HRP20020269A2 - The prv-1 gene and use thereof - Google Patents
The prv-1 gene and use thereof Download PDFInfo
- Publication number
- HRP20020269A2 HRP20020269A2 HR20020269A HRP20020269A HRP20020269A2 HR P20020269 A2 HRP20020269 A2 HR P20020269A2 HR 20020269 A HR20020269 A HR 20020269A HR P20020269 A HRP20020269 A HR P20020269A HR P20020269 A2 HRP20020269 A2 HR P20020269A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- sequence
- amino acids
- nucleotides
- prv
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 57
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 88
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 66
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 65
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 64
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 57
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 57
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 36
- 240000006711 Pistacia vera Species 0.000 claims description 29
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 21
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 21
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 13
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 claims description 8
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 claims description 8
- 208000032027 Essential Thrombocythemia Diseases 0.000 claims description 6
- 208000014767 Myeloproliferative disease Diseases 0.000 claims description 6
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 5
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010033661 Pancytopenia Diseases 0.000 claims description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 206010028537 myelofibrosis Diseases 0.000 claims description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 89
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 description 23
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 22
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 21
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 16
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 15
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 6
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 6
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 6
- 208000037244 polycythemia vera Diseases 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 5
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 5
- 208000017733 acquired polycythemia vera Diseases 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 5
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 5
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 2
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- VSNHCAURESNICA-NJFSPNSNSA-N 1-oxidanylurea Chemical compound N[14C](=O)NO VSNHCAURESNICA-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000002881 Colic Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000002702 GPI-Linked Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010043685 GPI-Linked Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010018690 Granulocytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000709400 Ruba Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005485 Thrombocytosis Diseases 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229930004094 glycosylphosphatidylinositol Natural products 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 208000018706 hematopoietic system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N meglumine amidotrizoate Chemical compound C[NH2+]C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- -1 secondary antibodies Substances 0.000 description 1
- 208000013213 secondary polycythemia Diseases 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 1
- 102000009816 urokinase plasminogen activator receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040001269 urokinase plasminogen activator receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/04—Antipruritics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Izum se odnosi na nukleotidnu sekvencu koja kodira PRV-1 gen, na rekombinantnu DNA koja sadrži tu nukleotidnu sekvencu, na vektore koji sadrže rekombinantnu DNA i na stanice koje su transformirane pomoću tih vektora, a također na polipeptid PRV-1, na antitijela za taj polipeptid, na proces za detekciju PRV-1 polipeptida i na lijekove koji obuhvaćaju PRV-1 polipeptid ili antitijela za PRV-1 polipeptid.
Polycythemia rubra vera (erythremia), također zvana i polycythemia vera ili p. vera, je zloćudna hematološka bolest u kojoj dolazi do povećanog nastajanja eritroidnih, granulocitnih i megakariocitnih stanica. Bolest je klonskog porijekla i javlja se kao rezultat mutacije pojedinačne hematopoietične prekursorske stanice. U Njemačkoj se javlja 4 do 6 slučaja p. vere na milijun stanovnika. U slučaju da je se ne liječi, bolest dovodi do smrti unutar 18 mjeseci. Liječenje ispuštanjem krvi ili kemoterapija produljuju prosječno vrijeme preživljavanja na više od 13 godina.
P. vera se dijagnosticira pomoću kliničkih kriterija. Klinička slika uključuje: glavobolju, pruritus, povećanja slezene kod dvije trećine pacijenata, krvarenja ili tromboze, povišeni krvni tlak kod trećine pacijenata, kostobolja, do koje dolazi uslijed povećane proizvodnje mokraćne kiseline i, u nekim slučajevima, gnojni čirevi. Najvažnije laboratorijske nalaze čine vrijednosti hemoglobina, hematokrit, broj eritrocita i ukupni volumen eritrocita, a također u mnogim slučajevima i neurofilna granulocitoza ili trombocitoza. S obzirom da je s jedne strane većina kriterija prilično difuzna, a s druge strane svi bolesnici ne ispunjavaju te kriterije, često je teško razlikovati p. veru od drugih mieloproliferativnih bolesti, kao što je kronična granulocitna leukemija ili esencijalna trombocitoza, te na taj način potvrditi dijagnozu. Molekularni uzrok p. vere je do danas u potpunosti nepoznat. Međutim, budući da se, ukoliko nije liječena, tijek bolesti povezan s p. verom može znatno pogoršati, točna dijagnoza je vrlo važna.
Cilj ovog izuma je stoga pronaći molekularni uzrok polycythemia rubra vere i stvoriti mogućnost za njeno dijagnosticiranje.
Taj cilj je postignut izoliranjem gena, čija je ekspresija specifično povezana s p. verom, a ne javlja se kod zdravih kontrolnih pojedinaca. Taj gen je označen kao gen PRV-1 (policistemia ruba vera).
Slična nukleotidna sekvenca je obuhvaćena u Međunarodnoj aplikaciji WO 98/50552.
Jedan od ciljeva iz ovog izuma se stoga odnosi na polinukleotid koji kodira gen PRV-1 i obuhvaća sekvencu ID br. 1. Polinukleotidi iz ovog izuma mogu biti jednolančana ili dvolančana DNA ili RNA. Ukoliko se radi o RNA, osobi vještoj u području struke će biti jasno da se nukleotid ̋U ̋ nalazi na mjestu nukleotida ̋T ̋. Pod ̋polinukleotidom ̋ se podrazumijevaju nukleinske kiseline koje sadrže 15 ili više nukleotida.
Nukleotidna sekvenca iz izuma je prikazana na slici 1. Izum se stoga odnosi na polinukleotid čija nukleotidna sekvenca odgovara sekvenci prikazanoj na slici 1, te također na polinukleotid čija nukleotidna sekvenca pokazuje male razlike. U ovoj aplikaciji se pod manjom razlikom podrazumijevaju one promijene sekvence kod kojih je nekoliko, preferirano ne više od 50, a naročito preferirano ne više od 25, nukleotida zamijenjeno, a da je, međutim, funkcija gena koji kodira nukleotidna sekvenca ostala nepromijenjena. Vješta osoba će biti upoznata s činjenicom da triplet baza koji kodira aminokiselinu može biti zamijenjen s drugim tripletom koji kodira istu aminokiselinu. Pored toga, područja koja su od manje važnosti mogu biti izbačena i/ili promijenjena u manjoj mjeri. U posebnom ostvarenju, polinukleotid koji obuhvaća nukleotide 36 do 1346 iz sekvence br. 1, predstavlja kodirajuće područje za gen PRV-1. Druga ostvarenja obuhvaćaju nukleotide 36 do 1262 ili 36 do 1238 iz sekvence br. 1. To područje vjerojatno kodira aktivno područje polipeptida PRV-1. Konačno, polinukleotid iz izuma može također obuhvatiti nukleotide 39 do 1346, 39 do 1262 ili 39 do 1238 iz sekvence br. 1, tako da kodon koji kodira polazni metionin nije prisutan. Preferirano ostvarenje predstavlja polinukleotid koji obuhvaća nukelotide 99 do 1346, 99 do 1262 ili 99 do 1238 iz sekvence br. 1. To rezultira s kodonom na 5' kraju koji kodira signalni peptid PRV-1 polipeptida koji nije bio prisutan.
Polinukleotid prema izumu može također biti fragment gena PRV-1. Pravilo je da fragment posjeduje više od 100 nukleotida, preferirano, međutim, više od 300 nukleotida. Fragmenti mogu također biti korišteni kao klice (praimers) ili kao probe, naročito za PCR; u tom slučaju, fragmenti mogu biti odrezani tako da odgovaraju svrsi. Obično, klice imaju duljinu između 10 i 30 nukleotida, a probe imaju duljinu između 15 i 50 nukleotida.
PRV-1 je endogeni gen čija ekspresija je kod zdravih pojedinaca ograničena na samo nekoliko organa. Normalno, ekspresija se pretežno odvija u hematopoietičkim organima, tj. u koštanoj srži i fetalnoj jetri, a slaba ekspresija se odvija u slezeni, dok u srcu, mišićima, gušterači ili bubregu ne dolazi do ekspresije. Kod bolesnika koji pate od p. vere dolazi do značajne prekomjerne ekspresije tog gena, osobito u hematopoietičkim stanicama.
Gen PRV-1 kodira protein s proteinskom sekvencom prikazanom na slici 2.
Signalni peptid, koji je prisutan u proteinskoj sekvenci svih površinskih molekula i koji se uobičajeno uklanja prilikom obrade proteina, je odijeljen crticom. Protein posjeduje sekvencijski ID br. 2. Kao rezultat navedenog, drugi aspekt izuma je čisti polipeptid koji posjeduje sekvencu br. 2, ali kome manjka signalni peptid (tj. aminokiseline 22 do 437 iz sekvence br. 2). Druga ostvarenja obuhvaćaju aminokiseline 1 do 409, 22 do 409 i 1 do 401 ili 22 do 401 iz sekvence br. 2 (što vjerojatno predstavlja aktivno područje proteina).
S obzirom na biološku aktivnost, polipeptid iz izuma je preferirano glikoziliran; najviše preferirano je N-glikoziliran. Nakon toga on može biti glikoziliran na najmanje jednoj od aminokiselina Asn-46, Asn-189 i Asn-382 PRV-1 polipeptida (brojevi aminokiselina se odnose na sekvencu br. 2). Izum također obuhvaća fragmente polipeptida iz izuma koji su N-glikozilirani. Fragmenti su dugački najmanje 50 aminokiselina, preferirano najmanje 100 aminokiselina, a najviše preferirano najmanje 150 aminokiselina. U drugom ostvarenju polipeptid može biti O-glikoziliran.
Vještoj osobi će biti jasno da određena aminokiselina može biti zamijenjena s drugim aminokiselinama bez slabljenja biološke aktivnosti proteina. Takvi modificirani oblici polipeptida iz izuma su također dio predmeta kojim se izum bavi (inačice). U aminokiselinske zamjene su uključene one zamjene koje nemaju negativno djelovanje na biološku aktivnost proteina. Vješta osoba može iskoristiti dobro poznati zakon za odabir zamjena.
Ovisno o postupku priprave PRV-1 polipeptid može, na primjer, posjedovati glikozil fosfatidilinozitolno sidro. Ono se nakon toga veže za aminokiseline 407 do 409 u sekvenci ID br. 2. GPI sidro je korišteno za vezanje proteina pomoću lipida na vanjskoj strani stanične membrane. Međutim, zbog razloga koji do sada još nisu u potpunosti razjašnjeni, često je opaženo da su GPI-povezani proteini također oslobođeni u medij. Ta pojava se naziva ̋curenje ̋. Do danas nije razjašnjeno da li je to specifični proces, tj. je su li takvi proteini odvojeni od membrane djelovanjem enzima na kontrolirani način, ili se radi o nespecifičnom gubitku sidra. Posljedica toga je da će vrlo vjerojatno PRV-1 biti nađen i na staničnoj membrani i izvan stanice. Izlučeni oblik, koji nije vezan za membranu, je vjerojatno važniji za djelovanje polipeptida kao faktora rasta i inhibitora rasta, budući da je kao faktor rasta taj oblik u stanju difundirati i doseći druge stanice.
Vještoj osobi će biti jasno da može utjecati na prianjanje proteina za staničnu membranu manipulacijom s aminokiselinama na C kraju proteina. To se posebno odnosi na pripravu definiranih DNA konstrukcija koje su namijenjene za ekspresiju polipeptida PRV-1 ili fragmenata tog polipeptida. Kodoni koji kodiraju te aminokiseline mogu biti mutirani ili uklonjeni.
Gen kodira površinski receptor iz obitelji uPAR/Ly6. Ta obitelj receptora može prenijeti mitogene signale, tj. signale koji stimuliraju diobu stanice. Zbog toga se podrazumijeva da prekomjerna ekspresija gena PRV-1, između ostaloga u stanicama leđne moždine pacijenata s p. verom, doprinosi hiperproliferaciji tih stanica.
Nađeno je da ne dolazi do ekspresije PRV-1 u granulocitima zdravih pojedinaca ili kod pacijenata koji pate od drugih mieloproliferativnih bolesti, na primjer koji pate od kronične granulocitne leukemije, akutne granulocitne leukemije, esencijalne trombocitoze ili sekundarne eritrocitoze.
Da bi smo bili u stanju koristiti polipeptid kodiran genom PRV-1 kod analize i postupaka detekcije, poželjno ga je dobiti od rekombinantne DNA, pri čemu rekombinantna DNA preferirano obuhvaća nukleotidnu sekvencu ID br. 1 ili barem kodirajuće područje gena PRV-1, koje predstavljaju nukleotidi 36 do 1346 iz sekvence ID br. 1 ili, u drugom slučaju, barem nukleotide 39 do 1262 ili 39 do 1238, funkcionalno vezane za promotor. Međutim, rekombinantna DNA može također obuhvatiti samo fragment iz sekvence br. 1.
Izum se pored toga odnosi na vektor koji sadrži rekombinantnu DNA za polipeptid PRV-1 ili na njegov fragment, te na stanicu domaćina koja je podvrgnuta transfekciji ili transformaciji pomoću tog vektora. Stanica domaćina može biti prokariotska, na primjer bakterija kao što je E. coli. Međutim, u tom slučaju polipeptidi dobiveni ekspresijom nisu glikozilirani. Prednost se zbog toga daje eukariotskim stanicama domaćina, koje su u stanju naknadno glikozilirati proteine dobivene ekspresijom, te ih modificirati na druge načine. Primjeri eukariotskih stanica domaćina su stanice kukaca, kao što su stanice Sf9, ekspresiju kojih prati infekcija s rekombinantnim bakulovirusima, te stanice sisavaca, kao što su 293 stanice, COS stanice, CHO stanice i HeLa stanice. Ti primjeri nisu iscrpljeni s navedenim stanicama. Također je moguće kao stanice domaćina koristiti stanice kvasca. Vještoj osobi će biti jasno da način glikoziliranja može varirati u ovisnosti o tipu stanice domaćina. Biološka aktivnost produkta ekspresije može, zbog toga, također varirati. Naročita prednost se daje stanicama domaćina koje glikoziliraju produkt ekspresije na način koji održava biološku aktivnost proteina.
Drugi aspekt izuma je proces za pripravu polipeptida iz izuma. Kod tog procesa, je potaknuta ekspresija DNA koja kodira polipeptid iz izuma u stanici domaćina. Medij stanične kulture ili stanice je/su korištene za kasniju izolaciju polipeptida, ovisno o tome je li polipeptid dobiven ekspresijom izlučen od stanice domaćina u medij stanične kulture ili je ostao u stanici.
Nakon toga je polipeptid iz izuma koncentriran i/ili pročišćen uz upotrebu postupaka poznatih u struci, na primjer pomoću kromatografskih postupaka. Postupci za pročišćavanje proteina su opisani, na primjer, u Scopes, R., Protein Purification: Principles and Practice (3rd edition), Springer Verlag (1994). U jednom posebnom ostvarenju, proces iz izuma uključuje korak u kojem je glikozilirani protein koncentriran i/ili pročišćen. Taj korak se može odvijati prije nego li je polipeptid iz izuma znatno pročišćen ili nakon što je već u biti pročišćen. U potonjem slučaju glikozilirani dijelovi pročišćenog polipeptida su odijeljeni i izolirani. U najviše preferiranom ostvarenju procesa, N-glikozilirani polipeptid je specifično izoliran. U drugom ostvarenju iz procesa, izoliran je polipeptid koji je glikoziliran na najmanje jednoj od aminokiselina Asn-46, Asn-189 i Asn-382 iz sekvence br. 2.
PRV-1 polipeptid, koji je izoliran iz granulocita ili proizveden rekombinantnom tehnologijom, može biti upotrijebljen za dijagnosticiranje polycythemia vere, te za liječenje bolesti.
Jedna terapeutska mogućnost je primjena terapije s reverznom nukleotidno sekvencom (antisense). Taj postupak koristi RNA molekule s nukleotidno sekvencom koja je komplementarna u odnosu na PRV-1 RNA. Budući da PRV-1 RNA posjeduje sekvencu 5'-AAAAGCAGAAAGAGATTACCAGCC-3' (SEQ ID No. 3) na svom početku, tražena RNA usmjerena protivno toj sekvenci će posjedovati slijedeću nukleotidnu sekvencu: 5'-GGCTGGTAATCTCTTTCTGCTTTT-3' (SEQ ID No. 4). Takva RNA je ugrađena u vektor i uvedena u p. vera stanice. Ta RNA se uvodi, na primjer, pomoću transfekcije, pri čemu je vektor koji se koristi za transfekciju preferirano oblikovan na način da se specifično uvodi u p. vera stanice. Ekspresija takve RNA rezultira time da više nije moguće da se PRV-1 mRNA translatira u polipeptid. Stanice koje su tretirane na taj način nakon toga ne formiraju niti jedan PRV-1 protein.
Izum se stoga također odnosi na proces za detekciju p. vere, koji je karakteriziran time da je PRV-1 polipeptid, ili njegov epitop, detektiran, te je određen doseg ekspresije.
Prekomjerna ekspresija tog receptora u zrelim stanicama izvan leđne moždine, na primjer u granulocitima, je snažna indikacija prisutnosti bolesti p. vere. Ta prekomjerna ekspresija se pogodno detektira primjenom imunoloških ispitivanja uz upotrebu antitijela za PRV-1 receptor. Pogodni postupci testiranja su poznate varijante imunološkog ispitivanja koje se koriste antitijelima specifičnim za polipeptid PRV-1 zajedno s drugim obilježenim antitijelima koja mogu biti imobilizirana ili u otopini. Obilježavanje se provodi na poznati način, na primjer uz upotrebu radioaktivnih izotopa, primjenom fluorescencije ili luminiscencije, uz upotrebu enzima, pomoću reaktanata koji tvore obojenja ili uz upotrebu drugih skupina koji su pogodni za određivanje. Te varijante su poznate vještoj osobi i ne zahtijevaju podrobnije objašnjavanje. ELISA testovi su naročito preferirani u izumu.
Antitijela koja su potrebna za specifično detektiranje PRV-1 receptora mogu pored toga biti pripravljena na dobro poznat način. Pogodna su i monoklonska i poliklonska antitijela, pri čemu se prednost daje upotrebi monoklonskih antitijela.
Peptidi dobiveni iz proteina mogu također biti korišteni za pripravu antitijela. Uspjeh je unutar ovog izuma postignut upotrebom peptida sa sekvencom:
a) KVSDLPRQWTPKN (aminokiseline 34 do 46) [SEQ. ID No. 5], te
b) SAREKRDVQPPASQH (aminokiseline 391 do 405) [SEQ. ID No. 6].
Poliklonska antitijela se normalno proizvode imunizacijom pogodnog domaćina (zec) s PRV-1 polipeptidom, na pogodan način povezanim s imunološkim pomoćnim sredstvom (adjuvant), čime se pobuđuje imunološka reakcija. Monoklonska antitijela se mogu dobiti na dobro poznati način uz upotrebu tehnike hibridoma. Antitijela se mogu pročistiti primjenom afinitetnog pročišćavanja. Priprava i pročišćavanje antitijela su opisani, na primjer, u ̋Antibodies: A laboratory Manual ̋, autora Harlow-a i Lane-a, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Pored toga, takva poliklonska ili monoklonska antitijela za PRV-1 mogu također biti korištena za tretman bolesti.
U drugom ostvarenju, receptor PRV-1 se može detektirati upotrebom postupka RT-PCR. Za to je RNA prvotno izolirana iz stanica koje prekomjerno eksprimiraju PRV-, a koje su u pravilu granulociti. Reverzna transkripcija se nakon toga provodi na poznati način uz upotrebu RT klica. RT klica je preferirano klica sa slijedećom nukleotidnom sekvencom (SEQ ID No. 7):
ATTAGGTTATGAGGTCAGAGGGAGGTT.
Na taj način je specifična RNA PRV-1 prepisana u DNA. Ta DNA je nakon toga umnožena u reakciji PCR na poznat način. Slijedeća dvije klice se preferirano koriste u ciklusima umnažanja:
Kao klica za nukleotidnu sekvencu koja je u stanju kodirati aminokiseline (sense primer) (SEQ ID br. 8)
GCAGAAAGAGATTACCAGCCACAGACGG.
Kao klica s reverznom orjentacijom (antisense primer) (SEQ ID br. 9)
GAATCGTGGGGGTAATAGAGTTAGCAGG.
Vješta osoba će biti u stanju koristiti danu sekvencu da bi našao druge klice koji su također pogodne.
Budući da je kao polazni materijal za taj postupak korištena RNA, rezultat signala PCR je pozitivan samo u slučaju kada je eksprimiran gen PRV-1. Kao što je objašnjeno ranije, to će se dogoditi samo u slučaju kada bolesnik pati od p. vere. Ekspresija PRV-a u granulocitima se ne javlja kod zdravih osoba. Kao posljedica toga, odsutnost bilo kakvog RT-PCR signala ukazuje da p. vera nije prisutna. Kvantifikacija se kod RT-PCR postupka preferirano provodi upotrebom TaqMan® tehnologije. Ta kvantifikacija zahtjeva pored klica i probu. Preferirana sekvenca probe je 5'-TTCTTGTTGAACCACACCAGACAAATCGG-3' (SEQ ID No. 10). Kvantitativni RT-PCR za detekciju transkripcije PRV-1 je stoga također dio predmeta ovog izuma.
Kao druga mogućnost, također je moguće koristiti postupke hibridizacije (blotting), preferirano Northern hibridizaciju, za dijagnosticiranje p. vere. Kod takvog postupka, RNA je izolirana iz granulocita i nakon toga ispitivana na prisutnost ekspresije PRV-1, upotrebom postupaka hibridizacije, na primjer tehnikom Northern hibridizacije. Sekvenca cDNA iz SEQ ID No. 1, ili neki segment te sekvence, može biti korišten kao proba. U tom slučaju dolazi do hibridizacije samo ukoliko su granulociti dobiveni od pacijenta koji pati od p. vere, budući da će samo u tom doći do pojave ekspresije u granulocitima. Odsutnost hibridizacije ukazuje da pojedinci od kojih su uzeti granulociti nemaju p. veru.
Također je moguće koristiti fragment gena za Northern hibridizaciju. Takav fragment je obično dug više od 300 baza. Druga mogućnost je da se raznoliki fragmenti gena, koji mogu biti korišteni kao probe u Northern hibridizaciji, mogu biti pripravljene tretiranjem gena s restrikcijskim endonukleazama. Ukoliko su fragmenti dobiveni iz cDNA, biti će prisutni u dvolančanom obliku koji u svrhu hibridizacije mora biti razdijeljen na pojedinačne lance. Pogodni primjeri su Bam HI-PstI fragment od para baza 420 do para baza 831 ili PstI-PstI fragment od para baza 831 do para baza 1900.
PRV-1 mRNA, te posljedično ekspresija PRV-1, može također biti detektirana prvom od svih reverznih transkripcija mRNA u RT-PCR reakciji i nakon toga umnožavanjem cDNA; umnožena DNA je nakon toga detektirana pomoću probe u hibridizacijskom postupku.
U slučaju pozitivne dijagnoze, bolest treba biti liječena budući da u protivnom dovodi do smrti unutar relativno kratkog vremenskog perioda. Za to liječenje je moguće koristiti koristiti specifična antitijela usmjerena na PRV-1 i na koja, kada je to pogodno, mogu biti vezane citotoksičke komponente. Izum se stoga dodatno odnosi na lijek koji uz dodatak uobičajenog ekscipijenta, obuhvaća antitijela koja su usmjerena na receptor PRV-1.
Budući da se kod p. vere odvija prekomjerna ekspresija receptora PRV-1, mnoga antitijela se vežu za površinu oštećenih granulocita, nakon što dođu u kontakt s anti-PRV-1 antitijelima. Vezanje brojnih antitijela za te stanice pobuđuje imunološke stanice da razore granulocite. Na taj način je moguće postići specifično uklanjanje stanica p. vera.
Iznenađujuće, također je nađeno da polipeptid PRV-1 pokazuje hematopoietičku aktivnost. Polipeptid PRV-1 je u stanju stimulirati određene hematopoietičke prekursorske stanice da formiraju eritroidne kolonije. Naročito N-glikozilirani polipeptidi PRV-1 pokazuju tu funkciju. Polipeptidi iz izuma koji su stoga preferirani su N-glikozilirani polipeptidi PRV-1 i njihovi fragmenti koji pokazuju aktivnost faktora rasta.
Drugi aspekt izuma stoga predstavlja lijek koji, uz dodatak farmaceutski prihvatljivog ekscipijenta, obuhvaća polipeptid PRV-1 ili njegov biološki aktivni fragment. PRV-1 polipeptid je preferirano glikozilirani PRV-1 polipeptid, a još više preferirano N-glikozilirani polipeptid PRV-1 ili njegov biološki aktivni fragment. Izum se također odnosi na lijekove koji obuhvaćaju najmanje jedan polinukleotid iz izuma.
Ovaj izum se pored toga odnosi na upotrebu polipeptida PRV-1 ili njegovih biološki aktivnih fragmenata ili biološki aktivnih varijanti, kao faktor rasta in vivo ili ex vivo. Polipeptid PRV-1 ili njegovi biološki aktivni fragmenti ili biološki aktivne varijante mogu biti korišteni za tretman svih pancitopenija i pancitopatija u leđnoj moždini i kod cirkulacije (zamjene staničnih sastojaka iz periferne krvi i leđne moždine). Polipeptidi iz ovog izuma mogu, na primjer, biti korišteni za tretiranje anemija u slučaju otkazivanja bubrega, kemoterapije ili zračenja cijelog tijela, za tretman neuropenija i trombocitopenija za vrijeme kemoterapije ili zračenja cijelog tijela, za ex vivo tretman perifernih matičnih stanica ili matičnih stanica leđne moždine u svrhu umnažanja i ponovne transfuzije u pacijenta i za tretman upale, sindroma upalne reakcije sustava (SIRS) ili regionalnih upalnih reakcija.
Polipeptidi iz ovog izuma ili lijekovi koji ih obuhvaćaju mogu biti davani na mnogo različitih načina. Oblici davanja obuhvaćaju: intravenozno, intramuskularno, subkutano, intraperitonealno, oralno, transdermalno i transmukozalno davanje.
Polinukleotidi iz izuma mogu također biti korišteni za tretman pancitopenija i pancitopatija. U tom slučaju, cilj je provesti ekspresiju polipeptida PRV-1 ili njegovog funkcionalnog fragmenta u stanicama pogođenog pacijenta. Postupci genske terapije su prvi i najviše korišteni u vezi s time. Stanice mogu biti izolirane iz pacijenta, te na njima provedena transfekcija polinukleotida iz izuma (ex vivo manipulacija), nakon čega se vraćaju u pacijenta. Također je moguće zamisliti postupke u kojima se polinukleotidi iz izuma dovode u ciljne stanice primjenom virusnog prijenosa. Ekspresija unesenih nukleinskih kiselina nakon toga dovodi do hematopoietičke aktivnosti.
Iznenađujuće, također je nađeno da pri višim koncentracijama PRV-1 posjeduje inhibicijsko djelovanje na rast stanica. Tako je, na primjer, opaženo da dodavanje povećane količine proteina PRV-1 gotovo u potpunosti zaustavlja eritroidne i granulocitne/monocitne kolonije. To djelovanje sliči djelovanju interferona-�� koji se između ostalog koristi za liječenje kronične mieloidne leukemije (CML) i kod p. vere. Endogene inhibitorske tvari posjeduju veliku prednost u usporedbi s kemijskim citostatičkim sredstvima, kao što je hidroksiurea, koja se koristila u vrijeme dok interferon-� još nije bio dostupan, a u određenoj mjeri se još uvjek koristi. Nedostatak interferona-� je što taj aktivni spoj izaziva vrlo žestoke popratne pojave. Pacijenti se osjećaju kao da pate od vrlo ozbiljne gripe. Ovaj izum čini dostupnim tvar koja inhibira hematopoiezu, pri čemu je inhibitorska aktivnost ovisna o koncentraciji.
Drugi aspekt izuma je stoga upotreba polipeptida PRV-1, kao što je opisan u ovoj aplikaciji, za inhibiciju rasta stanica, a osobito njegova upotreba kao citostatskog sredstva. Prednost je dana polipeptidu koji je korišten za inhibiciju rasta hematopoietskih stanica. Izum se također odnosi na upotrebu polipeptida iz izuma u svrhu priprave lijeka za tretiranje proliferativnih bolesti. U te bolesti posebno spadaju mieloproliferativne bolesti, p. vera, esencijelna trombocitemija, mielofibroza, CML, te također sve leukemije i limfome, kao i solidni tumori.
Drugi aspekt iz izuma je upotreba polinukleotida, kao što je opisan u ovoj aplikaciji, iz biološki aktivnog fragmenta ili iz njegove biološki aktivne varijante, za inhibiciju rasta stanica. Polinukleotid može biti ugrađen u pogodan vektor i unijet transfekcijom u pogodnu ciljnu stanicu. Nakon ekspresije polipeptida PRV-1 ili njegovih biološki aktivnih fragmenata ili njegovih biološki aktivnih varijanti u odgovarajućoj koncentraciji, počinju se javljati učinci inhibicije rasta. Na isti način polinukleotid može biti ugrađen u virusni vektor, nakon čega je odgovarajuća ciljna stanica zaražena virusom, što dovodi do ekspresije PRV-1. Izum se također odnosi na upotrebu polinukleotida iz ove aplikacije za proizvodnju lijeka za tretman proliferativnih bolesti kao što su mieloproliferativne bolesti, p. vera, esencijalna trombocitemija, mielofibroza, CML, te također sve leukemije i limfome, kao i solidni tumori.
Izum se također odnosi na set za detektiranje polycythemia vere ili remećenja hematopoietičkog sustava. Taj alat obuhvaća polinukleotid iz izuma i/ili polipeptid iz izuma i/ili jedan ili više antitijela iz izuma. Pored toga, alat također može obuhvaćati posudu ili takve sklopove koji su pogodni za provedbu reakcija detekcije. Primjeri takvih sastava su puferske otopine, reagensi za blokiranje membrana, hibridizacijske otopine, sekundarna antitijela, otopine supstrata za reakcije detekcije, itd. Alat se preferirano koristi u provedbi PCR reakcija, RT-PCR, Northern hibridizacije, hibridizacije po Sothernu, Western hibridizacije, te ELISA, RIA i sličnih reakcija.
Slijedeći primjeri su dani u svrhu pojašnjavanja.
Primjer 1
Karakterizacija gena PRV
Slijedeći eksperimenti su provedeni u svrhu karakterizacije gena:
- slijedeći protokol je korišten da bi se izolirali granulociti iz pohranjene krvi ili iz krvi dobivene puštanjem krvi iz pacijenata s p. verom:
- jednaki volumen 3%-tne otopine dekstrana u 0,9% otopini NaCl-a je dodan u krv i smjesa je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi (RT) tijekom 20 minuta.
- Smjesa se razdijelila na dvije faze. Gornja, svijetlo obojena faza, je uklonjena i centrifugirana tijekom 10 minuta pri 1800 g i pri RT.
- Matičnica je uklonjena, a stanični talog je ponovno suspendiran u istom volumenu 0,9% otopine NaCl-a.
- U svakom pojedinom slučaju je 35 ml stanica u NaCl-u tvorilo sloj na 15 ml Ficoll-Hypaque.
- Stanice na Ficoll-Hypaque su nakon toga centrifugirane tijekom 60 minuta pri 1800 g i pri RT bez upotrebe kočnice.
- Formirao se stanični talog i dva sloja s međufazama.
- Slojevi i međufaze su uklonjeni usisavanjem, a stanični talog je ponovno suspendiran tijekom 30 sekundi u 10 ml ledeno hladne 0,2% otopine NaCl-a, a nakon 30 sekundi je dodano 10 ml ledeno hladne otopine 1,6% NaCl.
- Stanice su istaložene centrifugiranjem tijekom 10 minuta pri 1800 g i pri RT.
- Nakon toga su jedan puta ispirane s 10 ml PBS-a i istaložene centrifugiranjem.
- Stanični talog je sadržavao 95 do 99% čiste granulocite.
- RNA je izolirana iz tih stanica upotrebom standardnih postupaka.
- Ekspresija PRV-1 je ispitana primjenom Northern hibridizacije na 10 mg RNA. Kao proba je korištena cjelokupna cDNA sekvenca prikazana u SEQ ID No. 1.
Taj eksperiment je proveden na 39 pacijenata s p. verom i 29 kontrolnih uzoraka pohranjene krvi. Nađeno je da PRV-1 proba jako hibridizira u slučaju pacijenata s p. verom. Kod zdravih kontrolnih uzoraka nije opažena pojava hibridizacije.
Primjer 2
PRV-1 posjeduje aktivnost faktora rasta
Iz skotnog miša su 13,5 dana nakon oplodnje uklonjeni embriji. Iz fetusa su uklonjene jetre. Stanice koje su bile prisutne u njima su označene pomoću antitijela, te primjenom kromatografije na koloni obogaćene s određenim tipom stanica, a osiromašene za druge stanične tipove. To je rezultiralo sa staničnom smjesom koja je obogaćena s određenim hematopoietičkim prekursorskim stanicama (jedinice formiranja kolonije-eritroid, CFU-E). Kao posljedica toga, dok se 2% ukupne jetre fetusa sastoji od CFU-E, obogaćene stanice sadrže 30 do 40% CFU-E.
Na tim CFU-E-ima je provedena transfekcija pomoću retrovirusa. Da bi se to moglo provesti i njihova stanična linija, označena 293-T, je podvrgnuta transfekciji 48 sati ranije. 293-T stanice predstavljaju uspostavljenu staničnu liniju bubrega ljudskog embrija. Na 293-T stanicama se može provesti stabilna transfekcija nekoliko gena iz retrovirusa. Ukoliko se te 293-T stanice podvrgnu transfekciji s dva plazmida, zvana pOS i pKAT, tada će stanice 293-T proizvoditi retrovirus koji je u stanju inficirati stanice jetre mišjeg fetusa. Ukoliko se stanice 293-T podvrgnu transfekciji s praznim vektorom pOS i pKAT, dobiva se divlji tip retrovirusa koji je u stanju vršiti ekspresiju samo retrovirusnih proteina. S druge strane, kloniranjem ljudskog gena, na primjer PRV-1 u vektor pOS rezultira u proizvodnji retrovirusa koji vrše ekspresiju tog proteina nakon što su stanice inficirane. Stanice 293-T izlučuju retrovirus u medij stanične kulture.
Nakon dva dana je medij stanične kulture stanica 293-T podvrgnutih transfekciji, koji sadrži retrovirus, prikupljen i filtriran kroz 0,45 �m filter. Da bi se provela transfekcija stanica jetre fetusa, potonje stanice su pomiješane s profiltriranim medijem stanične kulture, koji sadrži retrovirus, i centrifugirane tijekom 2 sata pri 1800 rpm i 20°C uz dodatak polibrena. Nakon transfekcije, stanice jetre fetusa su uzgajane u mediju (Methocult, iz Cell Systems-a) koji, pored uobičajenih soli i aminokiselina, sadrži fetusni serum, 0,0001 do 0,4 IU eritropoeitina (EPO)/ml i metil celulozu (0,8%). CFU-E-i zahtijevaju EPO da bi formirali hematopoietičke kolonije. Metil celuloza skrućuje medij u obliku želea i time fiksira pojedinačne stanice unutar tog želea tako da se one, za razliku od tekućeg medija, ne mogu kretati. Zbog toga je moguće vidjeti da li je iz pojedinačne stanice došlo ili nije došlo do nastanka hematopoietičke kolonije. CFU-E-i tvore eritroidne kolonije, a to su kolonije koje sadrže stanice crvenih krvnih zrnaca, te stanice koje im prethode.
Nakon tri dan je izračunat broj hematopoietičkih kolonija koje su se razvile. Uspoređene su različite smjese. Sve smjese nisu ispitane u svakom pojedinačnom eksperimentu; smjese 1 do 3 predstavljaju vrlo slične kontrole, te svaka od njih može biti zasebno uspoređena sa smjesom 4.
Smjesa 1: stanice koje nisu bile podvrgnute transfekciji s retrovirusom;
Smjesa 2: stanice koje su podvrgnute transfekciji s praznim vektorom pOS;
Smjesa 3: Stanice koje su podvrgnute transfekciji sa ̋zelenim fluorescentnim proteinom ̋ (GFP), proteinom koji nije hematopoietički aktivan.
Smjesa 4: Stanice koje su podvrgnute transfekciji s pOS-PRV-1 (vektor + gen iz izuma).
Tablica 1: tablica prikazuje rezultate dobivene iz tri eksperimenta koja su provedena na opisani način. Brojke dane za svaki pojedinačni slučaj ukazuju na broj kolonija.
[image]
Eksperimenti pokazuju da CFU-E-i koji su podvrgnuti transfekciji s PRV-1 formiraju puno više kolonija (do tri puta više) nego li to čine različiti kontrolni CFU-E-i. Taj rezultat ukazuje na to da PRV-1 predstavlja faktor rasta za CFU-E.
Primjer 3
Topljivost PRV-1 faktora rasta
Dodatni eksperiment je proveden kako bi se ispitalo je li PRV-1 topljivi faktor rasta ili je potrebno postići kontakt stanica-stanica. Nije samo retrovirus dobiven iz stanične linije 293-T nakon što je ona podvrgnuta transfekciji s vektorima pOS i pKAT. Pored toga, stanice 293-T također sintetiziraju protein kodiran od gena kloniranog u pOS-u, tj. u ovom slučaju u PRV-1. Ukoliko je produkt gena topljivi protein, on će se izlučiti u medij koji okružuje staničnu liniju 293-T. Ukoliko su stanice 293-T podvrgnute transfekciji samo s pOS vektorom, bez pKAT-a, neće doći do formiranja retrovirusa. Medij stanične kulture u tom slučaju sadrži samo topljivi protein proizveden od stanica. Medij dobiven od stanica podvrgnutih transfekciji s pOS-PRV-1, a koje ne sadrže nikakav retrovirus, je pomiješan s metil celulozom, te je cjelina prevučena na metil celuloznom mediju; nakon toga je izračunat broj dobivenih kolonija.
Dobiveni su slijedeći rezultati:
Tablica 2: Topljivost PRV-1. Brojke dane za svaki pojedinačni slučaj ukazuju na broj kolonija.
[image]
U tom eksperimentu su također CFU-E-i tretirani s medijem koji je sadržavao PRV-1 formirali veći broj hematopoietičkih kolonija u odnosu na kontrolne stanice. Iz tih rezultata se može zaključiti da je PRV-1 topljivi faktor rasta.
Primjer 4
PRV-1 također posjeduje inhibitorskog citostatičko djelovanje
Eksperimenti su provedeni na perifernim krvnim stanicama. Budući da je mali broj prekursorskih stanica također kružio u perifernoj krvi zdravih pojedinaca, moguće je u pogodnom mediju (metil celuloza) uzgojiti hematopoietičke kolonije od perifernih krvnih stanica. 40 ml periferne venozne krvi je ispušteno iz zdravog davaoca (čemu je prethodilo davanje heparina ili EDTA kao sredstva protiv koagulacije). U krv je dodano 15 ml Ficoll/Hypaque i smjesa je centrifugirana pri 1600 rpm bez kočnice tijekom 40 minuta. To je rezultiralo javljanjem gradijenta gustoće što je uzrokovalo razdjeljivanje krv na njene stanične konstituente. Nakon centrifugiranja stanice nazvane mononuklearne stanice, koje također uključuju matične stanice, su nađene u međufazi između seruma i Ficoll-a. Ta međufaza je uklonjena i ispirana s PBS-om (izotonička slana otopina). Time su dobivene pročišćene mononuklearne stanice od kojih je približno 0,1% predstavljao hematopoietičke matične stanice.
Mononuklearne stanice su uvedene u osobito obogaćeni mediji (IMDM) koji sadrži dodanu koncentraciju od 3% FCS-a (fetusnog seruma). Ta smjesa 3% FCS/IMDM je kasnije modificirana, tj. PRV-1 je ili nije dodan.
Mononuklearne stanice u IMDM-u su pri gustoći od 7 × 105 stanica/ml dodane u komercijalno dostupni medij od Stem Cell Technologies (Methocult), koji sadrži IMDM i 30% FCS, 1% BSA (albumin goveđeg seruma), merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin, 3 IU EPO (eritropoietin)/ml i 1,0% metil celuloze. Stanice su ostavljene da rastu u tom mediju tijekom 14 dana. Nekoliko matičnih stanica koje su prisutne u toj smjesi je u stanju razviti se u hematopoietičke kolonije. Obično se na svakih 7 × 105 upotrijebljenih stanica razvije između 100 i 200 hematopoietičkih kolonija.
Također je konstruirana stanična linija koja daje vrlo veliku količinu PRV-1. PRV-1 dobiven iz tih stanica je izmijenjen tako da više ne posjeduje lipidno sidro. Produkt ekspresije se sastoji od aminokiselina 1 do 401 iz sekvence SEQ ID No:2; stoga aminokiseline 402 do 437 nedostaju. Taj izmijenjeni PRV-1 stoga nije, kao divlji tip PRV-1, ugrađen u staničnu membranu pomoću lipidnog sidra, već se umjesto toga u potpunosti izlučuje iz stanice. Kao u primjeru 3, stanična linija se sastoji od stanica 293 koje ne proizvode retrovirus, ali koje vrše ekspresiju proteina (PRV-1). Za ispitivanje hematopoietičke kolonije, mononuklearne krvne stanice su uvedene ili u medij IMDM, koji je bio inkubiran tijekom 48 sati sa stanicama (293) koje nisu podvrgnute transfekciji, ili u medij koji je bio inkubiran tijekom 48 sati sa stanicama koje su davale izmijenjeni PRV-1 (293-GPI-less-PRV-1).
Nakon toga je ispitivana sposobnost tih stanica da formira hematopoietičke kolonije. Broj kolonija eritroidnih (crvenih) i mieloidnih (bijelih) krvnih stanica je određen nakon 14 dana. Eksperiment je ponovljen tri puta, a provođen je na različite dane i uz korištenje različitih davaoca krvi. Unutar eksperimenta su također procijenjeni duplikati. Dobiveni su slijedeći rezultati:
Eksperiment 1
[image]
Eksperiment 2
[image]
Eksperiment 3
[image]
Iz tih podataka se može zaključiti da veće doze PRV-1 nego li su korištene u eksperimentu 3 posjeduju citostatsko djelovanje.
Primjer 5
Faktor rasta PRV-1 je N-glikoziliran
Granulociti su izolirani iz pacijenta koji je patio od p. vere, a proteinski ekstrakti su dobiveni iz tih stanica primjenom standardnog protokola. Ti proteinski ekstrakti su tretirani u skladu s protokolom za N-glikozidaza F deglikozilacijski set dostavljen od Boehringer Mannheima. Detaljnije, to znači da je proteinskim ekstraktima dodan ̋denaturacijski pufer ̋, te su smjese grijana pri 95°C tijekom 3 minute, nakon čega su tretirane s ̋reakcijskim puferom ̋ ili s ̋reakcijskim puferom ̋ i N-glikozidazom. Svaka smjesa je inkubirana preko noći pri 37°C i proteini su analizirani na PAGE gel elsktroforezi, nakon čega je vršena Western hibridizacija. Protein PRV-1 je detektiran pomoću antitijela za protein s aminokiselinskom sekvencom ID br. 5. Dobiveni rezultati su pokazali da se veličina PRV-1 proteina očišćenih od granulocita kreće između 60 i 65 kDA, dok nakon tretiranja s N-glikozidazom on dostiže svega 40 kDa. To jasno dokazuje da je PRV-1 glikoziliran na asparaginskom ostatku (asparagine = N).
Claims (11)
1. Primjena N-glikoziliranog polipeptida naznačena time da obuhvaća u bitnom jednu od slijedećih sekvenci aminokiselina:
aminokiseline 1-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-401 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-401 iz sekvence br. 2;
ili fragmenta istog sa najmanje 50 aminokiselina ili polipeptida koji u bitnome obuhvaća jednu od slijedećih sekvenci aminokiselina:
aminokiseline 1-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-401 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-401 iz sekvence br. 2;
ili biološki aktivnog fragmenta ili biološki aktivne varijante istog za pripravu lijeka koji djeluje kao faktor rasta.
2. Primjena N-glikoziliranog polipeptida naznačena time da obuhvaća u bitnom jednu od slijedećih sekvenci aminokiselina:
aminokiseline 1-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-401 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-401 iz sekvence br. 2;
ili fragmenta istog sa najmanje 50 aminokiselina ili polipeptida koji u bitnome obuhvaća jednu od slijedećih sekvenci aminokiselina:
aminokiseline 1-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-401 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-401 iz sekvence br. 2;
ili biološki aktivnog fragmenta ili biološki aktivne varijante istog za pripravu lijeka za tretiranje pancitopenije i pancitopatije u koštanoj srži i cirkulaciji.
3. Primjena polinukleotida naznačena time da obuhvaća u bitnom jednu od slijedećih sekvenci nuklotida:
nukleotidi 1-1600 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 36-1346 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 36-1262 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 36-1238 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 39-1346 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 39-1262 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 39-1238 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 99-1346 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 99-1262 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 99-1238 iz sekvence br. 1;
ili fragmenta ili varijante istog za pripravu lijeka za tretiranje pancitopenije i pancitopatije u koštanoj srži i cirkulaciji.
4. Primjena N-glikoziliranog polipeptida naznačena time da obuhvaća u bitnom jednu od slijedećih sekvenci aminokiselina:
aminokiseline 1-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-401 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-401 iz sekvence br. 2;
ili fragmenta istog sa najmanje 50 aminokiselina ili polipeptida koji u bitnome obuhvaća jednu od slijedećih sekvenci aminokiselina:
aminokiseline 1-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-401 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-401 iz sekvence br. 2;
ili biološki aktivnog fragmenta ili biološki aktivne varijante istog za pripravu lijeka za tretiranje i/ili umnažanje vlastitih tjelesnih stanica i/ili etabliranog niza stanica "ex vivo" ili "in vitro".
5. Primjena N-glikoziliranog polipeptida naznačena time da obuhvaća u bitnom jednu od slijedećih sekvenci aminokiselina:
aminokiseline 1-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-401 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-401 iz sekvence br. 2;
ili fragmenta istog sa najmanje 50 aminokiselina ili polipeptida koji u bitnome obuhvaća jednu od slijedećih sekvenci aminokiselina:
aminokiseline 1-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-401 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-401 iz sekvence br. 2;
ili biološki aktivnog fragmenta ili biološki aktivne varijante istog za pripravu lijeka za sprečavanje rasta stanica.
6. Primjena prema zahtjevu 5, naznačena time da se polipeptid primjenjuje kao citostatik.
7. Primjena N-glikoziliranog polipeptida naznačena time da obuhvaća u bitnom jednu od slijedećih sekvenci aminokiselina:
aminokiseline 1-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-401 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-401 iz sekvence br. 2;
ili fragmenta istog sa najmanje 50 aminokiselina ili polipeptida koji u bitnome obuhvaća jednu od slijedećih sekvenci aminokiselina:
aminokiseline 1-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 1-401 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-437 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-409 iz sekvence br. 2;
aminokiseline 22-401 iz sekvence br. 2;
ili biološki aktivnog fragmenta ili biološki aktivne varijante istog za pripravu lijeka za tretiranje proliferativnih bolesti.
8. Primjena prema zahtjevu 7, naznačena time da proliferativno oboljenje spada u skupinu koja obuhvaća mieloproliferativna oboljenja, p. veru, esencijalnu trombocitemiju, mielofibrozu, CML, ukupne leukemije i limfome te solidne tumore.
9. Primjena polinukleotida naznačena time da obuhvaća u bitnom jednu od slijedećih sekvenci nukleotida:
nukleotidi 1-1600 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 36-1346 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 36-1262 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 36-1238 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 39-1346 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 39-1262 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 39-1238 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 99-1346 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 99-1262 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 99-1238 iz sekvence br. 1;
ili fragmenta ili varijante istog za sprečavanje rasta stanica.
10. Primjena polinukleotida naznačena time da obuhvaća u bitnom jednu od slijedećih sekvenci nuklotida:
nukleotidi 1-1600 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 36-1346 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 36-1262 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 36-1238 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 39-1346 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 39-1262 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 39-1238 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 99-1346 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 99-1262 iz sekvence br. 1;
nukleotidi 99-1238 iz sekvence br. 1;
ili fragmenta ili varijante istog za pripravu lijeka za tretiranje proliferativnih oboljenja.
11. Primjena prema zahtjevu 7, naznačena time da proliferativno oboljenje spada u skupinu koja obuhvaća mieloproliferativna oboljenja, p. veru, esencijalnu trombocitemiju, mielofibrozu, CML, ukupne leukemije i limfome te solidne tumore.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19947010A DE19947010A1 (de) | 1999-09-30 | 1999-09-30 | Das Gen PRV-1 und dessen Verwendung |
| PCT/EP2000/009594 WO2001023554A1 (de) | 1999-09-30 | 2000-09-29 | Das gen prv-1 und dessen verwendung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HRP20020269A2 true HRP20020269A2 (en) | 2003-06-30 |
Family
ID=7923937
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HR20020269A HRP20020269A2 (en) | 1999-09-30 | 2002-03-28 | The prv-1 gene and use thereof |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1220920A1 (hr) |
| JP (1) | JP2003510077A (hr) |
| KR (1) | KR20020047191A (hr) |
| CN (1) | CN1377408A (hr) |
| AU (1) | AU1132401A (hr) |
| BG (1) | BG106554A (hr) |
| BR (1) | BR0014444A (hr) |
| CA (1) | CA2387702A1 (hr) |
| CZ (1) | CZ20021094A3 (hr) |
| DE (1) | DE19947010A1 (hr) |
| EA (1) | EA200200286A1 (hr) |
| EE (1) | EE200200168A (hr) |
| HR (1) | HRP20020269A2 (hr) |
| HU (1) | HUP0203080A2 (hr) |
| IL (1) | IL148770A0 (hr) |
| MX (1) | MXPA02002800A (hr) |
| NO (1) | NO20021498L (hr) |
| PL (1) | PL354184A1 (hr) |
| SK (1) | SK4262002A3 (hr) |
| WO (1) | WO2001023554A1 (hr) |
| ZA (1) | ZA200202379B (hr) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL158599A0 (en) * | 2003-10-26 | 2004-05-12 | Yeda Res & Dev | Methods of modulating hematopoiesis |
| US20150353639A1 (en) | 2012-05-21 | 2015-12-10 | Genentech, Inc. | Methods for improving safety of blood-brain barrier transport |
| WO2018229179A1 (en) * | 2017-06-14 | 2018-12-20 | Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001515361A (ja) * | 1997-05-06 | 2001-09-18 | ザイモジェネティクス，インコーポレイティド | 新規な腫瘍抗原 |
| CA2328895A1 (en) * | 1998-06-02 | 1999-12-09 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
| DE19849044A1 (de) * | 1998-10-23 | 2000-04-27 | Univ Ludwigs Albert | Das Gen PRV-1 und dessen Verwendung |
| MXPA01006057A (es) * | 1998-12-16 | 2003-09-10 | Genentech Inc | Polipeptidos secretados y transmembranales y acidos nucleicos que los codifican. |
-
1999
- 1999-09-30 DE DE19947010A patent/DE19947010A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-09-29 EA EA200200286A patent/EA200200286A1/ru unknown
- 2000-09-29 MX MXPA02002800A patent/MXPA02002800A/es unknown
- 2000-09-29 KR KR1020027004095A patent/KR20020047191A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-09-29 JP JP2001526936A patent/JP2003510077A/ja active Pending
- 2000-09-29 AU AU11324/01A patent/AU1132401A/en not_active Abandoned
- 2000-09-29 EE EEP200200168A patent/EE200200168A/xx unknown
- 2000-09-29 CN CN00813580A patent/CN1377408A/zh active Pending
- 2000-09-29 IL IL14877000A patent/IL148770A0/xx unknown
- 2000-09-29 WO PCT/EP2000/009594 patent/WO2001023554A1/de not_active Application Discontinuation
- 2000-09-29 SK SK426-2002A patent/SK4262002A3/sk unknown
- 2000-09-29 BR BR0014444-4A patent/BR0014444A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-09-29 EP EP00972665A patent/EP1220920A1/de not_active Withdrawn
- 2000-09-29 HU HU0203080A patent/HUP0203080A2/hu unknown
- 2000-09-29 PL PL00354184A patent/PL354184A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-09-29 CA CA002387702A patent/CA2387702A1/en not_active Abandoned
- 2000-09-29 CZ CZ20021094A patent/CZ20021094A3/cs unknown
-
2002
- 2002-03-25 ZA ZA200202379A patent/ZA200202379B/en unknown
- 2002-03-26 NO NO20021498A patent/NO20021498L/no not_active Application Discontinuation
- 2002-03-27 BG BG106554A patent/BG106554A/bg unknown
- 2002-03-28 HR HR20020269A patent/HRP20020269A2/hr not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO20021498D0 (no) | 2002-03-26 |
| KR20020047191A (ko) | 2002-06-21 |
| EE200200168A (et) | 2003-04-15 |
| IL148770A0 (en) | 2002-09-12 |
| CZ20021094A3 (cs) | 2002-06-12 |
| BG106554A (bg) | 2003-01-31 |
| CN1377408A (zh) | 2002-10-30 |
| ZA200202379B (en) | 2003-10-29 |
| AU1132401A (en) | 2001-04-30 |
| NO20021498L (no) | 2002-05-23 |
| EA200200286A1 (ru) | 2002-12-26 |
| BR0014444A (pt) | 2002-06-11 |
| MXPA02002800A (es) | 2002-07-22 |
| JP2003510077A (ja) | 2003-03-18 |
| HUP0203080A2 (hu) | 2002-12-28 |
| EP1220920A1 (de) | 2002-07-10 |
| CA2387702A1 (en) | 2001-04-05 |
| PL354184A1 (en) | 2003-12-29 |
| DE19947010A1 (de) | 2001-04-05 |
| SK4262002A3 (en) | 2002-09-10 |
| WO2001023554A1 (de) | 2001-04-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2002516103A (ja) | インターロイキン２１およびインターロイキン２２ | |
| JPH07107983A (ja) | Ｊａｋキナーゼおよびサイトカインシグナル形質導入の調節 | |
| KR20010042364A (ko) | 성숙 ＦＬＩＮＴ(ｍＦＬＩＮＴ) 폴리펩타이드 또는 ＴＮＦ수용체인 ＯＰＧ3의 치료학적 용도 | |
| JP3750819B2 (ja) | Ｃ−ｋｉｔ受容体に対するリガンド及びその使用法 | |
| US5858701A (en) | DNA encoding an insulin receptor substrate | |
| JPH06503947A (ja) | Ｉｇｆｂｐ―５をコードする遺伝物質 | |
| US20040072259A1 (en) | Methods and products for manipulating hematopoietic stem cells | |
| CN111135311A (zh) | Ecm1在预防和/或治疗肝纤维化相关疾病中的应用 | |
| JP2004500080A (ja) | １７個のヒト分泌タンパク質 | |
| HRP20020269A2 (en) | The prv-1 gene and use thereof | |
| WO2011076095A1 (en) | Methods and compositions related to reduced met phosphorylation by leukocyte cell-derived chemotaxin 2 in tumor cells | |
| US6686153B1 (en) | PRV-1 gene and the use thereof | |
| KR20010043088A (ko) | 신규인 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 코드화하는 ｃＤＮＡ및 그 용도 | |
| US20120201792A1 (en) | Methods and products for manipulating hematopoietic stem cells | |
| US20030148952A1 (en) | Methods and materials for the recruitment of endothelial cells | |
| 이현채 | The Role of Adenylyl Cyclase-Associated Protein1 (CAP1) in Transendothelial Migration of Monocytes to Promote Chronic Inflammation | |
| EP3738651A1 (en) | Lymphotoxin alpha for use in therapy of myeloid leukemia | |
| JPS6229981A (ja) | サルコフア−ガ・レクチンの構造遺伝子 | |
| Cohen-Solal et al. | Mpl-Ligand and the Regulation of Megakaryocytopoiesis | |
| JPH08188596A (ja) | リセプター型チロシンキナーゼの新規なリガンド | |
| Shelburne | Kit expression in mastocytomas and neurofibrosarcomas |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1OB | Publication of a patent application | ||
| ODRP | Renewal fee for the maintenance of a patent |
Payment date: 20030924 Year of fee payment: 4 |
|
| ARAI | Request for the grant of a patent on the basis of the submitted results of a substantive examination of a patent application | ||
| OBST | Application withdrawn |