을 갖고 있는 경우가 많기 때문에, 어느 하나의 활성을 지표로서 유전자를 클로닝한 결과, 그것이 이미 알려진 폴리펩티드와 동일 한 것이 나중에 판명되는 사례가 증가하였다. 또한, 미량밖에 생산되지 않았거나, 특별한 생리적 조건에서만 발현되는 인자도 많아, 그것이 분리, 정제 및 생물 활성인 것을 확인하는 것이 곤란했었다.

최근, cDNA의 제작 기술이나 서열 결정 기술은 급속히 발전하여 대량의 cDNA의 서열을 신속히 행할 수 있게 되었다. 그래서 이들 기술을 이용하여 여러 가지세포나 조직으로부터 cDNA 라이브러리를 제작하여 무작위로 cDNA를 클로닝하여 염기 서열을 결정하고, 신규한 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 분리하는 방법이 발전하고 있다. 이 방법은 생화학적, 유전학적인 해석을 전혀 필요로 하지 않고서 유전자를 클로닝하여, 그의 염기 서열의 정보를 얻을 수 있다고 하는 특징을 갖고 있지만, 목적으로 하는 유전자의 발견은 우발적인 요소가 크다.

본 발명자들은 지금까지 조혈계나 면역계에서 활동하는 증식 분화 인자의 유전자의 클로닝을 연구하여 왔다. 그리고, 증식 분화 인자(예컨대, 각종 시토킨 등)와 같은 분비 단백질이나 그 수용체와 같은 막 단백질(이하, 이들을 통합하여 분비 단백질 등이라고 부른다.)의 대부분이 그 N 말단에 신호 펩티드라고 불리는 서열을 갖고 있는 것에 착안하여, 신호 펩티드를 암호화하는 유전자를 효율적이고 또한 선택적으로 클로닝하는 방법을 예의 검토했다. 그 결과, 동물 세포를 이용하여 신호 펩티드의 유무를 간단히 검색할 수 있는 방법(신호 시퀀스 트랩(SST)법)을 발견했다(유럽 특허 공개 제0607054호 참조). 또한 동일한 개념 하에 효모를 이용하여 더욱 대량으로 간편하게 신호 펩티드를 암호화하는 유전자를 분리하는 방법(효모 SST법)도 개발되었다(미국 특허 제5,536,637호 참조).

이 방법을 이용하여 치료, 진단, 혹은 연구상 유익한 신규 인자(폴리펩티드), 특히 분비 신호를 갖는 분비 단백질 및 막 단백질에 착안하여 그것을 발견하기 위해 예의 검토했다. 그 결과, 다종 다양한 분비 단백질 및 막 단백질을 생산하고 있을 거라고 예상되는 세포주 및 조직, 예컨대 인간의 태반, 성인의 뇌조직 및 뇌조직 유래의 세포주, 인간의 골 및 골수 유래의 세포주 및 인간의제대정맥 내피 세포주(HUV-EC-C)가 생산하고 있는 신규한 분비 단백질 또는 막 단백질 및 그것을 암호화하는 cDNA를 발견하는 것에 성공하여 본 발명을 완성했다.

본 발명이 제공하는 cDNA 서열은 클론 OAH047로서 결정되어, 상기 효모 SST법을 사용하여 얻은 정보를 기초로 인간의 제대정맥 내피 세포주(HUV-EC-C)로 제작한 cDNA 라이브러리로부터 분리되었다. 클론 OAH047은 막 단백질(여기서는 OAH047 단백질으로서 나타낸다.)을 암호화하는 완전한 cDNA 서열을 포함하는 전장쇄 cDNA이다.

핵산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 핵산 서열에 대하여 BLASTN 및 FASTA에 의해, 또 아미노산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 이미 알려진 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 BLASTX, BLASTP 및 FASTA에 의해 검색한 결과, 본 발명의 폴리펩티드 OAH047 및 각각을 암호화하는 핵산 서열과 일치하는 서열은 없었다. 또한 얻어진 아미노산 서열의 소수성 플롯에 의한 해석으로부터 본 발명의 폴리펩티드는 막관통 영역을 갖는 것으로 예상되었다. 이들 예상으로부터, 본 발명의 폴리펩티드 OAH047은 신규의 막 단백질인 것이 판명되었다.

본 발명은,

(1) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드,

(2) 상기 (1)에 기재한 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA,

(3) 서열 번호 2로 표시되는 염기 서열을 갖는 cDNA,

(4) 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열을 갖는 cDNA에 관한 것이다.

본 발명은 신규한 폴리펩티드, 그 제조 방법, 그 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA, 그 cDNA로 이루어지는 벡터, 그 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 그 폴리펩티드의 항체 및 그 폴리펩티드 또는 항체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 실질적으로 순수한 형태인 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 그 상동체, 그 서열의 단편 및 그 상동체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 이들 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 서열 번호 2로 표시되는 염기 서열을 갖는 cDNA 및 서열 번호 2 또는 3으로 표시되는 염기 서열에 선택적으로 하이브리드화하는 단편을 갖는 cDNA에 관한 것이다. 하이브리드화하는 cDNA에는 상기 서열의 상보 서열도 포함된다.

실질적으로 순수한 형태인 서열 번호 l로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드란 일반적으로 생산시 폴리펩티드의 90% 이상, 예컨대, 95%, 98% 또는 99%가 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것을 의미한다.

서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 상동체란 일반적으로 20개 이상, 바람직하게는 30개 이상, 예컨대 40개, 60개 또는 100개의 연속한 아미노산 영역에서 70% 이상, 바람직하게는 80% 또는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상 상동성인 것으로, 그와 같은 상동체는 이후 본 발명의 폴리펩티드로서 기재된다.

또한, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드의 단편 또는 이들 상동체의 단편이란 10개 이상의 아미노산, 바람직하게는 15개 이상의 아미노산, 예컨대 20개, 25개, 30개, 40개, 50개 또는 60개의 아미노산 부분을 의미한다.

서열 번호 2 또는 3으로 표시되는 염기 서열을 갖는 cDNA에 선택적으로 하이브리드화하는 cDNA란 일반적으로, 20개 이상, 바람직하게는 30개 이상, 예컨대 40개, 60개 또는 100개의 연속한 염기 서열 영역에서, 70% 이상, 바람직하게는 80% 또는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상 상동성인 것으로, 그와 같은 cDNA는 이후 본 발명의 cDNA로서 기재된다.

서열 번호 2 또는 3으로 표시되는 염기 서열을 갖는 cDNA의 단편이란 10개 이상의 염기, 바람직하게는 15개 이상의 염기, 예컨대 20개, 25개, 30개 또는 40개 염기 부분을 의미하며, 그와 같은 단편도 본 발명의 cDNA에 포함된다.

또한, 본 발명에는 본 발명의 cDNA로 이루어지는 복제 또는 발현 벡터가 포함된다. 벡터로서는 예컨대, 복제기점(ori) 영역과, 필요에 따라 상기 cDNA의 발현을 위한 프로모터, 프로모터의 제어 인자 등으로 이루어지는 플라스미드, 바이러스 또는 파지 벡터를 들 수 있다. 벡터는 하나 또는 그 이상의 선택적 마커 유전자, 예컨대 암피실린 내성 유전자를 포함하고 있어도 좋다. 벡터는 시험관내(in vitro)에서, 예컨대 cDNA에 대응하는 RNA의 제조, 숙주 세포의 형질 전환에 이용할 수 있다.

또한, 본 발명에는 서열 번호 2 또는 3으로 표시되는 염기 서열, 또는 그들의 오픈 리딩 프레임을 갖는 cDNA를 포함하는 본 발명의 cDNA를 복제 또는 발현시키기 위한 벡터로 형질 전환된 숙주 세포도 포함된다. 세포로서는, 예컨대 세균, 효모, 곤충 세포 또는 포유 동물 세포를 들 수 있다.

또한, 본 발명에는 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키기 위한 조건하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양함으로써 이루어지는 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법도포함된다. 배양은 본 발명의 폴리펩티드가 발현되어 숙주 세포로부터 제조되는 조건하에서 행해지는 것이 바람직하다.

본 발명의 cDNA는 상기한 바와 같은 벡터의 안티센스 영역에 삽입함으로써 안티센스 RNA를 제조할 수도 있다. 이러한 안티센스 RNA는 세포 중 본 발명의 폴리펩티드의 레벨을 제어하는 것에 이용할 수도 있다.

본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 모노크로날 또는 폴리크로날 항체도 포함한다. 또한 본 발명의 폴리펩티드의 모노크로날 또는 폴리크로날 항체의 제조 방법도 포함한다. 모노크로날 항체는 본 발명의 펩티드 또는 그 단편을 항원으로서 이용하여 통상의 하이브리도마의 기술에 의해 제조할 수 있다. 폴리크로날 항체는 숙주 동물(예컨대, 래트나 토끼 등)에 본 발명의 폴리펩티드를 접종하여 면역 혈청을 회수하는 통상의 방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명에는, 본 발명의 폴리펩티드, 그 항체와 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체를 함유하는 약학 조성물도 포함된다.

(1)의 본 발명의 폴리펩티드로는 서열 번호 1로 표시된 아미노산 서열을 갖는 것 이외에 그 일부가 결손된 것(예컨대, 서열 번호 1 중, 생물 활성의 발현에 필수적인 부분만으로 이루어지는 폴리펩티드 등), 본 발명의 폴리펩티드가 다른 아미노산과 치환한 것(예컨대, 물성이 유사한 아미노산으로 치환한 것) 및 그 일부에 다른 아미노산이 부가 또는 삽입된 것도 포함된다.

잘 알려진 바와 같이, 하나의 아미노산을 암호화하는 코돈은 1∼6종류(예컨대, Met는 1종류, Leu는 6종류) 알려져 있다. 따라서, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 바꾸는 일없이 cDNA의 염기 서열을 바꿀 수 있다.

(2)로 특정되는 본 발명의 cDNA에는 (1)의 서열 번호 1로 표시되는 폴리펩티드를 암호화하는 모든 염기 서열군이 포함된다. 염기 서열을 바꿈으로써 폴리펩티드의 생산성이 향상되는 경우가 있다.

(3)으로 특정되는 cDNA는 (2)로 표시되는 cDNA의 하나의 형태이며, 천연형 서열을 나타낸다.

(4)에 표시되는 cDNA는 (3)으로 특정되는 cDNA에 천연의 비번역 부분을 가한 서열을 나타낸다.

서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열을 갖는 cDNA는 다음과 같은 방법으로 제작된다.

먼저, 효모 SST법(미국 특허 제5,536,637호에 기재)의 개요에 관해서 설명한다.

사카로미세스 세레비제( Saccharomyces cerevisiae ) 등의 효모가 자당 또는 라피노스를 에너지원이나 탄소원으로서 이용하기 위해서는 인베르타아제를 배지 중에 분비해야 한다(인베르타아제는 라피노스를 자당과 메리비오스로, 자당을 프럭토스(과당)와 글루코스로 분해하는 효소이다.). 또한 이미 알려진 수많은 포유류의 신호 펩티드는 효모의 인베르타아제를 분비시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 이들 관찰로부터, 효모의 인베르타아제 분비를 가능하게 하는 신규의 신호 펩티드를 포유류의 cDNA 라이브러리로부터 라피노스 배지상에서의 효모의 생육을 지표로 스크리닝하는 방법으로서 본 방법은 개발되었다. 번역 개시점 ATG를 삭제한 비분비형의인베르타아제 유전자 SUC2(GENBANK accession No.V01311)를 효모의 발현 벡터[발현용 프로모터(ADH 프로모터) 및 터미네이터(ADH 터미네이터)는 AAH5 플라스미드(Gammerer, Methods in Enzymol. 101, 192-201, 1983) 유래로, 효모 복제 기점은 2μori, 효모 선택 마커에는 TRP1, 대장균 복제 기점은 ColEl ori, 대장균 약제 내성 마커에는 암피실린이 사용되고 있다.]에 삽입하여 효모 SST용 벡터 pSUC2를 제작했다. 그 SUC2 유전자의 상류에 포유류의 cDNA를 삽입하여, 효모 SST cDNA 라이브러리를 조제했다. 이 라이브러리를 분비형 인베르타아제가 부족한 효모로 형질 전환했다. 삽입된 포유류 cDNA가 신호 펩티드를 암호화하고 있는 경우, 효모로 발현된 인베르타아제에 대하여도 분비 작용을 한다고 생각되며, 그 결과 라피노스 배지상에서의 생육이 가능해진다. 따라서 출현한 콜로니로부터 효모를 배양하여 플라스미드를 조제하고, 인서트 cDNA의 염기 서열을 결정함으로써, 신규 신호 펩티드의 검색을 신속하고 또한 쉽게 했다.

효모 SST cDNA 라이브러리의 제작은

(1) 대상이 되는 세포로부터 mRNA를 분리하고, 특정 제한 효소(효소 I) 부위를 연결한 랜덤 프라이머를 이용하여 이본쇄 cDNA를 합성하고,

(2) 효소 I과는 다른 특정 제한 효소(효소 Ⅱ) 부위를 포함하는 어댑터를 연결하여 효소 I에서 분해한 후, 적당한 크기로 분획화하고,

(3) 효모 발현 벡터 내의 신호 펩티드를 삭제한 인베르타아제 유전자의 상류에 얻어진 cDNA 단편을 연결하여 형질전환하는 단계로 이루어진다.

각 단계를 자세히 설명하면, 단계 (1)에서는 대상이 되는 포유류의 장기나세포주 등에서, 필요에 따라 적당한 자극제로 자극한 후, 공지의 방법(이하, 공지의 방법은 특별히 기재가 없으면 Molecular C1oning(Sambrook, J., Fritsch, E.F. 및 Maniatis, T. 저서, Cold Spring Harbor Laboratory Press가 1989년에 발간) 또는 Current Protocol in Molecular Bio1ogy (F.M.Ausubel 등 편저, Jokm Wiley & Sons, Inc가 발간)에 기재된 방법이다. )에 따라 mRNA의 분리가 행하여진다.

대상이 되는 세포로서는, HUV-EC-C(인간의 제대정맥 내피 세포주 : ATCC No.CRL-1730)를 들 수 있다. 랜덤 프라이머를 이용하는 이본쇄 cDNA의 합성은 공지의 방법에 의해 행해진다.

어댑터에 연결되는 제한 효소(효소 I) 부위와 다음 공정 (2)에서 이용되는 제한 효소(효소 II) 부위는 서로 다른 것이면 무엇을 이용하더라도 좋다. 바람직하게는, 효소 I로서 XhoI, 효소 II로서는 EcoRI가 이용된다.

단계 (2)에서는 T4 DNA 폴리메라제로 말단을 평활화하여, 효소 II 어댑터를 연결한 후, 효소 I로 분해하여, 아가로스 전기 영동(AGE)에 의해 300∼800bp의 cDNA를 분획화한다. 효소 II는 상기한 바와 같이 효소 I과 다른 것이면 무엇이라도 좋다.

단계 (3)은 효모 발현용 플라스미드 벡터에 연결된 신호 펩티드를 삭제한 인베르타아제 유전자의 상류에 단계 (2)에서 얻어진 cDNA 단편을 삽입하여 대장균으로 형질전환하는 공정이다. 여기서 효모 발현용 플라스미드 벡터로서는 여러 가지 종류가 알려져 있는데, 예컨대, 대장균 내에서도 기능하는 YEp24 등이 이용되지만, 적합하게는 전술한 플라스미드 pSUC2가 이용된다.

형질 전환을 위한 숙주 대장균주는 이미 많은 것이 알려져 있으며, 바람직하게는 DH10B의 컴피텐트 세포이다. 또 형질 전환 방법은 공지의 어느 것을 이용해도 좋지만, 바람직하게는 전기적천공법에 의해 행해진다. 형질 전환체는 통상의 방법에 의해 배양되어, 효모 SST용의 cDNA 라이브러리를 얻을 수 있다.

이 cDNA 라이브러리는 모든 클론이 상기 단편을 포함하고 있는 것은 아니고, 또 전부가 미지의(신규의) 신호 펩티드를 암호화하는 유전자 단편이라고는 할 수 없다. 그래서, 다음에 해당 라이브러리로부터 미지의 신호 펩티드를 암호화하는 유전자 단편을 스크리닝해야 한다.

즉, cDNA 라이브러리를 인베르타아제 유전자를 갖고 있지 않은 효모 사카로미세스 세레비셰(예컨대 YT455주 등) 또는 인베르타아제 유전자를 인위적으로 결손시킨 주(공지의 방법에 따라 제작 가능)를 이용할 수 있다. 효모의 형질 전환은 공지의 방법, 예컨대 초산 리튬법에 의해서 행해진다. 형질 전환체를 선택 배지에서 생육후, 라피노스를 탄소원으로 하는 배지로 옮겨 생육 가능한 콜로니를 선택하여 플라스미드를 회수한다. 라피노스를 탄소원으로서 효모가 생육되었다는 것은 라이브러리 중에 어떠한 분비 단백질의 신호 펩티드가 삽입되어 있었던 것을 나타내고 있다.

다음에, 분리된 양성 클론에 관해서, 염기 서열을 결정하여 미지의 단백질을 암호화하는 것이 분명해진 cDNA에 대해서는 그것을 프로브로서 전장 클론을 분리하여 전장의 염기 서열을 결정할 수 있다. 이들 조작은 당업자에게 전부 공지의 방법으로 행해진다.

서열 번호 2로 표시되는 염기 서열이 일부, 바람직하게는 전부가 확정되면 포유류에 존재하는 본 발명의 단백질을 암호화하는 cDNA 혹은 본 발명 단백질의 상동체 및 서브셋을 암호화하는 cDNA를 얻을 수 있다. 적당한 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성하여 그것을 이용하여 포유류 유래의 cDNA 라이브러리 혹은 mRNA로부터 PCR법에 의해, 혹은 적당한 염기 서열의 단편을 프로브로서 하이브리드화시킴으로써, 다른 포유류 cDNA 라이브러리 혹은 해당 게놈 라이브러리로부터 다른 포유류형의 해당 단백질을 암호화하는 cDNA를 얻을 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 cDNA가 SST로 얻어진 cDNA 단편의 염기 서열(또는 그 상동 서열)을 포함하고 있으면 신호 펩티드를 암호화하고 있는 것이기 때문에, 해당 cDNA가 전장 또는 거의 전장인 것은 분명하다.(신호 펩티드는 예외 없이 단백질의 N 말단에 존재함으로써, cDNA의 오픈 리딩 프레임의 5'말단에 암호화되어 있다.)

또한 공지의 방법에 따라 해당 cDNA를 프로브로서 노던(Northern) 분석에 의해서 전장을 확인해도 좋다. 하이브리드화한 밴드로부터 얻어지는 mRNA의 크기와 해당 cDNA의 크기를 비교하여, 거의 동일하면 해당 cDNA는 거의 전장이라고 생각할 수 있다.

서열 번호 2로 표시되는 염기 서열이 일단 확정되면, 그 후는, 화학 합성에 의해서, 혹은 해당 염기 서열의 단편을 화학 합성하여 그것을 프로브로서 하이브리드화시킴으로써, 본 발명의 cDNA를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 cDNA를 함유하는 벡터 cDNA를 적당한 숙주에 도입하여 그것을 증식시킴으로써, 목적으로 하는cDNA를 필요량 얻을 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 얻는 방법으로서는,

(1) 생체 또는 배양 세포로부터 정제 분리하는 방법,

(2) 펩티드 합성하는 방법, 또는

(3) 유전자 재조합 기술을 이용하여 생산하는 방법,

등을 들 수 있는데, 공업적으로는 (3)에 기재한 방법이 바람직하다.

유전자 재조합 기술을 이용하여 폴리펩티드를 생산하기 위한 발현계(숙주-벡터계)로서는, 예컨대, 세균, 효모, 곤충 세포 및 포유 동물 세포의 발현계를 들 수있다.

예컨대, 대장균으로 발현시킬 경우에는, 성숙 단백질 부분을 암호화하는 cDNA의 5'말단에 개시 코돈(ATG)을 부가하여 얻어진 cDNA를 적당한 프로모터(예컨대, trp 프로모터, 1ac 프로모터, λPL 프로모터, T7 프로모터 등)의 하류에 접속하여 대장균 내에서 기능하는 벡터(예컨대, pBR322, pUC18, pUC19 등)에 삽입하여 발현 벡터를 제작한다.

다음에, 이 발현 벡터로 형질 전환한 대장균(예컨대, E.Coli DH1, E.Coli JMl09, E.Coli HBl01주 등)을 적당한 배지에서 배양하여, 그 균체로부터 목적으로 하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 또한, 박테리아의 신호 펩티드(예컨대, pelB의 신호 펩티드)를 이용하면, 주변 세포질 중에 목적으로 하는 폴리펩티드를 분비할 수도 있다. 또한, 다른 폴리펩티드와의 융합단백질을 생산할 수도 있다.

또한, 포유 동물 세포로 발현시킬 경우에는, 예컨대, 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열을 암호화하는 cDNA를 적당한 벡터(예컨대, 레트로 바이러스 벡터, 파피로마 바이러스 벡터, 왁시니아 바이러스 벡터, SV40계 벡터 등) 중 적당한 프로모터(예컨대, SV40 프로모터, LTR 프로모터, 메탈로치오네인 프로모터 등)의 하류에 삽입하여 발현 벡터를 제작한다. 다음에, 얻어진 발현 벡터로 적당한 포유 동물 세포(예컨대, 원숭이 COS-7 세포, 중국계 햄스터 CHO 세포, 쥐 L 세포 등)를 형질 전환하여, 형질 전환체를 적당한 배지에서 배양함으로써, 본 발명의 단백질이 분비 단백질인 경우와 막 단백질인 경우에, 다음과 같이 발현된다.

본 발명의 단백질이 분비 단백질인 경우, 그 세포 상청액 중에 목적으로 하는 폴리펩티드가 발현된다. 또한, 그 밖의 폴리펩티드, 예컨대 항체의 정상 영역(Fc 부분)을 암호화하는 cDNA 단편과 연결함으로써, 융합 단백질을 생산할 수도 있다.

한편, 본 발명의 단백질이 막 단백질인 경우, 그 세포막 상에 목적으로 하는 폴리펩티드가 발현된다. 또한 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열을 암호화하는 cDNA의 막관통 영역이 부족한 결실체를 상기 벡터에 삽입하여, 그것을 이용해 적당한 포유류 동물 세포를 형질 전환함으로써, 그 배양액 중에 목적으로 하는 가용성 폴리펩티드가 분비된다. 또한 그 막관통 영역이 부족한 결실체를 암호화하는 cDNA 단편과 그 밖의 폴리펩티드, 예컨대 항체의 정상 영역(Fc 부분)을 암호화하는 cDNA 단편을 연결함으로써, 융합 단백질을 생산할 수도 있다.

이상과 같이하여 얻어진 폴리펩티드는 일반적인 생화학적 방법에 의해서 분리 정제할 수 있다.

이하에 본 발명의 클론 OAH047에 관한 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1 : 폴리(A) ⁺ RNA의 조제

인간의 제대정맥 내피 세포주(HUV-EC-C)로부터 TRIzol 시약(TRIzol reagent, 등록상표, GIBCOBRL에서 판매)을 이용하여 모든 RNA를 추출하고, mRNA 정제 키트(mRNA Purification Kit, 상품명, Pharmacia에서 판매)를 이용하여 폴리(A)⁺RNA를 정제했다.

실시예 2 : 효모 SST cDNA 라이브러리의 조제

상기한 폴리(A)⁺RNA를 주형에 XhoI 부위를 연결한 랜덤 9 mer : 5'-CGATTGAATTCTAGACCTGCCTCGAGNNNNNNNNN-3'(서열 번호 4)를 프라이머로서, 수퍼스크립트·플라스미드·시스템(SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid C1oning, 상품명, GIBCOBRL에서 판매)을 이용하여 2개의 사슬 cDNA를 합성했다. EcoRI 어댑터(GIBCOBRL에서 판매)를 DNA 연결 키트 ver2(DNA ligation kit ver.2, 상품명, 다까라슈조(주)에서 판매. 이하, cDNA의 연결은 전부 본 키트를 사용했다.)를 이용하여 연결한 후, XhoI로 분해하여, 아가로스 전기 영동으로 300∼800bp의 cDNA를 추출하여 분획화하고, pSUC2(미국 특허 제5536637호 참조)의 EcoRI/NotI 부위에 연결하여 대장균 DHl0B주에 전기적천공법으로 형질 전환하여 효모 SST용의 cDNA 라이브러리를 얻었다.

실시예 3 : SST에 의한 스크리닝 및 SST 양성 클론의 염기 서열의 결정

이 cDNA 라이브러리의 플라스미드를 조제하고, 초산 리튬법(Current Protocols In Molecular Biology 13.7.1을 참조)에 의해 효모 YTK12주를 형질 전환하여, 트립토판(Trp)을 포함하지 않는 효모 형질 전환체의 선택 배지(CMD-Trp 배지)의 평판 상에 뿌려, 30℃에서 48시간 배양한 후, 아큐트란 리플리카 평판배양기(Accutran Replica Plater, 상품명, Schleicher & Schuel1에서 판매)를 이용하여 얻어진 콜로니(형질 전환체)의 복제를, 라피노스를 탄소원으로 하는 YPR 평판으로 해서, 30℃에서 14일간 배양했다. 3일째 이후, 출현한 각각의 콜로니를 하나씩 재차 YPR 평판에 도말하여 30℃에서 48시간 배양한 후, 단일 콜로니를 YPD 배지에 균을 번식시켜, 30℃에서 48시간 배양한 후, 플라스미드를 조제했다. 계속해서 pSUC2의 클로닝 부위 양끝 서열의 두 가지 프라이머(센스 쇄는 비오틴화 프라이머)를 이용하여 공지의 방법에 따라 PCR을 행하여, 삽입 cDNA를 증폭한 후, 다이나비드(Dynabeads, 상품명, DYNAL에서 판매)를 이용하여 비오틴화 1개 사슬 cDNA를 정제하여, 염기 서열을 결정했다. 염기 서열의 결정은 DNA 서열결정 키트(DNA Sequencing kit, Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction, 상 품명, Applied Biosystems Inc.에서 판매)를 이용한 형광 염료 종결 사이클 서열결정법으로 반응을 하고, 자동 DNA 시퀀서 373(Applied Biosystems Inc.)으로 판독을 행했다(이하, 염기 서열 결정은 전부 이 방법으로 행했다.).

얻어진 염기 서열 및 추정되는 아미노산 서열에 관해서 데이터 베이스와의 상동성 검색을 하여, 데이터 베이스에 등록되어 있지 않은 신규의 cDNA인 것이 분명해진 클론에 대하여, 전장 cDNA의 클로닝을 시도했다.

실시예 4 : 전장 cDNA의 클로닝 및 염기 서열의 결정

전장 cDNA의 클로닝은 마라톤 cDNA 증폭 키트(Marathon cDNA AmplificationKit, 상품명, Clontech사에서 판매)에 의한 3' RACE(신속한 cDNA 말단 증폭)법을 이용하여 행했다. 2개 사슬 cDNA의 조제에는, 각 클론의 유래, 즉 인간의 제대정맥 내피 세포주(HUV-EC-C)의 폴리(A)⁺RNA를 더 제작했다. SST로 얻어진 염기 서열의 정보에 기초하여 추정 번역 개시점 ATG 영역보다 상류인 27량체의 프라이머 OAH047-Fl: 5'-GCGACACGTGGATCCAAGATGGCGACG-3’(서열 번호 5)을 제작하여, 해당 키트에 첨부된 어댑터 프라이머로 PCR을 행했다. 클론 OAH047에 특이적으로 증폭된 cDNA를 아가로스 전기 영동으로 분획한 후, pT7블루-2 T-벡터(상품명, Novagen에서 판매)에 연결하여, 대장균 DH5a로 형질 전환하여 플라스미드를 조제했다. 먼저 5'측의 염기 서열을 결정하여 OAH047 SST cDNA의 염기 서열이 존재하는 것을 확인한 후, 모든 염기 서열을 결정하여 서열 번호 3으로 나타내는 서열을 얻었다. 또한 오픈 리딩 프레임을 결정하여, 아미노산으로 번역하여 서열 번호 1 및 2로 나타내는 서열을 얻었다.

핵산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 기지의 핵산 서열에 대하여 BLASTN 및 FASTA에 의해, 또한 아미노산 서열 데이터 베이스에 등록되어 있는 기지의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 BLASTX, BLASTP 및 FASTA에 의해 검색한 결과, 본 발명의 폴리펩티드 OAH047 및 그것을 암호화하는 핵산 서열과 일치하는 서열은 없었다. 추가로 얻어진 아미노산 서열의 소수성 플롯에 의한 해석으로부터 본 발명의 폴리펩티드에는 막관통 영역이 존재하는 것으로 예상되었다. 이로 부터, 본 발명의 폴리펩티드는 신규의 막 단백질인 것이 판명되었다. 또한 상동성 검색의 결과, BLASTX, BLASTP 및 FASTA는 클론 OAH047(서열 번호 1인 아미노산 서열12∼642 사이의 영역)과 효모·내막·단백질(yeast endomembrane protein, Genbank Accession U53880의 아미노산 서열 11∼667 사이의 영역) 사이에 유위한 상동성이 있는 것을 나타냈다. 이들 상동성에 기초하여, 클론 OAH047은 운송자로서 세포막으로부터 리소좀에의 홀몬 또는 그것에 상당하는 분자의 수송에도 기여한다고 기대된다.

본 발명의 폴리펩티드 및 그것을 암호화하는 cDNA는 하나 또는 그 이상의 효과 혹은 생물 활성(이하에 열거하는 분석에 관련되는 것을 포함한다.)을 나타내는 것을 생각할 수 있다. 본 발명의 단백질에 관해서 기술되는 효과 혹은 생물 활성은 그 단백질의 투여 또는 사용에 의해, 또는 그 단백질을 암호화하는 cDNA의 투여 또는 사용(예컨대, 유전자 요법이나 cDNA 도입에 알맞은 벡터)에 의해 제공된다.

[시토킨 활성 및 세포 증식/분화 활성]

본 발명의 단백질은 시토킨 활성 및 세포 증식(유도 혹은 저해)/분화 활성(유도 혹은 저해)을 보일 가능성, 혹은 어떤 세포 집단에 다른 시토킨의 생산을 유도 혹은 억제한다고 생각된다. 이미 알려진 모든 시토킨을 포함하는 현재 발견되어 있는 많은 단백질성 인자는 인자에 의존한 하나 혹은 그 이상의 세포 증식 분석법으로 활성을 보여 왔기 때문에, 이들 분석은 시토킨 활성의 편리한 확인법으로서 기능한다. 본 발명의 단백질 활성은 많은 종래의 인자 의존성 세포주의 세포 증식 분석 중 어느 하나에 의해서 증명될 수 있다.

[면역 자극/억제 활성]

본 발명의 단백질은 면역 자극 활성 및 면역 억제 활성도 보인다고 생각된다. 또한, 어떤 단백질은, 예컨대, T 림프구 및 B 림프구 혹은 어느 한 쪽의 성장 및 증식을 제어(자극 혹은 억제)하는 것이나, 마찬가지로 NK 세포나 다른 집단의 세포 상해성 활성에 영향을 줌으로써, 여러 가지 면역 부전 및 질환(severe combined immunodeficiency(SCID)를 포함한다.)의 치료에 효과를 보인다고 생각된다. 이들 면역 부전은 유전성인 경우도 있고, 예컨대 에이즈(HIV)와 같은 바이러스나, 마찬가지로 세균이나 곰팡이의 감염이 원인으로 발생하는 경우도 있다. 혹은, 자기 면역 질환으로부터 유래될 가능성도 있다. 보다 구체적으로는, 에이즈(HIV), 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 마이코박테리아, 리슈마니아(leshmania), 말라리아 및 칸디다와 같은 여러 가지 곰팡이 감염을 포함한, 바이러스, 세균, 곰팡이 혹은 다른 감염에 의한 감염증의 원인을 본 발명의 단백질을 이용함으로써 치료할 수 있다고 생각된다. 물론, 이러한 관련으로 인해, 본 발명의 단백질은 면역 시스템이 증대하고 있는 것이 일반적으로 시사되는 장소, 즉 암치료에 있어서 효과를 나타낸다고 생각된다.

본 발명의 단백질은 알레르기 반응 및 천식이나 다른 호흡기계 질환과 같은 상황의 치료에도 효과를 나타낸다고 생각된다. 면역 억제가 요구되는 다른 상태(예컨대, 천식이나 관련 호흡기 질환을 포함한다.)에도 본 발명의 단백질을 이용하여 치료할 수 있다고 생각된다.

본 발명의 단백질은 예컨대, 패혈병성의 쇼크 혹은 전신성 염증 반응 증후군(SIRS)과 같은 염증성 대장염, 클론병, 또는 IL-ll에 의해 증명된 효과와 같은 TNF나 IL-1과 같은 시토킨의 과잉 생산으로 유래되는 감염에 관련된 만성 혹은 급성 염증을 억제할 가능성도 있다.

[조혈 세포 제어 활성]

본 발명의 단백질은 조혈 세포의 제어에, 또한 그에 따라 골수구형 세포 혹은 림프구형 세포의 결핍에 대한 치료에도 효과를 나타낸다고 생각된다. 콜로니 형성 세포 혹은 인자 의존성 세포주의 도움하에서의 극히 약한 생물 활성에서 조차도, 조혈 세포의 제어에 관계되는 것을 시사한다. 그 생물 활성이란, 다음에 열거하는 예의 전부 혹은 그 어느 하나로 예를 들 수 있는 것에 관계된다. 적혈구형 전구 세포만의 성장 및 증식을 지지, 혹은 다른 시토킨과의 조합, 또 그것이 시사하는 유효성, 예컨대 여러 가지 빈혈 치료, 혹은 적혈구 전구 세포 및 적혈구 혹은 그 어느 쪽의 생산을 자극하는 방사선 요법/화학 요법과 조합하여서의 사용; 과립구 및 단구/대식 세포와 같은 골수구의 성장 및 증식을 지지(즉, 고전적인 CSF 활성), 화학 요법에 따른 골수 억제를 막기 위한 화학 요법과의 병용; 거핵구의 성장 및 증식 및 그것에 계속되는 혈소판의 성장 및 증식의 지지, 그에 의하여 혈소판 감소증과 같은 여러 가지 혈소판 장해의 방어 및 치료를 가능하게 하는 혈소판 수혈시 혹은 상보적으로 일반적 사용 ; 상기 조혈 세포의 몇가지 혹은 모든 세포로 성숙 가능한 조혈 간세포의 성장 및 증식의 지지, 따라서, 여러 가지 간세포 장해(한정은 되지 않지만, 재생 불량성 빈혈 및 발작성 야간 혈색소뇨증을 포함하는 이식에서 일반적으로 치료되는 것)에 치료적인 효과를 나타내며, 또한, 정상 세포 혹은 유전자 요법으로 인해 유전적으로 조작된 세포를 시험관 내에서 혹은 생체 외(즉, 골수 이식에 따른다.) 어느 쪽에서, 방사선 요법/화학 요법 후의 간세포 분획의 재구축을 하는 것도 마찬가지이다.

본 발명의 단백질은 다른 방법 중에서, 이하의 방법에 의해 측정하는 것이 가능하다.

[조직 생성/수복 활성]

본 발명의 단백질은 손상 치유 및 조직 수복, 또한, 화상, 절개 및 궤양의 치료와 같이, 뼈, 연골, 힘줄, 인대 및 신경 조직 성장 혹은 재생 중 어딘가에 사용된다고 생각된다.

뼈를 정상적으로 형성하지 않는 환경에서의 연골 및 뼈 혹은 어딘가의 성장을 유도하는 본 발명의 단백질은 인간 및 다른 동물의 골절 및 연골 손상 혹은 결손의 치유에 적용된다. 본 발명의 단백질을 사용하고 있는 제제는, 개방 골절과 같이 폐쇄 골절의 접골, 또한 인공 관절 고정의 개량과 예방에도 사용할 수 있다고 생각된다. 뼈 형성제에 의해 유도된 신생 뼈의 형성은, 선천성, 외상성, 암 절제술에 의해 유발된 두개안면 결손의 수복에 공헌한다. 또한, 미용 성형 외과 분야에도 유효하다.

본 발명의 단백질은 치근막증의 치료 및 다른 치아의 수복에도 사용된다고 생각된다. 그와 같은 약품은, 뼈 형성 세포를 유인하여 그 세포의 증식을 자극하고, 그 전구 세포의 분화를 유도하는 환경을 제공한다고 생각된다. 본 발명의 단백질은 뼈 및 연골 혹은 어딘가의 수복을 자극하는 것을 통해서 혹은, 염증 또는 염증 과정에서 개재되는 조직 파괴(콜라게나제 활성이나 파골 세포의 활성)의 과정을 저지함으로써, 골다공증증 및 골관절염의 치료에 유효하다고 생각된다.

본 발명의 단백질에 기인한다고 생각되는 조직 재생 활성의 다른 카테고리는 힘줄/인대 형성이다. 본 발명의 단백질은 힘줄/인대형 조직 혹은 다른 조직이 정상적으로 형성되지 않는 환경에서 그와 같은 조직 형성을 유도하는 것이지만, 인간 및 다른 동물의 힘줄/인대의 열상, 기형 및 다른 힘줄/인대의 장해 치유에 적용할수 있다. 힘줄/인대형 조직을 유도하는 단백질을 사용하고 있는 제제는, 뼈 혹은 다른 조직에의 힘줄/인대 고정의 개량 및 힘줄/인대 조직의 결손 수복에서의 사용은 물론, 힘줄 혹은 인대의 손상 방어에 대하여 예방적 사용도 생각할 수 있다. 본 발명의 구성물에 의해 유도된 신생 힘줄/인대형 조직 형성은 선천성, 외상, 혹은 다른 기원의 힘줄 혹은 인대 결손의 수복에 공헌한다. 또한, 힘줄 혹은 인대를 붙이거나 수복하는 미용 성형 외과에서도 유효하다. 본 발명의 구성물은 힘줄/인대 형성 세포를 유인하여 그 세포의 증식을 자극하고, 그 전구 세포의 분화를 유도하는 환경을 제공한다고 생각된다. 또는, 조직 수복을 다하기 위해서 생체내로의 반환에 대비하여 생체 외에서 힘줄/인대 세포 혹은 그 전구 세포를 유도한다. 본 발명의 구성물은 건염, 수근 터널 증후군(Carpal tunne1 syndrome) 및 다른 힘줄 혹은 인대 결손 치료에도 유효하다. 상기 구성물에는 적당한 매트릭스 및 캐리어와 같이 당업자에게 잘 알려져 있는 씨쿼스터링(Sequestering)제도 포함된다.

본 발명의 단백질은 신경 세포의 증식 및 신경 및 뇌 조직의 재생, 즉, 신경 세포 혹은 신경 조직에 대한 변성, 죽음, 혹은 외상을 포함하는 기계적 및 외상적 장해와 같이 중추 및 말초 신경계 질환 및 신경병의 치료에 대해서도 효과를 나타낸다고 생각된다. 구체적으로는, 어떤 단백질은 말초 신경 장해, 말초 신경증 및 국소적 신경증과 같은 말초 신경계의 질환 및 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성측책증 및 샤이·드레거(Shy-Drager) 증후군과 같은 중추신경계 질환의 치료에 유효하다고 생각된다. 게다가 본 발명에 따라 치료될 수 있는 조건에는, 척수 장해, 두부 외상 및 뇌졸중 등의 뇌혈관 질환과 같은 기계적 및 외상적 장해를 포함한다. 화학 요법 혹은 다른 치료로부터 기인하는 말초 신경증도 본 발명의 단백질을 이용하여 치료 가능하다.

본 발명의 단백질은 예컨대 췌장, 간장, 장, 신장, 피부, 내피를 포함하는 장기, 평활, 골격 혹은 심장 근육 및 혈관 내피를 포함하는 혈관 조직과 같은 다른 조직을 생성하는 활성, 혹은 그와 같은 조직을 구성하는 세포의 증식을 촉진하는 활성을 보일 가능성도 기대된다. 요구되는 효과의 일부는 정상 조직을 재생시키는 섬유성 반흔(scarring)의 저해에 의해서도 맡겨진다고 생각된다.

본 발명의 단백질은 소화관 보호 혹은 재생 및 폐 혹은 간장의 섬유화, 여러 가지 조직의 재환류 손상 및 전신성 시토킨 장해에 기인하는 상태에 대한 치료에도 유효하다고 생각된다.

[액티빈/인히빈 활성]

본 발명의 단백질은 액티빈/인히빈에 관련된 활성을 보인다고 생각된다. 액티빈은 여포자극 호르몬(FSH)의 방출을 자극하는 활성에 의해서 특징지어지지만, 인히빈은 여포자극 호르몬(FSH)의 방출을 저해하는 활성에 의해서 특징지어진다. 따라서, 본 발명의 단백질은 단독 혹은 인히빈 a 패밀리 멤버와의 이종이량체로, 포유류 동물의 암컷의 수정율을 감소시켜, 수컷의 정자 형성을 감소시키는 인히빈의 활성에 기초하는 피임 조절제로서 유효하다고 생각된다. 충분한 량의 다른 인히빈의 투여에 의해서, 포유 동물의 불임을 유도할 수 있다. 한편, 본 발명의 단백질은 인히빈 b 그룹의 다른 단백질 서브유닛과의 동종이량체 혹은 이종이량체로, 전뇌하수체의 세포로부터 FSH 방출을 자극하는 액티빈 분자의 활성에 기초를 둔 치료적인 불임 유도에 유효하다고 생각된다(미국 특허 제4,798,885호를 참조.). 본 발명의 단백질은 소, 양 및 돼지와 같은 가축의 생애 출산 능력이 가능한 기간을 연장시키기 위해서, 성적으로 미숙한 포유류 동물의 임신 가능 시기를 빠르게 하는 것에 유효하다고 생각된다.

[주화성(走化性)/화학 운동성 활성]

본 발명의 단백질은 예컨대, 단구, 호중구, T 세포, 비만 세포, 호산구 및 내피 세포, 혹은 그 중 어느 하나를 포함하는 포유 동물의 세포에 대하여 예컨대, 케모카인으로서 작용하는 주화성/화학 운동성 활성을 갖는다고 생각된다. 주화성/화학 운동성 단백질은 반응이 요구되는 부위로, 요구되는 세포 집단을 고정화 혹은 유인하기 위해 사용할 수 있다. 주화성/화학 운동성 단백질은 국소적인 감염과 같이, 창상 및 다른 외상의 치료에 특별한 우위성을 제공한다. 예컨대, 림프구, 단구 혹은 호중구를 종양 혹은 감염 부위로 가까이 유인하는 것은, 종양 혹은 감염 부위에 대한 면역 응답을 개선하는 결과가 된다고 생각된다.

단백질이나 펩티드는 만약 그것이 직접 혹은 간접으로 특수한 세포 집단에 대하여 지시된 방향 혹은 운동을 자극할 수 있으면, 그와 같은 세포 집단에 대한 주화성 활성을 유지하고 있다. 바람직하게는, 그 단백질이나 펩티드는 세포의 지시된 운동을 직접적으로 자극하는 활성을 유지한다. 특별한 단백질이 있는 집단의 세포에 대하여 주화성 활성을 유지하는지 아닌지는 이미 알려진 어떤 세포 주화성의 분석법에 그와 같은 단백질 혹은 펩티드를 사용하더라도 용이하게 결정할 수 있다.

[응혈 및 혈전 활성]

본 발명의 단백질은 응혈 혹은 혈전 활성도 보인다고 생각된다. 결과적으로, 그와 같은 단백질은 여러 가지 응고 장해(혈우병과 같은 유전성 장해를 포함한다.)의 치료에 유효하리라고 예측된다. 혹은, 외상, 수술 혹은 다른 원인에 의해 생긴 창상의 치료에 있어서의 응고 및 다른 응혈 현상을 촉진시킬 것이 예기된다. 본 발명의 단백질은 혈전 형성의 용해 혹은 저해 및 혈전 혹은 뇌졸중 등에 의해 생기는 상태의 치료 및 예방에도 효과가 있다고 생각된다.

[수용체/리간드 활성]

본 발명의 단백질은 수용체, 수용체/리간드 혹은 수용체/리간드의 억제제 혹은 작용 물질로서의 활성을 보일 가능성도 있다. 그와 같은 수용체 및 리간드의 예 로서, 시토킨 수용체 및 그 리간드, 수용체 키나제 및 그 리간드, 수용체 포스파타아제 및 그 리간드, 세포간 상호 작용에 관련된 수용체(셀렉틴, 인테그린 및 그 리간드, 수용체 키나제를 포함하는 세포 접착 분자 등) 및 그 리간드 및 항원 제시, 항원 인식 및 세포성 및 액성 면역 반응의 발달에 관계되는 수용체/리간드의 조합을 들 수 있지만, 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 수용체 및 리간드는 그 상호 작용에 대한 가능한 펩티드 혹은 소분자의 억제제의 스크리닝에도 유효하다. 본 발명의 단백질(수용체 및 리간드의 단편을 포함하지만, 제한되는 것은 아니다.)은 그 자체 수용체/리간드의 상호 작용의 억제제로서 유효하다고 생각된다.

[다른 활성]

본 발명의 단백질은 이하에 나타내는 부가적인 활성 혹은 효과중 하나 이상의 활성 또는 효과를 나타낸다고 생각된다: 세균, 바이러스, 곰팡이 및 다른 기생충을 포함하는 감염성 물질을 사멸시킨다; 신장, 체중, 모발의 색, 눈의 색, 피부 혹은 다른 조직의 색소 침착 혹은 기관의 크기(예컨대 흉부 증량 혹은 감량) 등 신체적 특징을 억제하는 혹은 촉진하는 효과를 미친다; 식이 지방, 단백질, 혹은 탄수화물의 분해에 효과를 미친다; 식욕, 성욕, 스트레스, 인식(인식 장해), 울병, 폭력 행동을 포함하는 행동 특징에 효과를 미친다; 진통 효과 혹은 다른 진통을 감소시키는 효과를 제공한다; 배성 간세포의 조혈계 이외의 다른 계통으로의 분화 및 증식을 촉진한다; 그리고, 효소의 경우, 그 효소의 부족을 보충하고, 또한 관련 질환을 치료한다.

상기 활성을 갖는 단백질은 예컨대, B 세포, T 세포, 비만 세포의 증식 또는 세포사멸, 면역 글로블린의 클래스 스위치 촉진에 의한 클래스 특이적 유도, B 세포의 항체 생산 세포에의 분화, 과립구 전구 세포의 증식 또는 분화, 세포사멸, 단구·대식 세포 전구 세포의 증식 또는 분화, 세포사멸, 호중구, 단구·대식 세포, 호산구, 호염기구의 증식 또는 기능 항진, 세포사멸, 거핵구 전구 세포의 증식 또는 세포사멸, 호중구 전구 세포의 증식 또는 분화, 세포사멸, B 또는 T 전구 세포의 증식 또는 분화, 세포사멸, 적혈구의 생산 촉진, 적혈구, 호중구, 호산구, 호염기구, 단구·대식 세포, 비만 세포, 거핵구 전구 세포의 증식 지지, 호중구, 단구·대식 세포, B 세포 또는 T 세포의 유주(遊走) 촉진, 흉선 세포의 증식 또는 세포사멸, 지방 세포의 분화 억제, 천연 킬러 세포의 증식 또는 세포사, 조혈 간세포의 증식 또는 세포사멸, 간세포 및 각종 조혈 전구 세포의 증식 억제, 간엽계 간세포로부터의 골아 세포, 연골 세포에의 분화 촉진 또는 증식, 세포사, 혹은 파골 세포의 활성화나 단구로부터 파골 세포로의 분화 촉진에 의한 뼈 흡수 촉진의 작용을 본 발명 폴리펩티드만으로, 또한 리간드-수용체 간의 결합을 통해, 혹은 다른 분자와 상승적으로 작용함으로써 갖는다고 생각된다.

또한 본 발명의 펩티드는 신경계에도 작용하는 것이 예측되기 때문에, 각종 신경 전달 물질 작동성 신경 세포로의 분화 및 이들의 생존 유지 또는 세포사멸, 신경교 세포의 증식 촉진 또는 세포사멸, 신경 돌기의 신장, 신경절 세포의 생존 유지 또는 세포사멸, 성상세포의 증식 또는 분화 촉진 또는 세포사멸, 말초 신경의 증식 또는 생존 유지, 세포사멸, 신경초 세포의 증식 또는 세포사멸, 운동 신경의 증식 또는 생존 유지, 세포사멸의 작용도 있다고 생각된다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 초기배의 발생 과정에서, 외배엽 유도 작용에 의한 표피, 뇌, 등뼈, 신경 기관 형성, 속배엽 유도 작용에 의한 배삭 결합 조직(뼈, 근육, 힘줄), 혈구 세포, 심장, 신장, 생식집의 기관 형성, 혹은 내배엽 유도 작용에 의한 소화기계 장기(위, 장, 간장, 췌장), 호흡기계(폐, 기관)의 형성에 촉진적 또는 억제적으로 작용한다고 생각되는 동시에, 생체에 있어서도 상기 기관의 증식 혹은 증식 억제 작용을 갖는다고 생각된다.

따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 그 자체로 면역계 또는 신경계 혹은 골대사 기능의 저하 또는 항진에 관한 질환, 또는 조혈계 세포의 발육 부전 또는 이상 증식, 예컨대, 염증성 질환(류머티즘, 궤양성 대장염 등), 골수 이식 후의 조혈 간세포의 감소증, 암, 백혈병에 대한 방사선 조사 또는 화학 요법제 투여후의 백혈구, 혈소판, B 세포 또는 T 세포의 감소증, 빈혈, 감염증, 암, 백혈병, 에이즈(AIDS),골대사 이상(골다공증 등), 각종 변성 질환(알츠하이머병, 다발성 경화증 등), 혹은 신경 손상의 예방 또는 치료약으로서 이용하는 것이 기대된다.

또한 본 발명의 폴리펩티드는 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래 기관의 분화 또는 증식 작용을 갖는다고 생각되므로, 각 기관(표피, 뼈, 근육, 힘줄, 심장, 신장, 위, 장, 간장, 췌장, 폐, 기관 등)의 조직 수복제로서 이용하는 것도 기대된다.

또한, 본 발명 폴리펩티드의 폴리크로날 항체 또는 모노크로날 항체를 이용하여, 생체에 있어서의 해당 폴리펩티드의 정량을 처리할 수 있고, 그에 의해서 해당 폴리펩티드와 질환과의 관계 연구 혹은 질환의 진단 등에 이용할 수 있다. 폴리크로날 항체 및 모노크로날 항체는 해당 폴리펩티드 혹은 그 단편을 항원으로서 이용하여 통상 방법에 의해 제작할 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드(바람직하게는 그 세포 밖 영역의 폴리펩티드)를 이용함으로써, 예컨대 친화성 컬럼을 제작하여, 본 폴리펩티드와 결합하는 기지 또는 미지의 단백질(리간드)의 동정, 정제 혹은 그 유전자 클로닝을 행할 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드(바람직하게는 그 막관통 영역 또는 세포 내 영역의 폴리펩티드)를 이용하여, 예컨대 웨스트-웨스턴법에 의해, 또는 본 발명의 cDNA(바람직하게는 해당 폴리펩티드의 막관통 영역 또는 세포 내 영역을 암호화하는 cDNA)를 이용하여, 예컨대 효모 2-하이브리드법에 의해 해당 폴리펩티드와 세포질 내에서 상호 작용하는 하류의 신호 전달 분자의 동정, 유전자 클로닝을 행할 수도 있다.

또한 본 발명의 폴리펩티드를 이용함으로써, 본 발명의 폴리펩티드 수용체 작용 물질, 길항 물질 및 수용체-신호 전달 분자 사이의 저해제 등의 스크리닝을 행할 수도 있다.

본 발명의 cDNA는 많은 유용성이 기대되는 본 발명의 폴리펩티드를 생산할 때 중요하고도 필수적인 주형이 될 뿐만 아니라, 유전병의 진단이나 치료(유전자 결손증의 치료 또는 안티센스 DNA(RNA)에 의해서 폴리펩티드의 발현을 정지시키는 것에 의한 치료 등)에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 cDNA를 프로브로서 게놈 DNA를 분리할 수 있다. 동일하게, 본 발명의 cDNA와 상동성이 높은 인간의 관련 폴리펩티드의 유전자, 또한 마우스 이외의 생물에 있어서의 본 발명 폴리펩티드와 상동성이 높은 폴리펩티드의 유전자를 분리하는 것도 가능하다.

[의약품에의 적용]

상기한 질환에 적응하기 위해서, 본 발명의 폴리펩티드, 혹은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체는 통상, 전신적 또는 국소적으로 일반적으로는 경구 또는 비경구의 형태로 투여된다. 바람직하게는, 경구 투여, 정맥내 투여 및 뇌실내 투여이다.

투여량은 연령, 체중, 증상, 치료 효과, 투여 방법, 처리 시간 등에 따라 다르지만, 통상, 성인 1인당, 일회에 100μg∼100mg의 범위에서, 하루 일회에서 여러 번 경구 투여되거나 또는 성인 1인당, 일회에 10μg∼100mg의 범위에서, 하루 일회에서 여러 번 비경구 투여된다.

물론 상기한 바와 같이, 투여량은 여러 가지의 조건에 의해 변동하기 때문에, 상기 투여량보다 적은 량으로 충분한 경우도 있고, 또한 범위를 넘어서 필요한 경우도 있다.

본 발명 화합물을 투여할 때는, 경구 투여를 위한 고체 조성물, 액체 조성물 및 그 밖의 조성물, 비경구 투여를 위한 주사제, 외용제, 좌제 등으로서 이용된다.

경구 투여를 위한 고체 조성물에는, 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 과립제 등이 포함된다. 캡슐에는 연질 캡슐 및 경질 캡슐이 포함된다.

이러한 고체 조성물에는, 하나 또는 그 이상의 활성 물질이 적어도 하나의 불활성 희석제(예컨대, 락토오스, 만니톨, 글루코스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 미결정 셀룰로오스, 전분, 폴리비닐피롤리든, 메타 규산 알루민산 마그네슘 등)와 혼합된다. 조성물은 통상 방법에 따라 불활성 희석제 이외의 첨가물, 예컨대, 윤활제(스테아린산 마그네슘 등), 붕괴제(섬유소 글리콜산 칼슘 등), 안정화제(인간 혈청 알부민, 락토오스 등), 용해 보조제(아르기닌, 아스파라긴산 등)를 함유하고 있어도 좋다.

정제 또는 환제는 필요에 따라 백당, 젤라틴, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트 등의 위용성 혹은 장용성 필름으로 피막하더라도 좋고, 또 2이상의 층으로 피막하더라도 좋다. 또한 젤라틴과 같은 흡수될 수 있는 물질의 캡슐도 포함된다.

경구 투여를 위한 액체 조성물은 약학적으로 허용되는 유탁제, 용액제, 현탁제, 시럽제, 엘릭시르제 등을 포함하며, 일반적으로 이용되는 불활성 희석제(예컨대, 정제수, 에탄올 등)를 포함하고 있어도 좋다. 이와 같은 조성물은 불활성 희석제 이외에 습윤제, 현탁제와 같은 보조제, 감미제, 풍미제, 방향제, 방부제를 함유하고 있어도 좋다.

경구 투여를 위한 그 밖의 조성물로서는 하나 또는 그 이상의 활성 물질을 포함하며, 그 자체 공지의 방법에 의해 처방되는 스프레이제가 포함된다. 이 조성물은 불활성 희석제 이외에 아황산수소 나트륨과 같은 안정제와 등장성(等張性)을 부여하는 안정화제, 염화나트륨, 구연산나트륨 혹은 구연산과 같은 등장제를 함유하고 있어도 좋다. 스프레이제의 제조 방법은 예컨대 미국 특허 제2,868,691호 및 미국 특허 제3,095,355호 명세서에 자세히 기재되어 있다.

본 발명에 의한 비경구 투여를 위한 주사제로서는 무균의 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제, 유탁제를 포함한다. 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제로서는 하나 또는 그 이상의 활성 물질이 적어도 하나의 불활성인 희석제와 혼합된다. 수성의 희석제로서는, 예컨대 주사용 증류수 및 생리 식염수를 들 수 있다. 비수성의 희석제로서는, 예컨대 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 에탄올과 같은 알콜류, 폴리솔베이트80(등록상표) 등을 들 수 있다.

이러한 조성물은, 또한 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제(예컨대, 인간 혈청 알부민, 락토오스 등), 용해 보조제(예컨대, 아르기닌, 아스파라긴산 등)와 같은 보조제를 포함하고 있어도 좋다.

Claims (10)

1. 실질적으로 순수한 형태인 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 그 상동체, 그 단편 또는 그 단편의 상동체로 이루어진 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 것인 폴리펩티드.
3. 제1항에 기재된 폴리펩티드를 암호화하는 것인 cDNA.
4. 서열 번호 2로 표시되는 염기 서열을 갖는 제3항에 기재된 cDNA, 또는 그 서열에 선택적으로 하이브리드화하는 단편으로 이루어진 cDNA.
5. 서열 번호 3으로 표시되는 염기 서열을 갖는 제3항에 기재된 cDNA, 또는 그 서열에 선택적으로 하이브리드화하는 단편으로 이루어진 cDNA.
6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 cDNA로 이루어진 복제 또는 발현 벡터.
7. 제6항에 기재된 복제 또는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
8. 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드를 발현시키기 위한 조건하에서 제7항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 상기 폴리펩티드의 제조 방법.
9. 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드의 모노크로날 또는 폴리클로날 항체.
10. 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드 또는 제9항에 기재된 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.