WO1999055863A1 - Nouveau polypeptide, adnc le codant et son utilisation - Google Patents

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WO1999055863A1
WO1999055863A1 PCT/JP1999/002283 JP9902283W WO9955863A1 WO 1999055863 A1 WO1999055863 A1 WO 1999055863A1 JP 9902283 W JP9902283 W JP 9902283W WO 9955863 A1 WO9955863 A1 WO 9955863A1
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WO
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polypeptide
cdna
present
cells
activity
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PCT/JP1999/002283
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Inventor
Tasuku Honjo
Kei Tashiro
Tomoyuki Nakamura
Original Assignee
Ono Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
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    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to novel polypeptides, cDNAs encoding the polypeptides, and uses thereof.
  • cardiovascular disease is an area of great interest because cardiovascular disease is the cause of death.
  • Studies in the cardiovascular area have revealed important facts about arterial intimal remodeling and arterial remodeling, both of which are thought to contribute to plaque formation and stenosis in arteriosclerosis.
  • the three components that make up the disease of the arterial wall are: a) proliferation of smooth muscle cells, macrophages and lymphocytes, b) formation of connective tissue, c) accumulation of fat and cholesterol in the newly formed connective tissue matrix, It is.
  • the present inventors have made intensive efforts for the purpose of isolating a molecule relating to a portion constituted by smooth muscle in angiogenesis and using it for controlling the proliferation of abnormal smooth muscle cells as described above.
  • Conventionally when attempting to obtain a specific polypeptide or cDNA encoding the same, the desired biological activity is confirmed in a tissue or cell culture, and then the gene is isolated and purified through polypeptide purification.
  • a method of cloning or a method of expression cloning of a gene using its biological activity as an index has been generally used.
  • bioactive polypeptides in vivo often have a variety of biological activities, and as a result of cloning a gene using a certain activity as an index, it is identical to a known polypeptide. Increasingly, there are cases where certain things become clear later. In addition, many factors are produced only in minute amounts or are expressed only under special physiological conditions, making isolation, purification, and confirmation of biological activity difficult.
  • the present inventors focus on novel factors (polypeptides) that are useful in the treatment, diagnosis, or research of diseases related to abnormal proliferation of smooth muscle cells, and find them by focusing on secretory proteins and membrane proteins having secretory signals. To this end, we worked diligently.
  • the present inventors have so far studied the cloning of genes for growth / differentiation factors that work in the hematopoietic and immune systems. And growth differentiation factors (eg, various site ) And membrane proteins such as their receptors (hereinafter collectively referred to as secreted proteins, etc.) have a sequence called a signal peptide at the N-terminus.
  • yeast SST method a method for isolating a gene encoding a signal peptide more efficiently and easily using yeast.
  • the cDNA sequence provided by the present invention is named mouse A55 clone, and is based on information obtained using the above yeast SST method from a cDNA library prepared from mouse fetal heart tissue. Isolated.
  • the mouse A55 clone is a full-length chain cDNA containing the complete cDNA sequence encoding a secreted protein (represented herein as mouse A55 protein).
  • the present inventors have found that the polypeptide suppresses the proliferation of vascular smooth muscle cells. It has been confirmed that it has an effect. Therefore, the polypeptide is considered to be useful for treating diseases related to abnormal smooth muscle proliferation, such as intimal thickening and fibroids that cause restenosis after arteriosclerosis and percutaneous coronary angioplasty (PTCA).
  • diseases related to abnormal smooth muscle proliferation such as intimal thickening and fibroids that cause restenosis after arteriosclerosis and percutaneous coronary angioplasty (PTCA).
  • PTCA percutaneous coronary angioplasty
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 6, or 9;
  • FIG. 1 shows how mouse A55 protein inhibits PDGF-stimulated proliferation of rat aortic vascular smooth muscle cells. Detailed description
  • the present invention relates to a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 6, or 9 in substantially pure form, a homolog thereof, a fragment of the sequence, and a homolog thereof.
  • the present invention further relates to cDNAs encoding those polypeptides. More specifically, a cDNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 5, 7, or 10, and a cDNA having a fragment that selectively hybridizes to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 5, 7, or 10 About DNA.
  • the hybridizing cDNA also includes the complementary sequence of the above sequence. Hybridization is preferably performed under stringent conditions.
  • a polypeptide consisting of a sequence is generally a polypeptide comprising at least 90%, for example, 95, 98 or 99%, of the polypeptide at the time of production consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 6 or 9. Means that.
  • a homologue of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 6, or 9 is generally at least 20, preferably at least 30, for example, 40, 60 or 100 contiguous amino acid regions, It is at least 70%, preferably at least 80 or 90%, more preferably 95% or more homologous, and such homologues are hereinafter described as polypeptides of the present invention.
  • a fragment of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 6 or 9 or a fragment of a homolog thereof is at least 10 amino acids, preferably at least 15 amino acids, for example, 20, 25, 30, 40 Means a 50 or 60 amino acid moiety.
  • a cDNA that selectively hybridizes to a cDNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, 5, 7, or 10 is generally at least 20, preferably at least 30, for example, 40, 60 or 100 It is a contiguous base sequence region that is at least 70%, preferably at least 80 or 90%, more preferably 95% or more homologous, and such cDNA is hereinafter referred to as cDNA of the present invention.
  • the fragment of cDNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 5, 7 or 10 means at least 10 bases, preferably at least 15 bases, for example, 20, 25, 30 or 40 bases, and Such fragments are also included in the cDNA of the present invention.
  • the present invention includes a replication or expression vector comprising the cDNA of the present invention.
  • the vector comprises, for example, an ori region and, if necessary, a promoter for expression of the above-mentioned cDNA, a regulator of the promoter, etc. Plasmid, virus or phage vectors.
  • the vector may contain one or more selectable marker gene, for example, an ampicillin resistance gene.
  • the vector can be used in vitro, for example, for producing RNA corresponding to cDNA and transforming host cells.
  • the present invention replicates or expresses the cDNA of the present invention containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 3, 5, 7, 8, or 10, or a cDNA comprising the open reading frame thereof.
  • host cells transformed with the vector for purification.
  • Cells include, for example, bacteria, yeast, insect cells or mammalian cells.
  • the present invention also includes a method for producing the polypeptide of the present invention, which comprises culturing the host cell of the present invention under conditions for expressing the polypeptide of the present invention.
  • the cultivation is preferably performed under conditions in which the polypeptide of the present invention is expressed and produced from host cells.
  • Antisense RNA can also be produced by inserting the cDNA of the present invention into the antisense region of a vector as described above. Such antisense RNA can also be used to control the level of the polypeptide of the present invention in cells.
  • the present invention also includes a monoclonal or polyclonal antibody of the polypeptide of the present invention.
  • the present invention also includes a method for producing a monoclonal or polyclonal antibody of the polypeptide of the present invention.
  • Monoclonal antibodies can be produced by ordinary hybridoma technology using the peptide of the present invention or a fragment thereof as an antigen.
  • a polyclonal antibody can be produced by a usual method of inoculating a host animal (for example, a rat or a heron) with the polypeptide of the present invention and collecting an immune serum.
  • the present invention provides a polypeptide of the present invention, an antibody thereof and a pharmaceutically acceptable excipient. Also included are pharmaceutical compositions containing the agent and / or carrier.
  • polypeptide of the present invention of (1) the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 4, 6, or 9 and partially deleted (for example, Polypeptides consisting only of a part essential for the expression of activity, etc.), those partially substituted with other amino acids (eg, those substituted with amino acids having similar physical properties), and those of the above-mentioned polypeptide of the present invention. It also includes those with other amino acids added or inserted.
  • nucleotide sequence of cDNA can be changed without changing the amino acid sequence of the polypeptide.
  • the cDNA of the present invention specified by (2) includes all base sequence groups encoding the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1, 4, 6, or 9 of (1). Changing the nucleotide sequence may improve the productivity of the polypeptide.
  • the cDNA specified in (3) is an embodiment of the cDNA specified in (2) and represents a natural sequence.
  • the cDNA shown in (4) shows the sequence obtained by adding the natural untranslated portion to the cDNA specified in (3).
  • Preparation of a cDNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 8 is performed according to the following method.
  • invertase In order for yeasts such as Saccharomyces cerevisiae to use sucrose or raffinose as an energy or carbon source, invertase must be secreted into the medium (invertase is It is an enzyme that breaks down sucrose into sucrose and melibiose, and sucrose into fructose and glucose. ). It is also known that many known mammalian signal peptides can secrete yeast invertase.
  • this method was used as a method for screening a novel signal peptide that enables the secretion of yeast inbellase from a mammalian cDNA library using yeast growth on a roughinos medium as an indicator.
  • the non-secretory invertase gene SUC2 (GENBANK accession No. V0131l) from which the translation start point ATG was deleted was incorporated into a yeast expression vector to prepare a yeast SST vector pSUC2.
  • the expression vector contains the AH5 plasmid (Gammerer, Methods in Enzymol. 101,192-201,1983) -derived expression promoter (ADH promoter) and Yuichi Minei Ichiichi (ADH terminator). 2 ori as the yeast replication origin, TRP 1 as the yeast selection marker, Co 1 E1 ori as the E. coli replication origin, and the ampicillin resistance gene as the E. coli drug resistance marker.
  • a yeast SST cDNA library was prepared by incorporating mammalian cDNAs upstream of the SUC2 gene. This library was transformed into a yeast deficient in secreted invertase. If the integrated mammalian cDNA encodes a signal peptide, the secretion of yeast-expressed ymvertase is more likely, and it is possible to grow on roughinos medium. Become.
  • a yeast was cultured from the colonies that appeared, a plasmid was prepared, and the nucleotide sequence of the insert cDNA was determined, thereby making the search for a novel signal peptide quick and easy.
  • step (1) after stimulating with a suitable stimulant from a target mammalian organ or cell line as necessary, a known method (hereinafter, known methods are not particularly described. For example, Molecular Cloning (by Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T., published in 1989 from the Cold Spring Harbor Laboratory Press) or Current Protocol in Molecular Biology (edited by FM Ausubel et al., From John Wiley & Sons, Inc.) Publication), and isolation of mRNA is performed according to).
  • Tissues of interest include the fetal mouse heart.
  • the synthesis of double-stranded cDNA using a random primer is performed by a known method.
  • restriction enzyme (enzyme I) site to be connected to the adapter and the restriction enzyme (enzyme II) site used in the next step (2) may be any as long as they are different from each other.
  • Xho I is used as enzyme I
  • EcoR I is used as enzyme II.
  • step (2) the ends are blunted with T4 DNA polymerase, an enzyme II adapter is ligated, then digested with enzyme I, and 300 to 800 bp of cDNA is fractionated by agarose electrophoresis (AGE).
  • Enzyme II may be anything that is different from enzyme I as described above.
  • Step (3) is a step of transforming Escherichia coli by incorporating the cDNA fragment obtained in (2) upstream of the invertase gene from which the signal peptide linked to the yeast expression plasmid vector has been deleted.
  • various plasmid vectors for yeast expression are known, for example, in E. coli.
  • YE p24 which also functions, is used, but preferably, the above-described plasmid pSUC2 is used.
  • E. coli strains for transformation are already known, and are preferably DH10B competent cells.
  • the transformation may be carried out by any known method, but is preferably carried out by an electroporation method.
  • the transformant is cultured by a known method to obtain a cDNA library for yeast SST.
  • the cDNA library is transformed into a yeast Saccharomycs cerevisiae without the invertase gene (for example, strain YT455) or a strain in which the invertase gene has been artificially deleted (can be prepared by a known method).
  • the cDNA library is introduced, and a fragment having a sequence encoding a signal peptide is screened.
  • the yeast is transformed by a known method, for example, the lithium acetate method. After the transformants are grown on a selective medium, they are transferred to a medium containing raffinose as a carbon source, and a viable colony is selected, and the plasmid is recovered. The fact that yeast grew using roughinos as a carbon source indicates that a signal peptide of some secreted protein had been incorporated into the library.
  • nucleotide sequence of the isolated positive clone was determined, and for cDNA that was found to encode an unknown protein, a full-length clone was isolated using it as a probe, and the full-length nucleotide sequence was determined. Can be determined. These operations are performed by methods known to those skilled in the art.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 5, 7, or 10 is partly, preferably, When all are confirmed, cDNA encoding the protein of the present invention present in mammals or cDNA encoding homologs and subsets of the protein of the present invention can be obtained.
  • oligonucleotide having an appropriate nucleotide sequence is synthesized, and the resulting oligonucleotide is used to hybridize from a mammal-derived cDNA library or mRNA by PCR, or by hybridization using a fragment of the appropriate nucleotide sequence as a probe.
  • cDNA encoding another mammalian type of the protein can be obtained from another mammalian cDNA library or the genomic library.
  • the cDNA thus obtained contains the base sequence of the cDNA fragment obtained by SST (or a homologous sequence thereof), it means that it encodes a signal peptide. It is clear that the cDNA is full-length or almost full-length (the signal peptide is coded at the 5 'end of the open reading frame of cDNA, since the signal peptide is without exception at the N-terminus of the protein).
  • the full length may be confirmed by Northern analysis using the cDNA as a probe according to a known method.
  • the size of the mRNA obtained from the hybridized band is compared with the size of the cDNA, and if they are almost the same, the cDNA is considered to be almost full length.
  • the present invention provides both full-length as well as mature forms of the disclosed proteins.
  • the full-length forms of those proteins are identified by the translated amino acid sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 7.
  • These mature proteins can be obtained by expressing the full-length DNA represented by SEQ ID NO: 3 or 8 in a suitable mammalian cell or other host cells.
  • the sequence of the mature protein can be predicted from the full-length amino acid sequence.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 5, 7, or 10 is determined, it is then chemically synthesized or a fragment of the nucleotide sequence is chemically synthesized. By hybridizing this as a probe, the cDNA of the present invention can be obtained.
  • a required amount of the desired cDNA can be obtained by introducing a vector cDNA containing the present cDNA into an appropriate host and growing the vector.
  • an initiation codon is added to the 5 'end of cDNA encoding the mature protein portion, and the resulting cDNA is cloned into a suitable promoter (eg, trp promoter). Lac promoter, ⁇ L promoter, ⁇ 7 promoter, etc.) and inserted into a vector that functions in E. coli (eg, pBR322, pUC18, pUC19, etc.) to produce an expression vector.
  • Escherichia coli for example, E. Coli DH1, E. Coli JMl09, E. Coli HB101 strain, etc. transformed with this expression vector is cultured in an appropriate medium, and the target cells are transformed from the cells.
  • a peptide can be obtained.
  • the use of a bacterial signal peptide allows secretion of the target polypeptide into periplasm. In addition, it can produce fusion proteins with other polypeptides.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 5, 7, or 10 may be replaced with an appropriate vector (for example, a retrovirus vector, a papilloma virus vector, Vaccinia virus vector, SV40 vector vector, etc.) and inserted into the downstream of an appropriate promoter (eg, SV40 promoter, LTR promoter, meta-mouth thionine promoter, etc.) and expressed.
  • an appropriate promoter eg, SV40 promoter, LTR promoter, meta-mouth thionine promoter, etc.
  • appropriate mammalian cells eg, monkey COS-1 cell, COS-7 cell, Chinese Hamster CH ⁇ cell, mouse L cell, etc.
  • the transformant is transformed into an appropriate transformant.
  • the protein of the present invention which is a secretory protein, is expressed as the polypeptide of interest in the cell supernatant. Furthermore, fusion with other polypeptides, for example, a cDNA fragment encoding the constant region (Fc portion) of an antibody, can produce fusion protein.
  • the polypeptide obtained as described above can be isolated and purified by a general biochemical method. Industrial applicability
  • polypeptides of the present invention and the cDNA encoding them exhibit one or more effects or biological activities, including those associated with the assays listed below.
  • the effects or biological activities described with respect to the proteins of the present invention may be due to the administration or use of the protein, or the administration or use of the cDNA encoding the protein (eg, for gene therapy or transduction of cDNA).
  • a suitable vector e.g., A suitable vector.
  • the present inventors have confirmed that the polypeptide of the present invention has an effect of suppressing proliferation of vascular smooth muscle cells. Therefore, diseases involving abnormal proliferation of smooth muscle using the polypeptides of the present invention, such as arteriosclerosis and angiointimal thickening resulting in restenosis after percutaneous coronary angioplasty (PTCA), fibroids, etc. It is considered applicable to treatment.
  • PTCA percutaneous coronary angioplasty
  • the present invention is not limited thereto, but may exhibit the following activities.
  • the protein of the present invention may exhibit cytodynamic activity and cell proliferation (induction or inhibition) Z differentiation activity (induction or inhibition), or induce or suppress the production of other cytokines in a certain cell population.
  • proteinaceous factors including all known cytokines, have been active in one or more factor-dependent cell proliferation assays, so that Serves as a convenient method for confirming inactivity.
  • the activity of the proteins of the present invention can be demonstrated by any of a number of conventional factor-dependent cell line cell proliferation assays.
  • proteins of the present invention also exhibit immunostimulatory and immunosuppressive activities. Certain proteins may also regulate (stimulate or inhibit) the growth and proliferation of, for example, T and / or B lymphocytes, as well as affect the cytotoxic activity of NK cells and other populations. It is considered that the treatment is effective for the treatment of various immunodeficiencies and diseases (including severe combined immunodeficiency (SCID)).
  • SCID severe combined immunodeficiency
  • immunodeficiencies can be hereditary or can be caused, for example, by viruses such as HIV, or by bacterial or fungal infections. Alternatively, it may be from an autoimmune disease.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • hepatitis viruses herpes viruses, cono qualino vmycobacteria
  • leishmania lehmania
  • malaria Candida
  • Candida Candida
  • the proteins of the present invention are also believed to be effective in treating allergic reactions and conditions such as asthma and other respiratory diseases. It is contemplated that other conditions in which immunosuppression is desired (including, for example, asthma and related respiratory diseases) can be treated using the proteins of the present invention.
  • the protein of the present invention may be, for example, an infection such as septic shock or systemic inflammatory response syndrome (SIRS), inflammatory bowel disease, Crohn's disease, or TNF which has been proved effective by IL-11. It may also suppress chronic or acute inflammation associated with infections, such as those resulting from overproduction of cytokins such as IL-11 and IL-11.
  • SIRS systemic inflammatory response syndrome
  • IL-11 inflammatory bowel disease
  • Crohn's disease Crohn's disease
  • TNF chronic or acute inflammation associated with infections, such as those resulting from overproduction of cytokins such as IL-11 and IL-11.
  • the protein of the present invention is expected to be effective in controlling hematopoietic cells and, correspondingly, in treating myeloid or lymphoid cells deficiency. Even weak bioactivity with the help of colony forming cells or factor-dependent cell lines suggests that they may be involved in the control of hematopoietic cells.
  • the biological activity relates to one or all of the following examples. Supports the growth and proliferation of erythroid progenitors alone, or in combination with other cytokins, and suggests their efficacy, such as treating various anemias, or producing erythroid progenitors and / or erythrocytes Irritating radiation therapy used in combination with chemotherapy;
  • myeloid cells such as granulocytes and monocytes macrophages (ie, classic CSF activity), combined with chemotherapy to prevent myelosuppression associated with chemotherapy;
  • hematopoietic stem cells that can mature into some or all of the hematopoietic cells, and thus supports various stem cell disorders, including but not limited to aplastic anemia and paroxysmal nocturnal hemoglobinuria Can be found to be therapeutically effective (as is commonly treated with transplantation), and can be used to transform normal cells or cells genetically engineered for gene therapy into cells in vitro (in-vitro) or ex-vivo. The same is true of reconstitution of the stem cell fraction after chemotherapy with radiation therapy (ie, associated with bone marrow transplantation).
  • radiation therapy ie, associated with bone marrow transplantation
  • the protein of the present invention can be measured by the following method, among other methods.
  • the proteins of the present invention are believed to be used in any of bone, cartilage, tendons, ligaments, and nerve tissue growth or regeneration, as well as wound healing and tissue repair, and treatment of burns, incisions, and ulcers. Can be
  • Proteins of the invention that induce cartilage and / or bone or any growth in an environment that does not form bone normally have application in the healing of fractures and cartilage damage or defects in humans and other animals. It is considered that the preparation using the protein of the present invention can be used prophylactically for reduction of closed fracture as well as open fracture and improvement of fixation of artificial joint.
  • New bone formation induced by osteogenic agents contributes to the repair of congenital, traumatic, and craniofacial defects induced by carcinomactomy. It is also effective in the field of cosmetic plastic surgery.
  • the proteins of the present invention are also believed to be used in the treatment of periodontosis and other dental restorations. Such drugs are thought to provide an environment that attracts osteogenic cells, stimulates their proliferation, and induces their progenitor cells to differentiate.
  • the protein of the present invention inhibits the process of inflammation or tissue destruction (collagenase activity or osteoclast activity) mediated by stimulating bone and / or cartilage or any repair. Therefore, it is considered to be effective in treating osteoporosis and osteoarthritis.
  • tissue regeneration activity that may be attributed to the proteins of the present invention is tendon ligament formation.
  • the protein of the present invention induces such tissue formation in an environment where tendon ligament-like tissue or other tissue is not properly formed, but it has been found that tendon ligament lacerations, malformations, and other disorders in humans and other animals. Applicable for healing of disorders of tendon Z ligament.
  • Formulations using proteins that induce tendon ligament-like tissue can be used to improve the fixation of tendon Z ligaments to bone or other tissues and to repair tendon / ligament tissue defects, as well as tendons or ligaments Prophylactic use for the protection of injuries is also conceivable.
  • Neoplastic tendon / ligament-like tissue formation induced by the compositions of the present invention contributes to the repair of congenital, traumatic, or tendon or ligament defects of other origin. It is also effective in cosmetic plastic surgery in which a tendon or ligament is attached or repaired.
  • constructs of the present invention provide an environment that attracts tendon ligament forming cells, stimulates their proliferation, and induces their progenitor cells to differentiate.
  • the inducible ligament cells or progenitor cells thereof are induced ex vivo in preparation for return to in vivo.
  • compositions of the present invention are also effective in treating tendinitis, Caital tunnel syndrome, and other tendon or ligament defects.
  • the compositions also include sequestering agents well known to those skilled in the art, as well as suitable matrices and carriers.
  • the protein of the present invention may be used for the growth of nerve cells and the regeneration of nerve and brain tissue, i.e., for central and central trauma as well as mechanical and traumatic disorders including degeneration, death or trauma of nerve cells or nerve tissue. It is also expected to be effective in treating peripheral nervous system diseases and neurological diseases.
  • certain proteins are diseases of the peripheral nervous system, such as peripheral neuropathy, peripheral neuropathy, and focal neurosis, and Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, And may be effective in treating central nervous system disorders such as Shy-Drager syndrome.
  • Further conditions that can be treated in accordance with the present invention include mechanical and traumatic disorders such as spinal cord disorders, head trauma, and cerebrovascular diseases such as stroke.
  • Peripheral neurosis resulting from chemotherapy or other treatments can also be treated using the proteins of the present invention.
  • the protein of the present invention may have an activity of producing other tissues such as organs including, for example, the liver, liver, intestine, kidney, skin, endothelium, smooth, skeletal or cardiac muscle, and vascular tissue including vascular endothelium, or the like. It is also expected to exhibit the activity of promoting or suppressing the proliferation of cells constituting such tissues. Some of the desired effects may also be mediated by inhibition of fibrous scars that regenerate normal tissue. It is believed that the protein of the present invention is also effective in protecting or regenerating the digestive tract and in treating lung or liver fibrosis, reperfusion injury of various tissues, and conditions caused by systemic site force-in disorder. Can be
  • the proteins of the present invention exhibit activity associated with activin / inhibin.
  • Activin is characterized by its ability to stimulate the release of follicle-stimulating hormone (FSH)
  • inhibin is characterized by its ability to inhibit the release of follicle-stimulating hormone (FSH).
  • FSH follicle-stimulating hormone
  • the proteins of the invention may be heterodimers, alone or with members of the inhibin a family, and It is considered to be effective as a contraceptive regulator based on the activity of inhibin, which reduces the fertility of females and reduces spermatogenesis in males. Administration of sufficient amounts of other inhibins can induce infertility in mammals.
  • the protein of the present invention is a homodimer or heterodimer with other protein subunits of the inhibin i3 group, and is a therapy based on the activity of an activin molecule that stimulates follicle-stimulating hormone (FSH) release from cells of the pituitary gland. It is considered to be effective as an effective fertility inducer (see US Pat. No. 4,798,885).
  • the proteins of the present invention are believed to be effective in hastening the onset of pregnancy in sexually immature mammals in order to extend the lifespan of livestock such as cattle, sheep and pigs.
  • the protein of the present invention can be used, for example, on mammalian cells including monocytes, neutrophils, T cells, mast cells, eosinophils, and endothelial cells, or any of them, for example, as a chemokine. ) It is considered to have chemotactic chemokinetic activity.
  • Chemotaxis Chemomotility proteins can be used to immobilize or attract a desired cell population to a desired site of a reaction.
  • Chemotactic chemokinetic proteins offer special advantages in the treatment of wounds and other trauma, as well as local infections. For example, attracting lymphocytes, monocytes, or neutrophils to a tumor or site of infection may improve the immune response to the tumor or site of infection.
  • a protein or peptide retains chemotactic activity on a particular cell population if it can directly or indirectly stimulate the indicated direction or movement of that cell population. Desirably, the protein or peptide retains the activity of directly stimulating the directed movement of the cell.
  • Whether a particular protein retains chemotactic activity against a population of cells depends on The use of such a protein or peptide in any known cell chemotaxis assay can be readily determined.
  • proteins of the present invention also exhibit clotting or thrombotic activity. As a result, such proteins are expected to be effective in treating a variety of coagulation disorders, including genetic disorders such as hemophilia. Alternatively, it is expected to promote clotting and other clotting events in the treatment of wounds resulting from trauma, surgery or other causes.
  • the protein of the present invention is also considered to be effective in dissolving or inhibiting the formation of thrombus, and in treating and preventing conditions caused by thrombus or stroke.
  • the protein of the present invention may exhibit the activity of a receptor, a receptor Z ligand or a receptor Z ligand as an inhibitor or agonist.
  • receptors and ligands include cytokine receptors and their ligands, receptor kinases and their ligands, receptor phosphatases and their ligands, and receptors associated with cell-cell interactions (Selectin). ), Integrin and its ligands, cell adhesion molecules including receptor kinases) and their ligands, and receptor Z ligands involved in antigen presentation, antigen recognition, and development of cellular and humoral immune responses
  • the present invention is not limited thereto.
  • Receptors and ligands are also effective in screening for possible peptides or small molecules for their interaction.
  • the proteins of the present invention including but not limited to receptor and ligand fragments, are believed to be effective as inhibitors of autologous receptor-ligand interactions.
  • the protein of the present invention can also be used as a nutrient source or supplement. Such uses include, but are not limited to, protein and amino acid supplementation, use as a carbon and nitrogen source, and use as a carbohydrate source.
  • the protein of the present invention can be added to the food of each organism, and can be taken as a separate solid or liquid, such as in the form of powders, tablets, solutions, suspensions, and capsules. Wear.
  • the protein of the present invention can be added to a culture solution.
  • Forced-herin is a calcium-dependent adhesion molecule that has been shown to play a major role in ontogenesis, especially in recognizing cell types. Deletion or alteration of normal cadherin expression can result in altered cell adhesion leading to tumor growth or metastasis. Forced-dherin dysfunction has also been linked to other diseases of humans, such as pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus (autoimmune plaque dermatoses), Crohn's disease, and some developmental abnormalities.
  • the members of the force helicopter-per-family are over 40 and show individually different occurrence patterns. Although all members of the cadherin superfamily have a common conserved extracellular repeat (cadherin domain), structural differences are observed at other sites in the molecule.
  • Calcium is essential for adhesion because the force doherin domain binds to calcium and forms a quaternary structure between force doherins. Only a few amino acids of the first force doherin domain are essential for homophilic adhesion.
  • This modification of the recognition site can alter the specificity of force-doherin, so that the mutant molecule can not only recognize itself but also bind to different cadherins. Some force doherins also heteroheterically adhere to different force doherins.
  • E-forced herin is a member of the cadherin superfamily and is expressed in epithelial cell lines. If E-force doherin expression is not found in the tumor When pathological, malignant cells infiltrate and cancer spreads. Transfection of cancer cell lines with the gene for E-drugin restores cell shape to normal, maintains cell-cell and substrate adhesion, slows cell growth, and is anchorage-independent. A dramatic decrease in cell proliferation reverses the changes associated with cancer. The expression of E-cadherin thus introduced returns to a stage where cancer progression is low. Another force, doherin, is more likely to have the same invasive suppression function in cancers from different tissues.
  • the protein of the present invention having a force doherin activity and the gene of the present invention encoding the same can be used for treating cancer.
  • Introducing such a protein or gene into cancer cells can reduce or eliminate the changes seen in cancer cells by providing normal expression of force doherin.
  • Cancer cells may also show expression of force doherin in different tissues. As a result, these cells can invade and metastasize to different tissues in the body.
  • the protein of the present invention having cadherin activity and the gene of the present invention encoding the same can be replaced with ectopically expressed force doherin. As a result, they maintain normal cell adhesion and reduce or eliminate metastasis.
  • the protein of the present invention having a force doherin activity and the gene of the present invention encoding the same can be used for production of an antibody that recognizes and binds force doherin.
  • Such antibodies can be used to block the binding of ectopically expressed doherin to cancer cells, preventing the formation of cancer.
  • Such anti-cadherin antibodies can also be used as an indicator of cancer grade, pathological type, and prognosis. That is, if the cancer is more advanced, the expression of force dherin will be lower, and a decrease in expression of force dherin can be detected by using an antibody that binds to force dherin.
  • a fragment of the protein of the present invention having a force-doherin activity preferably 10 peptides at the force-doherin recognition site, and a gene encoding such a protein fragment of the present invention bind to cadherin to produce an undesirable effect. Also used to block cadherin function by interfering with cadherin binding it can.
  • a fragment of the protein of the present invention having cadherin activity preferably a truncated solubilizing doherin fragment circulating stably in cancer patients, and a gene encoding such a protein fragment of the present invention are unique. Can be used to inhibit cell-cell adhesion.
  • the proteins of the present invention may exhibit additional anti-tumor activities.
  • the protein is believed to inhibit tumor growth either directly or indirectly, such as through ADCC. Proteins also inhibit tumor growth by acting on tumor tissue or tumor progenitors, thereby inhibiting the formation of tissues necessary to support tumor growth (eg, inhibiting angiogenesis). May produce tumor inhibiting activity by removing or inhibiting a factor, active agent or cell type that promotes tumor growth by producing another factor, active substance or cell type.
  • the proteins (polypeptides) of the invention may exhibit one or more of the following additional activities or effects: infectious agents, including bacteria, viruses, molds, and other parasites Kills;
  • Affects behavioral characteristics including appetite, libido, stress, cognition (cognitive impairment), depression, and violent behavior;
  • Proteins having the above activities include, for example, proliferation or cell death of B cells, T cells, and mast cells, class-specific induction of immunoglobulins by promoting class switches, differentiation of B cells into antibody-producing cells, granulocyte precursor cells Proliferation or differentiation, cell death, monocyte-macrophage progenitor cell proliferation or differentiation, cell death, neutrophil, monocyte-macrophage, eosinophil, basophil proliferation or hyperactivity, cell death, megakaryocyte precursor Cell proliferation or cell death, neutrophil precursor cell proliferation or differentiation, cell death, B or T precursor cell proliferation or differentiation, cell death, erythrocyte production promotion, erythrocyte, neutrophil, eosinophil, basophil Spheres, monocytes, macrophages, mast cells, megakaryocyte progenitor cells,
  • the peptide of the present invention since the peptide of the present invention is also expected to act on the nervous system, it differentiates into various neurotransmitter-operated neurons and maintains their survival or cell death, promotes proliferation or death of glial cells, neurites Growth, maintenance or death of ganglion cells, proliferation or differentiation promotion of astrocytes or cell death, proliferation or maintenance of peripheral nerves, cell death, proliferation or cell death of Schwann cells, proliferation of motor nerves or It is thought that it also has the effect of maintaining survival and cell death.
  • polypeptide of the present invention may be used in the developmental process of the early embryo during the development of the early embryo, such as formation of the epidermis, brain, spine, and nerve by the action of inducing ectoderm, the dorsal cord connective tissue (bone, muscle, tendon) and blood cells by the action of inducing mesoderm.
  • Organ formation of cells, heart, kidney, gonads, or digestive organs (stomach, intestine, liver, kidney), respiratory system by endoderm induction (Pulmonary, tracheal) formation is considered to have a promoting or inhibiting effect, and it is considered that adults also have the effect of inhibiting the growth or growth of the above organs.
  • the polypeptide of the present invention itself may be a disease relating to a decrease or increase in the function of the immune system or nervous system or bone metabolism, or a hypoplasia or abnormal proliferation of hematopoietic cells, such as an inflammatory disease (rheumatic disease).
  • a disease relating to a decrease or increase in the function of the immune system or nervous system or bone metabolism, or a hypoplasia or abnormal proliferation of hematopoietic cells, such as an inflammatory disease (rheumatic disease).
  • hematopoietic stem cells after bone marrow transplantation, Decrease in leukocytes, platelets, B cells or T cells after irradiation or chemotherapy for cancer, leukemia, anemia, infection, cancer , Leukemia, AIDS, bone metabolism disorders (osteoporosis, etc.), arteriosclerosis, various degenerative diseases (Alzheimer's disease, multiple sclerosis, etc.), or as a preventive or therapeutic agent for nerve damage.
  • polypeptide of the present invention is considered to have an action of dividing and proliferating organs derived from the ectoderm, mesoderm or endoderm, each of the organs (epidermal, bone, muscle, tendon, heart, kidney, stomach, intestine) , Liver, kidney, lung, trachea, etc.).
  • polypeptide of the present invention can be quantified in vivo using a polyclonal antibody or a monoclonal antibody of the polypeptide of the present invention, whereby a study of the relationship between the polypeptide of the present invention and a disease or diagnosis of a disease can be performed. It can be used for Polyclonal and monoclonal antibodies can be prepared by known methods using the polypeptide of the present invention or a fragment thereof as an antigen.
  • polypeptide of the present invention for example, preparing an affinity column to identify and purify a known or unknown protein (ligand) that binds to the polypeptide of the present invention, or to clone the gene thereof. Can be done.
  • the polypeptide of the present invention can be used, for example, by the West-Western method, or the cDNA of the present invention (preferably, the polypeptide encoding the polypeptide of the present invention).
  • the yeast 2-hybrid method can be used to identify a molecule that interacts with the polypeptide of the present invention and to perform genetic coupling.
  • polypeptide of the present invention screening for the polypeptide receptor-agonist of the present invention, an agonist, an inhibitor between a receptor and a signaling molecule, and the like can be performed.
  • Screening can be performed, for example, by the following method. That is,
  • a reaction mixture containing the polypeptide of the present invention, the compound to be screened, and the cells is combined under conditions in which the cells are normally stimulated by the peptide of the present invention. And a peptide other than the peptide of the present invention for effectively observing the function of the peptide of the present invention and the label introduced therein);
  • Rat vascular smooth muscle cell line (ATCC CRI ⁇ 1444 or CRL-1476) is spread on a plate and cultured for 24 hours in the presence of 10% serum, preferably at 1, 10, or 50 ng Zm 1 Replace with a serum-free medium containing human PDGF-BB (GENZYME) at a concentration. If you screening a compound having an en evening agonist activity of A 5 5 protein, was added this time A 5 5 protein and screening compound to be simultaneously added 3 H- thymidine after 2 4 hours incubation, the By measuring the 3 H incorporated into the cells after 4 hours of culturing, a compound that inhibits the activity of inhibiting the A 55 protein from taking up 3 H-thymidine can be screened.
  • 10% serum preferably at 1, 10, or 50 ng Zm 1 Replace with a serum-free medium containing human PDGF-BB (GENZYME) at a concentration.
  • the cDNA of the present invention is not only an important and essential type II for producing the polypeptide of the present invention, which is expected to have great utility, but also the diagnosis and treatment of genetic diseases (treatment of gene deficiency). Alternatively, it can be used for treatment by stopping expression of polypeptide by antisense DNA (RNA).
  • RNA antisense DNA
  • genomic DNA can be separated using the C DNA of the present invention as a probe.
  • a mouse or human related polypeptide gene highly homologous to the cDNA of the present invention or a polypeptide gene highly homologous to the polypeptide of the present invention in an organism other than mouse or human is isolated. This is also possible.
  • the polypeptide of the present invention or an antibody against the polypeptide of the present invention is usually administered systemically or locally, generally orally or parenterally.
  • Preferred are oral administration, intravenous administration and intraventricular administration.
  • Dosage varies depending on age, body weight, symptoms, therapeutic effect, administration method, treatment time, etc., but usually, once per day per adult, in the range of lOOg to lOOmg per day. It is administered orally several times, or parenterally once a day, several times a day, in the range of 10 g to 10 Omg per adult.
  • the dose varies depending on various conditions, so that a dose smaller than the above-mentioned dose may be sufficient, or may be required outside the range.
  • a solid composition or liquid composition for oral administration When administering the compound of the present invention, a solid composition or liquid composition for oral administration And other compositions, parenteral injections, external preparations, suppositories and the like.
  • Solid compositions for oral administration include tablets, pills, capsules, powders, granules and the like.
  • Capsules include soft capsules and hard capsules.
  • the one or more active substances include at least one inert diluent (e.g., lactose, mannitol, dalcose, hydroxypropylcellulose, microcrystalline cellulose). , Starch, polyvinylpyrrolidone, magnesium aluminate metasilicate, etc.).
  • the composition may contain additives other than an inert diluent, for example, a lubricant (eg, magnesium stearate), a disintegrant (eg, calcium cellulose glycolate), a stabilizer (eg, human serum albumin, lactate). And solubilizers (arginine, aspartic acid, etc.).
  • Tablets or pills may be coated with a gastric or enteric film such as sucrose, gelatin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, etc., if necessary, or with two or more layers. Good. Also included are capsules of absorbable materials such as gelatin.
  • Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs and the like, and commonly used inert diluents (eg, purified water, Ethanol etc.). Such compositions may contain, in addition to the inert diluent, adjuvants such as wetting agents and suspending agents, sweetening agents, flavoring agents, flavoring agents, and preservatives.
  • adjuvants such as wetting agents and suspending agents, sweetening agents, flavoring agents, flavoring agents, and preservatives.
  • compositions for oral administration include sprays which contain one or more active substances and are formulated in a manner known per se.
  • This composition contains, in addition to the inert diluent, stabilizers such as sodium bisulfite to provide isotonicity, sodium chloride, sodium citrate Or an isotonic agent such as citric acid.
  • stabilizers such as sodium bisulfite to provide isotonicity, sodium chloride, sodium citrate Or an isotonic agent such as citric acid.
  • the method for producing the spray is described in detail, for example, in US Pat. Nos. 2,868,691 and 3,095,355.
  • Injections for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions.
  • aqueous or non-aqueous solution, suspension one or more active substances is mixed with at least one inert diluent.
  • Aqueous diluents include, for example, distilled water for injection and saline.
  • non-aqueous diluent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol, and polysorbate 80 (registered trademark).
  • compositions may also contain preservatives, wetting agents, emulsifying agents, dispersing agents, stabilizers (eg, human serum albumin, lactose, etc.), solubilizing agents (eg, arginine, aspartic acid, etc.). It may contain various adjuvants.
  • Example 1 Preparation of p o 1 y (A) + RNA
  • TRIz ⁇ 1 reagent registered trademark, purchased from GIBCO BRL
  • mRNA Purification Kit trade name, (Purchased from Pharmacia)
  • RNA is randomized with X ho I site linked to ⁇ type 9
  • NNNNNNNN-3 '(SEQ ID NO: 11) as a primer
  • double-stranded cDNA synthesis was performed using the Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (trade name, purchased from GIBCOBRL).
  • EcoRI adapter purchased from GIBCO BRL
  • DNA ligation kit purchased from DNA ligation kit ver.2, trade name, Takara Shuzo Co., Ltd.
  • a plasmid of this cDNA library was prepared, and the yeast YTK12 strain was transformed by the lithium acetate method (refer to Current Protocols In Molecular Biology 13.7.1) to obtain a yeast transformant without tributofan (Trp). Plated on selective medium (CMD_Trp medium). After incubating at 30 for 48 hours, the colonies (transformants) obtained using Accutran Replica Plater (trade name, purchased from Schleicher & Schuell) were purified with raffinose. The sample was placed on a YPR plate serving as a carbon source and incubated at 30 ° C for 14 days.
  • each colony that has emerged is again streaked onto a ⁇ PR plate, incubated at 30 ° C for 48 hours, and then a single colony is inoculated in YPD medium and incubated at 30 ° C for 48 hours.
  • the plasmid was prepared.
  • two types of primers (the sense strand is a biotinylated primer) of the sequence at both ends of the cloning site of pSUC2
  • the nucleotide sequence is determined by the fluorescent sequencing using DNA sequencing kit (Dye Terminator Cvcle sequencing Ready Reaction), trade name, purchased from Applied Biosystems Inc.). Then, reading was carried out using an automatic DNA sequencer 373 (Applied Biosystems Inc.) (hereinafter, all the descending nucleotide sequences were determined by this method).
  • a homology search was performed on the obtained nucleotide sequence and deduced amino acid sequence with the database, and it was revealed that the clone named A55 was a novel cDNA not registered in the database. Therefore, we tried to clone a full-length cDNA of the fragment cDNA of the A55 clone (hereinafter, referred to as A55 SST fragment cDNA). By comparing the deduced amino acid sequence with a known signal peptide, it was confirmed that the A55SST fragment cDNA had a functional and structural signal peptide.
  • Example 4 Cloning of full-length cDNA and determination of total nucleotide sequence
  • Phage particles of mouse 13-day fetal heart cDNA library 1 (Uni-ZAP XR) (purchased from Stratagen) were infected with Escherichia coli XL 1—Blue MRF * strain, and 1 million plaques were transferred to a nylon membrane. . Plaque hybridization was performed using the mouse A55S ST fragment cDNA labeled with 32 P as a probe to obtain a large number of positive plaques.
  • Phage was prepared from one of the plaques and infected with Escherichia coli XL-1-Blue MR F * strain (purchased from Stratagene) together with ExAssist helper phage (purchased from Stratagene).
  • transformation A plasmid was prepared from the transformant. First, the nucleotide sequence on the 5 ′ side was determined to confirm that the nucleotide sequence of mouse A55 SST fragment cDNA was present. Then, the entire nucleotide sequence was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 3 was obtained.
  • SEQ ID NO: 2 an amino acid translation region shown in SEQ ID NO: 2 and a deduced amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 were obtained.
  • the mature protein of the peptide of the present invention is represented by SEQ ID NO: 3 (a region between the amino acid sequences 144 to 1418 of SEQ ID NO: 3) and 425 amino acids, or the 423 amino acid represented by SEQ ID NO: 4. Presumed to be amino acids.
  • SEQ ID NO: 5 represents the translated region of the polypeptide of SEQ ID NO: 4.
  • mouse A55 polypeptide of the present invention does not have a transmembrane region, and the mouse A55 polypeptide of the present invention is a novel secretory protein. was found to be.
  • BLASTX, BLASTP and FASTA are composed of mouse A55 clone (region between amino acid sequence 1-444 of SEQ ID NO: 1) and human S1_5 (amino acid sequence of Swiss Prot Accession HSU03877:! ⁇ ). (A region between 387) was shown to have significant homology.
  • Human S1-5 is a secreted protein whose expression is induced by fibroblasts at the stage of growth inhibition, and has been reported to have cell proliferation-related activity.
  • Primer mA55-R1 5'-CG based on full-length nucleotide sequence information
  • the plasmid was ligated to T Vector (trade name, purchased from Promega), transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ to prepare a plasmid, and the entire nucleotide sequence was determined. As a result, a clone having a 5 ′ terminal sequence different from the 5 ′ terminal sequence containing the translation start point ATG shown in SEQ ID NO: 3 was found (SEQ ID NOs: 7 and 8).
  • the clone represented by SEQ ID NO: 8 utilizes another exon in which the exon 1 portion of the clone represented by SEQ ID NO: 3 is located about 400 nucleotides downstream, and the clone generated by alternative splicing It turned out that it was.
  • the clone was found to encode an isoform protein (shown in SEQ ID NO: 6) in which the 6-amino acid at the ⁇ -terminal shown in SEQ ID NO: 1 was replaced with 19 amino acids.
  • the mature protein of the peptide of the present invention is estimated to be 425 amino acids shown in SEQ ID NO: 8 (region between amino acid sequences 340 to 1614 of SEQ ID NO: 8) or 423 amino acids shown in SEQ ID NO: 9 .
  • SEQ ID NO: 10 is the same as SEQ ID NO: 9 Represents the translation region of the polypeptide.
  • Example 6 Expression of mouse A55 protein using mammalian cells
  • the mouse full-length cDNA shown in SEQ ID NO: 3 was ligated to a mammalian cell expression vector pNotS (see Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991)) to express mouse A55 protein.
  • the plasmid pNotS-mA55 was constructed.
  • pNotS and pNotS-mA55 were transfected into 293 T cells (ATCC CRI ⁇ 1573 293 cells with SV40 T antigen introduced into 293 cells) using lipofectin (trade name, purchased from GIBCO BRL) for 19 hours Thereafter, the medium was replaced with a met-free medium supplemented with 35 S-methionine (Met), and after labeling for 30 minutes, the cells were cultured in a medium containing Met for 5 hours. After recovering the cell supernatant, the cells were concentrated approximately 10-fold with Centricon-10 (trade name, purchased from Amicon) and subjected to SDS-PAGE. After drying the acrylamide gel, the expression of the protein labeled with 35 S was detected using BAS2000 (Fuji Film).
  • vascular smooth muscle cells were isolated from the aorta extending from the rat heart to the diaphragm and subjected to primary culture.
  • the protein was transferred from acrylamide gel to Immobilon-P (PVDF membrane, trade name, purchased from Millipore).
  • Immobilon-P PVDF membrane, trade name, purchased from Millipore.
  • color was developed using an ECL kit (trade name, purchased from Amersham), and the recombinant mouse A55 protein was detected.

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Description

明細書 新規なポリペプチド、 そのポリペプチドをコードする c D NA、 およびその用途 技術分野
本発明は、 新規なポリペプチド、 そのポリペプチドをコードする c D NA、 およびその用途に関する。 背景技術
現代医学の研究では、 心臓血管系の疾患は死を招く原因であるので、 心臓 血管領域は大きな関心を喚起する分野である。 心臓血管領域の研究は、 動脈 内膜再形成および動脈リモデリングに関する重要な事実を明らかにしており、 双方とも動脈硬化におけるプラーク形成並びに血管狭窄に寄与すると考えら れている。 例えば、 動脈硬化の動物モデルでの血管損傷を与える高コレステ ロール血症における細胞レベルでの過程には 3つの事象がある。 動脈壁の病 変を形成する 3要素は、 a ) 平滑筋細胞、 マクロファージおよびリンパ球の 増殖、 b ) 結合組織の形成、 c ) 新たに形成された結合組織マトリックスへ の脂肪およびコレステロールの蓄積、 である。 この 3要素の関与に関しての 正確な順位付けには議論を要するが、 平滑筋細胞の異常な分化、 脱分化、 増 殖が構造的に血管障害に寄与することは明らかである。 更に、 平滑筋細胞の 異常な増殖が関与するもう一つの重要な組織学的過程は、 経皮的冠動脈形成 術後 (Percutaneous Transuluminal Coronary Angioplasty) の再狭窄 あ 。
血管形成における平滑筋が構成する部分に係る分子を単離し、 上記のよう な異常な平滑筋細胞の増殖を制御するために使用することを目的として、 鋭 意努力した。 従来、 ある特定のポリペプチドまたはそれをコードする c D NAを得よう とする場合、 組織や細胞培養液中に目的とする生物活性を確認し、 次いでポ リペプチドの単離精製を経て、 遺伝子をクローニングするという方法、 ある いはその生物活性を指標として遺伝子を発現クローニングする方法が一般的 に用いられてきた。
しかし、 生体内生理活性ポリペプチドは、 多様な生物活性を有している場 合が多いので、 あるひとつの活性を指標にして遺伝子をクローニングした結 果、 それが既知のポリぺプチドと同一であることが後になって判明するとい う事例が増えている。 また、 微量しか産生されなかったり、 特別な生理的条 件でのみ発現する因子も多く、 そのことが単離、 精製および生物活性の確認 を困難なものとしている。
近年、 c D N Aの作製技術やシークェンス技術は急速に発展し、 大量のに D NAのシークェンスを迅速に行なうことができるようになった。 そこでこ れらの技術を利用して、 様々な細胞や組織から c D NAライブラリ一を作製 し、 ランダムに c D N Aをクローニングして塩基配列を決定し、 新規なポリ ペプチドをコードする遺伝子を単離する方法が発展している。 この方法は、 生化学的、 遺伝学的な解析を一切必要とせずに遺伝子をクローニングし、 そ の塩基配列の情報を得ることができるという特徴を有しているが、 目的とす る遺伝子の発見は偶発的要素が大きい。 発明の開示
本発明者らは、 平滑筋細胞の異常増殖に係る疾患の治療、 診断、 あるいは 研究上有益な新規な因子 （ポリペプチド） 、 特に分泌シグナルを有する分泌 蛋白質および膜蛋白質に着目してそれを見出すべく、 鋭意検討を行なった。 本発明者らは、 これまで造血系や免疫系で働く増殖分化因子の遺伝子のク ローニングを研究してきた。 そして、 増殖分化因子 （例えば、 各種サイト力 イン等） のような分泌蛋白質やそのレセプターのような膜蛋白質 （以下、 こ れらをまとめて分泌蛋白質等と呼ぶ。 ） の大部分がその N末端にシグナルべ プチドと呼ばれる配列を有していることに着目して、 シグナルペプチドをコ ードする遺伝子を効率的かつ選択的にクローニングする方法を鋭意検討した。 その結果、 動物細胞を用いて、 シグナルペプチドをコードする配列を有する c D N Aを簡単に選別できる方法 （シグナルシークェンストラップ (S S T) 法） を見出した （特開平 6-315380号参照） 。
さらに同じ概念のもとに、 酵母を用いてさらに効率よくかつ簡便にシグナ ルペプチドをコードする遺伝子を単離する方法 （酵母 S S T法） も開発され た （米国特許第 5,536,637号参照） 。
本方法を用いて、 マウス胎児心臓組織が産生している新規な分泌蛋白質、 およびそれをコードする c D NAを同定することに成功し、 全長 c D NAを その情報を基にマウス胎児心臓組織より見出し、 更に該ポリペプチドが血管 平滑筋細胞の増殖を抑制する効果を有することを確認し、本発明を完成した。 本発明が提供する c D NA配列は、 マウス A 5 5クローンと命名され、 マ ゥス胎児心臓組織から作製した c D N Aライブラリ一より、 上記酵母 S S T 法を使用して得た情報をもとに単離された。 マウス A 5 5クローンは分泌蛋 白質 （ここではマウス A 5 5蛋白として表わされる） をコードする完全な c D N A配列を含む全長鎖 c D NAである。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTN および FASTAにより、またアミノ酸配列デ一夕ベースに登録されている既知 のポリペプチドのアミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAに より検索した結果、 本発明のポリペプチド、 マウス A 5 5およびそれらをコ ードする核酸配列と一致する配列はなかった。 このことから、 本発明のポリ ペプチドは、 新規の分泌蛋白質であることが判明した。
また、 本発明者らは、 前記ポリペプチドが血管平滑筋細胞の増殖を抑制す る効果を有することを確認した。 そのため、 該ポリペプチドは異常な平滑筋 の増殖に係る疾患、 例えば動脈硬化や経皮的冠動脈形成術 （PTCA) 後の 再狭窄をもたらす血管内膜肥厚、 筋腫等の治療に有用であると考えられる。 本発明は、
(1) 配列番号 1、 4、 6または 9で示されるアミノ酸配列からなるポリべ プチド、
(2) 前記 （1) に記載したポリペプチドをコードする cDNA、
(3) 配列番号 2、 5、 7または 10で示される塩基配列からなる cDNA、
(4) 配列番号 3または 8で示される塩基配列からなる c D N A、
に関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 PDGF刺激によるラット大動脈血管平滑筋細胞の増殖に対し、 マウス A 55蛋白が阻害する様子を表わす。 詳細な説明
本発明は、 実質的に純粋な形である配列番号 1、 4、 6または 9で示され るアミノ酸配列からなるポリペプチド、 そのホモローグ、 その配列のフラグ メントおよびそのホモローグに関する。
本発明はさらにそれらのポリペプチドをコードする cDN Aに関する。 よ り具体的には、 配列番号 2、 5、 7または 10で示される塩基配列からなる cDNA、 および配列番号 2、 5、 7または 10で示される塩基配列に選択 的にハイブリダィズするフラグメントを有する c DNAに関する。 ハイプリ ダイズする cDNAには、 上記配列の相補配列も含まれる。 ハイブリダィズ は、 ストリンジェントな条件で行なわれることが好ましい。
実質的に純粋な形である配列番号 1、 4、 6または 9で示されるアミノ酸 配列からなるポリペプチドとは、 一般に、 生産時のポリペプチドの 90 %以 上、 例えば、 95、 98または 99 %が配列番号 1、 4、 6または 9で示さ れるアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを意味する。
配列番号 1、 4、 6または 9で示されるアミノ酸配列からなるポリべプチ ドのホモローグとは、 一般に少なくとも 20個、 好ましくは少なくとも 30 個、 例えば 40、 60または 100個の連続したアミノ酸領域で、 少なくと も 70%、 好ましくは少なくとも 80または 90%、 より好ましくは 95% 以上相同性であるものであり、 そのようなホモローグは、 以後本発明のポリ ペプチドとして記載される。
さらに、 配列番号 1、 4、 6または 9で示されるアミノ酸配列からなるポ リペプチドのフラグメント、またはそれらのホモローグのフラグメントとは、 少なくとも 10アミノ酸、 好ましくは少なくとも 15アミノ酸、 例えば 20、 25、 30、 40、 50または 60アミノ酸部分を意味する。
配列番号 2、 5、 7または 10で示される塩基配列からなる cDNAに選 択的にハイブリダィズする cDN Aとは、 一般に、 少なくとも 20個、 好ま しくは少なくとも 30個、 例えば 40、 60または 100個の連続した塩基 配列領域で、 少なくとも 70 %、 好ましくは少なくとも 80または 90%、 より好ましくは 95%以上相同性であるものであり、そのような cDNAは、 以後本発明の c D N Aとして記載される。
配列番号 2、 5、 7または 10で示される塩基配列からなる c DNAのフ ラグメントとは、 少なくとも 10塩基、 好ましくは少なくとも 15塩基、 例 えば 20、 25、 30または 40塩基部分を意味し、 そのようなフラグメン トも本発明の c DNAに含まれる。
さらに、 本発明には、 本発明の cDNAからなる複製または発現べクタ一 が含まれる。 ベクタ一としては、 例えば、 o r i領域と、 必要により上記 c DNAの発現のためのプロモータ一、 プロモータ一の制御因子などからなる プラスミド、 ウィルスまたはファージベクターが挙げられる。 ベクタ一はひ とつまたはそれ以上の選択的マーカ一遺伝子、 例えばアンピシリン耐性遺伝 子を含んでいてもよい。 ベクタ一は、 イン 'ビトロ （in vitro) において、 例 えば c D N Aに対応する R N Aの製造、 宿主細胞の形質転換に用いることが できる。
さらに、 本発明には、 配列番号 2、 3、 5、 7、 8または 1 0で示される 塩基配列、 またはそれらのオープンリーディングフレームからなる c D N A を含む本発明の c D NAを複製または発現させるためのベクターで形質転換 された宿主細胞も含まれる。 細胞としては、 例えば細菌、 酵母、 昆虫細胞ま たは哺乳動物細胞が挙げられる。
さらに、 本発明には、 本発明のポリペプチドを発現させるための条件下で、 本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のポリぺプチドの製造方法 も含まれる。 培養は、 本発明のポリペプチドが発現し、 宿主細胞より製造さ れる条件下で行われることが好ましい。
本発明の c D N Aは、 上記のようなベクターのアンチセンス領域に揷入す ることでアンチセンス R N Aを製造することもできる。 このようなアンチセ ンス R N Aは、 細胞中の本発明のポリぺプチドのレベルを制御することに用 いることもできる。
本発明は、 本発明におけるポリぺプチドのモノク口一ナルまたはポリク口 —ナル抗体も含む。 さらに本発明におけるポリペプチドのモノクローナルま たはポリクロ一ナル抗体の製造方法も含む。 モノクローナル抗体は、 本発明 のペプチドまたは、 その断片を抗原として用い、 通常のハイプリドーマの技 術により製造することができる。 ポリクローナル抗体は、 宿主動物 （例えば、 ラットやゥサギ等） に本発明のポリペプチドを接種し、 免疫血清を回収する 通常の方法により製造することができる。
本発明には、 本発明のポリペプチド、 その抗体と薬学的に許容される賦形 剤および または担体を含有する薬学的組成物も含まれる。
(1) の本発明のポリペプチドとしては、 配列番号 1、 4、 6または 9で 示されたアミノ酸配列からなるもの以外に、 その一部が欠損したもの （例え ば、 配列番号 1中、 生物活性の発現に必須な部分だけからなるポリペプチド 等） 、 その一部が他のアミノ酸と置換したもの （例えば、 物性の類似したァ ミノ酸に置換したもの） 、 および上記本発明のポリペプチドに他のアミノ酸 が付加または挿入されたものも含まれる。
よく知られているように、 ひとつのアミノ酸をコードするコドンは 1〜6 種類 （例えば、 Me tは 1種類、 Le uは 6種類） 知られている。 従って、 ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく c DN Aの塩基配列を変える ことができる。
(2) で特定される本発明の cDN Aには、 （1) の配列番号 1、 4、 6 または 9で示されるポリペプチドをコードするすべての塩基配列群が含まれ る。 塩基配列を変えることによって、 ポリペプチドの生産性が向上すること がある。
(3) で特定される cDNAは、 （2) で示される cDNAの一態様であ り、 天然型配列を表わす。
(4) に示される cDNAは、 （3) で特定される c DNAに天然の非翻 訳部分を加えた配列を示す。
配列番号 3または 8で示される塩基配列からなる cDNAの作製は、 以下 の方法に従って行われる。
はじめに酵母 SST法（米国特許第 5,536,637号に記載） の概要について説 明する。
サッカロミセス ·セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) などの酵母がショ 糖またはラフィノースをエネルギー源や炭素源として利用するためにはイン ベル夕ーゼを培地中に分泌しなければならない （インベルタ一ゼはラフィノ ースをショ糖とメリビオースに、 ショ糖をフルクト一スとグルコースに分解 する酵素である。 ） 。 また数多くの既知の哺乳類のシグナルペプチドは酵母 のィンベルターゼを分泌させうることが知られている。
これらの知見から、 酵母のインベル夕一ゼの分泌を可能にする新規のシグ ナルペプチドを哺乳類の c DN Aライブラリ一からラフイノ一ス培地上での 酵母の生育を指標にスクリーニングする方法として本方法は開発された。 翻訳開始点 AT Gを削除した非分泌型のインベルタ一ゼ遺伝子 SUC 2 (GENBANK accession No.V0131l) を酵母の発現ベクターに組み込んで酵母 S ST用ベクター p SUC 2を作製した。
発現べクタ一には、 A AH 5プラスミド （Gammerer, Methods in Enzymol. 101,192-201,1983) 由来の発現用プロモー夕一 （ADHプロモーター） および 夕一ミネ一夕一 （ADHターミネータ一） が組み込まれ、 酵母複製起点とし ては 2 o r i、 酵母選択マ一カーには TRP 1、 大腸菌複製起点としては Co 1 E 1 o r i、大腸菌薬剤耐性マーカーにはアンピシリン耐性遺伝子が それぞれ組み込まれている。
その SUC 2遺伝子の上流に哺乳類の c DN Aを組み込んで、 酵母 S ST cDN Aライブラリーを調製した。 このライブラリーを分泌型インベルター ゼを欠損している酵母に形質転換した。 組み込まれた哺乳類 cDNAがシグ ナルぺプチドをコードしている場合、 酵母で発現されたィンベルタ一ゼに対 しても分泌作用をもっと考えられ、 その結果ラフイノ一ス培地上での生育が 可能となる。
よって出現したコロニーから酵母を培養してプラスミドを調製し、 インサ ート c D N Aの塩基配列を決定することによって、 新規シグナルペプチドの 検索を迅速かつ容易にした。
酵母 SST c DN Aライブラリーの作製は
(1) 対象となる細胞より mRN Aを単離し、 特定の制限酵素 （酵素 I) サイトを連結したランダムプライマ一を用いて二本鎖 cDNAを合成し、
(2) 酵素 Iとは異なる特定の制限酵素 （酵素 II) サイトを含むアダプタ —を連結して、 酵素 Iで消化した後、 適当なサイズで分画し、
( 3 ) 酵母発現べクター内のシダナルぺプチドを削除したインベル夕一ゼ 遺伝子の上流に得られた cDN A断片を連結し、形質転換する工程よりなる。 各工程を詳しく説明すると、 工程 （1) では、 対象となる哺乳類の臓器や 細胞株などより、 必要により適当な刺激剤で刺激した後、 公知の方法 （以下、 公知の方法は特に記載がなければ Molecular Cloning (Sambrook, J., Fritsch, E. F. および Maniatis, T.著、 Cold Spring Harbor Laboratory Pressより 1989年に発刊） または Current Protocol in Molecular Biology(F. M. Ausubelら編、 John Wiley & Sons, Inc.より発刊） に記載の方法に従って行われる。 ） に従って mRNAの 単離が行われる。
対象となる組織としては、 マウス胎児心臓が挙げられる。 ランダムプライ マ一を用いる二本鎖 cDNAの合成は公知の方法により行われる。
アダプターに連結される制限酵素 （酵素 I) サイトと次の工程 （2) で用 いられる制限酵素 （酵素 II) サイトは、 互いに異なるものであれば何を用い てもよい。 好ましくは、 酵素 Iとして Xho I、 酵素 IIとしては Ec oR I が用いられる。
工程 （2) では T 4 DNAポリメラーゼで末端を平滑化し、 酵素 IIァダプ ターを連結した後、 酵素 Iで消化し、 ァガロース電気泳動 （AGE) により 300〜800 b pの c DNAを分画する。酵素 IIは、 前記したように酵素 Iと異なるものなら何でもよい。
工程 （3) は、 酵母発現用プラスミドベクタ一に連結されたシグナルぺプ チドを削除したインベルターゼの遺伝子の上流に （2) で得られた cDNA 断片を組み込んで大腸菌に形質転換する工程である。 ここで酵母発現用ブラ スミドベクターとしては種々のものが知られているが、 例えば、 大腸菌内で も機能する Y E p 2 4などが用いられるが、 好適には前述したプラスミ p S U C 2が用いられる。
形質転換のための宿主大腸菌株はすでに多くのものが知られており、 好ま しくは D H 1 0 Bのコンビテントセルである。 また形質転換方法は公知の方 法のいずれを用いてもよいが、 好ましくはエレクトロボレ一シヨン法により 行われる。 形質転換体は公知の方法により培養され、 酵母 S S T用の c D N Aライブラリ一が得られる。
この c D NAライブラリ一では、 すべてのクローンに c D N A断片が導入 されている訳ではないし、 またすべてが未知のシダナルぺプチドをコードす る遺伝子断片とは限らない。 そこで、 次に該ライブラリーから未知のシグナ ルペプチドをコ一ドする遺伝子断片をスクリーニングする必要がある。
そのためには、 c D NAライブラリ一をインベルターゼ遺伝子をもたない 酵母 Saccharomycs cerevisiae (例えば Y T 4 5 5株など） またはインベルタ一 ゼ遺伝子を人為的に欠損させた株 （公知の方法に従い作製可能） に、 該 c D NAライブラリーを導入し、 シグナルペプチドをコードする配列を有する断 片のスクリ一ニングを行なう。
酵母の形質転換は公知の方法、 例えば酢酸リチウム法によって行われる。 形質転換体を選択培地で生育後、 ラフィノースを炭素源とする培地に移し、 生育可能なコロニ一を選択し、 プラスミドを回収する。 ラフイノ一スを炭素 源として酵母が生育したということは、 ライブラリ一中に何らかの分泌蛋白 質のシグナルペプチドが組み込まれていたことを示している。
次に、 単離した陽性クローンについて、 塩基配列を決定し、 未知の蛋白質 をコードすることが明らかになった c D N Aについては、 それをプローブと して全長クローンを単離し、 全長の塩基配列を決定することができる。 これ らの操作は、 当業者にとってすベて公知の方法で行われる。
配列番号 2、 5、 7または 1 0で示される塩基配列が、 一部、 好ましくは 全てが確定されると哺乳類に存在する本発明の蛋白質をコ一ドする c DNA もしくは本発明蛋白質のホモローグおよびサブセットをコードする cDN A を得ることができる。
適当な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、 それを用いて、 哺 乳類由来の cDNAライブラリ一あるいは mRNAから PCR法により、 あ るいは適当な塩基配列の断片をプローブとしてハイプリダイズさせることに より、他の哺乳類 cDNAライブラリーあるいは該ゲノムライブラリーから、 他の哺乳類型の当該蛋白質をコードする c DN Aを得ることができる。
このようにして得られた c DNAが、 S STで得られた cDNA断片の塩 基配列 （またはその相同配列） を含んでいるならばシグナルペプチドをコ一 ドしていることになるので、 該 cDNAが全長、 またはほぼ全長であること は明らかである （シグナルペプチドは例外なく蛋白質の N末端に存在するこ とから、 cDN Aのオープンリーディングフレームの 5 '末端にコードされ ている。 ） 。
さらに公知の方法に従い、 該 c DNAをプローブとしてノザン （Northern) 解析によつて全長の確認をしてもよい。 ハイブリダィズしたバンドから得ら れる mRNAのサイズと該 cDN Aのサイズを比較し、 ほぼ同じであれば該 cDNAはほぼ全長であると考えられる。
本発明は、 開示された蛋白の全長型並びに成熟型の両方を提供する。 それ らの蛋白の全長型は、 配列番号 2または 7で示される塩基配列の翻訳される アミノ酸配列で同定される。 それらの成熟蛋白は、 配列番号 3または 8で示 される全長 DN Aを適当な哺乳類の細胞あるいはその他の宿主細胞で発現さ せることによって得られる。 成熟型の蛋白の配列は、 全長型のアミノ酸配列 より予測可能である。
配列番号 2、 5、 7または 10で示される塩基配列が一旦確定されると、 その後は、 化学合成によって、 あるいは該塩基配列の断片を化学合成し、 こ れをプローブとしてハイブリダィズさせることにより、 本発明の c DNAを 得ることができる。
さらに、 本 c DNAを含有するベクター c DNAを適当な宿主に導入し、 これを増殖させることによって、 目的とする cDNAを必要量得ることがで さる。
本発明のポリぺプチドを取得する方法としては、
( 1 ) 生体または培養細胞から精製単離する方法、
(2) ペプチド合成する方法、 または
( 3 ) 遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、
などが挙げられるが、 工業的には （3) に記載した方法が好ましい。
遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系 （宿主 一ベクター系） としては、 例えば、 細菌、 酵母、 昆虫細胞および哺乳動物細 胞の発現系が挙げられる。
例えば、 大腸菌で発現させる場合には、 成熟蛋白部分をコードする cDN Aの 5' 末端に開始コドン （ATG) を付加し、 得られた cDNAを、 適当 なプロモ一夕一 （例えば、 t r pプロモータ一、 l a cプロモータ一、 λΡ Lプロモーター、 Τ 7プロモータ一等） の下流に接続し、 大腸菌内で機能す るベクター （例えば、 pBR322、 pUC 18、 pUC 19等） に挿入し て発現ベクターを作製する。
次に、 この発現ベクターで形質転換した大腸菌 （例えば、 E.Coli DH1、 E. Coli JMl 09、 E.Coli HB 101株等） を適当な培地で培養して、その 菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。 また、 バクテリアの シグナルペプチド （例えば、 p e 1 Bのシグナルペプチド） を利用すれば、 ペリブラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。さらに、 他のポリペプチドとのフュージョン ·プロテイン （fusion protein) を生産する こともできる。 また、 哺乳動物細胞で発現させる場合には、 例えば、 配列番号 2、 5、 7 または 1 0で示される塩基配列を適当なベクタ一 （例えば、 レトロウイルス ベクタ一、 パピ口一マウィルスベクタ一、 ワクシニアウィルスベクタ一、 S V 4 0系べクタ一等） 中の適当なプロモーター （例えば、 S V 4 0プロモー ター、 L T Rプロモ一夕一、 メタ口チォネインプロモータ一等） の下流に揷 入して発現ベクターを作製する。 次に、 得られた発現ベクターで適当な哺乳 動物細胞 （例えば， サル C O S— 1細胞、 C O S— 7細胞、 チャイニーズハ ムスター C H〇細胞、 マウス L細胞等） を形質転換し、 形質転換体を適当な 培地で培養することによって、 分泌蛋白である本発明の蛋白は、 その細胞上 清中に目的とするポリペプチドとして発現される。 さらに、 その他のポリべ プチド、 例えば抗体の定常領域 （F c portion) をコードする c D N A断片と 連結することによって、 フユ一ジョン 'プロテイン （fusion protein) を生産す ることもできる。 以上のようにして得られたポリペプチドは、 一般的な生化 学的方法によつて単離精製することができる。 産業上の利用可能性
本発明のポリペプチドおよびそれをコードする c D NAは、 一つあるいは それ以上の効果あるいは生物活性 （以下に列挙するァッセィに関連するもの を含む） を示すことが考えられる。
本発明の蛋白に関して記述される効果あるいは生物活性は、 その蛋白の投 与あるいは使用により、 あるいは、 その蛋白をコードする c D NAの投与あ るいは使用 （例えば、 遺伝子療法や c D NA導入に適したベクター） により 提供される。 また、 本発明者らは、 本発明のポリペプチドが血管平滑筋細胞 の増殖を抑制する効果を有することを確認した。 そのため、 本発明のポリべ プチドを用いて平滑筋の異常な増殖が関係する疾患、 例えば動脈硬化や経皮 的冠動脈形成術 （P T C A) 後の再狭窄をもたらす血管内膜肥厚、 筋腫等の 治療に応用可能であると考えられる。
本発明はこれに限定されるものではないが、 以下の活性を示す可能性があ る。
[サイ卜力イン活性および細胞増殖 分化活性]
本発明の蛋白は、 サイト力イン活性および細胞増殖 （誘導あるいは阻害） Z分化活性 （誘導あるいは阻害） を示す可能性、 あるいはある細胞集団に他 のサイトカインの産生を誘導あるいは抑制すると考えられる。
全ての既知のサイトカインを含む、 現在発見されている多くの蛋白性因子 は、 因子に依存した一つあるいはそれ以上の細胞増殖アツセィ法で、 活性を 示してきたので、 それらのアツセィは、 サイト力イン活性の便利な確認法と して機能する。 本発明の蛋白の活性は、 多くの従来の因子依存性の細胞株の 細胞増殖アツセィのうちのいずれかによって証明され得る。
[免疫刺激 抑制活性]
本発明の蛋白は、 免疫刺激活性および免疫抑制活性も示すと考えられる。 また、 ある蛋白は、 例えば、 Tリンパ球および Bリンパ球あるいはどちらか 一方の成長および増殖を制御 （刺激あるいは抑制） することや、 同様に NK 細胞や他の集団の細胞傷害性活性に影響を与えることによって、 様々な免疫 不全および疾 (severe combined immunodeficiency ( S C I D) を 'む） の治 療に効果を示すと考えられる。
これらの免疫不全は遺伝性である場合もあるし、 例えば H I Vのようなゥ ィルスや、 同様に細菌やカビの感染が原因で起こる場合もある。 あるいは、 自己免疫疾患に由来する可能性もある。
より具体的には、 ヒト免疫不全ウィルス（H I V)、肝炎ウィルス（hepatitis viruses; 、 ヘリレヘスゥっ レス (herpes viruses) 、 コノ クァリノ vmycobacteria) 、 リーシュマニア （leshmania) 、 マラリア （malaria) およびカンジダ （Candida) のような様々なカビ感染を含む、 ウィルス、 細菌、 カビあるいは他の感染に よる感染症の原因を、 本発明の蛋白を用いることによって治療できると考え られる。 もちろん、 この関連より、 本発明の蛋白は、 免疫システムが増大し ていることが一般的に示唆される場所、 すなわち癌治療の箇所において効果 を示すと考えられる。
本発明の蛋白は、 アレルギー反応および喘息や他の呼吸器系疾患のような 状況の治療に効果にも効果を示すと考えられる。 免疫抑制が望まれるような 他の状態 （例えば、 喘息や関連呼吸器疾患を含む） にも、 本発明の蛋白を用 いて治療できると考えられる。
本発明の蛋白は、 例えば、 敗血病性のショックあるいは全身性炎症反応症 候群 （S I R S ) のような感染、 炎症性大腸炎、 クローン病、 あるいは I L 一 1 1により効果が証明された T N Fや I L一 1のようなサイ卜力インの過 剰産生から由来するような感染に関連した慢性あるいは急性の炎症を抑制す る可能性もある。
[造血細胞制御活性]
本発明の蛋白は、 造血細胞の制御に、 またそれに応じて骨髄球様細胞ある いはリンパ球様細胞の欠乏に対する治療にも効果を示すと考えられる。 コロ ニー形成細胞あるいは因子依存性細胞株の援助の下での極く弱い生物活性で さえも、 造血細胞の制御に係わることを示唆する。 その生物活性とは、 次に 挙げる例の全てあるいはそのいずれかで例えられるようなものに係わるもの である。 赤血球前駆細胞のみの成長および増殖を支持、 あるいは他のサイト 力インとの組み合わせ、 また、 それが示唆する有効性、 例えば様々な貧血の 治療、 あるいは赤血球前駆細胞および赤血球あるいはそのどちらかの産生を 刺激する放射線療法 化学療法と組み合わせての使用；
顆粒球および単球 マクロファ一ジのような骨髄球の成長および増殖を支持 (すなわち、 古典的な C S F活性） 、 化学療法に伴う骨髄抑制を防ぐための 化学療法との併用； 巨核球の成長および増殖およびそれに続く血小板の成長および増殖の支持、 それによつて血小板減少症のような様々な血小板障害を防御および治療を可 能とする血小板輸血の際あるいは相補的に一般的使用；
上記造血細胞の幾つかあるいは全ての細胞へ成熟可能な造血幹細胞の成長お よび増殖の支持、 従って、 様々な幹細胞障害 （限定はされないが、 再生不良 性貧血および発作性夜間血色素尿症を含む、 移植で一般的に治療されるよう なもの） に治療的効果を見い出せる、 また、 正常細胞あるいは遺伝子療法の ため遺伝的に操作された細胞をインビトロ （in-vitro) あるいはェクソビポ (ex-vivo) (すなわち、 骨髄移植に伴う） どちらかで、 放射線療法ノ化学療 法後の幹細胞分画の再構築を行なうことも同様である。
種々の造血幹細胞株の増殖と分化に対する適切なアツセィは、 上記に記載 されている。
本発明の蛋白は、 他の方法の中で、 以下の方法により測定することが可能 である。
[組織生成/修復活性]
本発明の蛋白は、 損傷治癒および組織修復、 また、 火傷、 切開、 および潰 瘍の治療と同様に、 骨、 軟骨、 腱、 靭帯、 および神経組織成長あるいは再生 のいずれかに使用されると考えられる。
骨を正常に形成しない環境での軟骨および骨あるいはいずれかの成長を誘 導するような本発明の蛋白は、 ヒトおよび他の動物の骨折および軟骨損傷あ るいは欠損の治癒に適用される。 該発明の蛋白を使用している製剤は、 開放 骨折と同様に閉鎖骨折の整復、 また人工関節の固定の改良にも、 予防的使用 できると考えられる。
骨形成剤により誘導された新生骨形成は、 先天性、 外傷性、 癌切除術によ り誘発した頭蓋顔面の欠損の修復に貢献する。 また、 美容形成外科分野にも 有効である。 本発明の蛋白は、 歯根膜症の治療および他の歯の修復にも使用されると考 えられる。 そのような薬品は、 骨形成細胞を引き寄せ、 その細胞の増殖を刺 激し、 その前駆細胞の分化を誘導する環境を提供すると考えられる。
本発明の蛋白は、 骨および軟骨あるいはいずれかの修復を刺激することを 通して、 あるいは、 炎症あるいは炎症過程で介される組織破壊 （コラゲナ一 ゼ活性や破骨細胞の活性） の過程を阻止することにより、 骨粗鬆症および骨 関節炎の治療に有効であると考えられる。
本発明の蛋白に起因すると考えられる組織再生活性の別のカテゴリ一は腱 靭帯形成である。 本発明の蛋白は、 腱 靭帯様組織あるいは他の組織が正 常に形成されない環境でそのような組織形成を誘導するものであるが、 ヒト および他の動物における腱 靭帯の裂傷、 奇形、 および他の腱 Z靭帯の障害 の治癒に適用できる。
腱 靭帯様組織を誘導する蛋白を使用している製剤は、 骨あるいは他の組 織への腱 Z靭帯の固定の改良、 および腱/靭帯組織の欠損の修復での使用は もちろん、 腱あるいは靭帯の損傷の防御に対して予防的使用も考えられる。 本発明の構成物により誘導された新生腱/靭帯様組織形成は、 先天性、 外 傷、 あるいは他の起源の腱あるいは靭帯欠損の修復に貢献する。 また、 腱あ るいは靭帯の貼付あるいは修復という美容形成外科でも有効である。
本発明の構成物は、 腱 靭帯形成細胞を引き寄せ、 その細胞の増殖を刺激 し、 その前駆細胞の分化を誘導する環境を提供すると考えられる。 あるいは、 組織修復を果たすため、インビポ（in vivo)への返還に備えて ェクソビポ（ex vivo) で腱ノ靭帯細胞あるいはその前駆細胞を誘導する。
本発明の構成物は、 腱炎、 力一パルタネルシンドローム （Ca卬 al tunnel syndrome) 、 および他の腱あるいは靭帯欠損の治療にも有効である。 該構成 物には、 適当なマトリックスおよびキャリアーと同様に当業者に良く知られ ているセクエステリング （Sequestering) 剤も含まれる。 本発明の蛋白は、 神経細胞の増殖、 および、 神経および脳組織の再生、 即 ち、 神経細胞あるいは神経組織の変性、 死、 あるいは外傷を含む機械的およ び外傷的障害と同様に中枢および末梢神経系疾患および神経病の治療に対し ても、 効果を示すと考えられる。
より具体的には、 ある蛋白は、 末梢神経障害、 末梢神経症、 および局所的 神経症のような末梢神経系の疾患、 およびアルツハイマー病、 パーキンソン 病、 ハンチントン病、 筋萎縮性側索硬化症、 およびシャイ—ドラガー （Shy- Drager) 症候群のような中枢神経系の疾患の治療に有効であると考えられる。 更に本発明に応じて治療され得る条件には、 脊髄障害、 頭部外傷、 および 脳卒中等の脳血管疾患のような機械的および外傷的障害を含む。 化学療法あ るいは他の治療から起因する末梢神経症も本発明の蛋白を用いて治療可能で ある。
本発明の蛋白は、 例えば勝臓、 肝臓、 腸、 腎臓、 皮膚、 内皮を含む臓器、 平滑、 骨格あるいは心臓筋肉、 および血管内皮を含む血管組織のような他の 組織を生成する活性、 あるいはそのような組織を構成する細胞の増殖を促進 または抑制する活性を示す可能性も期待される。 望まれる効果の一部は、 正 常組織を再生させる繊維性瘢痕の阻害によっても担われると考えられる。 本発明の蛋白は、 消化管保護あるいは再生、 および肺あるいは肝臓の繊維 ィ匕、 様々な組織の再還流損傷、 および全身性サイト力イン障害に起因する状 態に対する治療にも有効であると考えられる。
[ァクチビン インヒビン活性]
本発明の蛋白は、 ァクチビン/インヒビンに関連した活性を示すと考えら れる。 ァクチビンは濾胞刺激ホルモン （F S H) の放出を刺激する活性によ つて特徴づけられるが、 インヒビンは、 濾胞刺激ホルモン （F S H) の放出 を阻害する活性によって特徴づけられる。 よって、 本発明の蛋白は、 単独あ るいはインヒビン aファミリ一のメンバ一とのへテロダイマ一で、 哺乳類動 物の雌の受精率を減少させ、 雄の精子形成を減少させるインヒビンの活性に 基づく避妊調節剤として有効であると考えられる。 充分量の他のインヒビン の投与によって、 哺乳動物の不妊を誘導可能である。
一方、 本発明の蛋白は、 インヒビン i3グループの他の蛋白サブユニットと のホモダイマーあるいはヘテロダイマーで、 前脳下垂体の細胞から濾胞刺激 ホルモン （F S H) 放出を刺激するァクチビン分子の活性に基づいた治療的 な不妊誘導として有効であると考えられる （米国特許第 4,798,885号を参照） 。 本発明の蛋白は、 牛、 羊、 および豚のような家畜の生涯出産能力可能な期間 を延ばすために、 性的に未熟なほ乳類動物における妊娠開始を早めることに 有効であると考えられる。
[走化性 化学運動性活性]
本発明の蛋白は、 例えば、 単球、 好中球、 T細胞、 マスト細胞、 好酸球、 および内皮細胞、あるいはそのいずれかを含む、哺乳動物の細胞に対して（例 えば、 ケモカインとして働く） 走化性ノ化学運動性活性を有すると考えられ る。
走化性 化学運動性蛋白は、 反応の望まれる部位へ、 望まれる細胞集団を 固定化あるいは引き寄せるため使用することが可能である。 走化性 化学運 動性蛋白は、 局所的な感染と同様に、 創傷および他の外傷の治療に特別な優 位性を提供する。 例えば、 リンパ球、 単球、 あるいは好中球を腫瘍あるいは 感染部位へ引き寄せることは、 腫瘍あるいは感染部位に対する免疫応答を改 善する結果となると考えられる。
蛋白やペプチドは、 もしそれが直接あるいは間接に特殊な細胞集団に対し て指示された方向あるいは運動を刺激可能であれば、 そのような細胞集団に 対する走化性活性を保持している。 望ましくは、 その蛋白やペプチドは、 細 胞の指示された運動を直接的に刺激する活性を保持する。
特別な蛋白がある集団の細胞に対し走化性活性を保持するか否かは、 どん な既知の細胞走化性のアツセィ法にそのような蛋白あるいはペプチドを使用 しても容易に決定できる。
[凝血および血栓活性]
本発明の蛋白は、 凝血あるいは血栓活性も示すと考えられる。結果として、 そのような蛋白は、 様々な凝固障害 （血友病のような遺伝性障害を含む） の 治療に有効であると予期される。 あるいは、 外傷、 手術あるいは他の原因に より生じた創傷の治療における凝固および他の凝血事象を促進させることが 予期される。 本発明の蛋白は、 血栓の形成の溶解あるいは阻害、 および血栓 あるいは卒中等により生じる状態の治療および予防にも効果があると考えら れる。
[受容体ノリガンド活性]
本発明の蛋白は、 受容体、 受容体 Zリガンドあるいは受容体 Zリガンドの インヒビ夕一あるいはァゴニストとしての活性を示す可能性もある。 そのよ うな受容体およびリガンドの例として、 サイトカイン受容体およびそのリガ ンド、 受容体キナ一ゼおよびそのリガンド、 受容体フォスファタ一ゼおよび そのリガンド、 細胞間相互作用に関連した受容体 （セレクチン （Selectin) 、 インテグリン （Integrin) 、 およびそのリガンド、 受容体キナーゼを含む細胞 接着分子等） およびそのリガンド、 および抗原提示、 抗原認識、 および細胞 性および液性免疫反応の発達に係わる受容体 Zリガンドの組み合わせが挙げ られるが、 本発明を制限するものではない。
受容体およびリガンドは、 その相互作用に対する可能なペプチドあるいは 小分子のインヒビ夕一のスクリーニングにも有効である。 本発明の蛋白 （受 容体およびリガンドの断片を含むが、 制限されるものではない） は、 それ自 身受容体 リガンドの相互作用のインヒビ夕一として有効であると考えられ る。
[栄養剤としての利用] 本発明の蛋白は栄養源または栄養補給剤としても使用できる。 このような 使用には、 制限はされないが、 蛋白、 アミノ酸の補給、 炭素源、 窒素源とし ての使用、 炭水化物源としての使用が含まれる。 そのような場合において、 本発明の蛋白は各生物の食物に添加できるし、 また粉末や錠剤、 溶液、 懸濁 液、 カプセルなどの剤型のように、 分離した個体または液体の状態で服用で きる。 微生物の場合、 本発明の蛋白を培養液中に添加することもできる。
[力ドヘリンノ腫瘍転移抑制活性]
力ドヘリンはカルシウム依存性接着分子であり、 個体発生において特に特 異的に細胞種を認識する際に主要な役割を果たすことが明らかとなっている。 通常のカドヘリンの発現の欠失または変化により、 腫瘍の増殖または転移に つながる細胞接着性の変化が起こりうる。 力ドヘリンの機能不全はまた尋常 性天疱瘡や落葉性天疱瘡 （自己免疫発斑皮膚病） 、 クローン病、 いくつかの 発生異常のようなヒ卜の別の疾病にも関連している。
力ドヘリンス一パーファミリ一のメンバ一は 4 0を越え、 個々に異なる発 現パターンを示す。 カドヘリンスーパ一ファミリ一のすベてのメンバ一は共 通の保存された細胞外リピート （カドヘリンドメイン） を有するが、 分子の 別の部位においては構造上の差異が認められる。
力ドヘリンドメインはカルシウムと結合し力ドヘリン間で 4次構造を形成 するのでカルシウムは接着に必須である。 最初の力ドヘリンドメインの数個 のアミノ酸のみがホモフィリックな接着に必須である。
この認識部位の修飾により力ドヘリンの特異性を変えることが可能である ので、 変異分子はそれ自身だけを認識するのではなく、 異なるカドヘリンと も結合可能となる。 またいくつかの力ドヘリンは異なる力ドヘリンとヘテロ フイリックな接着をする。
E—力ドヘリンはカドヘリンスーパ一ファミリ一のメンバ一のひとつで上 皮細胞系で発現している。 もし E—力ドヘリンの発現が腫瘍でみられない場 合、 病理学的には悪性細胞が浸潤し、 癌が転移する。 癌細胞株に E—力ドへ リンの遺伝子をトランスフエクトした場合、 細胞の形が通常に戻り、 細胞間 や基質への接着性が保たれ、 細胞増殖速度が遅くなり、 足場非依存的な細胞 増殖が劇的に減少することにより、 癌にともなう変化が元に戻る。 このよう に導入した E—カドヘリンの発現により癌の進行が低いステージに戻る。 ま た別の力ドヘリンは別の組織由来の癌において同じ浸潤抑制の機能をもっと 考えられる。 そこで力ドヘリン活性を有する本発明の蛋白とそれをコードす る本発明の遺伝子は癌の治療に用いることができる。 このような蛋白または 遺伝子を癌細胞に導入することは、 通常の力ドヘリンの発現を供給すること により、 癌細胞においてみられる変化を減少または排除することができる。 癌細胞はまた異なる組織の力ドヘリンの発現を示すことがある。 その結果 このような細胞は体内の異なる組織に浸潤、 転移することができるようにな る。 このような細胞において、 カドヘリン活性を有する本発明の蛋白とそれ をコ一ドする本発明の遺伝子は異所発現した力ドヘリンに置換されうる。 そ の結果、 通常の細胞の接着性を保ち、 転移性を減少または排除する。
また力ドヘリン活性を有する本発明の蛋白とそれをコードする本発明の遺 伝子は力ドヘリンを認識し結合する抗体の産生に利用できる。 このような抗 体は癌細胞に異所発現した力ドヘリンの結合をプロックすることに使用でき、 癌の形成を妨げる。 このような抗カドヘリン抗体はまた癌のグレード、 病理 学的タイプ、 予後に対するマ一力一として使用できる。 すなわち、 より癌が 進行していれば力ドヘリンの発現はより低いであろうし、 力ドヘリン発現の 減少は力ドヘリンに結合する抗体を用いることにより検出することができる。 また力ドヘリン活性を有する本発明の蛋白の断片、 好ましくは力ドヘリン 認識部位の 1 0個のペプチド、 およびこのような本発明の蛋白断片をコード する遺伝子はカドヘリンと結合し、 好ましくない効果をもたらすカドヘリン の結合を妨げることにより、 力ドヘリンの機能をブロックすることにも使用 できる。 さらにカドヘリン活性を有する本発明の蛋白の断片、 好ましくは癌 患者で安定して循環しているトランケ一卜した可溶化力ドヘリン断片、 およ びそのような本発明の蛋白断片をコードする遺伝子は固有の細胞間の接着を 阻害することに使用できる。
[腫瘍抑制活性]
上記の免疫学的処置または腫瘍の予防の活性に加えて、 本発明の蛋白は別 の抗腫瘍活性を示す可能性がある。 蛋白は直接的に、 または例えば AD C C を通してのような間接的に腫瘍の増殖を阻害すると考えられる。また蛋白は、 腫瘍組織または腫瘍前駆組織に作用することにより、 腫瘍の増殖を支持する ために必要な組織の形成を阻害する （例えば血管新生を阻害する） ことによ り、 腫瘍の増殖を阻害する別の因子、 活性物質または細胞種を産生すること により、 腫瘍の増殖を促進する因子、 活性物質または細胞種を除去または阻 害することにより腫瘍阻害活性を示す可能性がある。
[その他の活性]
本発明の蛋白 （ポリペプチド） は、 以下に示す付加的な活性あるいは効果 の一つあるいはそれ以上を示すと考えられる：細菌、 ウィルス、 カビ、 およ び他の寄生虫を含む感染性の物質を殺傷する；
身長、 体重、 髪の色、 目の色、 肌あるいは他の組織の色素沈着、 あるいは器 官の大きさ （例えば胸部増量あるいは減量） 等、 身体的特徴を抑制あるいは 促進する効果を及ぼす；
食餌脂肪、 蛋白、 あるいは炭水化物の分解に効果を示す；
食欲、 性欲、 ストレス、 認識 （認識障害） 、 鬱病、 暴力行動を含む行動特徴 に効果を及ぼす；
鎮痛効果あるいは他の痛みを減少させる効果を提供する；
胚性幹細胞の造血系以外の他の系統への分化および増殖を促進する； および、 酵素の場合、 その酵素の欠失を補い、 また関連疾患を治療する。 上記活性を有する蛋白は、 例えば、 B細胞、 T細胞、 肥満細胞の増殖また は細胞死、 免疫グロブリンのクラススイツチ促進によるクラス特異的誘導、 B細胞の抗体産生細胞への分化、顆粒球前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 単球 ·マクロファージ前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 好中球、 単球 · マクロファージ、 好酸球、 好塩基球の増殖または機能亢進、 細胞死、 巨核球 前駆細胞の増殖または細胞死、 好中球前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 Bまたは T前駆細胞の増殖または分化、 細胞死、 赤血球の産生促進、 赤血球、 好中球、 好酸球、 好塩基球、 単球 ·マクロファージ、 肥満細胞、 巨核球前駆 細胞の増殖支持、 好中球、 単球 ·マクロファージ、 B細胞または T細胞の遊 走促進、 胸腺細胞の増殖または細胞死、 脂肪細胞の分化抑制、 ナチュラルキ ラー細胞の増殖または細胞死、 造血幹細胞の増殖または細胞死、 幹細胞およ び各種造血前駆細胞の増殖抑制、 間葉系幹細胞からの骨芽細胞、 軟骨細胞へ の分化促進または増殖、 細胞死、 あるいは破骨細胞の活性化や単球から破骨 細胞への分化促進による骨吸収の促進の作用を本発明のポリペプチドのみで、 またリガンドーレセプター間の結合を介して、 あるいは他の分子と相乗的に 働くことにより有すると考えられる。
また本発明のペプチドは神経系にも作用することが予測されるので、 各種 神経伝達物質作動性神経細胞への分化ならびにそれらの生存維持または細胞 死、 グリア細胞の増殖促進または細胞死、 神経突起の伸展、 神経節細胞の生 存維持または細胞死、 ァストロサイトの増殖または分化促進または細胞死、 末梢神経の増殖または生存維持、 細胞死、 シュワン細胞の増殖または細胞死、 運動神経の増殖または生存維持、 細胞死の作用もあると考えられる。
さらに、 本発明のポリペプチドは初期胚の発生過程において、 外胚葉誘導 作用による表皮、 脳、 背骨、 神経の器官形成、 中胚葉誘導作用による背索結 合組織 （骨、 筋肉、 腱） 、 血球細胞、 心臓、 腎臓、 生殖巣の器官形成、 ある いは内胚葉誘導作用による消化器系臓器 （胃、 腸、 肝臓、 塍臓） 、 呼吸器系 (肺、 気管） の形成に促進的または抑制的に作用すると考えられ、 成体にお いても上記器官の増殖あるいは増殖抑制作用を有すると考えられる。
したがって、 本発明のポリペプチドはそれ自身で、 免疫系または神経系も しくは骨代謝の機能の低下または亢進に関する疾患、 または造血系細胞の発 育不全または異常増殖、 例えば、 炎症性疾患 （リウマチ、 潰瘍性大腸炎等） 、 骨髄移植後の造血幹細胞の減少症、 ガン、 白血病に対する放射線照射または 化学療法剤投与後の白血球、 血小板、 B細胞または T細胞の減少症、 貧血、 感染症、 ガン、 白血病、 エイズ （A I D S ) 、 骨代謝異常 （骨粗鬆症等） 、 動脈硬化、 各種変性疾患 （アルツハイマー病、 多発性硬化症等） 、 あるいは 神経損傷の予防または治療薬として用いることが期待される。
また本発明のポリペプチドは、 外胚葉、 中胚葉または内胚葉由来器官の分 化、 増殖作用を有すると考えられるので、 各器官 （表皮、 骨、 筋肉、 腱、 心 臓、 腎臓、 胃、 腸、 肝臓、 塍臓、 肺、 気管等） の組織修復剤として用いるこ とも期待される。
また、 本発明のポリペプチドのポリクロ一ナル抗体またはモノクローナル 抗体を用いて、 生体における該ポリペプチドの定量が行なえ、 これによつて 本発明のポリペプチドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用す ることができる。 ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は本発明の ポリペプチドあるいはその断片を抗原として用いて公知の方法により作製す ることができる。
また本発明のポリぺプチドを用いることにより、 例えばァフィニティ一力 ラムを作製して、本発明のポリペプチドと結合する既知または未知の蛋白（リ ガンド） の同定、 精製あるいはその遺伝子クローニングを行なうことができ る。
また本発明のポリペプチドを用いて、 例えばウェスト一ウェスタン法によ り、 または本発明の c D N A (好ましくは本発明のポリペプチドをコードす る c D NAを用いて、 例えば酵母 2—ハイプリッド法により本発明のポリべ プチドと相互作用する分子の同定、 遺伝子ク口一ニングを行なうこともでき る。
さらに本発明のポリペプチドを用いることによって、 本発明のポリべプチ ドレセプタ一ァゴ二スト、 アン夕ゴニストおよび受容体—シグナル伝達分子 間の阻害剤等のスクリーニングを行なうこともできる。
スクリーニングは、 例えば、 以下の方法により行なうことが出来る。 すな わち、
a ) 本発明のポリペプチド、 スクリーニングすべき化合物、 および細胞を含 む反応混合物を、 細胞が本発明のペプチドにより正常に刺激される条件下に 一緒にし （該反応混合物は細胞が増殖するに従い細胞中に導入される標識お よび本発明のペプチドの機能を効果的に観察させるための本発明のペプチド 以外のペプチドを含む） ；ついで
b ) 細胞の増殖の程度を測定して、 対象化合物が有効なアン夕ゴニストまた はァゴニストであるかどうかを決定する。
より詳細には、 以下のようにして行なわれる。 すなわち：
ラット血管平滑筋細胞株 （ATCC CRI^1444または CRL-1476) をプレート にまいて、 1 0 %血清存在下で 2 4時間培養した後、 望ましくは 1， 1 0ま たは 5 0 n g Zm 1濃度のヒト P D G F— B B (GENZYME社製） を含む無 血清培地に交換する。 A 5 5蛋白のアン夕ゴニスト活性を有する化合物をス クリーニングする場合は、 その際 A 5 5蛋白とスクリーニングすべき化合物 を同時に添加した後、 2 4時間培養後に3 H—チミジンを添加し、その 4時間 培養後に細胞に取りこまれた3 Hを測定することによって、 A 5 5蛋白の3 H —チミジン取り込抑制活性を阻害する化合物をスクリーニングができる。 A 5 5蛋白のァゴニスト活性を有する化合物をスクリーニングする場合は、 上 記細胞にスクリーニングすべき化合物を添加した後、 2 4時間培養後に3 H _ チミジンを添加し、その 4時間培養後に細胞に取りこまれた3 Hを測定するこ とによって、 3H—チミジン取り込抑制活性を有する化合物をスクリーニング ができる。
本発明の cDNAは、 多大な有用性が期待される本発明のポリペプチドを 生産する際の重要かつ必須の铸型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療（遺 伝子欠損症の治療またはアンチセンス DNA (RNA) によって、 ポリぺプ チドの発現を停止させることによる治療等） に利用できる。
また、 本発明の C DNAをプローブとしてジエノミック （genomic) DNA を分離できる。 同様にして、 本発明 CDNAと相同性の高いマウスあるいは ヒトの関連ポリペプチドの遺伝子、 またマウスあるいはヒト以外の生物にお ける本発明ポリぺプチドと相同性の高いポリぺプチドの遺伝子を分離するこ とも可能である。
[医薬品への適用]
前記の疾患に適応するために、 本発明のポリペプチド、 あるいは本発明の ポリペプチドに対する抗体は通常、 全身的又は局所的に、 一般的には経口ま たは非経口の形で投与される。 好ましくは、 経口投与、 静脈内投与および脳 室内投与である。
投与量は、 年齢、 体重、 症状、 治療効果、 投与方法、 処理時間等により異 なるが、 通常、 成人一人あたり、 一回につき、 l O O gから l O Omgの 範囲で、 一日一回から数回経口投与されるか、 または成人一人あたり、 一回 にっき、 10 gから 10 Omgの範囲で、 一日一回から数回非経口投与さ れる。
もちろん前記したように、 投与量は、 種々の条件により変動するので、 上 記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、 また範囲を越えて必要な場合 もある。
本発明化合物を投与する際には、 経口投与のための固体組成物、 液体組成 物およびその他の組成物、 非経口投与のための注射剤、 外用剤、 坐剤等とし て用いられる。
経口投与のための固体組成物には、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 散剤、 顆粒 剤等が含まれる。 カプセルには、 ソフトカプセルおよびハードカプセルが含 まれる。
このような固体組成物においては、 一つまたはそれ以上の活性物質が、 少 なくとも一つの不活性な希釈剤 （例えば、 ラクト一ス、 マンニト一ル、 ダル コース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 微結晶セルロース、 デンプン、 ポ リビニルピロリドン、 メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等） と混合される。 組成物は、 常法に従って、 不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、 潤滑剤（ス テアリン酸マグネシウム等） 、 崩壊剤 （繊維素グリコール酸カルシウム等） 、 安定化剤 （ヒト血清アルブミン、 ラクト一ス等） 、 溶解補助剤 （アルギニン、 ァスパラギン酸等） を含有していてもよい。
錠剤または丸剤は、 必要により白糖、 ゼラチン、 ヒドロキシプロピルセル ロース、 ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等の胃溶性あるい は腸溶性のフィルムで被膜してもよいし、また 2以上の層で被膜してもよい。 さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
経口投与のための液体組成物は、 薬学的に許容される乳濁剤、 溶液剤、 懸 濁剤、 シロップ剤、 エリキシル剤等を含み、 一般に用いられる不活性な希釈 剤 （例えば、 精製水、 エタノール等） を含んでいてもよい。 この様な組成物 は、 不活性な希釈剤以外に湿潤剤、 懸濁剤のような補助剤、 甘味剤、 風味剤、 芳香剤、 防腐剤を含有していてもよい。
経口投与のためのその他の組成物としては、 ひとつまたはそれ以上の活性 物質を含み、 それ自体公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。 この組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリゥムのような安定剤と 等張性を与えるような安定化剤、 塩化ナトリウム、 クェン酸ナトリウムある いはクェン酸のような等張剤を含有していてもよい。 スプレー剤の製造方法 は、 例えば米国特許第 2,868,691号および同第 3,095,355号明細書に詳しく記 載されている。
本発明による非経口投与のための注射剤としては、 無菌の水性または非水 性の溶液剤、 懸濁剤、 乳濁剤を包含する。 水性または非水性の溶液剤、 懸濁 剤としては、 一つまたはそれ以上の活性物質が、 少なくとも一つの不活性な 希釈剤と混合される。 水性の希釈剤としては、 例えば注射用蒸留水および生 理食塩水が挙げられる。 非水性の希釈剤としては、 例えばプロピレングリコ —ル、 ポリエチレングリコール、 オリ一ブ油のような植物油、 エタノールの ようなアルコール類、 ポリソルベート 8 0 (登録商標） 等が挙げられる。 このような組成物は、 さらに防腐剤、 湿潤剤、 乳化剤、 分散剤、 安定化剤 (例えば、 ヒト血清アルブミン、 ラクト一ス等） 、 溶解補助剤 （例えば、 ァ ルギニン、 ァスパラギン酸等） のような補助剤を含んでいてもよい。 発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の A 5 5クローンに関する実施例を挙げて本発明をより具体 的に説明するが、 これらは本発明の範囲を制限するものではない。 実施例 1 ： p o 1 y (A) +R NAの調製
マウス 18.5日胎児心臓組織より T R I z ο 1試薬 （TRIzol reagent, 登録商 標、 GIBCOBRLより購入） を用いて全 R NAを抽出し、 mR NAピユリフィ ケ一ション ·キット （mRNA Purification Kit, 商品名、 Pharmaciaより購入） を用いて p o l y (A) + R NAを精製した。 実施例 2 ：酵母 S S T c D NAライブラリ一の作製
上記の p o 1 y (A) +R NAを铸型に X h o I部位を連結したランダム 9 NNNNNNNN- 3' (配列番号 11 ) をプライマ一として、 ス一パースク リフト 'プフスミド 'システム （Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning, 商品名、 GIBCOBRLより購入） を用いて 2本鎖 cDNA の合成を行なった。 Ec oR Iアダプタ一 （GIBCOBRLより購入） を DNA ライゲ一シヨンキット （DNA ligation kit ver.2, 商品名、 宝酒造 （株） より購 入。 以下 cDNAの連結はすべて本キットを使用した。 ） を用いて連結した 後、 Xho lで消化し、 ァガロース電気泳動で 300〜800 b pの c DN Aを切り出して分画し、 pSUC2 (米国特許 5,536,637号参照） の Ec oR I /No t I部位に連結し、 大腸菌 DH 10 B株にエレクトロボレ一ション 法で形質転換して酵母 S S T用の c D N Aライブラリ一を得た。 実施例 3 ： S STによるスクリーニングおよび S ST陽性クローンの塩基配 列の決定
この C DNAライブラリ一のプラスミドを調製し、酢酸リチウム法（Current Protocols In Molecular Biology 13.7.1を参照)により酵母 YTK 12株を形質転 換し、 トリブトファン （Tr p) 不含の酵母形質転換体の選択培地 （CMD _T r p培地） のプレート上にまいた。 30 で 48時間インキュベートし た後、 アキュトラン ·レプリカ ·プレー夕一 （Accutran Replica Plater, 商品名、 Schleicher & Schuellより購入） を用いて得られたコロ二一（形質転換体） のレ プリカをラフィノースを炭素源とする YPRプレートにとり、 30°Cで 14 日間インキュベートした。 3日目以降、 出現してきた各々のコロニーを一つ ずつ再度 γ PRプレートにストリークして 30°Cで 48時間インキュベート した後、 シングルコロニーを YPD培地に植菌し、 30°Cで 48時間インキ ュペートした後、 プラスミドを調製した。 続いて p SUC 2のクローニング サイ卜の両端の配列の 2種類のプライマー （センス鎖はピオチン化プライマ 一） を用いて公知の方法に従って PC Rを行ない、 インサート cDNAを増 幅した後、 ダイナビーズ （Dynabeads, 商品名、 DYNALより購入） を用いて ピオチン化 1本鎖 cDN Aを精製し、 塩基配列の決定を行なった。
塩基配列の決定は D N Aシ一ケンシング 'キット （DNA Sequencing kit (Dye Terminator Cvcle sequencing Ready Reaction), 商品名、 Applied Biosystems Inc. より購入） を用いた蛍光ダイ夕一ミネ一夕一サイクルシークェンス法で反応 を行ない、 自動 DN Aシークェンサ一373 (Applied Biosystems Inc.)で読み取 りを行なった （以下、 降塩基配列決定はすべて本方法で行なった。 ) 。
得られた塩基配列および推定されるアミノ酸配列についてデータベースと の相同性検索を行ない、 A55と名付けられたクローンがデータベースに登 録されていない新規の c DNAであることが明らかとなった。 そこでこの A 55クローンの断片 c DNA (以下、 A55 S S T断片 c DNAと呼ぶ） に ついて全長 cDNAのクロ一ニングを試みた。 また推定されるアミノ酸配列 を既知のシグナルペプチドと比較することにより A 55 S ST断片 cDN Aが機能的かつ構造的にもシグナルペプチドを有することを確認した。 実施例 4 ：全長 cDNAのクローニングおよび全塩基配列の決定
マウス 13日胎児心臓 cDNAライブラリ一 （Uni-ZAP XR) (Stratagenよ り購入） のファージ粒子を大腸菌 XL 1— Blue MRF*株に感染させて得ら れた 100万プラークをナイロンメンブレンにトランスファ一した。 32P標 識したマウス A 55 S ST断片 c DNAをプロ一ブとしてプラークハイプリ ダイゼーションを行ない、 多数の陽性プラークを得た。
その中の 1プラークからファージを調製し、 ェクスアシスト ·ヘルパー · ファージ （ExAssist helper phage, Stratageneより購入)と共に大腸菌 X L 1 - Blue MR F*株 (Stratagene より購入）に感染させ、 ファージミド (pBluescript
SK(-))に変換した。 ファージミドを大腸菌 DH 5 a株に感染させた後、形質転 換体よりプラスミドを調製した。 初めに 5 '側の塩基配列を決定してマウス A 5 5 S S T断片 c D NAの塩基配列が存在することを確認した後、全塩基 配列を決定し、 配列番号 3に示す配列を得た。
さらにオープンリーディングフレームを決定し、 配列番号 2に示すアミノ 酸翻訳領域および配列番号 1に示す推定アミノ酸配列を得た。 本発明のぺプ チドの成熟蛋白は、 配列番号 3に示される （配列番号 3のアミノ酸配列 1 4 4〜： 1418間の領域） 4 2 5アミノ酸、 または配列番号 4に示される 4 2 3ァ ミノ酸であると推定される。 配列番号 5は、 配列番号 4のポリペプチドの翻 訳領域を表わす。
核酸配列データベースに登録されている既知の核酸配列に対して BLASTN および FASTAにより、またアミノ酸配列データベースに登録されている既知 のポリべプチドのァミノ酸配列に対して BLASTX、 BLASTPおよび FASTAに より検索した結果、 本発明のポリペプチド （マウス A 5 5ポリペプチドと呼 ぶ） およびそれをコードする核酸配列と一致する配列はなかった。
さらに得られたアミノ酸配列の疎水性プロットによる解析から、 本発明の マウス A 5 5ポリペプチドは膜貫通領域を持たないことも明らかとなり、 本 発明のマウス A 5 5ポリペプチドは、 新規の分泌蛋白質であることが判明し た。
しかし、 モチーフ検索の結果から、 マウス A 5 5クローンは 6力所の E G F様ドメインを有することが判明した。 この結果に基づいて、 マウス A 5 5 クローンは、 少なくとも E G Fファミリ一と同様な活性を保持すると期待さ れる。 また BLASTX、 BLASTPおよび FASTAは、 マウス A 5 5クロ一ン （配 列番号 1のァミノ酸配列 1〜 4 4 8間の領域） とヒト S 1 _ 5 (Swiss Prot Accession HSU03877のアミノ酸配列：！〜 3 8 7間の領域） の間に有為な相同 性があることを示した。 ヒト S 1— 5は繊維芽細胞より増殖抑制時期に発現 が誘導される分泌蛋白で、 細胞増殖に関連した活性を有することが報告され ている （Beata Lecka-Czemik et. al. Mol.Cell.Biol.15120-1281995)。 さらにその 他の EG F様ドメインを有する多くの蛋白とも相同性を示した。 実施例 5 ：マウス A 55蛋白アイソフォーム遺伝子の単離
転写開始点を決定するためにマラソン c DN Aアンプリフィケ一ションキ ット （Marathon cDNA Amplification Kit, 商品名、 Clontech社より購入)による 5 ' RACE (Rapid Amplification of cDNA End)法を用いて 5 '末端 cDNA のクロ一ニングを行なった。 铸型 2本鎖 cDNAの調製には、 マウス胎児心 臓組織の po l y (A) +RNAより作製した。
全長の塩基配列の情報に基づいてプライマー mA 55 -R 1 ： 5 ' 一 CG
2) を作製して、 該キットに添付されたアダプタ一プライマ一とで PC Rを 行なった。 増幅された cDNAをァガロース電気泳動で分画後、 pGEM—
T Vector (商品名、 Promegaより購入） に連結し、 大腸菌 DH 5 αに形質転 換してプラスミドを調製し、 全塩基配列を決定した。 その結果、 配列番号 3 で示された翻訳開始点 ATGを含む 5 '末端配列と異なる 5 '末端配列を有 するクローンを見い出した （配列番号 7および 8) 。
染色体遺伝子の解析から、 配列番号 8で示されたクローンは配列 3で示さ れたクローンのェクソン 1部分が約 400塩基下流に存在する別のェクソン を利用しており、 選択的スプライシングによって生じたクローンであること が判明した。 その結果該クローンは配列番号 1で示された Ν末端の 6ァミノ 酸が 1 9アミノ酸に置換されたァイソフォーム蛋白 （配列番号 6に示す） を コードすることが判明した。
本発明のペプチドの成熟蛋白は、 配列番号 8に示される （配列番号 8のァ ミノ酸配列 340〜1614間の領域） 425アミノ酸または、 配列番号 9に示 される 423アミノ酸であると推定される。 配列番号 10は、 配列番号 9の ポリぺプチドの翻訳領域を表わす。 実施例 6 ：哺乳動物細胞を用いたマウス A 55蛋白の発現
配列番号 3で示されたマウス全長 cD N Aを哺乳動物細胞用発現ベクター pNo t S (Kaufman etal., Nucleic Acids Res.l9,4485-4490(1991)参照） に連結 し、 マウス A 55蛋白発現用プラスミド pNo t S-mA55を構築した。 pN o t Sおよび pNo t S -mA 5 5をリポフエクチン （商品名、 GIBCOBRLより購入） を用いて 293 T細胞 （ATCC CRI^1573 293細胞 に SV40 T抗原を導入した細胞株） に導入し、 19時間後に35 S—メチォ ニン （Me t) を添加した Me tフリーの培地に交換して 30分間ラベルし た後、 Me tを含む培地で 5時間培養を行なった。 細胞上清を回収後、 セン トリコンー 10 (商品名、 Amiconより購入） にて約 10倍に濃縮し、 SDS — PAGEを行なった。 アクリルアミドゲルを乾燥させた後、 35Sでラベル された蛋白質の発現を BAS2000 (富士フィルム） を用いて検出した。
その結果 p No t S-mA55を導入した 293 T細胞の培養上清には、 発現ベクター P No t Sのみを導入した 293 T細胞の培養上清には認めら れないバンドが 60〜70 kD a付近に検出された。 このことから組み換え マウス A55蛋白が発現し、 培養上清中に分泌していることが確認された。 このマウス A55組み換え蛋白の分子量はァミノ酸組成から計算されるマ ウス A55の分子量 48 kDaよりも大きく、 マウス A 55蛋白には 2ケ所 の N型糖付加部位と O型糖鎖が付加しうる S e rおよび Th r残基が多数存 在することから、 N型および O型糖鎖が付加されていると予想された。 実施例 7 ：マウス A55蛋白によるラット血管平滑筋細胞増殖阻害作用の測 定
新生化学実験講座 10 「血管 内皮と平滑筋」 （日本生化学会編） に記載 の方法に従い、 ラットの心臓から横隔膜に至る大動脈より血管平滑筋細胞を 単離し初代培養を行なった。
ヒト PDGF— BB (GENZYME社製） 1， 3または 10 n g/m 1と同 時に、 実施例 6の方法で p No t Sまたは pNo t S-mA55を導入した 293 T細胞の培養上清を全培地量の 10%になるように添加し、 細胞増殖 EL I SA, B r dU発色キット （商品名、 ベ一リンガーマンハイムより購 入） の方法にしたがって、 血管平滑筋細胞の B r dUの取り込を測定した。 その結果、 図 1で示すように、 ラット血管平滑筋細胞は pNo t Sのみを 導入した 293 T細胞の培養上清を添加した場合は無添加の場合と比較して 無影響であつたが、 pNo t S— mA55を導入した 293 T細胞の培養上 清を添加した場合は有意な B r dUの取り込み阻害が認められた。
また PDGFを 1, 3， 10 ngZm 1の濃度で添加して、 濃度依存的に ラット血管平滑筋細胞における B r dUの取り込みを上昇させた場合におい ても、 pNo t Sのみを導入した 293 T細胞の培養上清を同時に添加した 場合は無添加の場合と比較して無影響であつたが、 pNo t S_mA55を 導入した 293 T細胞の培養上清を添加した場合には有意な B r dUの取り 込み阻害が認められた （図 1参照） 。
このことから、 組み換えマウス A 55蛋白は血管平滑筋細胞に対して増殖 阻害活性を有することが明らかとなつた。 実施例 8 ：抗マウス A 55蛋白ポリクロ一ナル抗体の作製
固相法により合成した 3種類のマウス A 55部分ペプチド
RTNPVYRGPYSNPYSTSYSG (71— 90) (配列番号 1の 48〜67)
GAYY I FQ I KS GNEGREF YMR (376 - 395) (配列番号 1の 353〜372) MTRP I KGPRD I QLDLEM I TVN (406— 426) (配列番 号 1の 383〜403)
を免疫原としてゥサギに免疫して、 抗体価の測定後血清を採取した。 得られ た血清を各々免疫原としたべプチド断片を結合させたァフィ二ティ一カラム により抗マウス A55蛋白ポリクロ一ナル抗体を精製した。
実施例 6と同じ方法で調製した培養上清を SDS— PAGEにかけた後、 蛋白をアクリルアミドゲルからィモビロン—P (PVDF膜、 商品名、 ミリ ポアより購入） にトランスファ一した。 作製した抗マウス A55ポリクロ一 ナル抗体を一次抗体として EC Lキット （商品名、 アマシャムより購入） を 用いて発色し、 組み換えマウス A 55蛋白を検出した。
その結果、 マウス A55発現ベクター pNo t S-mA55を導入した細 胞の培養上清には実施例 7で記載した35 Sラベルの実験と同じ位置である 6 0 kD a付近に単一のバンドが検出された。 一方発現ベクター p No t Sの みを導入した細胞の上清には 60 kD a付近にバンドは検出されなかった。 このことから得られたポリクロ一ナル抗体はマウス A 55蛋白を特異的に認 識していることが確認された。

Claims

請求の範囲
1. 実質的に純粋な形である配列番号 1、 4、 6または 9で示されるァミノ 酸配列からなるポリペプチド、 そのホモローグ、 そのフラグメントまたはそ のフラグメントのホモローグからなるポリペプチド。
2. 配列番号 1、 4、 6または 9で示されるアミノ酸配列からなる請求の範 囲第 1項記載のポリペプチド。
3. 請求の範囲第 1項に記載されたポリペプチドをコードする cDNA。
4. 配列番号 2、 5、 7または 10で示される塩基配列からなる請求の範囲 第 3項記載の c D N A、 またはその配列に選択的にハイプリダイズするフラ グメン卜からなる cDNA。
5. 配列番号 3または 8で示される塩基配列からなる請求の範囲第 3項記載 の c DNA、 またはその配列に選択的にハイブリダィズするフラグメントか らなる cDNA。
6. 請求の範囲第 3項から第 5項のいずれかの項に記載の c DN Aからなる 複製または発現ベクター。
7. 請求の範囲第 6項記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿主 細胞。
8. 請求の範囲第 1項または第 2項に記載されたポリぺプチドを発現させる ための条件下で請求の範囲第 7項記載の宿主細胞を培養することからなる該 ポリペプチドの製造方法。
9 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載されたポリぺプチドのモノクロ一 ナルまたはポリクローナル抗体。
1 0 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載されたポリペプチドまたは請求 の範囲第 9項記載の抗体および薬学的に許容される賦形剤および または担 体を含有することを特徴とする薬学的組成物。
1 1 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載されたポリペプチドおよび薬学 的に許容される賦形剤および または担体を含有することを特徴とする異常 な平滑筋の増殖が係る疾患の治療に有効な薬学的組成物。
1 2 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載されたポリペプチドおよび薬学 的に許容される賦形剤および または担体を含有することを特徴とする動脈 硬化または経皮的冠動脈形成術 （P T C A) 後の再狭窄をもたらす血管内膜 肥厚、 筋腫の治療に有効な請求の範囲第 1 1項記載の薬学的組成物。
1 3 . 請求の範囲第 1項または第 2項に記載されたポリペプチドを用いて、 該ポリペプチドに対するアン夕ゴニストまたはァゴニストとしての活性を有 する化合物をスクリーニングする方法。
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