BG106554A

BG106554A - Ген prv-1 и неговото приложение

Info

Publication number: BG106554A
Application number: BG106554A
Authority: BG
Inventors: Heike Pahl
Original assignee: Universitatsklinikum Freiburg
Priority date: 1999-09-30
Filing date: 2002-03-27
Publication date: 2003-01-31
Also published as: IL148770A0; AU1132401A; WO2001023554A1; CZ20021094A3; SK4262002A3; NO20021498D0; JP2003510077A; ZA200202379B; EP1220920A1; NO20021498L; EE200200168A; EA200200286A1; PL354184A1; MXPA02002800A; DE19947010A1; CA2387702A1; KR20020047191A; HUP0203080A2; BR0014444A; HRP20020269A2

Abstract

Изобретението се отнася до нуклеотидна последователност, която кодира PRV-1 протеин и съдържа последователността с ID No. 1, до метод за установяванена генната [lacuna]mPHK, кодирана от гена и полипептида, кодиран от този ген.

Description

I Изобретението се отнася до нуклеотидна последователност, която кодира генът PRV-1, до рекомбинантна ДНК която съдържа тази нуклеотидна последователност, до вектори които съдържат Q рекомбинантната ДНК и до клетки, които са трансформирани с тези вектори, и също до PRV-1 полипептид, до антитела спрямо този полипептид, до метод за установяване на PRV-1 полипептида и до лекарства, които включват PRV-1 полипептида или антитела, които са насочени спрямо PRV-1 полипептида.

Polycythaemia rubra vera (erythraemia), наречена още polycytbaem/a vera или p. vera, е малигнено хематологично заболяване, при което има повишено формиране на еритроидни, гранулоцитни и мегакариоцитни клетки. Заболяването е с клонален ф произход и възниква като резултат от мутацията на единична хемопоетична прекурсорна клетка. В Германия, случаите на р. vera са от 4 до 6 за един милион жители. Ако бъде оставено без лечение, заболяването води до смърт в рамките на 18 месеца. Лечение чрез кръвопускане или хемотерапия повишава средното време за преживяемост до повече от 13 години.

Р. vera се диагностицира посредством клинични критерии.

Клиничната картина включва главоболия, пруритус, спленомегалия в две трети от пациентите, кръвотечение или тромбози, хипертензия в една трета от пациентите, подагра, която е

28/02 ФБ • · · · • ·

причинена от повишената продукция на пикочна киселина и в някои случаи до септични язви. Най- важните резултати от лабораторни изследвания показват повишение в стойностите за хемоглобин, хематокрит, еритроцитното броене и общия еритроцитен обем, и също неутрофилната гранулоцитоза или тромбоцитоза в много случаи. Доколкото, от една страна, повечето от критериите са твърде дифузни и, от друга страна, не всички пациенти отговарят на тези критерии, често е трудно да се отличи р. vera от други I миелопролиферативни заболявания, като хронична гранулоцитна левкемия или есенциална тромбоцитоза, и така да се потвърди ^w диагнозата. Към настоящия момент, молекулярната причина за р.

vera е напълно неизвестна. Тъй като, обаче, р. vera приема | различни насоки ако не бъде лекувана, точната диагноза е важна.

Поради това, обект на изобретението е установяването на молекулярната причина за polycythaemia rubra vera и създаване на възможността за нейното диагностициране.

Този обект е постигнат чрез изолиране на ген, който се експресира специфично в асоциация с р. vera и не в здрави контролни индивиди. Този ген е наречен PRV-1 ген (polycythaemia rubra vera).

Сходна нуклеотидна последователност е описана в Международна заявка WO 98/50552.

Една част от обекта на изобретението поради това се отнася до полинуклеотид, който кодира гена PRV-1 и по същество включва последователността ID No. 1. Полинуклеотидите от настоящето изобретение могат да бъдат едноверижни или двойно верижни

ДНК или РНК. Ако са РНК, тогава е ясно за специалиста в

28/02 ФБ областта, че

“U” нуклеотидите се намират в място на з

«pw нуклеотиди. Под “полинуклеотиди” се разбира нуклеинови киселини, които съдържат 15 или повече нуклеотиди.

Нуклеотидната последователност, съгласно изобретението, е показана на Фигура 1. Изобретението поради това се отнася до полинуклеотид, който съответства на последователността, показана на Фигура 1 и също до полинуклеотид, чиято нуклеотидна последователност проявява малко разлики. В рамките на значението на настоящето описание, под малки различия се разбират такива последователности, в които малко, за предпочитане не повече от 50 и по- специално не повече от 25 нуклеотида са променени, със обаче функцията на кодирания ген от неафектираната нуклеотидна последователност. Специалиста в областа е запознат с факта, че триплет от бази, кодиращ дадена амино киселина може да бъде заместена с друг триплет, който кодира същата амино киселина. В допълнение към това, участъци които са по- маловажни могат да бъдат делетирани и/или мутирани до по- малък обхват. В конкретен вариант на изпълнение, полинуклеотида включва нуклеотиди 36 до 1346 от последователност № 1, което представлява кодиращия участък на гена PRV-1. Друг вариант на изпълнение включва нуклеотидите 36 до 1262 или 36 до 1238 от последователност №. 1. Този участък вероятно кодира активния участък на пептида PRV-1. Накрая, полинуклеотида от изобретението може да включва също нуклеотиди 39 до 1346, 39 до 1262 или 39 до 1238 от последователност №. 1, така че кодона, който кодира изходния метионин липсва. Предпочитан вариант е полинуклеотид, който включва нуклеотиди 99 до 1346, 99 до 1262 или 99 до 1238 от последователност №.1. Това води до кодони в 5’ края, които кодират сигналния пептид на полипептида PRV-1, който липсва.

28/02 ФБ ······ ······ ·· ·· 4 • · · ·* · ·*·* • · ··»···· ···· · ·· ·· ·· ····

Полинуклеотида съгласно изобретението може да бъде също фрагмент от гена PRV-1. Като правило, фрагмента притежава повече от 100 нуклеотида, за предпочитане обаче, повече от 300 нуклеотида. Фрагментите могат също да бъдат използвани като праймери или като сонди, по- специално за PCR; в този случай, фрагментите могат да бъдат срязани, за да пасват за дадената цел. Обикновено, праймерите притежават дължина между 10 и 30 нуклеотида, а сондите притежават дължина между 15 и 50 нуклеотида.

©

PRV-1 гена е един ендогенен ген, чиято експресия в здрави индивиди е, обаче, ограничена само до няколко органа. Обикновено, той се експресира главно в хематопоетичните органи, напр. в костния мозък и феталния черен дроб, и слабо се експресира в слезката, но не се експресира в сърце, мускули, панкреас или бъбреци. У пациенти, които страдат от р. vera, този ген е много силно свръхекспресиран в хематопоетичните клетки, в частност.

PRV-1 гена кодира протеин, който проявява протеиновата последователност, показана на Фигура 2. Сигналният пептид, който присъства в протеиновата последователност на всички повърхностни молекули и обикновено е отстранен, когато се получава протеина, се отделя от хифите. Протеина притежава последователността с ID № 2. Друг аспект на изобретението е един по същество чист протеин, притежаващ последователността № 2 или полипептид, притежаващ последователността № 2, но без ссигналния пептид (т.е. амино киселини 22 до 437 от последователност № 2). Други варианти обхващат амино киселини

28/02 ФБ • · • · • · · · · * · · · • · · · · ·· ·· · · ···· до 409, 22 до 409, 1 до 401 или 22 до 401 от последователност № (което е вероятно активния участък на протеина).

По отношение на биологичната активност, полипептида съгласно изобретението е за предпочитане гликозилиран; особено предпочитано е да бъде N-гликозилиран. Може да бъде гликозилиран при най- малко една от амино киселините Asn-46, Asn-189 и Asn-382 от PRV-1 полипептида (амино киселинните номера се отнасят до последователността № 2). Изобретението обхваща също фрагменти от полипептида съгласно изобретението, © които са N-гликозилирани. Фрагментите са най- малко 50 амино киселини в дължина, за предпочитане поне 100 амино киселини и особено предпочитано поне 150 амино киселини. В друг вариант на изпълнение, полипептида може да бъде О- гликозилиран.

За специалиста в областта е ясно, че определени амино киселини могат да бъдат заместени без увреждане на биологичната активност на протеина. Такива модифицирани форми на полипептидите съгласно изобретението са също част от обекта на изобретението. Амино киселинните замествания са онези, които © не притежават негативен ефект върху биологичната активност на протеина. Специалиста в областта може да използва добре известни правила за подбор на заместванията.

В зависимост от метода на получаване, PRV-1 полипептида може, например, да притежава място за гликозил фосфатидилинозитолова котва. То след това е свързано към амино киселините, които съответстват на амино киселини 407 до 409 в последователността с ID № 2. GPI мястото се използва за закотвяне на протеин посредством липид на външната страна на клетъчната мембрана. Обаче, поради причини които не са

28/02 ФБ * · • · · · • · достатъчно изяснени, често се наблюдава, че GPI- свързани протеини също се освобождават в средата. Тове се отнася като “засенчване”. Понастоящем, не е изяснено дали това е специфичен процес, т.е. такива протеини са отцепени от мембраната чрез ензими по контролиран маниер, или дали те представляват неспецифична загуба на прикрепването си. Поради това е много възможно PRV-1 да бъде намерен както в клетъчната мембрана,

така и екстрацелуларно. Секретираната форма, която е не мембранно свързана, е вероятно по- значима за ефекта на полипептида като фактор на растежа доколкото, като растежен фактор, тази форма е способна да дифундира и достигне други клетки.

За специалиста в областта е ясно, че прикрепването на протеина към клетъчната мембрана може да бъде повлияно чрез манипулиране на тези амино киселини. Това по- специално се отнася до получаването на дефинирани ДНК структури, които се предполага че експресират PRV-1 полипептида или негови фрагменти. Кодоните, които кодират тези амино киселини могат да бъдат променени или делетирани.

Генът кодира повърхностен рецептор от семейството j uPAR/Ly6. Това рецепторно семейство може да пренесе мутагенни i

| сигнали, т.е. сигнали, които стимулират клетъчното делене. Поради

I j това се предполага, че свръхекспресията на PRV-1 гена, inter alia t

j върху гранулоцити на пациенти с р. vera, съдействат за ί хиперпролиферацията на тези клетки.

I

Г' ( Установено е, че PRV-1 не се експресира в гранулоцити на здрави индивиди или в пациенти, страдащи от други миелопролиферативни заболявания, напр. страдащи от хронична J

28/02 ФБ гранулоцитна ·· ····

Λ * А Λ А Λ

левкемия, акутна гранулоцитна левкемия или вторична еритроцитоза.

С оглед използване на полипептида, кодиран от гена PRV-1 за анализи и методи на определяне, той бързо се генерира от рекомбинантна ДНК, с рекомбинантната ДНК за предпочитане включваща нуклеотидната последователност с ID № 1 или поне кодиращия участък на PRV-1 гена, който представлява нуклеотиди 36 до 1346 от последователността с ID № 1, най- малко, обаче, нуклеотиди 39 до 1262, функционално свързани с промотор. Но рекомбинантната ДНК може да включва също само фрагмент от последователност N2 1 .

Изобретението по- нататък се отнася до вектор, който съдържа рекомбинантната ДНК за PRV-1 полипептида, или негов фрагмент и до гостоприемникова клетка, която се трансфектира или трансформира с този вектор. Гостоприемниковата клетка може да бъде прокариотична, например бактерия като Е. coli. Обаче, полипептидите, които са експресирани след това, не се гликозилират. Поради това, предпочитание се дава на еукариотични гостоприемникови клетки, които са способни да гликозилират експресирания протеин пост- транслационно и да го модифицират по други начини. Примери за еукариотични гостоприемникови клетки, са Sf9 клетки, за експресия след инфекция с рекомбинантни бакуловируси, а за клетки на бозайници са 293 клетки, COS клетки, СНО клетки и HeLa клетки. Тези примери не са изчерпателни. Възможно е също използването на дрождеви клетки като гостоприемникови клетки. За специалиста в областта е ясно, че образците на гликозилация може да се различават в зависимост от гостоприемниковата клетка. Биологичната активност на експресионния продукт може поради

28/02 ФБ • ♦ · ·

това също да варира. Специално предпочитание е дадено на гостоприемникови клетки, които гликозилират експресионния продукт по такъв начин, че да се запази биологичната активност на протеина.

Друг аспект на изобретението е метод за получаване на j полипептид съгласно изобретението. В този метод е направено така, че ДНК кодираща полипептида съгласно изобретението, да се експресира в гостоприемникова клетка. Културалната среда или клетките е/са използвана за последващо изолиране на полипептида в зависимост от това дали експресирания полипептид се секретира от гостоприемниковата клетка в културалната среда или остава в клетката. След това, полипептида съгласно изобретението се концентрира и/или пречиства с помощта на j методи, които са известни от нивото на техниката, например j хроматографични методи. Методи за пречистване на протеини са

I ί описани, например, в Scopes, R., Protein Purification: Principles and i Practice (3^rd edition), Springer Verlag (1994). В един конкретен вариант на изпълнение, метода съгласно изобретението обхваща • етапа в който гликозилирания полипептид се концентрира и/или пречиства. Този етап може да бъде осъществен както преди пречистването по същество на полипептида съгласно изобретението или след като той вече е бил пречистен. В последния случай, гликозилираното количество от пречистения полипептид след това се отделя и изолира. В най- предпочитания вариант на изпълнение на метода, се изолира специфично Nгликозилиран полипептид. В друг вариант на изпълнение на метода, се изолира полипептид, който е гликозилиран в най- малко една от амино киселините Asn-46, Asn-189 и Asn-382 от последователността №. 2.

28/02 ФБ ·· ···· • · · ·· ·· ·· ····

PRV-1 полипептида, който е изолиран от гранулоцити или е продуциран рекомбинантно, може да бъде използван както за диагностициране на polycythaemia vera , така и за лечение на това заболяване.

Една терапевтична възможност е т. нар. “безсмислена терапия”. Този метод използва една “безсмислена” РНК молекула, като РНК, която е комплементарна на PRV РНК. Доколкото PRV-1 РНК има последователността

5-_ AAAAGCAGAAAGAGATTACCAGCC- 3’ (SEQ. ID No. 3) в нейното начало, а реквизитната безсмислена РНК, насочена спрямо тази последователност би притежавала следната нуклеотидна последователност: 5’- GGCTGGTAATCTCTTTCTGCTTTT- 3’ (Seq. ID No. 4). Тази безсмислена РНК е включена във вектор и въведена в клетки р. vera. Тази РНК се въвежда, например, посредством трансфекция, с вектора използван за трансфекцията за предпочитане конфигуриран така, че да се въвежда специфично в клетки р. vera. Експресията на безсмислена РНК води до това, че повече не е възможно за PRV-1 тРНК да бъде транслирана в полипептида. Клетки, които са обработени по този начин тогава не формират никакъв PRV-1 протеин.

Поради това изобретението се отнася до метод за установяване на р. vera, който се характеризира с това, че се установява PRV-1 полипептида или негов епитоп и се определя обхвата на експресията.

Свръхекспресията на този рецептор в зрели клетки извън костния мозък, напр. в гранулоцити, е строга индикация за наличието на заболяването р. vera. Тази свръхекспресия се определя бързо посредством имунологично изследване с помощта • · ··

28/02 ФБ

на антитела, които са насочени срещу PRV-1 рецептора.

Подходящи тест методи са известните варианти на имунологични

изследвания, които използват PRV-1 полипептид- специфични антитела заедно с други маркирани антитела, които могат да бъдат имобилизирани или да са в разтвор. Маркирането може да бъда осъществено по начин, известен per se, например с използването на радиоактивни изотопи, чрез флуоресценция или луминисценция, с помощта на ензими, чрез цветни реакции или с използането на други групи, които са подходящи за определяне. Тези варианти са известни на специалиста в областта и тук не изискват по- подробно обяснение. Съгласно изобретението, ELISA тестовете са специално предпочитани.

Антителата, които са необходими за специфичното определяне на PRV-1 рецептора могат да бъдат изготвени по начин, известен сам по себе си. Подходящи са както моноклонални, така и поликлонални антитела, като предпочитание се дава на използването на моноклоналните антитела.

Пептиди, които са получени от протеина също могат да бъдат използвани за получаване на антитела. В контекста на настоящето изобретение, е постигнат успех използвайки пептидите с последователност:

j a) KVSDLPRQWTPKN (амино киселини 34 до 46) [seq. ID No. 5] и

b) SAREKRDVQPPASQH (амино киселини 391 до 405) [seq. ID No.

I 6].

ί

Поликлоналните антитела са обикновено продуцирани чрез имунизиране на подходящ гостоприемник (заек) с PRV-1

28/02 ФБ ·· ····

полипептида, къдетосе свързва по подходящ начин с една имунологична основа (аджувант) извличайки имунен отговор. Моноклонални антитела могат да бъдат генерирани по начин, известен per se с помощта на хибридомната техника. Антителата могат да бъдат пречистени със срадствата на афинитетното пречистване. Получаването и пречистването на антителата е описано, например, в “Antibodies: A Laboratory Manual” by Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

По- нататък, такива поликлонални или моноклонални • антитела, които са насочени срещу PRV-1 могат също да бъдат използвани за лекуване на заболяването.

В друг вариант, PRV-1 рецептора може да бъде установен с помощта на един RT-PCR метод. За това, РНК най- напред се изолира от свръхекспресиращи PRV-1 клетки, които са като правило гранулоцити. След това се провежда обратна транскрибция по начин, известен per se с помощта на RT праймер. RT праймера е за предпочитане праймер, който има следната нуклеотидна последователност (SEQ ID No. 7):

•

ATTAGGTTATGAGGTCAGAGGGAGGTT.

По този начин специфичната PRV-1 РНК се трансформира в ДНК. Тази ДНК след това се амплифицира в PCR реакция по начин, известен per se. Следващите два праймера се използват с предпочитание за амплификационните цикли:

Като смисловия праймер (SEQ ID No. 8)

GCAGAAAGAGATTACCAGCCACAGACGG.

Нн

28/02 ФБ ·· ····

Като безсмисления праймер (SEQ ID No. 9)

GAATCGTGGGGGTAATAGAGTTAGCAGG.

Специалиста в областта е способен да използва описаната последователност за откриване на други праймери, които са също подходящи.

Доколкото РНК се използва като изходен материал за този метод, PCR сигнала е само позитивен когато PRV-1 е също експресиран. Както е обяснено по- горе, това е само случая когато пациента страда от р. vera. PRV не се експресира в гранулоцити на здрави пациенти. Съответно, липсата на какъвто и да е RT- PCR сигнал показва, че няма р. vera. Количественото определяне в RTPCR метода за предпочитане се осъществява с помощта на технологията TaqMan®. Това количествено определяне изисква сонда в допълнение към праймерите. Предпочитаната последователност на сондата е 5’TTCTTGTTGAACCACACCAGACAAATCGG-3’ (SEQ ID N0:10). Количествена RT-PCR за установяване на PRV-1 транскрибта, поради това, е част от обекта на настоящето изобретение.

В друг случай, възможно е също използването на метод на оцветяване, за предпочитане оцветяване по Northern за диагностика на р. vera. За подобен метод, РНК се изолира от гранулоцити и след това се изпитва за експресия на PRV-1 с помощта на метода на оцветяване, например метода по Northern. сДНК последователността на SEQ ID No. 1, или сегмент от тази последователност, може да бъде използвана като сонда. Хибридизация може да се осъществи само ако гранулоцитите са

28/02 ФБ ·· ···♦

..... ·· ·. ......

получени от пациент, страдащ от р. vera, доколкото само тогава има каквато и да е експресия в гранулоцитите. Липсата на хибридизация показва, че индивида от който са получени гранулоцитите, няма р. vera.

Възможно е също използването на фрагмент от гена за Northern blot хибридизация. Такъв фрагмент е обикновено с повече от 100 бази в дължина, за предпочитане повече от 300 бази в дължина. Обратно, много различни фрагменти от гена, които могат да бъдат използвани като сонди в оцветяването по Northern, могат ® да бъдат изготвени чрез разграждане на гена с рестрикционни ендонуклеази. Ако фрагментите са получени от сДНК, след това те присъстват като двойни вериги, които следва да бъдат разделени за хибридизацията. Подходящи примери са Ват Hl-Pstl фрагмента j от двойката бази 420 до двойката бази 831, или фрагмента Pstlj Pstl фрагмента от двойка бази 831 до двойка бази 1900.

j

PRV-1 mPHK, и следователно експресията на PRV-1, могат също да бъдат открити по първото от всички обратно1 j транскрибиране на mPHK в RT-PCR реакция и след това

I ® амплифициране на сДНК; амплифицираната ДНК след това се | установява със сонда в метод за хибридизация.

В случаите на позитивна диагноза, заболяването следва да бъде третирано доколкото в противен случай води до смърт в рамките на относително кратък период от време. За това лечение, е възможно използването на специфични антитела, които са насочени срещу PRV-1 и с които цитотоксичните компоненти могат да бъдат свързани, когато е възможно.

♦ ·· ·· ····

28/02 ФБ

Изобретението поради това по- нататък се отнася до лекарство, което в допълнение към обичайните ексципиенти, включва антитела които са насочени срещу PRV-1 рецептора.

Доколкото PRV-1 рецептора е свръхекспресиран в р. vera, много антитела са свързани на повърхността на поразените гранулоцити когато те идват в контакт с анти- PRV-1 антитялото. Свързването на много антитела към тези клетки стимулира имунологичните клетки да разрушат тези гранулоцити. По този начин, става възможно специфичното елиминиране на клетките р. vera.

Изненадващо е установено, че PRV-1 полипептида проявява хематопоетична активност. PRV-1 полипептида е способен да стимулира определени хематопоетични прекурсорни клетки за формиране на еритроидни колонии. Това са по- специално Nгликозилирани PRV-1 полипептиди, които проявяват тази функция. Полипептидите съгласно изобретението, които се предпочитани, са поради това N-гликозилирани PRV-1 полипептиди и техни фрагменти, които проявяват активността на растежен фактор.

Поради това друг аспект на изобретението е лекарство, което в допълнение към фармацевтично толерантен ексципиент, включва PRV-1 полипептида или негов биологично активен фрагмент. PRV-1 полипептида е за предпочитане гликозилиран PRV-1 полипептид и, дори повече се предпочита, N- гликозилиран PRV-1 полипептид или негов биологично активен фрагмент. Изобретението се отнася също до лекарства, които включват наймалко един полинуклеотид съгласно изобретението.

28/02 ФБ ·· ···· ·· ···«

Настоящето изобретение по- нататък се отнася до използването на PRV-1 полипептид, или биологично активен негов фрагмент, като растежен фактор in vivo и ex vivo. PRV-1 полипептида, или биологично активен негов фрагмент, могат да бъдат използвани за третиране на всички пацитопении и панцитопатии в костния мозък и циркулацията (изменение в клетъчните конституенти на периферната кръв и костен мозък). Полипептидите от настоящето изобретение може, например, да бъдат използвани за лечение на анемии в случаите на разрушаване на бъбреците, хемотерапия или пълно облъчване на тялото, за лечение на неуропении и тромбоцитопении по време на хемотерапия или пълно облъчване на тялото, за ex- vivo лечение на периферни или костно мозъчни стволови клетки за експанзия (мултипликация) и ретрансфузия в пациентите, и за лечение на сепсис, синдрома на системен възпалителен синдром (SIRS) или регионални възпалителни реакции. Полипептидите от настоящето изобретение, или лекарства които го съдържат, могат да бъдат прилагани по широк кръг начини. Формите на приложение включват интравенозно, интрамускулно, субкутанно, интраперитонеално, орално, трансдермално и трансмукозално приложение.

Полинуклеотидите съгласно изобретението могат да бъдат използвани също за лечение на панцитопении и панцитопатии. В този случай, целта е да се експресира PRV-1 полипептид, или негов функционален фрагмент, в клетки от афектирания пациент. В тази връзка най- напред и преди всичко се използват методите на генна терапия. Клетки могат да бъдат изолирани от пациента и трансфектирани с полинуклеотид съгласно изобретението (ex- vivo манипулация), след което те се връщат в пациента. Възможно е също да се помисли за методи, в които полинуклеотидите съгласно изобретението да достигнат желаните клетки чрез вирусен

28/02 ФБ .··.··*: .··.···; .·*. ·· 16 • · · · · I I * Σ • · ··· · · · · · • · ···· ·«· ···· · ·· ·· ·· ···· трансфер. Експресия на инсертираните нуклеинови киселини след това води до хематопоетична активност.

Изненадващо бе установено също, че при по- висока концентрация, PRV-1 полипептида има инхибиторен ефект върху растежа на клетките. Така, наблюдавано е, че добавянето на повишено количество от PRV-1 протеина фактически напълно стопира формирането на еритроидните и гранулоцитно/моноцитни колонии. Този ефект не позволява действието на интерферон-а, който се използва, между другото, терапевтично в хронична миелоидна левкемия (CML) и в р. vera. Едно ендогенно инхибиторно вещество притежава големи преимущества в сравнение с химично цитостатично средство, като хидроксиуреа, което е използвано когато интерферон-α все още не е било достъпно. Недостатък на интерферон-α е това, че това активно вещество притежава много остри странични ефекти. Пациентите се чувстват като че са болни от сериозен грип. Настоящето изобретение прави достъпно инхибиращо хематопоезата вещество, чиято инхибиторна активност е в зависимост от концентрацията.

Друг аспект на изобретението поради това, е използването PRV-1 полипептид, както е описано в настоящето описание, за инхибиране растежа на клетките, по- специално неговото приложение като цитостатично средство. Предпочитание е дадено на полипептида, който е използван за инхибиране растежа на хематопоетичните клетки. Изобретението се отнася също да приложението на полипептид съгласно изобретението, за получаване на лекарство за лечение на пролиферативни заболявания. Тези заболявания са, в частност, миелопролиферативни заболявания, р. vera, есенциална

28/02 ФБ • · · · · · • · · · · ·· · • · · · · · · · · · • · ······· ···· · ·· ·· ·· ···· тромбоцитемия, миелофиброза, CML и също всички левкемии и лимфоми и също твърди тумори.

Друг аспект на изобретението е приложението на полинуклеотид, както е описано в тази заявка, на биологично активен фрагмент или на биологично активен негов вариант, за инхибиране растежа на клетки. Полинуклеотида може да бъде включен в подходящ вектор и трансфектиран в подходящи мишенни клетки. След като PRV-1 полипептида, или биологично активния негов фрагмент, бъде експресиран в подходяща концентрация, инхибиращият растежа ефект настъпва. По същия начин, полинуклеотида може да бъде включен във вирусния вектор, след което подходящи мишенни клетки се инфектират вирусно, което води до експресия на PRV-1. Изобретението се отнася също до приложението на полинуклеотид от това описание за получаване на лекарство за лечение на пролиферативни заболявания, като миелопролиферативни заболявания, р. vera, есенциална тромбоцитемия, миелофиброза, CML и също всички левкемии и лимфоми и също твърди тумори.

Изобретението се отнася също до китове за откриване както на polycythaemia vera, така и на нарушения на хематопоетичната система. Тези китове съдържат полинуклеотид съгласно изобретението и/или полипептид съгласно изобретението и/или едно или повече антитела съгласно изобретението. В допълнение към това, кита може също да съдържа контейнер или състави, които са подходящи за приложение на реакции на установяване. Примери за такива състави са буферни разтвори, реагенти за блокиране на мембрани, хибридизационни разтвори, вторични антитела, субстратни разтвори за реакции на установяване и др. Кита се използва за предпочитане за провеждане на PCR реакции,

28/02 ФБ • · · · · · • · · · · ·

9 ··· · · » • · ··· ···· · • · · · · · ··· ···· · ·· ·· ·« ···· оцветявания по Northern, Southern, Western, ELISA, RIA и други подобни реакции.

За обяснение на изобретението са приведени следните примери.

Пример 1.

Охарактеризиране на PRV гена

За охарактеризиране на гена са проведени следните експерименти:

за изолиране на гранулоцити от кръвна банка или от кръв, получена от пациенти с р. vera се следва протокола, според който:

към кръвта се добавят еднакъв обем от 3% декстранов разтвор в 09% NaCI и сместа се оставя на стайна температура (RT) за 20 минути.

Сместа се разделя на две фази. По- горната, светло оцветена фаза се отстранява и центрофугира за 10 минути при 1800 g и при RT.

Супернатантата се изхвърля и клетъчната утайка се ресуспендира в същия обем от 0.9% NaCI.

Във всеки случай 35 ml от клетките в NaCI се полагат върху 15 ml Ficoll- Hypaque.

Клетките върху Ficoll-Hypaque след това се центрофугират за 60 минути при 1800 g при RT Формира се клетъчна утайка и два слоя с една интерфаза

Носителите и интерфазата се аспирират и клетъчната утайка се ресуспендира за 30 секунди в

28/02 ФБ .**.***! ····»» ·· ·· 19 • · · ·· · ···· • · ··· ···· · • ♦ · · · · · · · ···· · ·· ·· ·· ···· ml ледено студен 0.2% NaCl и 10 ml 1.6% ледено студен NaCl се добавят непосредствено след 30 секунди.

Клетките се подлагат на центрофугиране за 10 минути при 1800 g и при RT.

След това те се промиват еднократно в 10 ml PBS и се подлагат на центрофугиране.

Получената клетъчна утайка съдържа 95- 99% чисти гранулоцити.

РНК се изолира от тези клетки с помощта на Ф стандартни методи mg от тази РНК се изпитват за експресия на PRV-1 в оцветяване по Northern. Цялата сДНК последователност, показана на SEQ ID NO. 1 се използва като сонда.

Този експеримент се провежда върху 19 пациенти с р. vera и 21 контролни проби от кръвна банка. Сондата PRV-1 е установено да се хибридизира силно в случая на пациенти с

р. vera. Не се наблюдава хибридизация в здрави контролни проби.

ф

Пример 2.

PRV-1 притежава активност на растежен Фатор

Ембриони от бременни мишки се отстраняват 13.5 дни след фертилизация. Феталните черни дробове се отделят. Клетките, съдържащи се в тях се оцветяват използвайки антитела и обогатяват за определени клетки, и се изчерпват за други клетъчни типове, чрез колонна хроматография. Това води до клетъчна смес, която е обогатена за определени хематопоетични прекурсорни

28/02 ФБ

.......**·.* клеткиколоний- формиращи единици - еритроид, CFU-E). Така, докато във всички приблизително 2% от феталния черен дроб се състои от CFU-E, 30- 40% от обогатените клетки се състоят от CFUЕ.

Тези CFU-Es се трансфектират с помощта на ретровирус. За да стане това, опаковаща клетъчна лини, означена 293-Т, се трансфектира 48 часа предварително. 293-Т клетки са стабилна човешка ембрионална бъбречна клетъчна линия. 293-Т клетките са стабилно трансфектирани с различни гени от ретровирус. Ако тези 293-Т клетки са понастоящем трансфектирани с два плазмида, наречени pOS и рКАТ, 293-Т клетките след това продуцират ретровирус, който е способен да инфектира миши фетални чернодробни клетки. Ако 293-Т клетките са трансфектирани с празен pOS вектор и рКАТ, тогава се продуцира див- тип ретровирус, който експресира само ретровирусни протеини. От друга страна, клонирането на човешки ген, напр. PRV-1 в pOS вектора води до получаването на ретровирус, експресиращ този протеин, когато инфектира клетки. Клетките 293-Т секретират ретровируса в клетъчно културалната среда.

След два дни, клетъчно културалната среда от трансфектираните 293-Т клетки, която съдържа ретровируса се събира и филтрира еднократно през филтър с отвори 0.45 gm. С оглед трансфектиране на феталните чернодробни клетки, тези последни клетки се смесват с филтрираната клетъчна културална среда, която съдържа ретровируса, и се центрофугира за 2 часа при 1800 rpm и 20°С в присъствие на добавен Polybren. Трансфектираните фетални чернодробни клетки след това се култивират в среда (Methocult, from Cell Systems) която съдържа, в допълнение към обикновените соли и амино киселини, фетален • · · · · · • · · · · ·

28/02 ФБ телешки серум, 0.0001- 0.4 IU еритропоетин (EPO/ml) и метил целулоза (0.8%). CFU-Es изисква ЕРО с оглед формиране хематопоетични колонии. Метил целулозата втвърдява средата под формата на желе, като по този начин фиксира отделни клетки в това желе така че в противоположност на пребиваването си в течна среда, те не могат да се движат. Ето защо е възможно наблюдаването на това дали хематопоетичната колония е или не е формирана от отделни клетки. CFU-Es формира еритроидни колонии, т.е. колонии, които съдържат червени кръвни телца и

техните прекурсорни клетки.

След три дни се преброяват хематопоетичните колонии, които са се развили. Сравняват се различните смеси. Във всеки експеримент не се изпитват всички смеси; смеси 1-3 са много сходни контроли и всяка от тях може да бъде сравнена индивидуално със смес 4.

Смес 1:	Клетки, които не са трансфектирани с ретровирус;
Смес 2:	Клетки, които са трансфектирани с празен pOS вектор;
Смес 3:	Клетки, които са трансфектирани със “зелен флуоресцентен протеин” (GFP), протеин който не е хематопоетично активен.
Смес 4:	Клетки, които са трансфектирани с pOS- PRV-1 (вектор + ген съгласно изобретението).

Таблица 1:

Таблицата изброява резултатите, получени от трите експеримента, които са проведени както е описано. Фигурите във всеки от случаите показват броя на колониите.

28/02 ФБ • · · · ·♦ ···*

	Смес 1	Смес 2	СмесЗ	Смес 4
	нетрансфектирани	Празен вектор (pOS)	GFP (pOS-GFP)	PRV-1 (pOS-PRV-1)
Експеримент 1	116	156	80	326
Експеримент 2		271	273	410
Експеримент 3	120		131	291

Експериментите показват, че CFU-Es, които са трансфектирани с PRV-1 формират много колонии (до трикратно повече) в сравнение с различните контролни CFU-Es. Този резултат показва, че PRV-1 е растежен фактор за CFU-E.

Пример 3

Разтворимост на PRV-1 растежния фактор

За изследване на това дали PRV-1 е разтворим растежен фактор или дали е необходим клетъчно- клетъчен контакт, са проведени по- нататъшни експерименти. Това е не само ретровирус, който се продуцира чрез опаковане на клетъчната линия 293-Т след като бъде трансфектиран с pOS и рКАТ векторите. В допълнение, клетките 293-Т също синтезират протеина, кодиран от гена, клониран в pOS, т.е. PRV-1 в настоящия случай. Ако генният продукт е разтворим протеин, той се секретира в средата, която заобикаля опаковащата клетъчна линия 293-Т. Ако клетките 293-Т са трансфектирани само с вектора pOS, без рКАТ, след това не се формират ретровируси. Клетъчно културалната среда след това само съдържа разтворимия протеин, продуциран от клетките. Среда, която е получена от трансфектирани с pOSPRV-1 клетки, и която не съдържа никакъв ретровирус, се смесва с

28/02 ФБ ·· ···· • · · ·’· ·’'· • · · · · · • · · · · · · • · · · · · · • · ·· ·· ····

CFU-Es и цялата се посява в метил целулозна среда; получените в резултат колонии след това се преброяват.

Получени са следните резултати:

Таблица 2

Разтворимост на PRV-1. Фигурите във всеки случай показват броя на колониите

	Смес 1	Смес 2	СмесЗ	Смес 4
	нетрансфектирани	Празен вектор (POS)	GFP (pOS-GFP)	PRV-1 (pOS- PRV- 1)
Експеримент 4		137	187	557

В този експеримент, също, CFU-Es които са третирани с PRV-

1- съдържаща среда, формират много повече хематопоетични колонии, отколкото контролните клетки. От това следва, че PRV-1 е разтворим разтежен фактор.

Пример 4

Растежният фактор PRV-1 притежава също инхибиторен, цитостатичен ефект

Експериментите се провеждат върху клетки от периферна кръв. Доколкото малък брой прекурсорни клетки са също циркулиращи в периферната кръв на здрави индивиди, възможно е да се култивират хематопоетични колонии от клетки на периферна кръв в подходяща среда (метил целулоза). 40 ml периферна

28/02 ФБ

венозна кръв се изтегля от здрав донор (като отначало се въвежда хепарин или EDTA като антикоагулант). Добавят се 15 ml Ficoll/Hipaque към кръвта и сместа се центрофугира при 1 600 rpm за 40 минути непрекъснато. Това води до получаване на плътностен градиент, който фракционира кръвта на нейните кръвни конституенти. След центрофугиране, това което е

характерно за мононуклеарните клетки, които включват също стволови клетки е, че могат да бъдат намерени в интерфазата между серума и Ficoll. Тази интерфаза се отстранява и промива в PBS (изотоничен разтвор на соли). Това дава пречистени мононуклеарни клетки, приблизително 0.1% от които са хематопоетични стволови клетки.

Мононуклеарните клетки се взимат от специално набогатена среда (IMDM), която съдържа допълнително FCS (фетален телешки серум) в концентрация от 3%. Тази FCS/IMDM съответно съдържа модификации, т.е. PRV-1 се добавя или не се добавя нея.

Към търговски достъпна среда, получена чрез Stem Cell Technologies (Methocult), която съдържа IMDM и 30% FCS, 1% BSA (говежди телешки серумен албумин), меркаптоетанол, 2 mM Lглутамин, 3 IU ЕРО (еритропоетин)/т1 и 1% метил целулоза, се добавят мононуклеарните клетки в IMDM при плътност от 7 до 10⁵клетки/ml. Клетките растат в продължение на 14 дни в тази среда. Малкото стволови клетки, които има в тази смес са в състояние да се развият в хематопоетични колонии. Обикновено, между 100 и 200 хематопоетични колонии се развиват за всеки от използваните 7 χ 10⁵ клетки.

Създава се също и клетъчна линия, която експресира много голямо количество от PRV-1. PRV-1, който се продуцира от тези

28/02 ФБ

клетки се променя така, че повече да не притежава липидна котва. Продукта на експресия се състои от амино киселини 1- 401 от последователността SEQ ID NO: 2; амино киселините 402-437 поради това липсват. Този променен PRV-1, подобно на дивия тип PRV-1, не е включен в клетъчната мембрана посредством липидна котва, но вместо това е напълно секретиран от клетките. Както в пример 3, клетъчната линия се състои от 293 клетки, които не продуцират който и да е ретровирус, но които експресират протеин (PRV-1).

За изпитване на хематопоетичните колонии, мононуклеарните кръвни клетки се взимат както от IMDM среда, която е инкубирана за 48 часа с нетрансфектирани клетки (293), така и от среда, която е инкубирана за 48 часа с клетки, които са експресирали изменения PRV-1 (293-GPI-less-PRV-1). След това е изследвана способността на тези клетки да формират хематопоетични колонии. Броя на еритроидните (червени) и миелоидни (бели) колонии от кръвни клетки се определя след 14 дни. Експеримента се повтаря три пъти и също се повтаря в различни дни с използването на различни донори на кръв. Дубликатите съцо се оценяват в рамките на експеримента. Получени са следните резултати:

Експеримент 1

Клетъчна супернатанта	Донор 1	Донор 2
	Червени колонии	Бели колонии	Челвени колонии	Бели колонии
293	248/221	70/114	127/161	25/66
293-GPI-less-PRV-1	7/3	0/0	31/19	0/0

28/02 ФБ ·· ···· ·· ····

Експеримент 2

Клетъчна супернатанта	Донор 1	Донор 2
	Червени колонии	Бели колонии	Червени колонии	Бели колонии
293	99/91	20/19	49/33	8/1
293-GPI-less-PRV-1	0/0	0/0	0/0	0/0

Експеримент 3

Клетъчна супернатанта	Донор 1	Донор 2
	Червени колонии	Бели колонии	Червени колонии	Бели колонии
293	107/207	22/30	24/32	5/8
293-GPI-less-PRV-1	4/3	0/6	0/1	3/0

От тези данни може да се заключи, че по- висока доза на PRV-1 в сравнение с този, използван в Пример 3 притежава цитостатичен ефект.

Пример 5

Растежният фактор PRV-1 е N- гликозилиран

От пациенти, страдащи от р. vera се изолират гранулоцити и от тези клетки се изготвят протеинови екстракти с помощта на

28/02 ФБ ··· ·♦ ····

стандартен протокол. Тези протеинови екстракти се третират в съответствие с протокола за “N- гликозидазен F Дегликозилационен кит”, доставен от Boehringer Mannheim. В подробности това означава, че към протеиновите екстракти се добавя “денатурационенбуфер” и смесите се загряват при 95°С за 3 минути, след което те се третират или с “реакционен буфер” или с реакционен буфер плюс N- гликозидаза. Всяка смес се инкубира за една нощ при 37°С и протеините се анализират върху PAGE гелелектрофореза, последвано от оцветяване по Western. PRV-1 протеина се установява с антитяло, насочено срещу протеин, притежаващ амино киселинната последователност ID No. 5. Резултатите показват, че докато PRV-1 пречистен от гранулоцити е 60- 65 kDa по размер, той е само 40 kDa по размер след разграждане с N-гликозидаза. Това ясно доказва, че PRV-1 е гликозилиран при аспарагиновия остатък (аспарагин = N).

Claims

1. Приложение на N- гликозипиран полипептид, който по същество включва една от следните амино киселинни последователности:

амино киселини 1- 437 от последователност No. 2;

амино киселини 1- 409 от последователност No. 2; амино киселини 1-401 от последователност No. 2;

амино киселини 22- 437 от последователност No. 2;

амино киселини 22- 409 от последователност No. 2; амино киселини 22- 401 от последователност No. 2;

или на техен фрагмент, съдържащ най- малко 50 амино киселини или на полипептид, който включва по същество една от следните амино киселинни последователности:

амино киселини 1- 437 от последователност No. 2;

амино киселини 1- 409 от последователност No. 2;

амино киселини 1- 401 от последователност No. 2;

амино киселини 22- 437 от последователност No. 2; амино киселини 22- 409 от последователност No. 2; амино киселини 22- 401 от последователност No. 2;

или на техен биологично активен фрагмент или на техен биологично активен вариант, за получаване на лекарство, което действа като растежен фактор.

2. Приложение на един N-гликозилиран полипептид, който по същество включва една от следните амино киселинни последователности:

амино киселини 1- 437 от последователност No. 2;

амино киселини 1- 409 от последователност No. 2;

28/02 ФБ • · · · · · • · • · · · · ···· · • · · · ♦ · ··· ···· ♦ ·· ·· ·· ···· амино киселини 1- 401 от последователност No. 2;

амино киселини 22- 409 от последователност No. 2;

амино киселини 22- 401 от последователност No. 2;

амино киселини 1- 437 от последователност No. 2;

амино киселини 1- 409 от последователност No. 2;

амино киселини 1- 401 от последователност No. 2;

или на техен биологично активен фрагмент или на техен биологично активен вариант, за получаване на лекарство за лечение на панцитопении и панцитопатии в костния мозък и в циркулацията.

3. Приложение на полипептид, който по същество включва една от следните последователности:

амино киселини 1- 1600 от последователност No. 1;

амино киселини 36- 1346 от последователност No. 1;

амино киселини 36- 1262 от последователност No. 1;

амино киселини 36-1238 от последователност No. 1;

амино киселини 39-1346 от последователност No. 1;

амино киселини 39- 1262 от последователност No. 1;

амино киселини 39- 1238 от последователност No. 1;

амино киселини 99-1346 от последователност No. 1;

амино киселини 99- 1262 от последователност No. 1;

амино киселини 99- 1238 от последователност No. 1;

28/02 ФБ • · · · • · « * или на техен фрагмент или на техен вариант, за получаване на лекарство за лечение на панцитопении и панцитопатии в костния мозък и в циркулацията.

4. Приложение на един N-гликозилиран полипептид, който по същество включва една от следните амино киселинни последователности:

амино киселини 1- 437 от последователност No. 2;

амино киселини 1- 409 от последователност No. 2;

амино киселини 1- 401 от последователност No. 2;

амино киселини 1- 437 от последователност No. 2;

амино киселини 1- 409 от последователност No. 2;

амино киселини 1- 401 от последователност No. 2;

или на техен биологично активен фрагмент или на техен биологично активен вариант, за получаване на лекарство за лечение и/или на мултиплициране на ендогенни клетки и/или стабилни клетъчни линии ex vivo или in vitro.

5. Приложение на един N-гликозилиран полипептид, който по същество включва една от следните амино киселинни последователности:

28/02 ФБ • ·· · .:.. : ·..· ·..·'· · ·' ·· ♦· ·· ···· амино киселини 1- 437 от последователност No. 2;

амино киселини 1- 409 от последователност No. 2;

амино киселини 1- 401 от последователност No. 2;

амино киселини 1- 437 от последователност No. 2;

амино киселини 1- 409 от последователност No. 2;

амино киселини 1-401 от последователност No. 2;

или на техен биологично активен фрагмент или на техен биологично активен вариант, за получаване на лекарство за инхибиране на клетъчния растеж.

6. Приложение съгласно претенция 5, характеризиращо се с това, че полипептида се използва като цитостатично средство.

7. Приложение на един N-гликозилиран полипептид, който по същество включва една от следните амино киселинни последователности:

амино киселини 1- 437 от последователност No. 2;

амино киселини 1- 409 от последователност No. 2;

амино киселини 1-401 от последователност No. 2;

liriaSasiBsitoSSii&Sfel

28/02 ФБ «··· или на техен фрагмент, съдържащ най- малко 50 амино киселини или на полипептид, който включва по същество една от следните амино киселинни последователности:

амино киселини 1- 437 от последователност No. 2;

амино киселини 1- 409 от последователност No. 2;

амино киселини 1- 401 от последователност No. 2;

или на техен биологично активен фрагмент или на техен биологично активен вариант, за получаване на лекарство за лечение на пролиферативни заболявания.

8. Приложение съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че пролиферативното заболяване е избрано от групата, включваща миелопролиферативни заболявания, р. vera, есенциална тромбоцитемия, миелофиброза, CML, всички левкемии и лимфоми и също твърди тумори.

9. Приложение на полинуклеотид, който по същество включва една от следните амино киселинни последователности: амино киселини 1- 1600 от последователност No. 1; амино киселини 36-1346 от последователност No. 1; амино киселини 36-1262 от последователност No. 1; амино киселини 36- 1238 от последователност No. 1; амино киселини 39- 1346 от последователност No. 1; амино киселини 39- 1262 от последователност No. 1; амино киселини 39-1238 от последователност No. 1; амино киселини 99-1346 от последователност No. 1; амино киселини 99-1262 от последователност No. 1; амино киселини 99- 1238 от последователност No. 1;

28/02 ФБ ···· • * • · · · · · ··· ···· · ·· ·· ·· ···· или на техен фрагмент или на техен вариант, за инхибиране клетъчния растеж.

10. Приложение на полинуклеотид, който по същество включва една от следните амино киселинни последователности:

амино киселини 36 амино киселини 36 амино киселини 36 амино киселини 39 амино киселини 39 амино киселини 39 амино киселини 99 амино киселини 99 амино киселини 99

1346 от последователност No. 1;

1262 от последователност No. 1;

1238 от последователност No. 1;

1346 от последователност No. 1;

1262 от последователност No. 1;

1238 от последователност No. 1;

1346 от последователност No. 1;

1262 от последователност No. 1;

1238 от последователност No. 1;

или на техен фрагмент или на техен вариант, за получаване на лекарство за лечение на пролиферативни заболявания.

I

11. Приложение съгласно претенция 10, характеризиращо се с това, че пролиферативното заболяване е избрано от групата, включваща миелопролиферативни заболявания, р.