JP2003219889A - 新規ｍａｐキナーゼ活性抑制因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 細胞外シグナルに応じた細胞の増殖と分化に
関連するＭＡＰキナーゼを介した情報伝達系の制御に関
与するヒト遺伝子のクローニング。 【解決手段】 ＭＡＰキナーゼ活性抑制作用を有するヒ
ト遺伝子、その遺伝子発現産物、その遺伝子が挿入され
た組換え発現ベクター、その遺伝子が挿入された組換え
発現ベクターを有する宿主細胞、その遺伝子発現産物ま
たはそれらの部分断片に結合性を有する抗体等に関す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞外シグナルに
応じた細胞の増殖と分化に関連するＲａｓ、Ｒａｆおよ
びＭＡＰキナーゼを介した情報伝達系の制御に関与する
新規ヒト遺伝子及び遺伝子の利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞外シグナルに応じた細胞の増殖と分
化は、Ｒａｓ、ＲａｆおよびＭＡＰキナーゼを介した情
報伝達系によって調節されている。しかし、この情報伝
達系の制御機構は十分には明らかにされていない現状に
ある。

【０００３】Ｒａｓは細胞内シグナル伝達系では中心的
な役割を果たしており、ＲａｓのＣ末端は脂質で修飾さ
れており細胞膜に存在し、増殖因子など様々な外界の刺
激によって活性化される。ＭＡＰキナーゼ（mitogen-ac
tivated protein kinase）を中心的な構成要素とした情
報伝達系(ＭＡＰキナーゼ系 )の活性化は、細胞によっ
て増殖、分化、あるいは運動性亢進を誘導する。そして
多くの癌細胞においてはＭＡＰキナーゼ系の恒常的機能
亢進が認められている。またＲａｓの恒常的活性化型変
異は約３０％の癌にみられ、細胞増殖と密接な関係があ
ることがわかっている。

【０００４】活性化されたＲａｓは主にＲａｆを細胞膜
にリクルートしそこでＲａｆはリン酸化（特に３８８番
目のセリン残基）され、そして活性化される。Ｒａｓは
ＧＥＦ (GDP/GTP変換因子)のひとつであるＳｏｓ (son
of sevenless)によって活性化（GTP型に変換する）さ
れ、逆にＲａｓＧＡＰ (GTPアーセ゛活性化蛋白)によって不
活性化（GDP型に変換する）される。活性化されたＲａ
ｆはＭＥＫ（mitogen-activated protein kinase）を、
ＭＥＫはＭＡＰキナーゼを活性化するカスケードを形成
する。 このようにＲａｓ／ＭＡＰキナーゼ経路の正の
シグナル経路は近年かなりの理解が進んだが負の制御メ
カニズムに関しては未だ不明な点が多い。特にＭＡＰキ
ナーゼの下流に存在するいわゆるネガティブフィードバ
ック制御因子は、ＭＡＰキナーゼフォスファターゼであ
るＭＫＰ遺伝子群やショウジョウバエのＧＦ受容体アン
タゴニストａｒｇｏｓ、ＥＧＦ受容体の活性を抑制する
膜タンパク質ｋｅｋｋｏｎｌなど以外はあまり知られて
いない。

【０００５】近年ＭＡＰキナーゼ系の負の制御因子とし
て新たにＳｐｒｏｕｔｙが発見され注目を集めている。
ショウジョウバエ(Drosophila)の気管の発生にはＦＧＦ
(繊維芽細胞成長因子:fibroblast growth factor) が
必須であり、その過程に異常をきたす遺伝子としてＳｐ
ｒｏｕｔｙは発見された。変異によって気管の分枝が多
くなり、出芽（Sprout）したような状態になることから
Ｓｐｒｏｕｔｙと命名された。遺伝学的な解析からＦＧ
Ｆシグナルにアンチゴナイズ(antigonize)する分子と考
えられたが、その後カスキ(Casci)らによりＳｐｒｏｕ
ｔｙはショウジョウバエの眼、羽根形成においてＥＧＦ
(内皮細胞成長因子:epidermal growthfactor) レセプ
ター／Ｒａｓシグナルを抑制する細胞内分子として再発
見された。発現はＭＡＰキナーゼの活性化と一致するこ
となどからＭＡＰキナーゼの標的遺伝子と考えられる。
哺乳類では４種類のホモログが知られており、少なくと
もＳｐｒｏｕｔｙ２、Ｓｐｒｏｕｔｙ４はＥＧＦ、ＦＧ
Ｆ、フォルボールエステルなどの刺激によってＭＡＰキ
ナーゼを介して転写誘導される［Hunter, T., Cell, 8
0, 225-236(1995); Lowy, D.R. and Willumsen, Ｂ．
M., Annu. Rev. Biochem., 62, 851-891 (1993); Ferre
ll, J.E.Jr., Curr. Top. Dev. Biol., 33, 1-60 (199
6); Prehoda, K.E., et al., Cell, 97, 471-480 (199
9); Hacohen, N., et al., Cell, 92, 253-263 (1998);
Casci, T., et al., Cell, 96, 655-665(1999); de Ma
ximy, A.A.，et al., Mech. Dev., 81, 213-216(1999);
Tefft, J.D.,et al., Curr. Biol., 9, 219-222 (199
9); Minowada, G., et al., Development, 126, 4465-4
475(1999)］。

【０００６】上記のように、多くの癌細胞においてはＭ
ＡＰキナーゼ系の恒常的機能亢進が認められていること
から、その特異的阻害は、細胞の癌化または癌細胞に対
して抑制的に作用すると考えられ、新たな癌抑制剤の開
発の可能性を導き出すことが当業界で所望されている。

【０００７】本発明者は、レセプター型のチロシンキナ
ーゼであるｃ−ｆｍｓやｃ−ｋｉｔの新たな基質や制御
因子を検索する目的でキナーゼドメインを標的とした酵
母ツー・ハイブリッド・スクリーニングを実施してき
た。そして破骨細胞ｃＤＮＡライブラリーより新たな分
子を単離した。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、チロ
シンキナーゼの新たな基質や制御因子を介した情報伝達
系の制御に関与する新規ヒト遺伝子を単離することにあ
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明によれば、
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなる
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその
相補鎖、 （ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列
からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに
対して少なくとも９５％の相同性を持っている塩基配列
からなり、かつＭＡＰキナーゼ活性抑制作用を有するポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相
補鎖、 （ｃ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列に
おいて、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若し
くは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＡＰキナ
ーゼ活性抑制作用を有するポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドまたはその相補鎖、 （ｄ）配列番号：
２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、 （ｅ）配
列番号：２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも９
５％の相同性を持っている塩基配列からなり、かつＭＡ
Ｐキナーゼ活性抑制作用を有するポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドまたはその相補鎖、 （ｆ）配列
番号：２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは
複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列からなり、かつＭＡＰキナーゼ活性抑制作用を
有するポリペプチド、をコードするポリヌクレオチドま
たはその相補鎖、のいずれかのポリヌクレオチドを含む
ヒト遺伝子が提供される。

【００１０】また、本発明によれば、配列番号：１また
は２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖からなるヒ
ト遺伝子が提供される。

【００１１】更に、本発明によれば、 （ａ）配列番
号：３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドま
たはその相補鎖、 （ｂ）配列番号：３で示される塩基
配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、
かつＭＡＰキナーゼ活性抑制作用を有するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、
（ｃ）配列番号：４で示される塩基配列からなるポリヌ
クレオチドまたはその相補鎖、 （ｄ）配列番号：４で
示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドからなり、かつＭＡＰキナーゼ活性抑制作用を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその
相補鎖、のいずれかのポリヌクレオチドからなるヒト遺
伝子が提供される。

【００１２】また、本発明によれば配列番号：３または
４で示される塩基配列である遺伝子、あるいは上記いず
れか記載の遺伝子発現産物、前記遺伝子が挿入された組
換え体発現ベクター、該組換え体発現ベクターを有する
宿主細胞が提供される。

【００１３】さらに本発明によれば、前記遺伝子発現産
物またはそれらの部分断片に結合性を有する抗体または
抗体断片が提供される。

【００１４】本発明によれば、 （ａ）配列番号：１で
示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、 （ｂ）
配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプ
チドに対して少なくとも９５％の相同性を持っているア
ミノ酸配列からなり、かつＭＡＰキナーゼ活性抑制作用
を有するポリペプチド、 （ｃ）配列番号：１で示され
るアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸
が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつＭＡＰキナーゼ活性抑制作用を有するポリペプ
チド、 （ｄ）配列番号：２で示されるアミノ酸配列か
らなるポリペプチド、 （ｅ）配列番号：２で示される
アミノ酸配列からなるポリペプチドに対して少なくとも
９５％の相同性を持っているアミノ酸配列からなり、か
つＭＡＰキナーゼ活性抑制作用を有するポリペプチド、
（ｆ）配列番号：２で示されるアミノ酸配列におい
て、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは
付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＡＰキナーゼ
活性抑制作用を有するポリペプチド、のいずれかのポリ
ペプチドが提供される。

【００１５】さらに、本発明によれば、配列番号：１ま
たは２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
該ポリペプチドまたはそれらの部分断片に結合性を有す
る抗体または抗体断片が提供される。

【００１６】本発明によれば、 ａ）生理的条件下にお
いて、ＭＡＰキナーゼ活性抑制作用を促進するために被
検物質を処理するのに十分な時間の間、適当な反応培地
／溶液中において上記遺伝子発現産物に対して被検物質
を提示させる工程、 ｂ）被検物質の存在下の前記ＭＡ
Ｐキナーゼ活性抑制作用に対する比較において、前記遺
伝子発現産物の該ＭＡＰキナーゼ活性抑制作用の促進を
検出し、そしてＭＡＰキナーゼ活性抑制作用を促進する
被検物質の存在を特定する工程を含む、前記遺伝子発現
産物のＭＡＰキナーゼ活性抑制作用を促進する候補化合
物のスクリーニング方法が提供される。

【００１７】また、本発明によれば、 ａ）生理的条件
下において、Ｒａｆ活性の抑制を促進するために被検物
質を処理するのに十分な時間の間、適当な反応培地／溶
液中において上記遺伝子発現産物に対して被検物質を提
示させる工程、 ｂ）被検物質の存在下の前記Ｒａｆ活
性抑制に対する比較において、前記遺伝子発現産物の該
Ｒａｆ活性抑制の促進を検出し、そしてＲａｆ活性の抑
制を促進する被検物質の存在を特定する工程を含む、前
記遺伝子発現産物のＲａｆ活性の抑制を促進する候補化
合物のスクリーニング方法、及び該スクリーニング方法
を用いて、抗腫瘍作用を有する化合物を特定する医薬の
スクリーニング方法が提供される。

【００１８】さらに本発明によれば、遺伝子発現産物ま
たはポリペプドを有効成分として用いる抗腫瘍剤が提供
される。

【００１９】また本発明によれば、（ａ）配列番号：１
で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドまたはその相補鎖、（ｂ）配列番
号：１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドに対して少なくとも９５％
の相同性を持っている塩基配列からなり、かつ細胞の分
化を抑制する作用を有するポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドまたはその相補鎖、（ｃ）配列番号：１
で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個の
アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつ細胞の分化を抑制する作用を有するポリ
ペプチド、をコードするポリヌクレオチドまたはその相
補鎖、（ｄ）配列番号：２で示されるアミノ酸配列から
なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは
その相補鎖、（ｅ）配列番号：２で示されるアミノ酸配
列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
に対して少なくとも９５％の相同性を持っている塩基配
列からなり、かつ細胞の分化を抑制する作用を有するポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相
補鎖、（ｆ）配列番号：２で示されるアミノ酸配列にお
いて、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しく
は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞の分化を
抑制する作用を有するポリペプチド、をコードするポリ
ヌクレオチドまたはその相補鎖、のいずれかのポリヌク
レオチドを含むヒト遺伝子が提供される。

【００２０】更に、本発明によれば、 （ａ）配列番
号：３で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドま
たはその相補鎖、 （ｂ）配列番号：３で示される塩基
配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、
かつ細胞の分化を抑制する作用を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖、
（ｃ）配列番号：４で示される塩基配列からなるポリヌ
クレオチドまたはその相補鎖、 （ｄ）配列番号：４で
示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチ
ドからなり、かつ細胞の分化を抑制する作用を有するポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相
補鎖、のいずれかのポリヌクレオチドからなるヒト遺伝
子が提供される。

【００２１】以下、本明細書におけるアミノ酸、ペプチ
ド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ
−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biologi
calNomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (198
4)〕、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の
作成のためのガイドライン」（特許庁編）および当該分
野における慣用記号に従うものとする。

【００２２】

【発明の実施の形態】ＭＡＰキナーゼ活性抑制因子遺伝
子の一具体例としては、後述する実施例に示される「マ
ウスＳｐｒｅｄ１」、「マウスＳｐｒｅｄ２」、「ヒト
Ｓｐｒｅｄ１」および「ヒトＳｐｒｅｄ２」と名付けら
れたものを挙げることができる。「マウスＳｐｒｅｄ
１」の塩基配列は１３３２塩基長、「ヒトＳｐｒｅｄ
１」の塩基配列は１３３２塩基長からなり、それぞれ配
列番号：３または配列番号：７に示されるとおりであ
る。また、「マウスＳｐｒｅｄ２」の塩基配列は１２３
０塩基長、「ヒトＳｐｒｅｄ２」の塩基配列は１２５４
塩基長からなり、それぞれ配列番号：４または配列番
号：８に示されるとおりである。

【００２３】該ヒトＳｐｒｅｄ１遺伝子は、配列番号：
１に示される４４４アミノ酸配列の長さからなる新規な
Ｓｐｒｅｄ（Ｓｐｒｅｄ１蛋白質という）をコードする
ヒトｃＤＮＡであり、全長１３３２塩基長からなってい
る。

【００２４】該ヒトＳｐｒｅｄ２遺伝子は、配列番号：
２に示される４１８アミノ酸配列の長さからなる新規な
Ｓｐｒｅｄ（Ｓｐｒｅｄ２蛋白質という）をコードする
ヒトｃＤＮＡであり、全長１２５４塩基長からなってい
る。

【００２５】本発明の遺伝子ヒトＳｐｒｅｄ１でコード
されるヒトＳｐｒｅｄ１蛋白質及び本発明の遺伝子ヒト
Ｓｐｒｅｄ２でコードされるヒトＳｐｒｅｄ２蛋白質
は、ｔｂｌａｓｔｎ法を利用したＮＣＢＩのヒトＥＳＴ
およびｎｒデーターベースの検索の結果、マウスＳｐｒ
ｅｄ１でコードされるマウスＳｐｒｅｄ１蛋白質および
マウスＳｐｒｅｄ２でコードされるマウスＳｐｒｅｄ２
蛋白質との相同性に基づき検出された。

【００２６】本発明者は、先にマウスＳｐｒｅｄ遺伝子
を取得した。該マウスＳｐｒｅｄ遺伝子は、Ｎ末端にＥ
ＶＨ−１ (Ena/Vasodilator-stimulated phosphoprotei
n homology-1) ドメインをＣ末端にＳｐｒｏｕｔｙと相
同性のあるＳｐｒｏｕｔｙ(SPR)ドメインをもつ蛋白質
をコードしており、該蛋白質をＳｐｒｅｄ (Sprouty-re
lated protein with EVH-1 domain) と命名した。デー
タベース検索によりＳｐｒｅｄと類似するＳｐｒｅｄ−
２もクローニングした。Ｃ−ｋｉｔと結合するドメイン
として約５０アミノ酸からなるＫｉｔ−結合ドメイン
(ＫＢＤ)を同定した。これはＳＨ２やＰＴＢといった既
知のリン酸化チロシンを認識するドメインとは全く異っ
た配列でありその結合様式の解明に興味が待たれる。一
方、ＥＶＨ−１ドメインはタンパク間の結合に機能する
もので、ＶＡＳＰ (血管拡張作用因子刺激リン酸化タン
パク質(Vasodiletor-stimulated phosphoprotein) やＷ
ＡＳＰ (ウイスコット・アルト゛リッチ症候群蛋白質: Wiskott-Aldri
ch syndrome protein) 等のアクチン重合化に関与する
分子群にみられるドメインである。これらのＥＶＨ−１
ドメインはＦＰＰＰＰというプロリンリッチな配列を認
識し、細胞骨格再構築が行われている領域にアクチンを
集蔟させるために必要と思われた。しかしＳｐｒｅｄの
ＥＶＨ−１ドメインはこれらのＥＶＨ−１ドメインから
進化上やや離れており別の機能も予想された。マウスＳ
ｐｒｅｄはＳＣＦによってチロシンリン酸化をうけ、Ｓ
ｐｒｏｕｔｙドメインによって細胞膜に局在していた。

【００２７】そして野生型のＳｐｒｅｄ１、ないしＳｐ
ｒｅｄ２の強制発現はＮＧＦ(nervegrowth factor)によ
るＰＣ１２細胞の分化を抑制した。この際にＮＧＦによ
るＭＡＰキナーゼ活性の抑制が確認された。抗体マイク
ロインジェクションとＣ末端のＳｐｒｏｕｔｙドメイン
を欠損させたドミナント・ネガティブ変異体の過剰発現
においては、逆にＰＣ１２のＮＧＦによる分化とＭＡＰ
キナーゼの活性化が増強されて、さらにＳｐｒｅｄ２の
発現が高い筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２は低血清培地にさらさ
れると一過性にＭＡＰキナーゼの活性化が低下し、筋肉
様細胞への分化を示した。Ｃ２Ｃ１２においては野生型
のＳｐｒｅｄの発現はそれだけで分化を誘導し、逆にＳ
ｐｒｅｄ１及びＳｐｒｅｄ２のドミナント・ネガティブ
変異体の過剰発現は分化を抑制した。このとき野生型Ｓ
ｐｒｅｄではＭＡＰキナーゼ活性の低下が、ドミナント
・ネガティブ変異体ではＭＡＰキナーゼ活性の増強が認
められた。これらの事実から、Ｓｐｒｅｄは内因性のタ
ンパクレベルでのＭＡＰキナーゼ抑制因子であることが
示された。

【００２８】本発明のヒトＳｐｒｅｄ遺伝子および該遺
伝子によってコードされるアミノ酸配列のＳｐｒｅｄ蛋
白質は、マウスＳｐｒｅｄ−１とは核酸配列で、９１．
１％とアミノ酸配列９３．３％、またマウスＳｐｒｅｄ
−２とは、８６．５％と９１．９％とそれぞれ高い相同
性を有していた。

【００２９】このことから、マウスＳｐｒｅｄと高い配
列相同性を有するヒトＳｐｒｅｄは、上記のマウスＳｐ
ｒｅｄが有するそれら特性を有するヒト相応物であると
考えられる。

【００３０】尚、本発明において遺伝子は、２本鎖ＤＮ
Ａのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセ
ンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨であり、
またその長さに何ら制限されるものではない。従って、
本発明の遺伝子(ＤＮＡ)には、特に言及しない限り、ヒ
トゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、およびｃＤＮＡを
含む１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、並びに該センス鎖と相
補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ、およびそれらの断片
のいずれもが含まれる。

【００３１】本発明において遺伝子(ＤＮＡ)とは、リー
ダ配列、コード領域、エキソン、イントロンを含む。ポ
リヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡを例示できる。ＤＮ
Ａ分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡを含
み、特定アミノ酸配列を有するポリペプチドは、蛋白
質、ペプチドを含み、その断片、同族体、誘導体、変異
体を含む。

【００３２】変異体は、天然に存在するアレル変異体、
天然に存在しない変異体、欠失、置換、付加、および挿
入された変異体等コードされるポリペプチドの機能を実
質的に変更しないポリヌクレオチド配列を意味する。

【００３３】尚、これらアミノ酸配列の改変（変異等）
は、天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾等に
より生じることもあるが、天然由来の遺伝子（例えば本
発明の具体例遺伝子）を利用して人為的にこれを行なう
こともできる。

【００３４】上記ポリペプチドは、アレル体、ホモロ
グ、天然の変異体で少なくとも９０％、好ましくは、９
５％、より好ましくは９８％、さらにより好ましくは９
９％相同なものを含む。

【００３５】また、上記ポリペプチドは、共通に保存す
る構造的な特徴があり、本発明遺伝子のセンス鎖ＤＮＡ
分子発現産物の生物活性は、例えばＭＡＰキナーゼの活
性化の抑制、あるいはＲａｆの活性化阻害作用、あるい
は神経や筋肉細胞への分化を抑制する活性など、これら
生物活性を有している。なおポリペプチドの相同性は配
列分析ソフトウェア、例えばＦＡＳＴＡプログラムを使
用した測定（Clustal,V., Methods Mol.Biol., 25, 307
-318 (1994)）において、ＢＬＡＳＴプログラムを使用
した測定において、或いはＳＷＩＳＳＰＬＯＴＳで解析
することが出来る。

【００３６】変異体ＤＮＡは、アミノ酸置換についてサ
イレントまたは保存変異体を意味し、塩基配列によって
コードされるアミノ酸残基が変らない塩基配列の変異の
ことを表わす。

【００３７】保存的なアミノ酸置換の数は以下に示され
ているとおりである： 元のアミノ酸残基 保存的な置換アミノ酸残基 Ala Ser Arg Lys Asn Gln, His Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Pro His Asn またはGln Ile Leu またはVal Leu Ile またはVal Lys Arg, または Glu Met Leu またはIle Phe Met, Leu またはTyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp またはPhe Val Ile またはLeu 加えて、一般にシスティン残基をコードする1またはそ
れ以上のコドンは、特定のポリペプチドのジスフィド結
合に影響を与えるのでシステイン残基の欠失の結果、置
換することが可能である。

【００３８】置換基を選択することによって作られる機
能における実質的な変化は、上記アミノ酸のリストに記
載されたものより少し保存性が劣っている：例えば、 a) 置換基の領域におけるポリペプチドの構造背景、 b) 標的部位のポリペプチドの電荷または疎水性、 c) アミノ酸側鎖の大きさ(容積)。

【００３９】蛋白の特性に最も大きな変化を生み出すと
一般的に期待される置換は、以下のものである： a) 親水性残基、例えばセリンまたはスレオニンが疎水
性残基例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラ
ニン、ヴァリン、またはアラニンに対して置換される、 b) システィンまたはプロリンは、いかなる他の残基に
対して置換される、 c) 電気的陽性側鎖を有している残基、例えば、リジ
ン、アルギニン、ヒスチジンは電気的陰性残基、例え
ば、バルタアミルまたはアスパラギン酸によって置換さ
れるが、 d) 非常に大きな側鎖を有している残基、例えば、フェ
ニルアラニンはグリシンのような側鎖を有しないものと
置換できる。

【００４０】以上のとおり、本発明ヒトＳｐｒｅｄ遺伝
子およびその遺伝子産物の提供は、ＭＡＰキナーゼ活性
抑制因子、あるいはＲａｆ活性阻害因子としての新規遺
伝子の解明、把握、診断、予防および治療等に極めて有
用な情報乃至手段を与える。また、本発明遺伝子は、上
記Ｓｐｒｅｄ遺伝子のポリヌクレオチドおよびその遺伝
子産物と相互作用し、前記生物活性を促進する作用、本
発明遺伝子の遺伝子発現の誘導を促進する新規薬剤の開
発の上でも好適に利用できる。更に、個体或は組織にお
ける本発明遺伝子の発現またはその産物の発現の検出
や、該遺伝子の変異（欠失や点変異）乃至発現異常の検
出は、上記Ｓｐｒｅｄ１またはＳｐｒｅｄ２と相互作用
の解明おいて好適に利用できる。

【００４１】本発明のヒトＳｐｒｅｄ遺伝子は、具体的
には配列番号：１または２で示されるアミノ酸配列をコ
ードする配列番号：３または４の塩基配列を含む遺伝
子、または該配列番号：３または４で示される塩基配列
の全部またはその相補鎖を含むポリヌクレオチドからな
る遺伝子として示されるが、特にこれらに限定されるこ
となく、例えば、上記特定のアミノ酸配列において一定
の改変を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ
チドや、上記特定のアミノ酸配列や塩基配列と一定の相
同性を有するポリヌクレオチドであることができる。前
記特定のアミノ酸配列や塩基配列と一定の相同性は、例
えば少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、よ
り好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上の
相同性を有するものであり、これら相同物を含む。

【００４２】本発明ヒトＳｐｒｅｄ遺伝子改変体につい
ては、配列番号：１または２に示されるアミノ酸配列に
おいて、少なくとも１以上の、あるいは１または複数個
のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列
（改変されたアミノ酸配列）をコードする塩基配列を含
むポリヌクレオチドもまた包含される。

【００４３】ここで、「アミノ酸の欠失、置換または付
加」の程度およびそれらの位置などは、改変された蛋白
質が、配列番号：１または２で示されるアミノ酸配列か
らなる蛋白質（ヒトＳｐｒｅｄ蛋白）と同様の機能を有
する同効物であれば特に制限されないが、少なくとも１
個以上の、好ましくは１から十数個、更に好ましくは１
から数個程度が、ヒトＳｐｒｅｄ蛋白と同様の機能を有
するうえで好ましく例示される。

【００４４】ここで「同様の機能」とは、Ｓｐｒｅｄ活
性因子としてのＭＡＰキナーゼの活性の抑制作用、ある
いはＲａｆの活性抑制作用、あるいは癌細胞、神経細胞
や筋肉細胞の分化を抑制する作用を例示できる。

【００４５】かくしてＳｐｒｅｄはＭＡＰキナーゼ抑制
因子ファミリーのひとつである。これらの特性を以後
「Ｓｐｒｅｄ活性」または「Ｓｐｒｅｄポリペプチド活
性」または「Ｓｐｒｅｄの生物学的活性」ということも
できる。これらの活性の中には、前記Ｓｐｒｅｄポリペ
プチドの抗原性および免疫原性活性、特に配列番号１ま
たは２のポリペプチドの抗原性および免疫原性活性も含
まれる。本発明のポリペプチドはＳｐｒｅｄの少なくと
も１つの生物学的活性を示すことが好ましい。

【００４６】上記Ｓｐｒｅｄ活性において、該Ｓｐｒｅ
ｄ生物活性として選択されるＭＡＰキナーゼの活性の抑
制作用、あるいはＲａｆの活性抑制作用、あるいは神経
や筋肉細胞の分化を抑制する作用の活性測定方法は後記
参考例に示されるように、例えばＰＣ１２細胞またはＣ
２Ｃ１２細胞に本発明ヒトＳｐｒｅｄをトランスフェク
トし、該細胞の分化の程度を免疫蛍光顕微鏡で検出し、
コントロール、或はＮＧＦなどの成長因子を添加したと
きとの比較において、本発明のヒトＳｐｒｅｄの分化の
抑制の程度を検出することにより、その有意な分化の抑
制によって、Ｓｐｒｅｄ活性を測定することができる。
また、ＭＡＰキナーゼの活性の抑制作用は、例えばＰＣ
１２細胞にＳｐｒｅｄとヘマグルチニン・タグのついた
Ｅｒｋ２でコードされた発現ベクターでトランスフェク
トし、ＮＧＦで刺激した後、ヘマグルチニン・タグのつ
いたＥｒｋ２を免疫沈降させ、基質としてミエリン塩基
蛋白および放射性標識されたＡＴＰを用いるイン・ビト
ロ・キナーゼアッセイによって、その放射線活性の程度
の減少度をＭＡＰキナーゼの活性の抑制の程度として測
定することが例示できる。また、Ｒａｆの活性抑制作用
は、例えばＥＧＦ誘導されたＲａｓまたはＲａｆの活性
に対する自己リン酸化およびイン・ビトロ・キナーゼア
ッセイによって、その放射線活性の程度の減少度をＲａ
ｆの活性を抑制として測定することがすることができ
る。そしてこのＲａｆの活性抑制作用によって、前記同
様ＭＡＰキナーゼの活性の抑制の程度として同様に測定
することができる。

【００４７】また、上記改変されたアミノ酸配列をコー
ドする遺伝子は、その利用によって改変前のアミノ酸配
列をコードする本発明Ｓｐｒｅｄ遺伝子が検出できるも
のであってもよい。

【００４８】さらに本発明のＤＮＡ分子としては、例え
ば配列番号：１または２に示されるアミノ酸配列からな
る蛋白質をコードする塩基配列を有するＳｐｒｅｄ遺伝
子を挙げることができるが、特にこれに限定されること
なく、当該Ｓｐｒｅｄ遺伝子の相同物も包含される。

【００４９】ここで「Ｓｐｒｅｄ遺伝子の相同物」と
は、本発明Ｓｐｒｅｄ 遺伝子（またはそのＤＮＡ分子
産物）と配列相同性を有し、上記構造的特徴並びに遺伝
子発現パターンにおける共通性、および上記したような
その生物学的機能の類似性によりひとつの遺伝子ファミ
リーと認識される一連の関連遺伝子を意味し、Ｓｐｒｅ
ｄ遺伝子のアレル体（対立遺伝子）も当然含まれる。

【００５０】上記アミノ酸配列の改変（変異）などは、
天然において、例えば突然変異や翻訳後の修飾などによ
り生じることもあるが、天然由来の遺伝子（例えば本発
明のヒトＳｐｒｅｄまたはヒトＳｐｒｅｄ遺伝子）に基
づいて人為的に改変することもできる。本発明は、この
ような改変・変異の原因および手段などを問わず、上記
特性を有する全ての改変遺伝子のＤＮＡ分子を包含す
る。本発明のＤＮＡ分子（ヒトＳｐｒｅｄ遺伝子）に
は、配列番号：１または２で示されるアミノ酸配列を有
する蛋白質をコードするポリヌクレオチドのＤＮＡ分子
の対立遺伝子（アレル体）もまた包含される。

【００５１】上記の人為的手段としては、例えばサイト
スペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzym
ology, 154, 350, 367-382 (1987)；同 100, 468 (198
3)；Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)；続生化学
実験講座１「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105
(1986)〕などの遺伝子工学的手法、リン酸トリエステ
ル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am.
Chem. Soc., 89, 4801(1967)；同 91, 3350 (1969)；S
cience, 150, 178 (1968)；Tetrahedron Lett.,22, 185
9 (1981)；同 24, 245 (1983)〕およびそれらの組合せ
方法などが例示できる。より具体的には、ＤＮＡの合成
は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による
化学合成によることもでき、市販されている自動オリゴ
ヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断
片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニ
ーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共に
ＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによっ
て、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。

【００５２】本発明ＤＮＡ分子の具体的態様としては、
配列番号：３または４に示される塩基配列を有するＤＮ
Ａ分子を例示できる。この塩基配列中のコーディング領
域は、配列番号：１または２に示されるアミノ酸配列の
各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合せ例を示して
いる。本発明の遺伝子は、かかる特定の塩基配列を有す
るＤＮＡ分子に限らず、各アミノ酸残基に対して任意の
コドンを組合せ、選択した塩基配列を有することも可能
である。コドンの選択は、常法に従うことができ、例え
ば利用する宿主のコドン使用頻度などを考慮することが
できる〔NcleicAcids Res., 9, 43 (1981)〕。

【００５３】また、本発明ＤＮＡ分子は、前記のとお
り、配列番号：３または４に示される塩基配列と一定の
相同性を有する塩基配列からなるものも包含する。

【００５４】上記相同性は、配列番号：３または４に示
される塩基配列と少なくとも７０％の同一性、好ましく
は少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくと
も９５％の同一性、最も好ましくは、９８％の同一性を
有するポリヌクレオチドおよびその相補鎖ポリヌクレオ
チドを言う。

【００５５】かかる遺伝子としては、例えば、０．１％
ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃または０．１％Ｓ
ＤＳを含む１×ＳＳＣ中、６０℃のストリンジェントな
条件下で配列番号：３または４に示される塩基配列から
なるＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮ
Ａ分子を例示することもできる。

【００５６】本発明遺伝子は、マウスＳｐｒｅｄ遺伝子
の具体的な配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手
法により容易に製造・取得することができる。

【００５７】具体的には、マウスＳｐｒｅｄ蛋白質をコ
ードするマウスＳｐｒｅｄ遺伝子の適当な配列をプライ
マー又はプローブとして用い、本発明のヒトＤＮＡ分子
が発現される適当な起源より常法に従って調製されるｃ
ＤＮＡライブラリーから、ヒトＳｐｒｅｄ遺伝子を取得
することができる。

【００５８】本発明遺伝子は、本発明により開示された
本発明遺伝子の具体例についての配列情報に基づいて、
一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得するこ
とができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring H
arbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子
研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）など参
照〕。

【００５９】具体的には、本発明ＤＮＡ分子が発現され
る適当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリー
を調製し、該ライブラリーから、本発明遺伝子に特有の
適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択する
ことにより実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., US
A., 78, 6613 (1981)；Science, 222, 778 (1983)な
ど〕。

【００６０】上記において、ｃＤＮＡの起源としては、
本発明の遺伝子を発現する各種の細胞、組織やこれらに
由来する培養細胞などが例示される。また、これらから
の全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの
取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実
施することができる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市
販されてもおり、本発明においてはそれらｃＤＮＡライ
ブラリー、例えばクローンテック社（Clontech Lab.In
c.）などより市販されている各種ｃＤＮＡライブラリー
などを用いることもできる。

【００６１】本発明の遺伝子のＤＮＡ分子をｃＤＮＡラ
イブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限さ
れず、通常の方法に従うことができる。

【００６２】具体的には、例えばｃＤＮＡによって産生
される蛋白質に対して、該蛋白質の特異抗体を使用した
免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローン
を選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合する
プローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コ
ロニーハイブリダイゼーションなどやこれらの組合せな
どを例示できる。

【００６３】ここで用いられるプローブとしては、本発
明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合
成されたＤＮＡなどが一般的に使用できるが、既に取得
された本発明ＤＮＡ分子やその断片も良好に利用でき
る。また、本発明のＤＮＡ分子の塩基配列情報に基づき
設定したセンス・プライマー、アンチセンス・プライマ
ーをスクリーニング用プローブとして用いることもでき
る。

【００６４】前記プローブとして用いられるヌクレオチ
ド配列は、配列番号３または４に対応する部分ヌクレオ
チド配列であって、少なくとも１５個の連続した塩基、
好ましくは２０個の連続した塩基、より好ましくは３０
個の連続した塩基、最も好ましくは５０個の連続した塩
基を有するものも含まれる、或いは前記配列を有する陽
性クローンそれ自体をプローブとして用いることも出来
る。ここで本発明において選択されるプローブとして用
いられるヌクレオチド配列は、配列番号３または４に対
応する部分ヌクレオチド配列であって、かつ他のＳｐｒ
ｏｕｔｙファミリー遺伝子やマウスＳｐｒｅｄのＤＮＡ
配列とは異なるオリゴヌクレオチド配列のプライマー配
列であることを必須の要件とすることはいうまでもな
い。

【００６５】本発明の遺伝子の取得に際しては、ＰＣＲ
法〔Science, 230, 1350 (1985)〕によるＤＮＡ／ＲＮ
Ａ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから
全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ
法〔Rapid amplification ofcDNA ends；実験医学、12
(6), 35 (1994)〕、特に５'-ＲＡＣＥ法〔M.A. Frohma
n, etal., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1
988)〕などの採用が好適である。

【００６６】かかるＰＣＲ法の採用に際して使用される
プライマーは、本発明によって明らかにされた本発明の
遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定でき、これは常法
に従って合成できる。尚、増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断
片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例
えばゲル電気泳動法などによればよい。

【００６７】また、上記で得られる本発明遺伝子或いは
各種ＤＮＡ断片は、常法、例えばジデオキシ法〔Proc.
Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)〕やマキサ
ム−ギルバート法〔Methods in Enzymology, 65, 499
(1980)〕などに従って、また簡便には市販のシークエン
スキットなどを用いて、その塩基配列を決定することが
できる。

【００６８】このようにして得られる本発明のＤＮＡ分
子によれば、例えば該ＤＮＡ分子の一部または全部の塩
基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織に
おける本発明のＳｐｒｅｄ遺伝子のＤＮＡ分子発現の有
無を特異的に検出することができる。

【００６９】かかる検出は常法に従って行うことがで
き、例えばＲＴ−ＰＣＲ〔Reverse transcribed-Polyme
rase chain reaction; E.S. Kawasaki, et al., Amplif
ication of RNA. In PCR Protocol, A Guide to method
s and applications, AcademicPress,Inc.,SanDiego, 2
1-27 (1991)〕によるＲＮＡ増幅やノーザンブロッティ
ング解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Harbor La
b. (1989)〕、in situＲＴ−ＰＣＲ〔Nucl. Acids Re
s., 21, 3159-3166 (1993)〕や in situ ハイブリダイ
ゼーションなどを利用した細胞レベルでの測定、ＮＡＳ
ＢＡ法〔Nucleicacid sequence-based amplification,
Nature, 350, 91-92 (1991)〕およびその他の各種方法
を挙げることができる。好適には、ＲＴ−ＰＣＲによる
検出法を挙げることができる。

【００７０】尚、ここでＰＣＲ法を採用する場合に用い
られるプライマーとしては、本発明のＤＮＡ分子のみを
特異的に増幅できる該遺伝子特有のものである限り、特
に制限はなく、本発明ＤＮＡ分子の配列情報に基いて適
宜設定することができる。通常プライマーとして１０〜
３５程度のヌクレオチド、好ましくは１５〜３０ヌクレ
オチド程度の長さを有する本発明遺伝子の部分配列を有
するものを挙げることができる。

【００７１】このように、本発明の遺伝子には、本発明
にかかるＳｐｒｅｄ遺伝子を検出するための特異プライ
マーおよび／または特異プローブとして使用されるＤＮ
Ａ断片もまた包含されるが、上記プライマーの要件と同
様に他のＳｐｒｏｕｔｙファミリー遺伝子やマウスＳｐ
ｒｅｄのＤＮＡ配列とは異なるオリゴヌクレオチド・プ
ライマーであることを必須の要件とする。

【００７２】当該ＤＮＡ断片は、配列番号：３または４
に示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェント
な条件下でハイブリダイズすることを特徴とするＤＮＡ
として規定することできる。ここで、ストリンジェント
な条件としては、プライマーまたはプローブとして用い
られる通常の条件を挙げることができ、特に制限はされ
ないが、例えば、前述するような０．１％ＳＤＳを含む
０．２×ＳＳＣ中５０℃の条件または０．１％ＳＤＳを
含む１×ＳＳＣ中６０℃の条件を例示することができ
る。

【００７３】本発明のＳｐｒｅｄ遺伝子のＤＮＡ分子の
提供によれば、通常の遺伝子工学的手法を用いることに
より、該ＤＮＡ分子産物（Ｓｐｒｅｄ蛋白）またはこれ
を含む蛋白質を容易に大量に、安定して製造することが
できる。

【００７４】従って本発明は、本発明のＳｐｒｅｄ遺伝
子によってコードされるＳｐｒｅｄ蛋白質などの蛋白質
を始め、該蛋白質の製造のための、例えば本発明遺伝子
を含有するベクター、該ベクターによって形質転換され
た宿主細胞、該宿主細胞を培養して上記本発明蛋白質を
製造する方法などをも提供するものである。

【００７５】本発明蛋白質の具体的態様としては、配列
番号：１または２に示すアミノ酸配列を有するＳｐｒｅ
ｄポリペプチドを挙げることができるが、本発明蛋白質
には、該Ｓｐｒｅｄポリペプチドのみならず、その相同
物も包含される。該相同物としては、上記配列番号：１
または２に示されるアミノ酸配列において、少なくとも
１以上、好ましくは１もしくは数個乃至複数個のアミノ
酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、
且つ前記ＭＡＰキナーゼ活性を抑制する作用、Ｒａｆ活
性を抑制する作用、あるいは癌細胞、神経細胞などの分
化を抑制する作用を有する蛋白質を挙げることができ
る。

【００７６】具体的には、前記Ｓｐｒｅｄ遺伝子の相同
物（アレル体を含むＳｐｒｅｄ同等遺伝子）の遺伝子産
物を挙げることができる。

【００７７】本発明の蛋白質は、本発明により提供され
るＳｐｒｅｄ遺伝子の配列情報に基づいて、常法の遺伝
子組換え技術〔例えば、Science, 224, 1431 (1984) ;
Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985)；Pro
c. Natl. Acad. Sci., USA.,80, 5990 (1983)など参
照〕に従って調製することができる。

【００７８】該蛋白質の製造は、より詳細には、該所望
の蛋白をコードする遺伝子が宿主細胞中で発現できる組
換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞
に導入して形質転換し、該形質転換体を培養し、次いで
得られる培養物から回収することにより行なわれる。

【００７９】上記宿主細胞としては、原核生物および真
核生物のいずれも用いることができ、例えば原核生物の
宿主としては、大腸菌や枯草菌といった一般的に用いら
れるものが広く挙げられ、好適には大腸菌、とりわけエ
シェリヒア・コリ（Escherichia coli）株に含まれるも
のを例示できる。また、真核生物の宿主細胞には、脊椎
動物、酵母等の細胞が含まれ、前者としては、例えばサ
ルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Cell, 23: 175 (1981)〕や
チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞およびそのジヒドロ
葉酸レダクターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad. Sci., US
A., 77: 4216 (1980)〕などが、後者としては、サッカ
ロミセス属酵母細胞などが好適に用いられる。勿論、こ
れらに限定される訳ではない。

【００８０】原核生物細胞を宿主とする場合は、該宿主
細胞中で複製可能なベクターを用いて、このベクター中
に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプ
ロモーターおよびＳＤ（シャイン・アンド・ダルガー
ノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン
（例えばＡＴＧ）を付与した発現プラスミドを好適に利
用できる。上記ベクターとしては、一般に大腸菌由来の
プラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵ
Ｃ１２、ｐＵＣ１３などがよく用いられるが、これらに
限定されず既知の各種のベクターを利用することができ
る。大腸菌を利用した発現系に利用される上記ベクター
の市販品としては、例えばｐＧＥＸ−４Ｔ（Amersham P
harmacia Biotech社）、ｐＭＡＬ−Ｃ２，ｐＭＡｌ−Ｐ
２（New England Biolabs社）、ｐＥＴ２１，ｐＥＴ２
１／ｌａｃｑ（Invitrogen社）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（In
vitrogen社）等を例示できる。

【００８１】脊椎動物細胞を宿主とする場合の発現ベク
ターとしては、通常、発現しようとする本発明遺伝子の
上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部
位、ポリアデニル化部位および転写終了配列を保有する
ものが挙げられ、これは更に必要により複製起点を有し
ていてもよい。該発現ベクターの例としては、具体的に
は、例えばＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳ
Ｖ２dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)〕等が例
示できる。上記以外にも既知の各種の市販ベクターを用
いることができる。動物細胞を利用した発現系に利用さ
れるかかるベクターの市販品としては、例えばｐＥＧＦ
Ｐ−Ｎ，ｐＥＧＦＰ−Ｃ（Clontrech社）、ｐＩＮＤ（I
nvitrogen社）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Invitroge
n社）などの動物細胞用ベクターや、ｐＦａｓｔＢａｃ
ＨＴ（ＧｉｂｃｉＢＲＬ社）、ｐＡｃＧＨＬＴ（PharMi
ngen社）、ｐＡｃ５／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＭＴ／Ｖ５−Ｈ
ｉｓ，ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５−ｈｉｓ（以上Invitrogen
社）などの昆虫細胞用ベクターなどが挙げられる。

【００８２】また、酵母細胞を宿主とする場合の発現ベ
クターの具体例としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺
伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２〔Proc.
Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)〕などが例示で
きる。市販の酵母細胞用発現ベクターには、例えばｐＰ
ＩＣＺ（Invitrogen社）、ｐＰＩＣＺα（Invitrogen
社）なとが包含される。

【００８３】プロモーターとしても特に限定なく、エッ
シェリヒア属菌を宿主とする場合は、例えばトリプトフ
ァン(trp)プロモーター、lppプロモーター、lacプロモ
ーター、recAプロモーター、PL/PRプロモーターなどを
好ましく利用できる。宿主がバチルス属菌である場合
は、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモ
ーターなどが好ましい。酵母を宿主とする場合のプロモ
ーターとしては、例えばpH05プロモーター、PGKプロモ
ーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどを好適
に利用できる。また、動物細胞を宿主とする場合の好ま
しいプロモーターとしては、ＳＶ４０由来のプロモータ
ー、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネイン
プロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメ
ガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを
例示できる。

【００８４】尚、本発明遺伝子の発現ベクターとして
は、通常の融合蛋白発現ベクターも好ましく利用でき
る。該ベクターの具体例としては、グルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として発現
させるためのｐＧＥＸ（Promega社）などを例示でき
る。

【００８５】また、成熟ポリペプチドのコード配列が宿
主細胞からのポリペプチドの発現、分泌を助けるポリヌ
クレオチド配列としては、分泌配列、リーダ配列が例示
でき、細菌宿主に対して融合成熟ポリペプチドの精製に
使用されるマーカー配列(ヘキサヒスチジン・タグ、ヒス
チジン・タグ)、哺乳動物細胞の場合はヘマグルチニン(H
A)・タグを例示できる。

【００８６】所望の組換えＤＮＡ（発現ベクター）の宿
主細胞への導入法およびこれによる形質転換法として
は、特に限定されず、一般的な各種方法を採用すること
ができる。

【００８７】また得られる形質転換体は、常法に従い培
養でき、該培養により所望のように設計した遺伝子によ
りコードされる本発明の目的蛋白質が、形質転換体の細
胞内、細胞外または細胞膜上に発現、生産（蓄積、分
泌）される。

【００８８】該培養に用いられる培地としては、採用し
た宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利
用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施で
きる。

【００８９】かくして得られる本発明の組換え蛋白質
は、所望により、その物理的性質、化学的性質などを利
用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、
1175-1259 頁、第１版第１刷、1980年 6月23日株式会社
東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274 (198
6); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)など参照〕に
より分離、精製できる。

【００９０】該方法としては、具体的には、通常の再構
成処理、蛋白沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、
浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、分子篩クロ
マトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロ
マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これ
らの組合せが例示でき、特に好ましい方法としては、本
発明蛋白質に対する特異的な抗体を結合させたカラムを
利用したアフィニティクロマトグラフィーなどを例示す
ることができる。

【００９１】尚、本発明蛋白質をコードする所望の遺伝
子の設計に際しては、配列番号：３または４に示される
Ｓｐｒｅｄ遺伝子の塩基配列を良好に利用することがで
きる。該遺伝子は、所望により、各アミノ酸残基を示す
コドンを適宜選択変更して利用することも可能である。

【００９２】また、Ｓｐｒｅｄ遺伝子でコードされるア
ミノ酸配列において、その一部のアミノ酸残基ないしは
アミノ酸配列を置換、欠失、付加などにより改変する場
合には、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシ
スなどの前記した各種方法により行うことができる。

【００９３】本発明蛋白質は、また、配列番号：１また
は２に示すアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法
により製造することができる。該方法には、通常の液相
法および固相法によるペプチド合成法が包含される。

【００９４】かかるペプチド合成法は、より詳しくは、
アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐
次結合させて鎖を延長させていく所謂ステップワイズエ
ロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメン
トを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング
反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包
含し、本発明蛋白質の合成は、そのいずれによってもよ
い。

【００９５】上記ペプチド合成に採用される縮合法も、
常法に従うことができ、例えば、アジド法、混合酸無水
物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰ
Ａ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物
（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ
サクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−
２，３−ジカルボキシイミドなど）法、ウッドワード法
などを例示できる。

【００９６】これら各方法に利用できる溶媒も、この種
ペプチド縮合反応に使用されることのよく知られている
一般的なものから適宜選択することができる。その例と
しては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメ
チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホロアミ
ド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸
エチルなどおよびこれらの混合溶媒などを挙げることが
できる。

【００９７】尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応
に関与しないアミノ酸乃至ペプチドにおけるカルボキシ
ル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエス
テル、エチルエステル、第３級ブチルエステルなどの低
級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メ
トキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステル
などのアラルキルエステルなどとして保護することがで
きる。

【００９８】また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例
えばチロシン残基の水酸基は、アセチル基、ベンジル
基、ベンジルオキシカルボニル基、第３級ブチル基など
で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護を行う必要
はない。更に、例えばアルギニン残基のグアニジノ基
は、ニトロ基、トシル基、ｐ−メトキシベンゼンスルホ
ニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシ
カルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダ
マンチルオキシカルボニル基などの適当な保護基により
保護することができる。

【００９９】上記保護基を有するアミノ酸、ペプチドお
よび最終的に得られる本発明蛋白質におけるこれら保護
基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還
元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭
化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メ
タンスルホン酸などを用いる方法などに従って実施する
ことができる。

【０１００】かくして得られる本発明蛋白質は、前記し
た各種の方法、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグ
ラフィー、ゲルクロマトグラフィー、向流分配法などの
ペプチド化学の分野で汎用される方法に従って、適宜精
製を行うことができる。

【０１０１】本発明Ｓｐｒｅｄ蛋白質は、その特異抗体
を作成するための免疫抗原としても好適に利用でき、こ
の抗原を利用することにより、所望の抗血清（ポリクロ
ーナル抗体）およびモノクローナル抗体を取得すること
ができる。

【０１０２】該抗体の製造法自体は、当業者によく理解
されているところであり、本発明においてもこれら常法
に従うことができる〔例えば、続生化学実験講座「免疫
生化学研究法」、日本生化学会編（1986）など参照〕。

【０１０３】かくして得られる抗体は、例えばＳｐｒｅ
ｄ蛋白の精製およびその免疫学的手法による測定ないし
は識別などに有利に利用することができる。

【０１０４】また、本発明のＳｐｒｅｄ遺伝子発現産
物、またはＳｐｒｅｄポリペプチドおよびそれらの部分
は、ＭＡＰキナーゼ活性を抑制する作用或いはＲａｆ活
性を抑制する作用、あるいは細胞の分化を抑制する作用
を有することから、例えば抗腫瘍剤として臨床応用でき
ると考えられる。また前記Ｓｐｒｅｄ遺伝子のＤＮＡ分
子発現産物の発現を増強するか、あるいはＳｐｒｅｄポ
リペプチドの生物活性を増強する化合物(アクチベータ
ー)は、強い抗癌作用を有すると考えられ、これらも抗
腫瘍剤として臨床応用できると考えられる。また上記作
用を有する化合物は該化合物を有効成分とする抗腫瘍剤
はとして、前記Ｓｐｒｅｄ遺伝子発現産物、またはＳｐ
ｒｅｄポリペプチドを有効成分として使用する抗腫瘍剤
と併用することにより、医薬組成物としても有用であ
る。

【０１０５】前記ＭＡＰキナーゼ活性を抑制するか、Ｒ
ａｆ活性を抑制するか、あるいは細胞の分化を抑制する
作用を有する化合物には、低分子化合物、高分子化合
物、Ｓｐｒｅｄポリペプチドの変異体(Ｓｐｒｅｄのア
ミノ酸配列の一部のアミノ酸が、付加、欠失、挿入また
は置換された修飾されたポリペプチド)、センス鎖ＤＮ
Ａ分子、等が包含される。

【０１０６】上記において、Ｓｐｒｅｄポリペプチドを
有効成分として使用する抗腫瘍剤としての抗癌効果また
は抗腫瘍効果は、例えはイン・ビトロ試験において、Ｍ
ＫＮ４５細胞、ＣａＲ−３細胞、ＨＢＣ−４細胞、Ｕ−
２６６細胞などのヒト癌細胞株にトランスフェクトさ
せ、癌細胞の分化度の抑制または癌細胞組織の減弱ある
いは癌細胞数の減少効果の有意性により、また、または
イン・ビボ試験においては、例えば動物モデルに癌細胞
を移植後、本発明のＳｐｒｅｄ遺伝子を癌細胞にトラン
スフェクトさせるか、Ｓｐｒｅｄポリペプチドを癌組織
または血管内に投与することによって、癌組織の増大の
程度や減少の程度をコントロールと比較して抗癌効果ま
たは抗腫瘍効果として判定することができる。

【０１０７】医薬組成物において有効成分とする本発明
のＳｐｒｅｄ遺伝子発現産物、またはＳｐｒｅｄポリペ
プチドには、その医薬的に許容される塩もまた包含され
る。かかる塩には、当業界で周知の方法により調製され
る、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウ
ム、マグネシウム、バリウム、アンモニウムなどの無毒
性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム
塩などが包含される。更に上記塩には、本発明蛋白質と
適当な有機酸ないし無機酸との反応による無毒性酸付加
塩も包含される。代表的無毒性酸付加塩としては、例え
ば塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫
酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウ
リン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ
−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、
マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ス
ルホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコル
ビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩およびナプシレートな
どが例示される。

【０１０８】上記医薬組成物は、前記本発明の化合物を
活性成分として、その薬学的有効量を、適当な無毒性医
薬担体ないし希釈剤と共に含有するものが含まれる。

【０１０９】上記医薬組成物（医薬製剤）に利用できる
医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用さ
れる、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面
活性剤、滑沢剤などの希釈剤或は賦形剤などを例示で
き、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜
選択使用される。

【０１１０】特に好ましい本発明医薬製剤は、通常の蛋
白製剤などに使用され得る各種の成分、例えば安定化
剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整
剤、界面活性剤などを適宜使用して調製される。

【０１１１】上記安定化剤としては、例えばヒト血清ア
ルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導
体などを例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤な
どと組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有
効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。

【０１１２】上記Ｌ−アミノ酸としては、特に限定はな
く例えばグリシン、システィン、グルタミン酸などのい
ずれでもよい。

【０１１３】上記糖としても特に限定はなく、例えばグ
ルコース、マンノース、ガラクトース、果糖などの単糖
類、マンニトール、イノシトール、キシリトールなどの
糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖などの二糖
類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コン
ドロイチン硫酸、ヒアルロン酸などの多糖類などおよび
それらの誘導体などを使用できる。

【０１１４】界面活性剤としても特に限定はなく、イオ
ン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用でき、
例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキ
ルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル
系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリ
ド系などを使用できる。

【０１１５】セルロース誘導体としても特に限定はな
く、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシ
エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチル
セルロースナトリウムなどを使用できる。

【０１１６】上記糖類の添加量は、有効成分１μｇ当り
約０．０００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０１〜
１０ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。界面活性剤
の添加量は、有効成分１μｇ当り約０．００００１ｍｇ
程度以上、好ましくは約０．０００１〜０．０１ｍｇ程
度の範囲とするのが適当である。ヒト血清アルブミンの
添加量は、有効成分１μｇ当り約０．０００１ｍｇ程度
以上、好ましくは約０．００１〜０．１ｍｇ程度の範囲
とするのが適当である。アミノ酸は、有効成分１μｇ当
り約０．００１〜１０ｍｇ程度とするのが適当である。
また、セルロース誘導体の添加量は、有効成分１μｇ当
り約０．００００１ｍｇ程度以上、好ましくは約０．０
０１〜０．１ｍｇ程度の範囲とするのが適当である。

【０１１７】本発明医薬製剤中に含まれる有効成分の量
は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００
１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程
度の範囲とするのが適当である。

【０１１８】また本発明医薬製剤中には、各種添加剤、
例えば緩衝剤、等張化剤、キレート剤などをも添加する
ことができる。ここで緩衝剤としては、ホウ酸、リン
酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミ
ン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれら
のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシ
ウム塩などのアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）な
どを例示できる。等張化剤としては、例えば塩化ナトリ
ウム、塩化カリウム、糖類、グリセリンなどを例示でき
る。またキレート剤としては、例えばエデト酸ナトリウ
ム、クエン酸などを例示できる。

【０１１９】本発明医薬製剤は、溶液製剤として使用で
きる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした
後、用時水、生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解
して適当な濃度に調製した後に使用することも可能であ
る。

【０１２０】本発明の医薬製剤の投与単位形態として
は、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表
的なものとしては、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒
剤、カプセル剤などの固体投与形態や、溶液、懸濁剤、
乳剤、シロップ、エリキシルなどの液剤投与形態が含ま
れ、これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、
経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、軟膏剤などに分類さ
れ、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形乃至調製す
ることができる。

【０１２１】例えば、錠剤の形態に成形するに際して
は、上記製剤担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリ
ウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カ
オリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウムなど
の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロッ
プ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキ
シメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、
メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合
剤、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキ
シメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプ
ロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウ
ム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、
炭酸カルシウムなどの崩壊剤、ポリオキシエチレンソル
ビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ス
テアリン酸モノグリセリドなどの界面活性剤、白糖、ス
テアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制
剤、第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム
などの吸収促進剤、グリセリン、デンプンなどの保湿
剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイ
ド状ケイ酸などの吸着剤、精製タルク、ステアリン酸
塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤な
どを使用できる。

【０１２２】更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した
錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィ
ルムコーティング錠とすることができ、また二重錠ない
しは多層錠とすることもできる。

【０１２３】丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担
体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、
硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤、アラビア
ゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結
合剤、ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤などを使用で
きる。

【０１２４】カプセル剤は、常法に従い通常本発明の有
効成分を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質
ゼラチンカプセル、軟質カプセルなどに充填して調整さ
れる。

【０１２５】経口投与用液体投与形態は、慣用される不
活性希釈剤、例えば水、を含む医薬的に許容される溶
液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシルなど
を包含し、更に湿潤剤、乳剤、懸濁剤などの助剤を含ま
せることができ、これらは常法に従い調製される。

【０１２６】非経口投与用の液体投与形態、例えば滅菌
水性乃至非水性溶液、エマルジョン、懸濁液などへの調
製に際しては、希釈剤として例えば水、エチルアルコー
ル、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、
エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イ
ソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタ
ン脂肪酸エステルおよびオリーブ油などの植物油などを
使用でき、また注入可能な有機エステル類、例えばオレ
イン酸エチルなどを配合できる。これらには更に通常の
溶解補助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存
剤、分散剤などを添加することもできる。滅菌は、例え
ばバクテリア保留フィルターを通過させる濾過操作、殺
菌剤の配合、照射処理および加熱処理などにより実施で
きる。また、これらは使用直前に滅菌水や適当な滅菌可
能媒体に溶解することのできる滅菌固体組成物形態に調
製することもできる。

【０１２７】坐剤や膣投与用製剤の形態に成形するに際
しては、製剤担体として、例えばポリエチレングリコー
ル、カカオ脂、高級アルコール、高級アルコールのエス
テル類、ゼラチンおよび半合成グリセライドなどを使用
できる。

【０１２８】ペースト、クリーム、ゲルなどの軟膏剤の
形態に成形するに際しては、希釈剤として、例えば白色
ワセリン、パラフィン、グリセリン、セルロース誘導
体、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、
シリコン、ベントナイトおよびオリーブ油などの植物油
などを使用できる。

【０１２９】経鼻または舌下投与用組成物は、周知の標
準賦形剤を用いて、常法に従い調製することができる。

【０１３０】尚、本発明薬剤中には、必要に応じて着色
剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品な
どを含有させることもできる。

【０１３１】上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がな
く、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾
患の程度などに応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、
液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤は経口投
与され、注射剤は単独でまたはブドウ糖やアミノ酸など
の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応
じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与され、
坐剤は直腸内投与され、経膣剤は膣内投与され、経鼻剤
は鼻腔内投与され、舌下剤は口腔内投与され、軟膏剤は
経皮的に局所投与される。

【０１３２】上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分
の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療
効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条
件などに応じて広範囲より適宜選択される。一般的に
は、該投与量は、通常、１日当り体重１ｋｇ当り、約
０．０１μｇ〜１０ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ
〜１ｍｇ程度とするのがよく、該製剤は１日に１〜数回
に分けて投与することができる。

【０１３３】本発明者らは、後記実施例に示されるよう
に、本発明のヒトＳｐｒｅｄ１またはヒトＳｐｒｅｄ２
は、マウスＳｐｒｅｄ１またはマウスＳｐｒｅｄ２と高
いアミノ酸配列の相同性を有することを見い出した。

【０１３４】本発明ヒトＳｐｒｅｄ遺伝子の全部または
一部のセンス鎖を包含する任意の遺伝子発現ベクターを
作成し、該発現ベクターをこれら組織において強制的に
ヒトＳｐｒｅｄ遺伝子の発現を起こさせることにより、
ＭＡＰキナーゼ活性抑制因子としてのヒトＳｐｒｅｄ遺
伝子の発現増強に基づくＭＡＰキナーゼ活性の抑制作
用、またはＲａｆ活性の抑制作用等の細胞外シグナルに
応じた細胞の増殖と分化に関連するＭＡＰキナーゼ、Ｒ
ａｓ、及びＲａｆを介した情報伝達系の制御作用を有す
る遺伝子治療用組成物として、或いは遺伝子治療剤とし
て利用できると考えられる。

【０１３５】従って、本発明は、Ｓｐｒｅｄ遺伝子の全
部または一部のセンス鎖を含有する遺伝子治療用ベクタ
ーおよび該ベクターによりＳｐｒｅｄ遺伝子のセンス鎖
を導入した細胞を有効成分とする医薬を提供しようとす
るものである。

【０１３６】即ち、本発明によれば、配列番号：３また
は４で示される塩基配列の全部または一部を含むＳｐｒ
ｅｄ遺伝子のセンス鎖を含有する遺伝子治療用導入用ベ
クターおよび該ベクターによりＳｐｒｅｄ遺伝子センス
鎖を導入した細胞、並びに該遺伝子治療用導入用ベクタ
ーおよび該ベクターによりＳｐｒｅｄ遺伝子センス鎖を
導入した細胞を有効成分とする遺伝子治療剤が提供され
る。

【０１３７】また、本発明によれば、配列番号：３また
は４で示される塩基配列の全部または一部のセンス鎖を
含むＳｐｒｅｄ遺伝子センス鎖を含有する遺伝子治療用
導入用ベクターおよび該ベクターによりＳｐｒｅｄ遺伝
子センス鎖を導入した細胞を、例えば癌患者の癌細胞と
相互作用させるため、癌患者の癌組織内または患者の血
管内に投与することによってこれら癌組織におけるＭＡ
Ｐキナーゼ活性の抑制作用、またはＲａｆ活性の抑制作
用に基づく抗腫瘍作用、あるいはこれら細胞におけるＳ
ｐｒｅｄ遺伝子の発現量を増加させることを特徴とする
癌患者の腫瘍の進展抑制剤およびＭＡＰキナーゼ活性抑
制剤、またはＲａｆ活性抑制剤、或いは癌細胞の分化を
抑制する抗腫瘍剤を提供することができる。同様に本発
明のＳｐｒｅｄ遺伝子センス鎖を導入した細胞を有効成
分とする遺伝子治療剤の提供により、ＭＡＰキナーゼ活
性抑制剤、またはＲａｆ活性抑制剤、或いは癌細胞の分
化を抑制する抗腫瘍剤に係る薬剤の提供が可能である。

【０１３８】更にまた、本発明によれば、上記ヒトＳｐ
ｒｅｄ遺伝子センス鎖を含有する遺伝子治療用導入用の
ウイルスベクターを有効成分として含有する医薬、特
に、ＭＡＰキナーゼ活性抑制作用、またはＲａｆ活性抑
制作用に基づく遺伝子の転写を促進するための処置等に
使用される当該医薬が提供される。

【０１３９】以下、かかる遺伝子治療につき詳述する。
尚、以下の遺伝子治療の実施においては、特記しないか
ぎり、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺
伝学、および免疫学の慣用的な方法を用いることができ
る。これらは、例えばマニアティス(Maniatis,T., et a
l., Molecular cloning: A laboratory manual (ColdSp
ring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Yo
rk (1982))、サムブルック(Sambrook,J., et al.,Molec
ular cloning: A laboratory manual, 2nd Ed. (Cold S
pring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Y
ork (1981))、アウスベル(Ausbel,F.M., et al., Curre
nt Protocols in Molecular Biology,John Wiley and S
ons, New York, New York,(1992))、グローバー(Glove
r,D.,DNA Cloning,I and II(Oxford Press)(1985))、ア
ナンド(Anand,Techniques forthe Analysis of Complex
Genomes,(Academic Press(1992))、グスリー(Guthrie,
G., et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular
Biology, (Academic Press)(1991))およびフィンク(Fin
k,et al., Hum. Gene Ther., 3, 11-19(1992)に記載さ
れている。

【０１４０】本発明の遺伝子治療によれば、本発明ヒト
Ｓｐｒｅｄ遺伝子の発現する細胞において、細胞内のm
ＲＮＡに対して相補的配列を作り出し、翻訳を促し、Ｓ
ｐｒｅｄ遺伝子の発現を増強するためのセンス医薬の提
供によるＭＡＰキナーゼ活性抑制作用、またはＲａｆ活
性抑制作用に基づく遺伝子の転写の促進の処置等に使用
される当該医薬が提供される。

【０１４１】上記センス・オリゴヌクレオチドを用いた
癌患者に対する遺伝子治療によれば、レトロウイルス、
アデノウイルス、ＡＡＶ由来のベクターに該センス・オ
リゴヌクレオチドを組み込み、これを癌細胞に感染させ
てセンス・オリゴヌクレオチドを過剰発現させることに
より、所望の抗腫瘍効果を得ることが出来る。

【０１４２】このように癌細胞にセンス・オリゴヌクレ
オチドを導入してＳｐｒｅｄ蛋白の発現を促進させる場
合、当該センス・オリゴヌクレオチドはＳｐｒｅｄ遺伝
子の全長に対応するものである必要はなく、例えば該Ｓ
ｐｒｅｄ遺伝子の発現機能を促進する機能と実質的に同
質な機能を保持する限りにおいて、前記した改変体であ
っても、また特定の機能を保持した一部配列からなる遺
伝子を使用することもできる。

【０１４３】かかる組換えおよび染色体外維持の双方の
ための所望遺伝子の導入のためのベクターは、当該分野
において既に知られており、本発明ではかかる既知のベ
クターのいずれもが使用できる。例えば、発現制御エレ
メントに連結したＳｐｒｅｄのセンス・オリゴヌクレオ
チドのコピーを含み、かつ目的の細胞内で当該センス・
オリゴヌクレオチド産物を発現できるウイルスベクター
またはプラスミドベクターを挙げることができる。かか
るベクターとして、通常前述する発現用ベクターを利用
することもできるが、好適には、例えば起源ベクターと
して、米国特許第５２５２４７９号明細書およびＰＣＴ
国際公開ＷＯ９３／０７２８２号明細書に開示されたベ
クター（ｐＷＰ−７Ａ、ｐｗＰ−１９、ｐＷＵ−１、ｐ
ＷＰ−８Ａ、ｐＷＰ−２１および／またはｐＲＳＶＬな
ど）またはｐＲＣ／ＣＭＶ（Invitrogen社製）などを用
いて、調製されたベクターを挙げることができる。より
好ましくは、後述する各種ウイルス・ベクターである。

【０１４４】なお、遺伝子導入治療において用いられる
ベクターに使用されるプロモーターとしては、各種疾患
の治療対象となる患部組織に固有のものを好適に利用す
ることができる。

【０１４５】その具体例としては、例えば、肝臓に対し
ては、アルブミン、α−フェトプロティン、α１−アン
チトリプシン、トランスフェリン、トランススチレンな
どを例示できる。結腸に対しては、カルボン酸アンヒド
ラーゼＩ、カルシノエンブロゲンの抗原などを例示でき
る。子宮および胎盤に対しては、エストロゲン、アロマ
ターゼサイトクロームＰ４５０、コレステロール側鎖切
断Ｐ４５０、１７アルファーヒドロキシラーゼＰ４５０
などを例示できる。

【０１４６】前立腺に対しては、前立腺抗原、ｇｐ９１
−フォックス遺伝子、前立腺特異的カリクレインなどを
例示できる。乳房に対しては、ｅｒｂ−Ｂ２、ｅｒｂ−
Ｂ３、β−カゼイン、β−ラクトグロビン、乳漿蛋白質
などを例示できる。肺に対しては、活性剤蛋白質Ｃウロ
グロブリンなどを例示できる。皮膚に対しては、Ｋ−１
４−ケラチン、ヒトケラチン１または６、ロイクリンな
どを例示できる。

【０１４７】脳に対しては、神経膠繊維質酸性蛋白質、
成熟アストロサイト特異蛋白質、ミエリン塩基性蛋白
質、チロシンヒドロキシラーゼなどを例示できる。膵臓
においては、ヴィリン、グルカゴン、ランゲルハンス島
アミロイドポリペプチドなどを例示できる。甲状腺に対
しては、チログロブリン、カルシトニンなどを例示でき
る。骨に対しては、α１コラーゲン、オステオカルシ
ン、骨シアログリコプロティンなどを例示できる。腎臓
に対してはレニン、肝臓／骨／腎臓アルカリ性ホスフォ
ターゼ、エリスロポエチンなどを、膵臓に対しては、ア
ミラーゼ、ＰＡＰ１などを例示できる。

【０１４８】なおセンス・オリゴヌクレオチド導入用ベ
クターの製造において、導入されるセンス・オリゴヌク
レオチド（Ｓｐｒｅｄ遺伝子配列に対応する逆相補配列
全部または一部）は、本発明のＳｐｒｅｄ遺伝子の塩基
配列情報に基づいて、前記の如く、一般的遺伝子工学的
手法により容易に製造・取得することができる。

【０１４９】かかるセンス・オリゴヌクレオチド導入用
ベクターの細胞への導入は、例えばエレクトロポレーシ
ョン、リン酸カルシウム共沈法、ウイルス形質導入、遺
伝子銃などを始めとする、細胞にＤＮＡを導入する当該
分野において既に知られている各種の方法に従って行う
ことができる。なお、Ｓｐｒｅｄ のセンス・オリゴヌ
クレオチドで形質転換された細胞は、それ自体単離状態
でＭＡＰキナーゼ活性やＲａｆ活性、あるいは細胞の分
化を抑制するための医薬や、治療研究のためのモデル系
として利用することも可能である。

【０１５０】遺伝子治療においては、上記のセンス・オ
リゴヌクレオチド導入用ベクターは、患者の対象とする
組織部位に局所的にまたは全身的に注射投与することに
より患者の標的細胞内に導入することができる。この際
全身的投与によれば、他の部位にＳｐｒｅｄｍＲＮＡが
発現し得るいずれの細胞にも到達させることができる。
形質導入された遺伝子が各標的細胞の染色体内に恒久的
に取り込まれない場合には、該投与を定期的に繰り返す
ことによって達成できる。

【０１５１】本発明の遺伝子治療方法は、前述するセン
ス・オリゴヌクレオチド導入用の材料（センス・オリゴ
ヌクレオチド導入用ベクター）を直接体内に投与するイ
ンビボ（in vivo）法と、患者の体内より一旦標的とす
る細胞を取り出して体外で遺伝子を導入して、その後、
該細胞を体内に戻すエクスビボ（ex vivo）法の両方の
方法を包含する。

【０１５２】またＳｐｒｅｄのセンス・オリゴヌクレオ
チドを直接細胞内に導入し、ＲＮＡ鎖を切断する活性分
子であるリボザイムによる遺伝子治療も可能である。

【０１５３】センス・オリゴヌクレオチドを導入する標
的細胞は、遺伝子治療（処置）の対象により適宜選択す
ることができる。例えば、標的細胞として、特に脳・神
経組織、脳細胞、脳神経細胞の他、Ｓｐｒｅｄ発現が認
められる組織の細胞、心臓、胎盤、肺、肝臓、膵臓、脾
臓、小腸、末梢血組織以外に、神経細胞、リンパ球、線
維芽細胞、肝細胞、造血幹細胞、如き細胞などを挙げる
ことができる。

【０１５４】上記遺伝子治療におけるセンス・オリゴヌ
クレオチド導入方法には、ウイルス的導入方法および非
ウイルス的導入方法が含まれる。

【０１５５】ウイルス的導入方法としては、例えば、Ｓ
ｐｒｅｄ のセンス・オリゴヌクレオチドが正常細胞に
発現する外来の物質であることに鑑みて、ベクターとし
てレトロウイルスベクターを用いる方法を挙げることが
できる。その他のウイルスベクターとしては、アデノウ
イルスベクター、ＨＩＶ（human immunodeficiency vir
us）ベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ，
adeno-associated virus）、ヘルペスウイルスベクタ
ー、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターおよびエ
プスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ，Epstein-Barr vir
us）ベクターなどがあげられる。

【０１５６】非ウイルス的な遺伝子導入方法としては、
リン酸カルシウム共沈法；ＤＮＡを封入したリポソーム
と予め紫外線で遺伝子を破壊した不活性化センダイウイ
ルスを融合させて膜融合リポソームを作成し、細胞膜と
直接融合させてＤＮＡを細胞内に導入する膜融合リポソ
ーム法〔Kato,K.,et al., J. Biol .Chem., 266, 22071
-22074 (1991)〕；プラスミドＤＮＡを金でコートして
高圧放電によって物理的に細胞内にＤＮＡを導入する方
法〔Yang,N.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87,9
568-9572 (1990)〕；プラスミドＤＮＡを直接インビボ
で臓器や腫瘍に注入するネイキッド（naked）ＤＮＡ法
〔Wolff,J.A.,et al. Science, 247,1465-1467 (199
0)〕；多重膜正電荷リポソームに包埋した遺伝子を細胞
に導入するカチオニック・リポソーム法〔八木国夫, 医
学のあゆみ, Vol.175,No.9,635-637 (1995)〕；特定細
胞のみに遺伝子を導入し、他の細胞に入らないようにす
るために、目的とする細胞に発現するレセプターに結合
するリガンドをＤＮＡと結合させてそれを投与するリガ
ンド−ＤＮＡ複合体法〔Frindeis,et al.,Trends Biote
chnol.,11,202 (1993); Miller,et al.,FASEB J.,9,190
(1995)〕などを使用することができる。

【０１５７】上記リガンド−ＤＮＡ複合体法には、例え
ば肝細胞が発現するアシアロ糖蛋白レセプターをターゲ
ットとしてアシアロ糖蛋白をリガンドとして用いる方法
〔Wu, et al.,J.Biol. Chem., 266,14338 (1991); Ferk
ol,et al.,FASEB J.,7,1081-1091 (1993)〕などが含ま
れる。

【０１５８】本発明の遺伝子治療において、所望遺伝子
の標的細胞または標的組織への導入方法には、代表的に
は２種類の方法が含まれる。

【０１５９】その第１法は、治療対象とする患者から標
的細胞を採取した後、該細胞を体外で例えばインターロ
イキン−２(ＩＬ−２)などの添加の下で培養し、レトロ
ウイルスベクターに含まれる目的とするＳｐｒｅｄ を
センス・オリゴヌクレオチド導入した後、得られる細胞
を再移植する手法(ex vivo法)である。該方法はＡＤＡ
欠損症を始め、欠陥遺伝子によって発生する遺伝子病や
癌、動脈硬化症、ＡＩＤＳなどの治療に好適であると報
告されている。

【０１６０】第２法は、目的センス・オリゴヌクレオチ
ド（Ｓｐｒｅｄ センス・オリゴヌクレオチド）を直接
患者の肝臓内や門脈内、血管組織などの標的部位に注入
する遺伝子直接導入法(直接法)である。

【０１６１】上記遺伝子治療の第１法は、より詳しく
は、例えば次のようにして実施される。即ち、患者から
採取した単核細胞を血液分離装置を用いて単球から分取
し、分取細胞をＩＬ−２の存在下にＡＩＭ−Ｖ培地など
の適当な培地で７２時間程度培養し、導入すべきセンス
・オリゴヌクレオチド（Ｓｐｒｅｄ センス・オリゴヌ
クレオチド）を含有するベクターを加える。 センス・
オリゴヌクレオチドの導入効率をあげるために、プロタ
ミン存在下に３２℃で１時間、２５００回転にて遠心分
離した後、３７℃で１０％炭酸ガス条件下で２４時間培
養してもよい。この操作を数回繰り返した後、更にＩＬ
−２存在下にＡＩＭ−Ｖ培地などで４８時間培養し、細
胞を生理食塩水で洗浄し、生細胞数を算定し、センス・
オリゴヌクレオチド導入効率を前記in situ ＰＣＲや、
例えば所望の対象が-本発明のようにＳｐｒｅｄ活性(転
写活性)であればその活性の程度を測定することによ
り、目的センス・オリゴヌクレオチド導入効果を確認す
る。

【０１６２】また、培養細胞中の細菌・真菌培養、マイ
コプラズマの感染の有無、エンドトキシンの検索などの
安全度のチェックを行い、安全性を確認した後、予測さ
れる効果用量のセンス・オリゴヌクレオチド（Ｓｐｒｅ
ｄ センス・オリゴヌクレオチド）が導入された培養細
胞を患者に点滴静注により戻す。かかる方法を例えば数
週間から数カ月間隔で繰り返することにより遺伝子治療
が施される。

【０１６３】ここでウイルスベクターの投与量は、導入
する標的細胞により適宜選択される。通常、ウイルス価
として、例えば標的細胞 １×１０⁸細胞に対して１×１
０³ｃｆｕから１×１０⁸ｃｆｕの範囲となる投与量を採
用することが好ましい。

【０１６４】上記第１法の別法として、目的センス・オ
リゴヌクレオチド（Ｓｐｒｅｄ センス・オリゴヌクレ
オチド）を含有するレトロウイルスベクターを含有する
ウイルス産生細胞と例えば患者の細胞とを共培養して、
目的とする細胞へセンス・オリゴヌクレオチド（Ｓｐｒ
ｅｄ センス・オリゴヌクレオチド）を導入する方法を
採用することもできる。

【０１６５】遺伝子治療の第２法（直接法）の実施に当
たっては、特に体外における予備実験によって、遺伝子
導入法によって、実際に目的センス・オリゴヌクレオチ
ド（Ｓｐｒｅｄ センス・オリゴヌクレオチド）が導入
されるか否かを、予めベクター遺伝子ｃＤＮＡのＰＣＲ
法による検索やin situＰＣＲ法によって確認するか、
あるいは目的センス・オリゴヌクレオチド（Ｓｐｒｅｄ
センス・オリゴヌクレオチド）の導入に基づく所望の
治療効果である特異的活性の上昇や標的細胞の増殖増加
や増殖抑制などを確認することが望ましい。また、ウイ
ルスベクターを用いる場合は、増殖性レトロウイルスな
どの検索をＰＣＲ法で行うか、逆転写酵素活性を測定す
るか、あるいは膜蛋白(env)遺伝子をＰＣＲ法でモニタ
ーするなどにより、遺伝子治療に際してセンス・オリゴ
ヌクレオチド導入による安全性を確認することが重要で
あることはいうまでもない。

【０１６６】本発明はまた、本発明のセンス・オリゴヌ
クレオチド導入用ベクターまたは目的センス・オリゴヌ
クレオチド（Ｓｐｒｅｄセンス・オリゴヌクレオチド
ど）が導入された細胞を活性成分とし、それを薬学的有
効量、適当な無毒性医薬担体ないしは希釈剤と共に含有
する医薬組成物または医薬製剤（遺伝子治療剤）を提供
する。

【０１６７】本発明の医薬組成物（医薬製剤）に利用で
きる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使
用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、
表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤ないし賦形剤などを例
示でき、これらは得られる製剤の投与単位形態に応じて
適宜選択使用できる。

【０１６８】例えば、本発明のセンス・オリゴヌクレオ
チド導入用ベクターを含む医薬製剤は、該ベクターをリ
ポソームに包埋された形態あるいは所望のセンス・オリ
ゴヌクレオチドが包含されるレトロウイルスベクターを
含むウイルスによって感染された培養細胞の形態に調製
される。

【０１６９】これらは、リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ
７．４）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合
した形態などに調製することもでき、またプロタミンな
どの遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるよう
な形態に調製することもできる。

【０１７０】上記医薬製剤の投与方法は、特に制限がな
く、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾
患の程度などに応じて決定される。

【０１７１】上記医薬製剤中に含有されるべき有効成分
の量およびその投与量は、特に限定されず、所望の治療
効果、投与法、治療期間、患者の年齢、性別その他の条
件などに応じて広範囲より適宜選択される。

【０１７２】一般には、医薬製剤としての所望センス・
オリゴヌクレオチド含有レトロウイルスベクターの投与
量は、１日当り体重１ｋｇ当り、例えばレトロウイルス
の力価として約１×１０³ｐｆｕから１×１０¹⁵ｐｆｕ
程度とするのがよい。

【０１７３】また所望の導入用センス・オリゴヌクレオ
チドが導入された細胞の場合は、１×１０⁴細胞／body
から１×１０¹⁵細胞／body程度の範囲から選ばれるのが
適当である。

【０１７４】該製剤は１日に１回または数回に分けて投
与することもでき、１から数週間間隔で間欠的に投与す
ることもできる。尚、好ましくは、プロタミンなど遺伝
子導入効率を高める物質またはこれを含む製剤と併用投
与することができる。

【０１７５】また本発明によれば、ヒトＳｐｒｅｄ遺伝
子の存在を検出するために、血液または血清のごとき生
物学的試料を調製し、所望により核酸を抽出し、ヒトＳ
ｐｒｅｄ遺伝子が存在するか否かについて分析すること
が可能である。 該検出方法は、例えば、ヒトＳｐｒｅ
ｄのＤＮＡ断片を作成し、ヒトＳｐｒｅｄ遺伝子のスク
リーニングおよび／またはその増幅に用いられるように
設計される。より具体的には、例えばプラークハイブリ
ダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サ
ザンブロット法、ノーザンブロット法などにおけるプロ
ーブとしての性質を有するもの、核酸配列をポリメラー
ゼで増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、
増幅したＳｐｒｅｄの全部または一部のＤＮＡ断片を得
ることができるためのプローブとしての性質を有するも
のを作成できる。そのためにはまずヒトＳｐｒｅｄと同
じ配列を持つプライマーを作成し、スクリーニング用プ
ローブとして用い、生物学的試料（核酸試料）と反応さ
せることにより、当該ヒトＳｐｒｅｄ配列を有する遺伝
子の存在を確認することができる。該核酸試料は、標的
配列の検出を容易にする種々の方法、例えば変性、制限
消化、電気泳動またはドットブロッティングで調製して
もよい。

【０１７６】前記スクリーニング方法としては、特にＰ
ＣＲ法を用いるのが感度の点から好ましく、該方法は、
Ｓｐｒｅｄ断片をプライマーとして用いる方法であれば
とくに制限されず、従来公知の方法(Science, 230, 135
0-1354(1985))や新たに開発された、或いは将来使用さ
れるＰＣＲ変法(榊 佳之、ほか編、羊土社、実験医学、
増刊, 8(9)(1990); 蛋白質・核酸・酵素、臨時増刊、共
立出版(株), 35(17)(1990))のいずれも利用することが
可能である。

【０１７７】プライマーとして使用されるＤＮＡ断片
は、化学合成したオリゴＤＮＡであり、これらオリゴＤ
ＮＡの合成は自動ＤＮＡ合成装置など、例えばＤＮＡ合
成装置(PharmaciaLKB Gene Assembler Plus: ファルマ
シア社製)を使用して合成することができる。合成され
るプライマー(５'−プライマーまたは３'−プライマー)
の長さは約１０〜３０ヌクレオチド程度が好ましく例示
できる。上記スクリーニングに用いられるプローブは、
通常は標識したプローブを用いるが、非標識であっても
よく、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異
的結合によって検出してもよい。適当な標識、並びにプ
ローブおよびリガンドを標識する方法は、本発明の技術
分野で知られており、ニック・トランスレーション、ラ
ンダム・プライミングムまたはキナーゼ処理のような、
既知の方法によって取り込ませることができる放射性標
識、ビオチン、蛍光性基、化学発光基、酵素、抗体など
がこれらの技術に包含される。

【０１７８】検出のために用いるＰＣＲ法としては、例
えばＲＴ−ＰＣＲ法が例示されるが、当該分野で用いら
れる種々の変法を適応することができる。

【０１７９】さらに本発明のヒトＳｐｒｅｄ遺伝子の利
用において、ヒトＳｐｒｅｄ遺伝子の発現レベルやヒト
Ｓｐｒｅｄ遺伝子のポリモルフィズム（多型：個人差）
を調べることにより（ヒトＳｐｒｅｄの遺伝子診断）、
薬剤の選択を始めとする治療法の選択のための診断・分
析（より副作用の少ない治療法の選択を促す）に有用で
ある。

【０１８０】一般に、ヒトの薬物代謝には、大きな個人
差があることが知られているが、この個人差を判定する
ことは、ヒトに投与される薬物による副作用の軽減や、
負っている疾患の治療法の選択のために有用である。

【０１８１】また、本発明の測定方法は、試料中のＳｐ
ｒｅｄ遺伝子の検出のための試薬キットを利用すること
によって、簡便に実施することができる。

【０１８２】故に本発明は上記ヒトＳｐｒｅｄの ＤＮ
Ａ断片を含有することを特徴とするヒトＳｐｒｅｄの検
出用試薬キットが提供される。

【０１８３】該試薬キットは、少なくとも配列番号：３
または４に示される塩基配列もしくはその相補的塩基配
列の一部または全てにハイブリダイズするＤＮＡ断片を
必須構成成分として含んでいれば、他の成分として、標
識剤、ＰＣＲ法に必須な試薬（例えば、ＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、プライマ
ーなど）が含まれていてもよい。

【０１８４】標識剤としては、放射性同位元素または蛍
光物質などの化学修飾物質などが挙げられるが、ＤＮＡ
断片自身が予め該標識剤でコンジュゲートされていても
よい。更に当該試薬キットには、測定の実施の便益のた
めに適当な反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反
応停止液などが含まれていてもよい。

【０１８５】更に本発明は、前記測定方法を用いるヒト
Ｓｐｒｅｄ遺伝子の多型検出方法および該方法に用いる
診断剤並びに診断用キットをも提供するものである。

【０１８６】また、前記方法を用いることにより、被検
試料中から得られたヒトＳｐｒｅｄ配列を直接的若しく
は間接的に配列決定することにより、野生型Ｓｐｒｅｄ
と相同性の高い相同物である新たなヒトＳｐｒｅｄ遺伝
子に関連する関連遺伝子を見出すことができる。

【０１８７】従って、本発明はかかる測定と被検試料中
のヒトＳｐｒｅｄの ＤＮＡの配列決定により、被検試
料中のヒトＳｐｒｅｄ遺伝子に関連する関連遺伝子のス
クリーニング方法をも提供するものである。

【０１８８】また、本発明の配列番号：１または２で示
されるヒトＳｐｒｅｄ遺伝子でコードされる蛋白質、ま
たは該配列番号：１または２において、少なくとも１以
上の、或いは１もしくは数個乃至複数個のアミノ酸が欠
失、置換または付加されたアミノ酸配列、またはこれら
の断片から蛋白質を合成し、もしくは該蛋白質に対する
抗体を合成することによって、野生型Ｓｐｒｅｄおよび
／または変異Ｓｐｒｅｄの測定が可能となる。

【０１８９】従って、本発明は、ヒト野生型Ｓｐｒｅｄ
および／またはヒト変異Ｓｐｒｅｄの抗体測定法、抗原
測定法を提供するものである。かかる変化は、この分野
における前記慣用技術によるヒトＳｐｒｅｄ配列分析に
よっても決定できるが、更に好ましくは、抗体(ポリク
ローナルまたはモノクローナル抗体)を用いて、ヒトＳ
ｐｒｅｄ蛋白質中の相違、またはヒトＳｐｒｅｄ蛋白質
の有無を検出することができる。本発明の測定法の具体
的な例示としては、ヒトＳｐｒｅｄ抗体は、血液・血清
などのヒトより採取した生体材料試料含有溶液からＳｐ
ｒｅｄ蛋白質を免疫沈降し、かつポリアクリルアミドゲ
ルのウェスタン・ブロットまたはイムノブロット上でヒ
トＳｐｒｅｄ蛋白質と反応することができる。また、ヒ
トＳｐｒｅｄ抗体は免疫組織化学的技術を用いてパラフ
ィンまたは凍結組織切片中のヒトＳｐｒｅｄ蛋白質を検
出することができる。

【０１９０】抗体産生技術および精製する技術は当該分
野においてよく知られているので、これらの技術を適宜
選択することができる。

【０１９１】ヒト野生型Ｓｐｒｅｄまたはその突然変異
体を検出する方法に関連するより好ましい具体例には、
モノクローナル抗体および／または、ポリクローナル抗
体を用いるサンドイッチ法を含む、酵素結合イムノソル
ベントアッセイ(ＥＬＩＳＡ)、放射線免疫検定法(ＲＩ
Ａ)、免疫放射線検定法(ＩＲＭＡ)、および免疫酵素法
(ＩＥＭＡ)が含まれる。

【０１９２】また、本発明は、ヒトＳｐｒｅｄ蛋白に対
するヒトＳｐｒｅｄ結合活性を有する細胞膜画分または
細胞表面上に存在するヒトＳｐｒｅｄレセプターをも提
供することが可能である。該ヒトＳｐｒｅｄレセプター
の取得は、細胞膜画分を含む生体材料試料中において標
識したヒトＳｐｒｅｄ蛋白をコンジュゲートさせ、ヒト
Ｓｐｒｅｄ結合反応物を抽出・単離、精製し、単離物の
アミノ酸配列を特定することによって達成され、該ヒト
Ｓｐｒｅｄレセプター蛋白の取得並びに配列決定は、こ
の分野の当業者には容易に達成できる。

【０１９３】また本発明は、ヒトＳｐｒｅｄレセプター
蛋白質またはその結合断片を種々の薬剤のいずれかをス
クリーニングする技術に用いることによって、化合物
(ヒトＳｐｒｅｄレセプター反応物：化合物は低分子化
合物、高分子化合物、蛋白質、蛋白質部分断片、抗原、
または抗体など言う)をスクリーニングすることに利用
可能である。好ましくは、ヒトＳｐｒｅｄレセプターを
利用する。かかるスクリーニング試験に用いるヒトＳｐ
ｒｅｄレセプターポリペプチドまたはその断片は、固体
支持体に付着するか、または細胞表面に運ばれている溶
液中の遊離物であってもよい。

【０１９４】薬剤スクリーニングの一例としては、例え
ば、ヒトＳｐｒｅｄ蛋白質またはその断片を発現する組
換え蛋白質で安定して形質転換した原核生物または真核
生物の宿主細胞を、好ましくは競合的結合アッセイにお
いて利用することができる。また遊離のまたは固定した
形態のかかる細胞を標準結合アッセイに用いることもで
きる。より具体的には、ヒトＳｐｒｅｄレセプター蛋白
質またはその断片と、試験する物質との間の複合体の形
成を測定し、ヒトＳｐｒｅｄレセプター蛋白質またはそ
の断片とヒトＳｐｒｅｄ蛋白質またはその断片との間の
複合体の形成が、試験する物質によって阻害される程度
を検出することによって化合物をスクリーニングするこ
とが可能である。

【０１９５】かくして、本発明は、当該分野で既知の方
法によって、かかる物質とヒトＳｐｒｅｄレセプター蛋
白質またはその断片とを接触させ、次いで、該物質とヒ
トＳｐｒｅｄレセプター蛋白質またはその断片との間の
複合体の存在、またはヒトＳｐｒｅｄレセプター蛋白質
またはその断片とリガンドとの間の複合体の存在につい
て測定することを特徴とする薬剤のスクリーニング方法
を提供することができる。さらに、ＭＡＰキナーゼある
いはＲａｆ活性を測定して、かかる物質がヒトＳｐｒｅ
ｄレセプターを阻害でき、かくして上記定義されたＭＡ
ＰキナーゼあるいはＲａｆ活性などの作用を調節できる
かどうか、或いは蛋白−蛋白相互結合の調節または複合
体形成能の調節ができるかどうか判断する。かかる競合
結合アッセイにおいて、より具体的には、ヒトＳｐｒｅ
ｄレセプター蛋白質またはその断片を標識する。遊離の
ヒトＳｐｒｅｄレセプター蛋白質またはその断片を、蛋
白質：蛋白質複合体で存在するものから分離し、遊離
（複合体未形成）標識の量は、各々、試験される因子の
ヒトＳｐｒｅｄレセプターに対する結合またはヒトＳｐ
ｒｅｄレセプター：Ｓｐｒｅｄ蛋白質結合の阻害の尺度
となる。ヒトＳｐｒｅｄ蛋白質の小さなペプチド(ペプ
チド疑似体)をこのように分析し、ヒトＳｐｒｅｄレセ
プター阻害活性を有するものを測定できる。

【０１９６】本発明において、薬剤スクリーニングのた
めの他の方法は、ヒトＳｐｒｅｄレセプター蛋白質に対
して適当な結合親和性を有する化合物についてのスクリ
ーニング法であって、該略すると、多数の異なるペプチ
ド試験化合物をプラスチックのピンまたは他の物質の表
面のごとき固体支持体上で合成し、次いでペプチド試験
化合物をヒトＳｐｒｅｄレセプター蛋白質と反応させ、
洗浄する。次いで既知の方法を用いて反応結合Ｓｐｒｅ
ｄヒトレセプター蛋白質を検出する方法も例示できる
（ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ８４−０３５６４号）。精
製されたヒトＳｐｒｅｄレセプターは、直接、前記の薬
剤スクリーニング技術で使用するプレート上に被覆する
ことができる。しかしながら、ポリペプチドに対する非
−中和抗体を用いて抗体を補足し、ヒトＳｐｒｅｄレセ
プター蛋白質を固相上に固定することができる。さらに
本発明は、競合薬剤スクリーニングアッセイの使用をも
目的とし、ヒトＳｐｒｅｄレセプター蛋白質またはその
断片に対する結合性につき、ヒトＳｐｒｅｄレセプター
蛋白質に特異的に結合できる中和抗体と試験化合物とを
競合させる。抗体による該競合によって、ヒトＳｐｒｅ
ｄレセプター蛋白質の１またはそれ以上の抗原決定部位
を有するいずれのペプチドの存在をも検出することが可
能である。

【０１９７】また、本発明のＳｐｒｅｄ活性を増加また
は促進する薬剤の候補化合物をスクリーニングする方法
において、例えば、ヒトＳｐｒｅｄ遺伝子発現産物また
はヒトＳｐｒｅｄ蛋白質(以下、Ｓｐｒｅｄ蛋白質と併
せて称する)、またはそれらの断片に対する抗体と、被
検液および標識化されたＳｐｒｅｄ蛋白質、Ｓｐｒｅｄ
蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩とを競合的に反
応させ、該抗体に結合した標識化されたＳｐｒｅｄ蛋白
質、Ｓｐｒｅｄ蛋白質の部分ペプチドまたはそれらの塩
の割合を測定することを特徴とする被検液中のＳｐｒｅ
ｄ蛋白質、Ｓｐｒｅｄ蛋白質の部分ペプチドまたはそれ
らの塩を定量するスクリーニング方法も可能である。

【０１９８】また被検液と担体上に不溶化した前記抗体
および標識化された別の異なるＳｐｒｅｄ蛋白質に対す
る抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶
化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする、
被検液中のＳｐｒｅｄ蛋白質、Ｓｐｒｅｄ蛋白質の部分
ペプチドまたはそれらの塩の定量法も可能である。

【０１９９】さらに、Ｓｐｒｅｄ蛋白質、Ｓｐｒｅｄ蛋
白質の部分ペプチドまたはそれらの塩に基質を接触させ
た場合とＳｐｒｅｄ蛋白質、Ｓｐｒｅｄ蛋白質の部分ペ
プチドまたはそれらの塩に基質および試験化合物を接触
させた場合における、Ｓｐｒｅｄ蛋白質、Ｓｐｒｅｄ蛋
白質の部分ペプチドまたはそれらの塩の活性を測定し
て、比較することによってＳｐｒｅｄ蛋白質またはその
塩の活性（例、ＭＡＰキナーゼ活性の抑制）を増加また
は促進する化合物またはその塩をスクリーニングするこ
とも可能である。

【０２００】本発明によれば、ヒトＳｐｒｅｄポリペプ
チドまたはヒトＳｐｒｅｄ遺伝子発現産物の機能を活性
化または抑制する化合物を同定するためのスクリーニン
グ法であって、(a) 候補化合物と、該ポリペプチドまた
は遺伝子発現産物（または該ポリペプチドまたは遺伝子
発現産物を担持している細胞もしくはその膜）またはそ
の融合タンパク質との結合を、該候補化合物に直接また
は間接的に結合させた標識により測定する方法、(b) 候
補化合物と、該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物（ま
たは該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物を担持してい
る細胞もしくはその膜）またはその融合タンパク質との
結合を、標識競合物質(Ｓｐｒｅｄ抗体またはＳｐｒｅ
ｄレセプター)の存在下で測定する方法、(c) 候補化合
物が該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物の活性化また
は抑制により生ずるシグナルをもたらすか否かを、該ポ
リペプチドまたは遺伝子発現産物を担持している細胞ま
たは細胞膜に適した検出系を用いて調べる方法、(d) 候
補化合物と、該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物を含
有する溶液とを同時に混合して混合物を調製し、該混合
物中の該ポリペプチドまたは遺伝子発現産物の活性を測
定し、該混合物の活性をスタンダードと比較する方法、
および(e) 候補化合物が細胞における該ポリペプチドを
コードするｍＲＮＡおよび該ポリペプチドの産生に及ぼ
す効果を検出する方法よりなる群から選択される方法を
含んでなるスクリーニング法が提供される。

【０２０１】また、薬剤スクリーニングに関し、さらな
る方法としては、非機能性Ｓｐｒｅｄ遺伝子を含有する
宿主真核細胞系または細胞の使用が挙げられる。宿主細
胞系または細胞を薬剤化合物の存在下において一定期間
増殖させた後、該宿主細胞の増殖速度を測定して、該化
合物が例えば、細胞の分化を調節できるかどうか、或い
は蛋白−蛋白相互結合の調節又は複合体形成能の調節が
できるかどうかを確認する。増殖速度を測定する１手段
として、ヒトＳｐｒｅｄレセプターの生物活性を測定す
ることも可能である。

【０２０２】また本発明によれば、より活性または安定
した形態のＳｐｒｅｄ蛋白質誘導体または例えば、イン
・ビボ(in vivo)でＳｐｒｅｄ蛋白質の機能を高めるか
もしくは妨害する薬剤を開発するために、それらが相互
作用する目的の生物学的に活性な蛋白質または構造アナ
ログ、例えばヒトＳｐｒｅｄアゴニスト、ヒトＳｐｒｅ
ｄアンタゴニスト、ヒトＳｐｒｅｄインヒビターなどを
作製することが可能である。前記構造アナログは例えば
ヒトＳｐｒｅｄと他の蛋白質の複合体の三次元構造をＸ
線結晶学、コンピューター・モデリングまたは、これら
の組み合わせた方法によって決定することができる。ま
た、構造アナログの構造に関する情報は、相同性蛋白質
の構造に基づく蛋白質のモデリングによって得ることも
可能である。

【０２０３】また上記より活性または安定した形態のヒ
トＳｐｒｅｄ蛋白質誘導体を得る方法としては、例えば
アラニン・スキャンによって分析することが可能であ
る。該方法はアミノ酸残基をAlaで置換し、ペプチドの
活性に対するその影響を測定する方法でペプチドの各ア
ミノ酸残基をこのように分析し、当該ペプチドの活性や
安定性に重要な領域を決定する方法である。該方法によ
って、より活性な、または安定なヒトＳｐｒｅｄ誘導体
を設計することができる。

【０２０４】また機能性アッセイによって選択した標的
−特異的抗体を単離し、次いでその結晶構造を解析する
ことも可能である。原則として、このアプローチによ
り、続く薬剤の設計の基本となるファーマコア(pharmac
ore)を得る。機能性の薬理学的に活性な抗体に対する抗
−イディオタイプ抗体を生成させることによって、化学
的または生物学的に生成したペプチドのバンクよりペプ
チドを同定したり単離したりすることが可能である。故
に選択されたペプチドもファーマコアとして作用すると
予測される。

【０２０５】このようにして、例えば改善されたＭＡＰ
キナーゼ活性もしくは安定性またはＭＡＰキナーゼ活性
のアゴニスト、アクチベーターなどとしての作用を有す
る薬剤を設計・開発することができる。

【０２０６】また本発明によれば、Ｓｐｒｅｄ遺伝子含
有ノックアウト・マウス(変異マウス)を作成することに
よってＳｐｒｅｄ遺伝子配列のどの部位が生体内で上記
したような多様なＳｐｒｅｄ活性に影響を与えるかどう
か、即ちＳｐｒｅｄ遺伝子産物、並びに改変Ｓｐｒｅｄ
遺伝子産物が生体内でどのような機能を有するかを確認
することができる。

【０２０７】該方法は、遺伝子の相同組換えを利用し
て、生物の遺伝情報を意図的に修飾する技術であり、マ
ウスの胚性幹細胞(ＥＳ細胞)を用いた方法を例示できる
（Capeccchi, M. R., Science, 244, 1288-1292 (198
9)）。

【０２０８】尚、上記変異マウスの作製方法はこの分野
の当業者にとって既に通常の技術であり、この改変技術
(野田哲生編、実験医学,増刊, 14 (20) (1996)、羊土
社)に、野性型Ｓｐｒｅｄ遺伝子および変異Ｓｐｒｅｄ
遺伝子を適応して容易に変異マウスを作製し得る。従っ
て前記技術の適応により、改善されたＳｐｒｅｄ活性も
しくは安定性またはＳｐｒｅｄ活性のインヒビター、ア
ゴニスト、アンタゴニストなどとしての作用を有する薬
剤を設計・開発することができる。

【０２０９】

【発明の効果】本発明によれば、細胞外シグナルに応じ
た細胞の増殖と分化に関連するＭＡＰキナーゼを介した
情報伝達系の制御に関与するＭＡＰキナーゼ活性抑制作
用を有するヒト遺伝子Ｓｐｒｅｄが提供される。

【０２１０】本発明遺伝子の利用によれば、ヒトＳｐｒ
ｅｄ遺伝子発現産物またはヒトＳｐｒｅｄポリペプチド
を製造でき、これを抗原とする抗体をも製造することが
出来る。本発明によれば、該ヒトＳｐｒｅｄ遺伝子発現
産物の発現を増強するか、またはヒトＳｐｒｅｄポリペ
プチドの生物活性を増強する候補化合物のスクリーニン
グ方法及び該スクリーニング方法によって得られた化合
物が提供される。

【０２１１】本発明によればヒトＳｐｒｅｄ遺伝子発現
産物またはヒトＳｐｒｅｄポリペプチドを有効成分とす
る抗腫瘍剤に対する医薬組成物並びに医薬が提供され
る。

【０２１２】また、ヒトＳｐｒｅｄ遺伝子の提供によれ
ば、該遺伝子がコードするヒトＳｐｒｅｄ蛋白質を遺伝
子工学的に大量に製造することができ、該蛋白質の提供
によれば、ＭＡＰキナーゼ抑制作用やＳｐｒｅｄ蛋白質
の結合活性などの機能を調べることもできる。

【０２１３】また本発明遺伝子の利用によれば、ヒトＳ
ｐｒｅｄ変異体ポリペプチドを製造でき、該変異体を有
効成分とするＭＡＰキナーゼ抑制作用、Ｒａｆ抑制作
用、あるいは細胞の分化を抑制する作用を有する医薬が
提供される。

【０２１４】本発明によれば、さらにヒトＳｐｒｅｄセ
ンス・オリゴヌクレオチドを含有する遺伝子治療に有用
な遺伝子導入用ベクター、該ヒトＳｐｒｅｄセンスセン
ス・オリゴヌクレオチド導入された細胞および該ベクタ
ーまたは細胞を有効成分とする遺伝子治療剤、並びにそ
の利用による遺伝子治療法などが提供される。

【０２１５】本発明によれば、ヒトＳｐｒｅｄタンパク
またはヒトＳｐｒｅｄ遺伝子発現産物との相互作用物の
スクリーニング方法が提供される。

【０２１６】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、参
考例および実施例を挙げる。

【０２１７】

【参考例】Ａ．マウスＳｐｒｅｄ１およびＳｐｒｅｄ２
のスクリーニングおよびクローニング マウス破骨細胞ｍＲＮＡから合成されたランダムに調整
されたｃＤＮＡをλファージｐＡＳＶ３Ａベクターにク
ローニングし、パッケージした。プラスミドは大腸菌
Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＮＮ−１３２(Elledg, S.J., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,1731-1735(1991))の
中に該ファージを感染させることによって回収した。ベ
イトとしてｃ−ｋｉｔおよびｃ−ｆｍｓを用いる酵母ツ
ー・ハイブリッド・スクリーニングは、ヨコウチら(Yok
ouchi, M., et al., Oncogene, 15,7-15(1997))に記載
された方法に順じて実施した。

【０２１８】マウスＳｐｒｅｄ１の全長ｃＤＮＡは、前
記ヨコウチらの方法に順じて(Yokouchi, M., et al., O
ncogene, 15, 7-15(1997))、ＥＳＴの配列に基づいたＰ
ＣＲ及び続いて実施されたＲＡＣＥ−ＰＣＲによって得
られた。

【０２１９】マウスＳｐｒｅｄ１の全長ｃＤＮＡの取得
のため、最初のＰＣＲに用いた具体的配列は、最初のＡ
ＴＧからストップコドンを含む領域を増幅した。

【０２２０】また、ＲＡＣＥ−ＰＣＲによってｍＲＮＡ
の５'端の開始コドンより上流２４ベースを得た。

【０２２１】上記で得られたクローンの一つは、Ｎ末端
にＥＶＨ−１ (Ena/Vasodilator-stimulated phosphopr
otein homology-1) ドメインを、Ｃ末端にＳｐｒｏｕｔ
ｙと相同性のあるＳｐｒｏｕｔｙ(ＳＰＲ)ドメインをも
っており、Ｓｐｒｅｄ (Sprouty-related protein with
EVH-1 domain) と命名した。

【０２２２】データベース検索［ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭ
ＢＬデータベース ］によりＳｐｒｅｄと類似するＳｐ
ｒｅｄ−２もクローニングした。

【０２２３】Ｃ−ｋｉｔと結合するドメインとして約５
０アミノ酸からなるｋｉｔ結合ドメイン(kit-binding d
omain : ＫＢＤ) を同定した。これはＳＨ２やＰＴＢ
といった既知のリン酸化チロシンを認識するドメインと
は全く異った配列でありその結合様式の解明が待たれ
る。一方、ＥＶＨ−１ドメインはタンパク間の結合に機
能するもので、ＶＡＳＰ (Vasodilator-stimulated pho
sphoprotein) やＷＡＳＰ (Wiskott-Aldrich syndrome
protein) 等のアクチン重合化に関与する分子群にみら
れるドメインである（Digicaylioglu, M., et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 3717-3720(1995)）。こ
れらのＥＶＨ−１ドメインはＦＰＰＰＰというプロリン
リッチな配列を認識し、細胞骨格再構築が行われている
領域にアクチンを集蔟させるために必要である(Reich,
A., et al., Development, 126, 4139-4147 (1999))。
しかしＳｐｒｅｄのＥＶＨ−１ドメインはこれらのＥＶ
Ｈ−１ドメインから進化上やや離れており別の機能も予
想される。

【０２２４】かくして得られた２つのマウスＳｐｒｅｄ
−１およびマウスＳｐｒｅｄ−２のＯＲＦ領域の核酸配
列は、配列番号７および配列番号８に示されるようにそ
れぞれ１３３２塩基および１２３０塩基で、これら核酸
配列よってコードされたアミノ酸配列はそれぞれ配列番
号５および配列番号６に示されるようにそれぞれ４４４
アミノ酸残基および４１０アミノ酸残基であり、前者を
マウスＳｐｒｅｄ−１、後者をマウスＳｐｒｅｄ−２と
それぞれ命名した。マウスＳｐｒｅｄ−１のアミノ酸配
列において、Ｎ末端のＥＶＨ−１ドメインは、配列番号
１の1番目から１３３番目であり、ＫＢＤは、２３４番
目から２８６番目で示され、Ｃ末端ＳＰＲドメインは、
３３４番目から４４４番目にあることが判明した。ま
た、マウスＳｐｒｅｄ−１とマウスＳｐｒｅｄ−２のＥ
ＶＨ−１ドメイン、ＫＢＤ、およびＣ末端ＳＰＲドメイ
ンの相同性は、それぞれ６２％、４５％、および７６％
であった。

【０２２５】マウスＳｐｒｏｕｔｙ−４およびマウスＶ
ＡＳＰとのマウスＳｐｒｅｄ−１およびマウスＳｐｒｅ
ｄ−２のドメイン構造の比較図を図１に示す。 Ｂ．マウスＳｐｒｅｄ−１およびマウスＳｐｒｅｄ−２
の機能解析 ａ．細胞の培養：Ｒａｔ褐色細胞腫から誘導されたＰＣ
１２細胞は、１０％ＦＢＳおよび５％ウマ血清(ＨＳ)を
添加したＤＭＥＭ培地中で培養された。また、ヒト胎児
腎臓２９３細胞は、１０％仔ウシ血清(ＣＳ)を添加した
ＤＭＥＭ培地中で培養された。マウス筋原細胞Ｃ２Ｃ１
２細胞は、２０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地中で培
養された。

【０２２６】尚、本明細書中のＢａ／Ｆ３は、マウス・
プレＢ細胞株、ＮＩＨ３Ｔ３は、マウス線維芽細胞株、
Ｍ１は、マウス白血病細胞株(ＡＴＣＣ寄託番号：ＴＩ
Ｂ−１９２)、ＰＣ１２は、ラット褐色細胞腫細胞株(Ａ
ＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ−１７２１)、およびＣ２Ｃ１
２は、マウス筋原細胞細胞株(ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲ
Ｌ−１７７２)を表わす。

【０２２７】ｂ．各種プラスミドの構築：ヒトＲａｓ、
Ｒａｆ、ＭＥＫおよびマウスＳｐｒｏｕｔｙ−４のｃＤ
ＮＡと同様に、マウスＳｐｒｅｄ−１およびマウスＳｐ
ｒｅｄ−２を６回反復配列が付加されＭｙｃタグの付い
たｐｃＤＮＡ３あるいはＮ末端にＦｌａｇタグが付加さ
れたｐＣＭＶ２の中にクローンした。

【０２２８】マウスＳｐｒｅｄ−１およびマウスＳｐｒ
ｅｄ−２は、さらにＮ末端でＥＧＦＰタグを誘導するた
めに、ｐＥＧＦＰ(クローンテック社製)の中にクローン
した。

【０２２９】ＨＡタグあるいはＦｌａｇタグが付加され
たＥｒｋ２ＭＡＰキナーゼは東京大学、ゴトー先生およ
びＷＡＳＰｃＤＮＡは、東京大学、ミキ先生及びタケナ
ワ先生より贈与された。

【０２３０】Ｓｐｒｅｄの欠失、置換、およびキメラ変
異体の作成は、ヤスカワら(Yasukawa, H., et al., EMB
O J., 18, 1309-1320(1999))あるいはササキら(Sasaki,
A.,et al., Genes to Cells, 339-351(1999) )の標準
的なＰＣＲ方法によって創り出した。野生型Ｓｐｒｅｄ
および変異体の幾つかは、ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ
ベクター(Nosaka,T., et al., EMBO J., 18,4754-4765
(1999))の中にサブクローンした。

【０２３１】Ｓｐｒｅｄ−１(コドン1−127番目)のＥＶ
Ｈ−１ドメインは、接合物でＢａｍＨ Ｉサイトを導入
することによってＷＡＳＰ(コドン1−130番目)のそれで
置換させた。ヒトＲａｓＧＡＰおよびマウスＰＫＩＰｃ
ＤＮＡは、胎盤からのＰＣＲか、またはＢａ／Ｆ３ｃＤ
ＮＡライブラリーによって得られ、ｐｃＤＮＡ３中にク
ローンした。

【０２３２】ｃ．ＰＣ１２およびＣ２Ｃ１２細胞の分化
試験：ポリＬ−リジンでコートされた３５ｍｍプレート
において成長させたＰＣ１２は、ＴｒａｎｓＦａｓｔ
(プロメガ社製)を使用するＥＧＦＰタグが付加されたＳ
ｐｒｅｄ−１、ＥＧＦ(epidermal growth factor)レセ
プター、およびＨＡタグが付加されたＥｒｋ２でトラン
スフェクトされた。選択的にＭｙｃタグが付加されたＳ
ｐｒｅｄ−１は、Ｓｐｒｅｄ−１ｃＤＮＡおよびＩＲＥ
Ｓ−ＥＧＦＰ(Nosaka,T., et al., EMBO J., 18, 4754-
4765 (1999))を用いるレトロウイルスベクターを用いて
ＰＣ１２細胞の中に導入した。

【０２３３】トランスフェクションまたは感染の４８時
間後に、ＰＣ１２細胞は、ＮＧＦまたはＥＧＦの添加、
あるいは無添加において、さらに７２時間培養した、そ
して蛍光顕微鏡によって試験した。

【０２３４】細胞体の直径が１．５倍以上の突起を有す
る細胞は、神経突起陽性であると考慮された。

【０２３５】アフィニティ精製されたＳｐｒｅｄ抗体あ
るいはＳｐｒｅｄ抗体＋抗原ペプチドのマイクロインジ
ェクションは、ローズらやラビンスキーらの記載の方法
(Rose, D.W., et al., J.Cell Biol., 119, 1405-1411
(1992): Lavinsky, R.M., ｅｔal., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 95, 2920-2925(1998))と同様にエッペンド
ルフ・トランスジェクター５２４６および５１７１と倒
立顕微鏡(Carl Zeiss社製;AS-2)を用いて行なった。

【０２３６】マイクロインジェクションの後、ＰＣ１２
細胞は、ＮＧＦの添加、無添加の後、４８時間培養され
た。そして、それから抗ウサギＦＩＴＣで染色した。Ｃ
２Ｃ１２細胞の分化とＳｐｒｅｄ−１のトランスフェク
ションは、ロンメルら(Rommel, C., et al., Science,
286, 1738-1741 (1999)に記載の方法と同様に実施し
た。２４ウェルプレート上において成長した細胞は、Ｌ
ｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ(ギブコＢＲＬ社製)を用い
て、ｐＥＧＦＰ空ベクター、Ｆｌａｇタグが付加された
Ｓｐｒｅｄ−１またはＳｐｒｅｄ−２、それらの欠失し
た変異体、Ｍｙｃタグが付加されたＮ１７Ｒａｓまたは
Ｍｙｃタグが付加されたＤＮ−Ｒａｆでそれぞれ同時ト
ランスフェクションされた。

【０２３７】トランスフェクションの後、細胞は２０％
ＦＢＳまたは２％ＨＳにおいて５日間培養し、そして蛍
光顕微鏡を使用して試験した。

【０２３８】伸長したか、あるいは多核した筋管様細胞
は、分化されていると考慮された。

【０２３９】ｄ．免疫化学分析：免疫沈降およびイムノ
ブロッティングは、ヤスカワら(Yasukawa, A., et al.,
EMBO J., 18, 1309-1320 (1999))に記載されたと同様に
抗Ｍｙｃ抗体(９Ｅ１０)、 抗Ｆｌａｇ抗体(Ｍ２)、抗
Ｒａｓ抗体(Calbiochem社製)、抗Ｅｒｋ２抗体(サンタクルス゛
・ハ゛イオテクノロシ゛ー社製)、抗ＨＡ抗体(１２ＣＡ５)、および
抗リン酸化Ｅｒｋ２抗体(プロメガ社製)を用いて実施し
た。

【０２４０】ＲａｆのＮ末端のＲａｓ結合ドメイン(Ｒ
ＢＤ)で免疫したＲａｓ−ＧＴＰフォームは、ウォルネ
(Warne)に記載されたと同様(Warne, P.H., et al., Nat
ure, 364, 352-355(1993) )にＧＳＴ (ＧＳＴ−ＲＢＤ)
に融合した。

【０２４１】抗Ｓｐｒｅｄ−１抗体または抗Ｓｐｒｅｄ
−２抗体は、ＫＬＨ接合したペプチド（それぞれＦＫＳ
ＫＲＲＫＥＤＧＥＲＳＲＣ、またはＩＫＴＱＰＰＲＡＫ
ＳＲＲＲＫＥＮＧＥＣ）でウサギを免疫することによっ
て調整された。 免疫蛍光顕微鏡分析は、ミツイら(Mits
ui, K., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.,26
4, 457-464(1999))と同様に実施した。

【０２４２】ｅ．キナーゼ・アッセイ：２９３細胞株(A
TCC寄託番号：ＣＲＬ−１５７３)における一時的なトラ
ンスフェクションとルシフェラーゼアッセイ法は、ヤス
カワら(Yasukawa, H. et al.,EMBO J., 18，1309-1320
(1999))に記載の方法に準じて行なった。Ｅｌｋ−１ル
シフェラーゼアッセイは、製品使用説明書に従い、Ｅｌ
ｋ−１のためのトランス・リポーティング・システム構
築物(ストラタジーン社製)を用いて実施した。ＨＡ−Ｅ
ｒｋ２は、抗ＨＡモノクローナル抗体で沈降させた。抗
リン酸化Ｅｒｋ２特異的抗体は、プロメガ＆セル・シグ
ナリング社(Promega and Cell SignalingCo.)より購入
した。

【０２４３】免疫沈降物は、１０ｍＣｉ γ³²Ｐ−ＡＴ
Ｐの存在下で１０分間、ミエリン塩基蛋白質(ＭＢＰ)と
共にインキュベートした。イン・ビトロＲａｆキナーゼ
活性のために、Ｆｌａｇ−Ｒａｆは、抗Ｆｌａｇ抗体で
免疫沈降させた。

【０２４４】免疫沈降物は、２０ｍＭ ＡＴＰを含むＲ
ａｆキナーゼ緩衝液中において、４０ｎｇの精製された
ＭＥＫ−１および２５０ｎｇのＧＳＴ−Ｅｒｋ２で３０
℃で２０分間インキュベートされた。

【０２４５】Ｒａｆの自己リン酸化を測定するために、
下流成分は、省略された。

【０２４６】活性化反応物は、５０ｍｌのＲａｆキナー
ゼ緩衝液中に希釈され、それから１０ｍＣｉ γ³²Ｐ−
ＡＴＰおよびＭＢＰで５分間インキュベートされた。

【０２４７】それからＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ＭＢ
Ｐのリン酸化は、ＢＡＳ−２０００イメージ・システム
(フジ社製)を使用して定量した。

【０２４８】ｆ．時間推移蛍光顕微鏡：ＥＧＦＰはｐＥ
ＧＦＰ−Ｃ１ベクター(クローンテック社製)においてＲ
ａｆのＮ末端領域に対して融合させた。次いで２９３細
胞は、ＥＧＦＰ−Ｒａｆでトランスフェクトされ、そし
てＲａｓｃＤＮＡは、２５℃でＥＧＦで刺激された。蛍
光イメージは、ＡＱＡＣＯＳＭＯＳソフトウエア（浜松
ホトニクス社製）によって作動されるディジタルＣＣＤ
カメラ（C4742）を備えるオリンパスＩＸ７０倒立蛍光
顕微鏡を用いて各３０秒毎に取得した。

【０２４９】ｇ．ｃ−ｋｉｔ結合ドメイン（ＫＢＤ）の
特定：２９３細胞は、Ｆｌａｇタグが付加されたＳｐｒ
ｅｄ−１の開示された欠失変異体および点変異体(R247
A; このArg残基がＳｐｒｅｄ間でコンバートされた)お
よび構成的に活性化されたｃ−ｋｉｔ（Ｄ８１４Ｖ）を
トランスフェクトすることで検定された。

【０２５０】抗Ｆｌａｇ抗体と免疫沈降反応後、ｃ−ｋ
ｉｔおよびＳｐｒｅｄ−１は、抗リン酸チロシン抗体
(ａｎｔｉ−ＰＹ)または抗Ｆｌａｇ抗体でそれぞれブロ
ットされた。

【０２５１】１）幹細胞因子(ＳＣＦ)に対する応答にお
けるＳｐｒｅｄ−１のチロシンリン酸化 図２にＳＣＦに対する応答における２９３細胞において
発現したＭｙｃタグ付けされたＳｐｒｅｄ−１（Ｍｙｃ
−Ｓｐｒｅｄ−１）のチロシンリン酸化(ＰＹ)を示す。
（ 図中、ＩＰは免疫沈降（Immunoprecipitate）を、Ｉ
Ｂはイムノブロット（Immunoblot）を示す。以下同
じ。） ２９３細胞は、ｃ−ｋｉｔおよびＭｙｃ−Ｓｐｒｅｄ−
１でトランスフェクトされ、そして１００ｎｇ／ｍｌの
ＳＣＦで１０分間刺激した。

【０２５２】全細胞溶菌液(ＴＣＬ)および抗Ｍｙｃ抗体
での免疫沈降は、抗リン酸チロシン抗体(ａｎｔｉ−Ｐ
Ｙ)または抗Ｍｙｃ抗体(ａｎｔｉ−Ｍｙｃ)でブロット
した。

【０２５３】図３にＳｐｒｅｄの細胞膜の局在を示す。
ＰＣ１２細胞内因性のＳｐｒｅｄ−２蛋白が、免疫蛍光
顕微鏡を用いて検出された。中間パネルは、コントロー
ル抗原ペプチド（＋peptide）を有する染色を示してい
る。右の２つの明瞭なパネルは、ＰＣ１２細胞における
野性型(ＧＦＰ−ＷＴ)およびＣ末端が欠失した(ＧＦＰ
−ΔＣ)ＥＧＦＰ−Ｓｐｒｅｄ−１の蛍光顕微鏡像を示
す。

【０２５４】Ｓｐｒｅｄ−１は幹細胞因子(ＳＣＦ)、Ｐ
ＤＧＦおよびＥＧＦ（図には示されていない）に応答し
て燐酸化されるチロシンを有していた。そして、Ｓｐｒ
ｅｄ−１の効率的なリン酸エステル化はＫＢＤドメイン
に依存した。

【０２５５】免疫蛍光顕微鏡検査を使用して、本発明者
は内因性Ｓｐｒｅｄ−２の原形質膜局在を検出した。

【０２５６】Ｓｐｒｅｄの膜局在は、蛍光性蛋白系（Ｅ
ＧＦＰ）との融合蛋白質として発現されたＳｐｒｅｄ−
１およＳｐｒｅｄ−２によって確認された。ＳＰＲドメ
インの欠失している欠失変異体(ＧＦＰ−ΔＣ)は細胞質
に局在したのでＳＰＲドメインは原形質膜局在に対して
本質的に重要であることが分かった。

【０２５７】２）種々の組織と細胞株におけるＳｐｒｅ
ｄ−１およびＳｐｒｅｄ−２の発現 多能性組織ブロット(クローンテック社製)と細胞株から
の全ＲＮＡ(5mg/レーン)を実施する膜は、マウスＳｐｒ
ｅｄ−１またはＳｐｒｅｄ−２プローブ、或いはコント
ロールのβ−アクチン・プローブでハイブリダイズさせ
た。

【０２５８】その結果、Ｓｐｒｅｄ−１は脳において大
部分が発現された。その一方で、Ｓｐｒｅｄ−２は脳だ
けでなく心臓、肝臓および腎臓にもおいて認められた。

【０２５９】２９３細胞株を除いて最も多くの検察した
細胞系において、Ｓｐｒｅｄ−１およびＳｐｒｅｄ−２
は発現していた。

【０２６０】３）ＰＣ１２細胞の分化に関するＳｐｒｅ
ｄの影響 (a) 野生型（ＷＴ）、そして、Ｎ末端の（ΔＮ）または
Ｃ末端の（ΔＣ）が切断されたＳｐｒｅｄ−１構築物
を、ＥＧＦＰと共にＰＣ１２細胞の中にレトロウイルス
的に導入した。そして１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦで３日
間インキュベートした。これらの細胞は、固定化された
後、ＥＧＦＰ陽性細胞を蛍光顕微鏡を用いて検出した。

【０２６１】神経突起成長の数量化は、マーシャルの方
法(Marshall, C.J., Cell,80,179-185(1995) （n=100）
に準じて実施した。

【０２６２】その結果を、図４に示す。尚、図の値の位
置は３回の実験結果の平均と平均誤差を意味する。

【０２６３】上記のようにＳｐｒｏｕｔｙとの類似性か
らＲａｓシグナルへの影響を調べた結果、末梢神経系の
細胞株ＰＣ１２細胞はＮＧＦなどによってＲａｓ／ＭＡ
Ｐキナーゼが活性化されることにより神経突起を伸ば
し、分化が促進されることが判明した。

【０２６４】ＰＣ１２細胞はＳｐｒｅｄ−１および−２
を発現しておりＮＧＦ処理によって発現が２−３倍に増
強された。まず野生型のＳｐｒｅｄ−１、ないしＳｐｒ
ｅｄ−２の強制発現はＮＧＦ(nerve growth factor)に
よるＰＣ１２細胞の分化を抑制した。

【０２６５】（b）Ｅｒｋ２活性化に関するＳｐｒｅｄ
−１の効果。

【０２６６】野生型Ｓｐｒｅｄ−１とＨＡタグが付加さ
れたＥｒｋ２をコードする発現ベクターでトランスフェ
クトされたＰＣ１２細胞は、１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ
で３０分間刺激した。ＨＡ−Ｅｒｋ２は細胞の抽出液か
ら免疫沈降されて、そしてイン・ビトロ・キナーゼ活性
のためにアッセイに用いた。その結果を図５に示す。図
５中には、リン酸化された基質(ＭＢＰ)の位置が示され
ている。

【０２６７】ウエスタンブロッティングは、各々のトラ
ンスフェクションにおけるＨＡ−Ｅｒｋ２発現の同等の
レベルを示している。

【０２６８】上記の結果から、Ｓｐｒｅｄ−１はＮＧＦ
によって誘導されたＥｒｋ２ ＭＡＰキナーゼ活性の抑
制することが認められた。

【０２６９】(c) Ｓｐｒｅｄ蛋白に対する抗体のマイク
ロインジェクションによる内因性のＳｐｒｅｄの阻害 ＰＣ１２細胞は、抗原ペプチド（＋ペプチド）の有無と
アフィニティ精製された抗Ｓｐｒｅｄ−１抗体および抗
Ｓｐｒｅｄ−２抗体の混合液でマイクロインジェクショ
ンされ、そして２５ｎｇ／ｍｌのＮＧＦで２日間処理さ
れた。分化した細胞数は、コントロールに対する％変化
で記載された（n=50）（図６）。

【０２７０】(d)Ｅｒｋ２活性化に関するＳｐｒｅｄ抗
体の影響 ＰＣ１２細胞は、Ｓｐｒｅｄ抗体またはＳｐｒｅｄ抗体
＋ペプチドでマイクロインジェクションされ、そして
２５ｎｇ／ｍｌのＮＧＦで５分間刺激された。

【０２７１】活性化されたＥｒｋは、モノクローナル抗
リン酸化Ｅｒｋ抗体で（Cell Signaling 社製USA）可視
化され、そして定量化された。

【０２７２】マイクロインジェクションされた細胞を有
する面積はランダムに写真を撮られた、そして、個々の
核の染色強度はＮＩＨイメージ（n=20）を用いて測定さ
れた。

【０２７３】その結果が図７に示され、該図中各図下段
の矢印はインジェクションされた細胞を示し、そして上
段の矢印は、インジェクションされなかった細胞を示し
ている（図７）。

【０２７４】その結果、 抗体マイクロインジェクショ
ンとＣ末端のＳｐｒｏｕｔｙドメインを欠損させたドミ
ナント・ネガティブ変異体の過剰発現においては、逆に
ＰＣ１２のＮＧＦによる分化とＭＡＰキナーゼの活性化
が増強されていたことが判明した。

【０２７５】(e,f) Ｃ末端欠失したＳｐｒｅｄ−１変異
体、ドミナント・ネガティブの影響 細胞は、Ｃ末端欠失したＳｐｒｅｄ−１変異体およびＥ
ＧＦレセプターで同時トランスフェクトされ、そして１
０ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで３日間処
理した。

【０２７６】その結果は、図８に示され、図中の数値は
３つの実験（n=100）の平均＋SEを意味している。

【０２７７】Ｃ末端欠失した(ΔＣ)Ｓｐｒｅｄ−１、Ｅ
ＧＦレセプター、およびＨＡタグを付したＥｒｋ２をコ
ードしている発現ベクターでトランスフェクトされた細
胞は、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで３０分間刺激された。
ＨＡ−Ｅｒｋ２は、細胞抽出液から免疫沈降させて、イ
ンビトロ・キナーゼ活性をアッセイした。その結果が同
様に図９に示される。

【０２７８】上記より、Ｃ末端欠失したＳｐｒｅｄ−１
変異体の過剰発現は、ＥＧＦの低濃度(10ng/ ml)で処理
したＰＣ１２細胞の分化を増強し、そしてＥｒｋ２のＥ
ＧＦ誘導活性化を高めた。

【０２７９】４）Ｃ２Ｃ１２細胞に関する野生型および
C末端欠失したＳｐｒｅｄ−１変異体の影響 さらにＳｐｒｅｄ−２の発現が高い筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１
２細胞での分化を調べた。

【０２８０】(a)Ｃ２Ｃ１２細胞に筋肉様細胞分化の間
のＳｐｒｅｄ−１の発現タイムコース Ｃ２Ｃ１２細胞は、５日間の間、分化用培地(ＤＭ（2%
のＨＳ)で培養され、そしてＳｐｒｅｄ−１のレベル
は、ノーザンブロット分析によって測定された。

【０２８１】Ｃ２Ｃ１２細胞はにおけるＳｐｒｅｄ−１
のレベルは、２日間の培養で上昇し、３日目に鋭く低下
し、ＭＡＰキナーゼ活性のレベルに逆相関した(図１
０)。

【０２８２】(b)野生型Ｓｐｒｅｄ−１、野生型Ｓｐｒ
ｅｄ−２、またはドミナント・ネガディブＲａｓ（Ｎ１
７−Ｒａｓ）構築物は、ＥＧＦＰベクターで同時トラン
スフェクトされた。細胞は、トランスフェクション後、
５日間成長培地(20%ＦＢＳ)中において培養された。さ
らに細胞は蛍光顕微鏡を用いて撮影された。分化の定量
化は、上記３）の方法と同様に(n=100)行なった。

【０２８３】図１１のパネルに結果が示される、数値％
は、独立した３回の実験結果の平均＋ＳＥで示される。

【０２８４】(c) 図１２に示されるように野生型(ＷＴ)
Ｓｐｒｅｄ−１およびＳｐｒｅｄ−２は、Ｅｒｋ２活性
化を抑制した。尚、細胞は、Ｆｌａｇ−Ｅｒｋ２と共に
野生型Ｓｐｒｅｄ−１、Ｓｐｒｅｄ−２、またはＮ１７
−Ｒａｓをコードしている発現ベクターでトランスフェ
クトし、４８時間成長培地(20%ＦＢＳ)で培養した。Ｆ
ｌａｇ−Ｅｒｋ２は、細胞抽出液から免疫沈降させて、
抗リン酸化Ｅｒｋ２抗体にてイムノブロットした。

【０２８５】(Ｎ１７−Ｒａｓ)の強制発現は、通常の成
長条件においてさえ(20%ＦＢＳ)、Ｃ２Ｃ１２細胞にお
ける形態学的な変化を誘導し、ＭＡＰキナーゼ活性を抑
制した。また、野性型Ｓｐｒｅｄ−１およびＳｐｒｅｄ
−２の強制発現は類似の効果を示した。

【０２８６】(d)Ｃ末端欠失したＳｐｒｅｄ−１または
Ｓｐｒｅｄ−２構築物、あるいは構築中に活性化された
Ｒａｆ（ΔＮ−Ｒａｆ）をＥＧＦＰベクターで同時にト
ランスフェクトした。

【０２８７】細胞は、トランスフェクション後、５日間
分化培地(２％ＨＳ)中において培養された。分化した細
胞の％で示され、それぞれ比較された(n=100)(図１
３)。

【０２８８】(e)Ｃ末端欠失したＳｐｒｅｄ−１変異
体、またはＳｐｒｅｄ−２、またはＦｌａｇ−Ｅｒｋ２
のついたΔＮ−Ｒａｆをコードしている発現ベクターで
トランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞は、４８時間分
化培地(２％ＨＳ)で培養した。

【０２８９】免疫沈降およびイムノブロットは、上記と
同様に実施した。

【０２９０】対照的に、Ｃ末端欠失したＳｐｒｅｄ−１
またはＳｐｒｅｄ−２構築物、あるいは構築中に活性化
されたＲａｆ（ΔＮ−Ｒａｆ）でトランスフェクトされ
たＣ２Ｃ１２細胞は、分化培地中においてさえ、筋肉様
細胞に分化せず、そして高いレベルのＭＡＰキナーゼ活
性は維持された(図１４)。

【０２９１】このように、種々の組織におけるＭＡＰキ
ナーゼ経路の抑制因子として内因性のＳｐｒｅｄ蛋白質
が機能するという仮説を支持するＣ末端変異体は、おそ
らくＭＡＰキナーゼを増強することによってＣ２Ｃ１２
細胞分化を抑制する。

【０２９２】上記結果から、Ｃ２Ｃ１２細胞は低血清培
地にさらされると一過性にＭＡＰキナーゼの活性化が低
下し、筋肉様細胞へと分化する。 Ｃ２Ｃ１２細胞にお
いては野生型のＳｐｒｅｄの発現はそれだけで分化を誘
導し、逆にＳｐｒｅｄ−１またはＳｐｒｅｄ−２のドミ
ナント・ネガティブ変異体の過剰発現は分化を抑制し
た。このとき野生型ＳｐｒｅｄではＭＡＰキナーゼ活性
の低下が、ドミナント・ネガティブ変異体ではＭＡＰキ
ナーゼ活性の増強が認められた。以上のことからＳｐｒ
ｅｄは内因性のタンパクレベルでのＭＡＰキナーゼ抑制
因子であることが示された。

【０２９３】５）Ｅｌｋ−１リポーターに関するＳｐｒ
ｅｄ−１および種々の蛋白質の影響 次にＳｐｒｅｄのＲａｓ／ＭＡＰキナーゼ経路に対する
抑制メカニズムを調べた。

【０２９４】(a)ＥＧＦ誘導されたＥｌｋ−１またはＳ
ＴＡＴ３活性化は、ＨＡ−Ｅｒｋ２、野生型Ｆｌａｇ−
Ｒａｓ、およびＳｐｒｅｄ−１と共にＦｌａｇ−Ｒａ
ｆ、あるいはＳｐｒｅｄ−１なしのＦｌａｇ−Ｒａｆで
トランスフェクトされた２９３細胞において測定した。
ＳＴＡＴ３活性は、ＡＰＲＥリポーター遺伝子を用いて
アッセイを行なった。

【０２９５】(b)Ｅｌｋ−１リポーター活性は、活性化
ＭＥＫ、Ｎ末端欠失活性化Ｒａｆ（ΔＮ−Ｒａｆ）およ
びＳｐｒｅｄ−１の示された量を有する活性化Ｒａｓ
（Ｖ１２−Ｒａｓ）でトランスフェクトされた２９３細
胞において測定した。

【０２９６】(c)Ｅｒｋ−２、Ｒａｓ、およびＲａｆ活
性化の時間経過 ２９３細胞は、ＨＡ−Ｅｒｋ２、野生型Ｆｌａｇ−Ｒａ
ｓ、およびＳｐｒｅｄ−１と共にＦｌａｇ−Ｒａｆ、あ
るいはＳｐｒｅｄ−１なしのＦｌａｇ−Ｒａｆでトラン
スフェクトされた。０、５、１５、３０分間の間、５０
ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで刺激した後、活性化したＦｌａｇ
−Ｒａｓは、ドメイン(ＲＢＤ)ビーズが結合しているＧ
ＳＴ−Ｒａｓで沈降され、そして抗Ｆｌａｇ抗体でブロ
ットした。免疫沈降したＦｌａｇ−Ｒａｆは、インビト
ロ自動リン酸化アッセイに付した(Auto-Phospho.社
製)。ＨＡ−Ｅｒｋ２は、免疫沈降させて、抗リン酸Ｅ
ｒｋ２抗体でイムノブロットした。

【０２９７】(d)２９３細胞Ｆｌａｇ−ＲａｆおよびＭ
ｙｃタグが付加された野生型、またはＮ末端欠失(ΔＮ)
Ｓｐｒｅｄ−１でトランスフェクトされ、そしてＥＧＦ
で１０分間刺激した。抗Ｆｌａｇ免疫沈降は、ＭＡＰキ
ナーゼ・カスケード・コンポーネントを用いて、インビ
トロ・キナーゼ・アッセイ(I.V.K.)に付した。全細胞溶菌
物(ＴＣＬ)は、抗Ｍｙｃ抗体でブロットした。

【０２９８】２９３細胞は、Ｅｌｋ−１リポーター・プ
ラスミドおよび³²Ｐ−ＭＢＰ、Ｆｌａｇ−Ｒａｓ、Ｍｙ
ｃ−タグが付されたＳｐｒｅｄ−１、Ｎ末端欠失したＭ
ｙｃのｃＤＮＡｓでトランスフェクトされ、ＥＧＦ（５
０ｎｇ／ｍｌ）で６時間刺激した。Ｅｌｋ−1リポータ
ー活性を測定した(図１８)。

【０２９９】２９３細胞はほとんど内因性Ｓｐｒｅｄｓ
を発現していない。Ｎ末端変異体は、Ｅｌｋ−１活性の
基礎レベルと刺激されたレベルの両者を増大させるが、
Ｅｒｋ２キナーゼ活性のレベルには、影響を与えなかっ
た。

【０３００】(e)２９３細胞は、Ｆｌａｇ−Ｒａｆおよ
びＭｙｃ−タグが付されたＳｐｒｅｄ−１またはＲａｓ
ＧＡＰでトランスフェクトされて、それからＥＧＦで１
０分間刺激した。抗Ｆｌａｇ免疫沈降は、抗リン酸Ｓｅ
ｒ³³⁸抗体(ａｎｔｉ−ｐＳ３３８、Upstate Biotechnol
ogy社)、またはＳｅｒ²⁵⁹Ｒａｆ抗体（ａｎｔｉ−ｐＳ
２５９、New England BioLabs社）でブロットされた(図
１７)。

【０３０１】(a,b)ＥＧＦまたは活性化Ｖ１２−Ｒａｓ
誘導されたＡｋｔ活性に関するＳｐｒｅｄ−１の影響 ２９３細胞はＨＡ−Ａｋｔおよび(a)Ｖ１２−Ｒａｓな
しのＳｐｒｅｄ−１または(b)Ｖ１２−ＲａｓのあるＳ
ｐｒｅｄ−１でトランスフェクトされた。抗ＨＡ免疫沈
降は、抗リン酸セリン４７３Ａｋｔ(Biosource, Co.
社)または抗ＨＡ抗体でブロットした。

【０３０２】(c)ＰＬＣγ−１のチロシンリン酸化に関
する影響 ２９３細胞は、Ｓｐｒｅｄ−１および／またはＥＧＦレ
セプターでトランスフェクトされた。

【０３０３】抗ＰＬＣγ−１抗体(Sanra Cruz Biotechn
ology 社)での免疫沈降は、抗ＰＹ−２０抗体(Transduc
tion Laboratories社)および抗ＰＬＣγ−１抗体でイム
ノブロットした。

【０３０４】(d)ＥＧＦ依存性膜ラフリング 野生型ＲａｓおよびＳｐｒｅｄ−１と共に、またはＳｐ
ｒｅｄ−１のないＥＧＦＰ−Ｒａｆでトランスフェクト
された２９３細胞は、一定期間の間ＥＧＦ（１００ｎｇ
／ｍｌ）で処理された。

【０３０５】類似の膜ラフリングおよび微小突起形成
は、Ｓｐｒｅｄ−1の存在に関係なく観察された。 Ｒａ
ｓは直接Ｓｐｒｅｄ−１は、Ｒａｆ活性を抑制すること
によってＥｌｋ−１およびＭＡＰキナーゼの活性を抑制
した。

【０３０６】上記試験の結果、Ｒａｓは直接的にＲａｆ
と相互作用し、Ｒａｆを活性化した。ＲａｆはＭＡＰキ
ナーゼをリン酸化し、かつ活性化した。Ｓｐｒｅｄ活性
化Ｒａｓ（Ｖ１２−Ｒａｓ）によって誘導されたＥＬｋ
−１の活性化を抑制したが、活性化ＭＥＫまたは活性化
Ｒａｆ(ΔＮ−Ｒａｆ)によって誘導されたＥＬｋ−１の
活性化を抑制しなかった。

【０３０７】それ故に、Ｓｐｒｅｄの標的は、おそらく
ＲａｓとＲａｆの間に局在している。この仮説を試験す
るために、ＥＧＦ誘導されたＲａｓおよびＲａｆ活性化
に関するＳｐｒｅｄ−１の影響を試験した(図１５)。興
味あることにＳｐｒｅｄは、Ｒａｓ活性化を維持した
が、一方ではインビトロ自動リン酸化(ＡｕｔｏＰ)によ
る測定(図１５)およびイン・ビトロキナーゼ・アッセイ
(図１６)によって測定されたのと同様にＲａｆ活性化を
抑制した。さらにｒａｓＧＡＰのように、Ｓｐｒｅｄ
は、Ｒａｆ活性化に必須とされるＳｅｒ３３８におい
て、Ｒａｆのリン酸化を抑制したが、Ｒａｆ活性化に必
須とされないＳｅｒ２５９においては抑制しなかった
(図１７)。このようにＳｐｒｅｄは、Ｒａｆの活性化を
抑制することによってＭＡＰキナーゼ活性を抑制する。
対照的に、Ｓｐｒｅｄは、ＥＧＦ−またはＶ１２−Ｒａ
ｓ−依存性Ａｋｔ活性化あるいはリン酸リパ−ゼ−Ｃγ
のＥＧＦ依存性チロシン・リン酸化に影響を与えなかっ
た、そしてＧＴＰ−結合蛋白Ｒａｃによって誘導される
ＥＧＦ依存性膜ラフリングもＳｐｒｅｄによって抑制さ
れなかった。

【０３０８】上記の結果は、ＳｐｒｅｄがＲａｓ−Ｒａ
ｆシグナル経路を特異的に抑制することが提言された。

【０３０９】６）ＲａｓおよびＲａｆとのＳｐｒｅｄの
相互作用 (a) 内因性のＳｐｒｅｄ−２およびＲａｓの相互作用 内因性のＳｐｒｅｄ−２はＣ２Ｃ１２細胞抽出物から前
免疫血清(Pre-immune)または抗Ｓｐｒｅｄ−２抗体（ａ
ｎｔｉ−Ｓｐｒｅｄ−２）で免疫沈降され、そして示さ
れた抗体でイムノブロットされた。結果は、図１８に示
される。図中、全細胞溶菌液(ＴＣＬ)のブロットもま
た、左側に見られる。

【０３１０】(b)Ｒａｓ、ＲａｆおよびＳｐｒｅｄ−１
の免疫局在 Ｃ２Ｃ１２細胞は、ＥＦＧレセプター、Ｍｙｃ−Ｓｐｒ
ｅｄ−１、およびＦｌａｇ−Ｒａｓ（図１９中の上の２
つのパネル）またはＭｙｃ−Ｓｐｒｅｄ−１、Ｆｌａｇ
−Ｒａｆおよび野性型(ＷＴ)Ｒａｓ(図１９中の下の２
つのパネル)によってトランスフェクションした。

【０３１１】５分間１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで刺激し
た後、細胞は固定され、Ｍｙｃタグを付けられた蛋白、
Ｆｌａｇタグを付けられた蛋白は、図１９中の左のパネ
ル、ＦＩＴＣ(緑)および中央のパネル、Ｃｙ３(赤)で、
右のパネルは、合体（Ｍｅｒｇｅ）された染色像をそれ
ぞれ接合された第二抗体で染色され、そしてレーザー共
焦顕微鏡検査を用いて視覚化した。 尚、図１９中の右
のパネルに示される矢印は、同時局在を示す。

【０３１２】(c)活性化Ｒａｓ、ＲａｆおよびＳｐｒｅ
ｄ−１の複合形成 Ｃ２Ｃ１２細胞は、Ｆｌａｇタグを付けられた野性型
(ＷＴ)Ｒａｓまたは構成的に活性化された（Ｖ１２）Ｒ
ａｓ、Ｍｙｃタグを付けられたＳｐｒｅｄ−１、Ｍｙｃ
タグを付けられたＲａｆでトランスフェクトされた。分
解産物は、抗Ｆｌａｇ抗体とともに免疫沈降に付し、そ
して９Ｅ１０（抗Ｍｙｃ）および抗Ｆｌａｇ抗体でイム
ノブロットされた。

【０３１３】(d)ＥＧＦに対する応答におけるＥＧＦＰ
−Ｒａｆの転座の時間経過 野生型ＲａｓおよびＳｐｒｅｄ−１(-)またはＳｐｒｅ
ｄ−２のないＥＧＦＰ−Ｒａｆでトランスフェクトされ
た２９３細胞は、ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理さ
れた。

【０３１４】さらにＣ２Ｃ１２細胞におけるＲａｓおよ
びＲａｆとのＳｐｒｅｄの相互作用について試験した結
果、免疫沈降の後、内因性のＲａｓとは同時沈降した
が、Ｒａｆとはしなかった内因性のＳｐｒｅｄ−２が４
０，０００(Mr40K)の推定分子量を持つ蛋白として特定
された(図１８)。

【０３１５】更に、ＲａｓおよびＳｐｒｅｄはプラズマ
膜に同時に局在し、ＥＧＦ刺激には非依存的であった。
ＲａｆはＳｐｒｅｄ−１の存在においてさえプラズマ膜
の中に輸送され、そしてＳｐｒｅｄ−１と同時局在した
(図１９)、このように、ＳｐｒｅｄによるＲａｆ活性化
の抑制は、Ｒａｓのエフェクタードメインの単純なマス
キングに負うものではないことが指摘される。さらにＲ
ａｆと活性化したＲａｓ(Ｖ１２−Ｒａｓ)の間の相互作
用に関してＳｐｒｅｄの効果を検討すると、Ｓｐｒｅｄ
によるＲａｆおよびＲａｓの間の相互作用の増加は、プ
ラズマ膜に対するＲａｆのＥＧＦ誘導された輸送の時間
経過をモニタリングすることによって確認された（図２
０）。

【０３１６】Ｒａｆは、Ｓｐｒｅｄ−１またはＳｐｒｅ
ｄ−２の過剰発現によってプラズマ膜においてより長く
存在していた。

【０３１７】このようにＳｐｒｅｄ蛋白質は、Ｒａｓ−
Ｒａｆ相互作用を強めることが判明した。

【０３１８】

【実施例】ヒトＳｐｒｅｄ−１およびＳｐｒｅｄ−２の
取得 本発明のヒトＳｐｒｅｄ−１およびヒトＳｐｒｅｄ−２
は、上記で得られたマウスＳｐｒｅｄ−１およびマウス
Ｓｐｒｅｄ−２のアミノ酸配列からＥＳＴデータベース
に対してtＢｌａｓｔｎサーチを行い取得した。

【０３１９】tＢｌａｓｔｎサーチは、アミノ酸配列か
ら核酸配列（ＤＮＡ配列）を検索する方法であり、直接
核酸（ＥＳＴ）配列を引き出し、それをつないで最後に
アミノ酸配列にするものである。

【０３２０】まずインターネット上のＢｌａｓｔ−ホー
ムページにアクセスした後、protein-nucleotide ＢＬ
ＡＳＴにアクセスし、tblastn法によってヒトＥＳＴお
よび nrデータベースを検索した。参考例で得られた配
列番号５のマウスＳｐｒｅｄ−１の アミノ酸配列を用
いて、tblastnサーチを行ない、登録されている相同性
の高いＥＳＴ配列を１０個得た。相同性の基準は、スコ
ア（score）が２００以上のもの、あるいはＥ−Ｖａｌ
ｕｅがｅ−５０以下のものを選択した。得られたＤＮＡ
配列を、オーバーラップを考慮して目視によりつなぎ合
わせた。かくして得られた４４４アミノ酸配列からなる
アミノ酸配列をコードするヒト遺伝子のＤＮＡ配列を、
ヒトＳｐｒｅｄ−１と命名した。

【０３２１】同様に配列番号６のマウスＳｐｒｅｄ−２
のアミノ酸配列を用いて、４１８アミノ酸配列からなる
アミノ酸配列をコードするヒト遺伝子のＤＮＡ配列を、
ヒトＳｐｒｅｄ−２と命名した。

【０３２２】その結果、 本発明のヒトＳｐｒｅｄ遺伝
子および該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の
Ｓｐｒｅｄ蛋白質は、マウスＳｐｒｅｄ−１とは核酸配
列で、９１．１％とアミノ酸配列９３．３％、またマウ
スＳｐｒｅｄ−２とは、８６．５％と９１．９％とそれ
ぞれ高い相同性を有していた。

【０３２３】このことから、本発明のヒトＳｐｒｅｄ遺
伝子によってコードされる蛋白は、マウスＳｐｒｅｄと
同様なＭＡＰキナーゼの活性を抑制する機能を有するこ
とが分かる。

【０３２４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. <120> New MAP kinase activity repressor <130> 302JP <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 444 <212> PRT <213> human <400> 1 Met Ser Glu Glu Thr Ala Thr Ser Asp Asn Asp Asn Ser Tyr Ala Arg 1 5 10 15 Val Arg Ala Val Val Met Thr Arg Asp Asp Ser Ser Gly Gly Trp Leu 20 25 30 Pro Leu Gly Gly Ser Gly Leu Ser Ser Val Thr Val Phe Lys Val Pro 35 40 45 His Gln Glu Glu Asn Gly Cys Ala Asp Phe Phe Ile Arg Gly Glu Arg 50 55 60 Leu Arg Asp Lys Met Val Val Leu Glu Cys Met Leu Lys Lys Asp Leu 65 70 75 80 Ile Tyr Asn Lys Val Thr Pro Thr Phe His His Trp Lys Ile Asp Asp 85 90 95 Lys Lys Phe Gly Leu Thr Phe Gln Ser Pro Ala Asp Ala Arg Ala Phe 100 105 110 Asp Arg Gly Ile Arg Arg Ala Ile Glu Asp Ile Ser Gln Gly Cys Pro 115 120 125 Glu Ser Lys Asn Glu Ala Glu Gly Ala Asp Asp Leu Gln Ala Asn Glu 130 135 140 Glu Asp Ser Ser Ser Ser Leu Val Lys Asp His Leu Phe Gln Gln Glu 145 150 155 160 Thr Val Val Thr Ser Glu Pro Tyr Arg Ser Ser Asn Ile Arg Pro Ser 165 170 175 Pro Phe Glu Asp Leu Asn Ala Arg Arg Val Tyr Met Gln Ser Gln Ala 180 185 190 Asn Gln Ile Thr Phe Gly Gln Pro Gly Leu Asp Ile Gln Ser Arg Ser 195 200 205 Met Glu Tyr Val Gln Arg Gln Ile Ser Lys Glu Cys Gly Ser Leu Lys 210 215 220 Ser Gln Asn Arg Val Pro Leu Lys Ser Ile Arg His Val Ser Phe Gln 225 230 235 240 Asp Glu Asp Glu Ile Val Arg Ile Asn Pro Arg Asp Ile Leu Ile Arg 245 250 255 Arg Tyr Ala Asp Tyr Arg His Pro Asp Met Trp Lys Asn Asp Leu Glu 260 265 270 Arg Asp Asp Ala Asp Ser Ser Ile Gln Phe Ser Lys Pro Asp Ser Lys 275 280 285 Lys Ser Asp Tyr Leu Tyr Ser Cys Gly Asp Glu Thr Lys Leu Ser Ser 290 295 300 Pro Lys Asp Ser Val Val Phe Lys Thr Gln Pro Ser Ser Leu Lys Ile 305 310 315 320 Lys Lys Ser Lys Arg Arg Lys Glu Asp Gly Glu Arg Ser Arg Cys Val 325 330 335 Tyr Cys Gln Glu Arg Phe Asn His Glu Glu Asn Ala Arg Gly Lys Cys 340 345 350 Gln Asp Ala Pro Asp Pro Ile Lys Arg Cys Ile Tyr Gln Val Ser Cys 355 360 365 Met Leu Cys Ala Glu Ser Met Leu Tyr His Cys Met Ser Asp Ser Glu 370 375 380 Gly Asp Phe Ser Asp Pro Cys Ser Cys Asp Thr Ser Asp Asp Lys Phe 385 390 395 400 Cys Leu Arg Trp Leu Ala Leu Val Ala Leu Ser Phe Ile Val Pro Cys 405 410 415 Met Cys Cys Tyr Val Pro Leu Arg Met Cys His Arg Cys Gly Glu Ala 420 425 430 Cys Gly Cys Cys Gly Gly Lys His Lys Ala Ala Gly 435 440 <210> 2 <211> 418 <212> PRT <213> human <400> 2 Met Thr Glu Glu Thr His Pro Asp Asp Asp Ser Tyr Ile Val Arg Val 1 5 10 15 Lys Ala Val Val Met Thr Arg Asp Asp Ser Ser Gly Gly Trp Phe Pro 20 25 30 Gln Glu Gly Gly Gly Ile Ser Arg Val Gly Val Cys Lys Val Met His 35 40 45 Pro Glu Gly Asn Gly Arg Ser Gly Phe Leu Ile His Gly Glu Arg Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Leu Val Val Leu Glu Cys Tyr Val Arg Lys Asp Leu Val 65 70 75 80 Tyr Thr Lys Ala Asn Pro Thr Phe His His Trp Lys Val Asp Asn Arg 85 90 95 Lys Phe Gly Leu Thr Phe Gln Ser Pro Ala Asp Ala Arg Ala Phe Asp 100 105 110 Arg Gly Val Arg Lys Ala Ile Glu Asp Leu Ile Glu Gly Ser Thr Thr 115 120 125 Ser Ser Ser Thr Ile His Asn Glu Ala Glu Leu Gly Asp Asp Asp Val 130 135 140 Phe Thr Thr Ala Thr Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ser Gln Lys Arg Glu 145 150 155 160 Gln Pro Thr Arg Thr Ile Ser Ser Pro Thr Ser Cys Glu His Arg Arg 165 170 175 Ile Tyr Thr Leu Gly His Leu His Asp Ser Tyr Pro Thr Asp His Tyr 180 185 190 His Leu Asp Gln Pro Met Pro Arg Pro Tyr Arg Gln Val Ser Phe Pro 195 200 205 Asp Asp Asp Glu Glu Ile Val Arg Ile Asn Pro Arg Glu Lys Ile Trp 210 215 220 Met Thr Gly Tyr Glu Asp Tyr Arg His Ala Pro Val Arg Gly Lys Tyr 225 230 235 240 Pro Asp Pro Ser Glu Asp Ala Asp Ser Ser Tyr Val Arg Phe Ala Lys 245 250 255 Gly Glu Val Pro Lys His Asp Tyr Asn Tyr Pro Tyr Val Asp Ser Ser 260 265 270 Asp Phe Gly Leu Gly Glu Asp Pro Lys Gly Arg Gly Gly Ser Val Ile 275 280 285 Lys Thr Gln Pro Ser Arg Gly Lys Ser Arg Arg Arg Lys Glu Asp Gly 290 295 300 Glu Arg Ser Arg Cys Val Tyr Cys Arg Asp Met Phe Asn His Glu Glu 305 310 315 320 Asn Arg Arg Gly His Cys Gln Asp Ala Pro Asp Ser Val Arg Thr Cys 325 330 335 Ile Arg Arg Val Ser Cys Met Trp Cys Ala Asp Ser Met Leu Tyr His 340 345 350 Cys Met Ser Asp Pro Glu Gly Asp Tyr Thr Asp Pro Cys Ser Cys Asp 355 360 365 Thr Ser Asp Glu Lys Phe Cys Leu Arg Trp Met Ala Leu Ile Ala Leu 370 375 380 Ser Phe Leu Ala Pro Cys Met Cys Cys Tyr Leu Pro Leu Arg Ala Cys 385 390 395 400 Tyr His Cys Gly Val Met Cys Arg Cys Cys Gly Gly Lys His Lys Ala 405 410 415 Ala Ala <210> 3 <211> 1620 <212> DNA <213> human <222> (1)...(1332) <400> 3 atgagcgagg agacggcgac ttctgacaac gataatagtt atgcacgagt gcgagctgtg 60 gtgatgaccc gagatgactc aagtggtgga tggttaccac ttggagggag tggactaagc 120 agcgtcactg tcttcaaagt ccctcatcag gaagagaatg gctgtgctga cttttttatc 180 cgtggagagc gactcaggga caaaatggtg gttttggaat gtatgcttaa aaaagacctc 240 atttataata aggtcactcc aacatttcac cactggaaga ttgatgacaa aaagtttggt 300 cttacgtttc aaagtcctgc tgatgctagg gcttttgata gaggtatccg aagagctata 360 gaggatattt ctcaaggatg ccccgaatca aaaaatgaag ctgaaggggc agatgactta 420 caagcaaatg aagaggattc ttccagttct ctagtgaagg atcacctttt tcagcaagag 480 acagttgtta ccagtgagcc ttatagaagc tcaaatataa gaccttctcc ctttgaagat 540 ctgaatgcca gaagagtcta catgcaaagc caagccaatc agataacatt tggtcagcca 600 ggcttggaca ttcagagcag aagtatggaa tacgtacagc ggcaaatatc caaggaatgt 660 ggaagcctaa agtcccaaaa tagggtccct ttgaaatcaa tcagacatgt cagctttcaa 720 gatgaggatg agattgtcag aataaaccct cgagatatct taatacgtcg ctatgcagac 780 tacagacatc ctgacatgtg gaaaaatgac ttggaaagag atgatgctga ttccagtatt 840 cagttttcta aaccagacag taaaaaatca gactatctgt actcttgtgg ggatgagact 900 aagttaagtt cacccaaaga ctctgtggta tttaagacgc agccttcctc attaaaaatt 960 aagaagtcaa aacgaagaaa agaggatggt gaacgttctc gctgcgtata ctgccaggaa 1020 aggtttaatc atgaagaaaa tgccagggga aaatgtcagg atgctccaga ccctattaaa 1080 agatgcatat atcaagttag ttgcatgctc tgtgcagaga gcatgttgta tcattgtatg 1140 tcagactcag agggagattt ttctgatccc tgttcgtgtg acactagcga cgacaagttc 1200 tgcttgcgat ggttagccct tgtagctttg tctttcattg taccatgtat gtgctgctac 1260 gtccctttga gaatgtgcca tcgctgtggt gaggcatgtg gttgctgtgg tgggaaacat 1320 aaagctgctg gatgaaatgg tccagtgcca aaatgagctt aaaatctttg ttttcaggaa 1380 ttagctaact tggatttgtg gaagcttttg gcaagcaata tggaatcttg cctggtatca 1440 ttgagcccac acatggagga agcagaactc atcagttctt ggcgtttcac gccatgccta 1500 acttttccct tgagtgcatg gcatgttttg ttacaggttg tagagtattt gcagaaggaa 1560 accatttctg gttatttggc tataaaaagt cagcataaaa tatgatccaa ctaaaaggga 1620 <210> 4 <211> 1364 <212> DNA <213> human <222> (1)...(1254) <400> 4 atgaccgaag aaacacaccc agacgatgac agctatattg tgcgtgtcaa ggctgtggtt 60 atgaccagag atgactccag cgggggatgg ttcccacagg aaggaggcgg gatcagtcgc 120 gtcggggtct gtaaggtcat gcaccccgaa ggcaatggac gaagcggctt tctcatccat 180 ggtgaacgac agaaagacaa actggtggta ttggaatgct atgtaagaaa ggacttggtc 240 tacaccaaag ccaatccaac gtttcatcac tggaaggtcg ataataggaa gtttggactt 300 actttccaaa gccctgctga tgcccgagcc tttgacaggg gagtaaggaa agcaatcgaa 360 gaccttatag aaggttcaac aacgtcatct tccaccatcc ataatgaagc tgagcttggc 420 gatgatgacg tttttacaac agctacagac agttcttcta attcctctca gaagagagag 480 caacctactc ggacaatctc ctctcccaca tcctgtgagc accggaggat ttataccctg 540 ggccacctcc acgactcata ccccacagac cactatcacc tcgatcagcc gatgccaagg 600 ccctaccgcc aggtgagctt cccggacgac gacgaggaga tcgtgcgcat caacccccgg 660 gagaagatct ggatgacggg gtacgaggat taccggcacg cacccgtcag gggcaagtac 720 ccggacccct cggaggacgc ggactcctcc tacgtgcgct tcgccaaggg cgaggtcccc 780 aagcatgact acaactaccc ctacgtggac tcctcagact ttggcctagg cgaggacccc 840 aaaggccgcg ggggcagcgt gatcaagacg cagccctccc ggggcaagtc gcggcggcgg 900 aaggaggacg gagagcgctc gcggtgcgtg tactgcaggg acatgttcaa ccacgaggag 960 aaccgccggg gccactgcca ggacgcgccc gactccgtga gaacttgcat ccgccgggtg 1020 agctgcatgt ggtgcgcgga cagcatgctc tatcactgta tgtcggaccc cgagggagac 1080 tatacagacc cttgctcgtg cgatactagc gacgagaagt tttgcctccg gtggatggct 1140 cttattgcct tgtctttcct ggccccctgt atgtgctgtt acctgcccct tcgggcctgc 1200 taccactgcg gagtgatgtg caggtgctgt ggcgggaagc acaaagcggc cgcgtgactc 1260 agtttccctc ccttctccct ccatccgcag ccacagggga actcgtctct tacatactct 1320 catcttctcc cccgatacag cgaccaggta tgaacaacag tgca 1364 <210> 5 <211> 444 <212> PRT <213> mouse <400> 5 Met Ser Glu Glu Thr Ala Thr Ser Asp Asn Asp Asn Ser Tyr Ala Arg 1 5 10 15 Val Arg Ala Val Val Met Thr Arg Asp Asp Ser Ser Gly Gly Trp Leu 20 25 30 Pro Leu Gly Gly Ser Gly Leu Ser Ser Val Thr Val Phe Arg Val Pro 35 40 45 His Gln Glu Glu Asn Gly Cys Ala Asp Phe Phe Ile Arg Gly Glu Arg 50 55 60 Leu Arg Asp Lys Met Val Val Leu Glu Cys Met Leu Lys Lys Asp Leu 65 70 75 80 Ile Tyr Asn Lys Val Thr Pro Thr Phe His His Trp Lys Ile Asp Asp 85 90 95 Lys Lys Phe Gly Leu Thr Phe Gln Ser Pro Ala Asp Ala Arg Ala Phe 100 105 110 Asp Arg Gly Ile Arg Arg Ala Ile Glu Asp Ile Ser Leu Gly Cys Pro 115 120 125 Ala Ser Lys Thr Glu Ala Glu Gly Gly Asp Asp Asp Leu Gln Thr Thr 130 135 140 Glu Glu Asp Thr Ser Arg Ser Leu Val Lys Asp His Phe Phe Gln Gln 145 150 155 160 Glu Thr Val Val Thr Ser Glu Pro Tyr Arg Ser Ser Asp Ile Arg Pro 165 170 175 Leu Pro Phe Glu Asp Leu Asn Ala Arg Arg Val Tyr Leu Gln Ser Gln 180 185 190 Val Ser Gln Ile Pro Phe Ser Gln Gln Gly Leu Asp Ile Gln Ser Arg 195 200 205 Ser Met Glu Tyr Val Gln Arg Gln Ile Ser Lys Glu Cys Gly Ser Leu 210 215 220 Lys Ser Gln Thr Arg Val Pro Leu Lys Ser Ile Arg His Val Ser Phe 225 230 235 240 Gln Asp Glu Asp Glu Ile Val Arg Ile Asn Pro Arg Asp Ile Leu Ile 245 250 255 Arg Arg Tyr Ala Asp Tyr Arg His Pro Asp Met Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 Glu Arg Asp Asp Thr Asp Ser Ser Val Pro Phe Ser Lys Gln Asp Ser 275 280 285 Lys Lys Ser Asp Tyr Leu Tyr His Cys Gly Asp Glu Thr Lys Leu Ser 290 295 300 Ser Leu Lys Asp Ser Val Val Phe Lys Thr Gln Pro Pro Ser Leu Lys 305 310 315 320 Phe Lys Ser Lys Arg Arg Lys Glu Asp Gly Glu Arg Ser Arg Cys Val 325 330 335 Tyr Cys Gln Glu Arg Phe Asn His Glu Glu Asn Ala Arg Gly Lys Cys 340 345 350 Gln Asp Ala Pro Asp Pro Val Lys Arg Cys Ile Tyr Gln Val Ser Cys 355 360 365 Met Leu Cys Ala Glu Ser Met Leu Tyr His Cys Met Ser Asp Ser Glu 370 375 380 Gly Asp Phe Ser Asp Pro Cys Ser Cys Asp Thr Ser Asp Asp Lys Phe 385 390 395 400 Cys Leu Arg Trp Leu Ala Leu Val Ala Leu Ser Phe Ile Val Pro Cys 405 410 415 Met Cys Cys Tyr Val Pro Leu Arg Met Cys His Arg Cys Gly Glu Ala 420 425 430 Cys Gly Cys Cys Gly Gly Lys His Lys Ala Ala Gly 435 440 <210> 6 <211> 410 <212> PRT <213> mouse <400> 6 Met Thr Glu Glu Thr His Pro Asp Asp Asp Ser Tyr Ile Val Arg Val 1 5 10 15 Lys Ala Val Val Met Thr Arg Asp Asp Ser Ser Gly Gly Trp Phe Pro 20 25 30 Gln Glu Gly Gly Gly Ile Ser Arg Val Gly Val Cys Lys Val Met His 35 40 45 Pro Glu Gly Asn Gly Arg Ser Gly Phe Leu Ile His Gly Glu Arg Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Leu Val Val Leu Glu Cys Tyr Val Arg Lys Asp Leu Val 65 70 75 80 Tyr Thr Lys Ala Asn Pro Thr Phe His His Trp Lys Val Asp Asn Arg 85 90 95 Lys Phe Gly Leu Thr Phe Gln Ser Pro Ala Asp Ala Arg Ala Phe Asp 100 105 110 Arg Gly Val Arg Lys Ala Ile Glu Asp Leu Ile Glu Gly Ser Thr Thr 115 120 125 Ser Ser Ser Thr Leu His Asn Glu Ala Glu Leu Gly Asp Asp Asp Val 130 135 140 Phe Thr Thr Ala Thr Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ser Gln Lys Arg Glu 145 150 155 160 Pro Thr Thr Arg Thr Ile Ser Ser Pro Thr Ser Cys Glu His Arg Lys 165 170 175 Ile Tyr Thr Leu Asp Pro Tyr Pro Met Asp His Tyr His Pro Asp Gln 180 185 190 Arg Leu Pro Arg Ser Tyr Pro Gln Val Thr Phe Pro Glu Asp Asp Glu 195 200 205 Glu Ile Val Arg Ile Asn Pro Arg Glu Lys Ile Trp Met Thr Gly Tyr 210 215 220 Glu Asp Tyr Arg His Ala Pro Val Arg Gly Lys Tyr Leu Asp Thr Thr 225 230 235 240 Glu Asp Ala Asp Ser Tyr Val Arg Phe Ala Lys Gly Glu Val Pro Lys 245 250 255 His Glu Tyr Thr Tyr Pro Tyr Val Asp Ser Ser Asp Phe Gly Phe Gly 260 265 270 Glu Asp Pro Lys Gly Ser Val Ile Lys Thr Gln Pro Pro Arg Ala Lys 275 280 285 Ser Arg Arg Arg Lys Glu Asn Gly Glu Arg Ser Arg Cys Val Tyr Cys 290 295 300 Arg Asp Met Phe Asn His Glu Glu Asn Arg Arg Gly His Cys Gln Asp 305 310 315 320 Ala Pro Asp Ala Val Arg Thr Cys Ile Arg Arg Val Ser Cys Met Trp 325 330 335 Cys Ala Asp Ser Met Leu Tyr His Cys Met Ser Asp Pro Glu Gly Asp 340 345 350 Tyr Thr Asp Pro Cys Ser Cys Asp Thr Ser Asp Glu Lys Phe Cys Leu 355 360 365 Arg Trp Met Ala Leu Ile Ala Leu Ser Phe Leu Ala Pro Cys Met Cys 370 375 380 Cys Tyr Leu Pro Leu Arg Ala Cys His Arg Cys Gly Val Met Cys Arg 385 390 395 400 Cys Cys Gly Gly Lys His Lys Ala Ala Ala 405 410 <210> 7 <211> 1335 <212> DNA <213> mouse <222> (1)...(1332) <400> 7 atgagcgagg agacggcgac ttctgacaac gataatagtt atgcacgagt gcgagctgtg 60 gtgatgacca gagatgactc aagtggtgga tggctaccac tcggagggag cggactgagc 120 agcgtcactg tcttcagagt ccctcatcag gaagagaatg gctgtgcgga cttttttatc 180 cgtggagaga gactcagaga caaaatggtg gttttggaat gtatgcttaa gaaagacctc 240 atctataata aggtcactcc cacatttcac cactggaaga tcgatgacaa gaagtttggc 300 cttacctttc agagtcctgc tgatgccagg gcttttgatc gaggcattcg aagagctata 360 gaggatatat ctctagggtg cccagcgtca aaaactgagg ctgaaggagg agatgatgat 420 ttacaaacga ctgaagaaga cacttcccgt tccctagtga aagatcactt tttccagcaa 480 gagacagttg ttaccagtga accttacaga agctcagaca taagaccgtt accctttgaa 540 gatctgaatg ccagaagagt ctacttgcaa agccaagtca gccagatacc attcagtcag 600 caaggcctag acattcagag ccgaagtatg gaatatgtac agcggcaaat atctaaggaa 660 tgtgggagcc taaagtccca aactagggtc cctttgaagt caatcagaca tgtcagcttt 720 caagatgagg atgagattgt tagaataaat cctcgagata tcttaatacg tcgatatgca 780 gactacagac atccggacat gtggaaaaat gacttggaga gagatgatac tgactccagt 840 gttccatttt ctaaacaaga cagtaaaaag tcagactatc tctaccactg tggggatgag 900 actaagttaa gttctctgaa agactctgtg gtatttaaga cacagcctcc ctcgttaaaa 960 tttaagtcaa aacgaagaaa agaggatggg gaacgttctc gctgcgtata ctgccaggaa 1020 aggtttaatc atgaagaaaa cgccaggggg aaatgccagg acgctccaga tcctgttaaa 1080 agatgcatat atcaagttag ctgcatgctc tgtgctgaga gcatgctata tcattgtatg 1140 tcagactcag agggagactt ttctgatcct tgttcgtgtg acactagcga tgacaagttc 1200 tgcctaaggt ggttagccct ggtagctctg tctttcattg taccatgtat gtgctgctac 1260 gtccctttga gaatgtgcca tcgctgtggt gaggcatgcg ggtgctgtgg tgggaaacat 1320 aaggctgctg ggtga 1335 <210> 8 <211> 1233 <212> DNA <213> mouse <222> (1)...(1230) <400> 8 atgaccgaag aaacacaccc ggacgatgac agctatattg tgcgtgtcaa ggctgtggtt 60 atgaccagag atgactccag cgggggatgg ttcccacagg aaggaggcgg gatcagtcgc 120 gtcggcgtgt gtaaggtcat gcaccctgaa ggcaacggac gaagcggctt tctcatccat 180 ggcgagcgac agaaagacaa actggtggta ttggaatgct atgtcagaaa ggacttggtc 240 tacaccaaag ccaatccgac gtttcatcat tggaaggttg ataacaggaa gtttggactt 300 actttccaaa gtcctgcaga tgcacgagcc tttgacaggg gcgtgagaaa agccattgaa 360 gaccttatag aaggttcaac gacctcctct tccactctcc ataacgaagc tgagctcgga 420 gacgatgacg ttttcacgac agctacggac agttcttcta attcctcgca gaagagggag 480 ccgactacga ggacaatctc ctcccccacg tcctgtgagc accggaagat ttataccctt 540 gacccatacc ccatggacca ttaccaccct gaccagcggt tgccgcggtc ctacccccag 600 gtcaccttcc cagaagatga tgaagaaatt gtacgcatca acccccgaga gaagatctgg 660 atgaccggtt atgaagacta ccggcacgcg ccggttcgcg gcaaatactt agacaccaca 720 gaagacgcgg actcctacgt gcgcttcgcc aagggcgaag tccccaaaca cgaatatacc 780 tatccctatg ttgattcttc ggacttcggc ttcggggagg atcccaaagg tagtgtgatc 840 aagacacagc cgcccagggc caagtcccgt cggcggaagg agaacggcga acggtcgcgg 900 tgtgtgtact gcagggatat gtttaatcac gaagagaacc gaaggggcca ctgccaagac 960 gcgcccgacg ccgtgagaac ttgcattcgc cgggtgagct gtatgtggtg cgcggacagc 1020 atgctgtacc actgtatgtc cgaccccgag ggagactaca ctgacccttg ttcgtgtgac 1080 acaagcgatg agaagttttg cctccggtgg atggctctaa ttgccttgtc tttcctggcc 1140 ccttgtatgt gctgttacct gcccctccgg gcctgccacc gctgtggagt gatgtgcagg 1200 tgctgtggtg ggaagcacaa agccgccgcg tga 1233 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> mouse <400> 9 Phe Lys Ser Lys Arg Arg Lys Glu Asp Gly Glu Arg Ser Arg Cys 1 5 10 15 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> mouse <400> 10 Ile Lys Thr Gln Pro Pro Arg Ala Lys Ser Arg Arg Arg Lys Glu Asn 1 5 10 15 Gly Glu Cys

【図面の簡単な説明】

【図１】マウスＳｐｒｏｕｔｙ−４およびマウスＶＡＳ
ＰとのマウスＳｐｒｅｄ−１およびマウスＳｐｒｅｄ−
２のドメイン構造の比較図を示す図である。

【図２】幹細胞因子（ＳＣＦ）に対する応答における２
９３細胞において発現したＭｙｃタグ付けされたＳｐｒ
ｅｄ−１（Ｍｙｃ−Ｓｐｒｅｄ−１）のチロシンリン酸
化(ＰＹ)を示す図である。

【図３】Ｓｐｒｅｄの細胞膜の局在を示す図である。

【図４】ＰＣ１２細胞の分化に関するＳｐｒｅｄの影響
を示す図である。

【図５】Ｅｒｋ２活性化に関するＳｐｒｅｄ−１の効果
を示す図である。

【図６】Ｓｐｒｅｄ蛋白に対する抗体のマイクロインジ
ェクションによる内因性のＳｐｒｅｄ阻害を示す図であ
る。

【図７】Ｅｒｋ２活性化に関するＳｐｒｅｄ抗体の影響
を示す図である。

【図８】Ｃ末端欠失したＳｐｒｅｄ−１変異体、ドミナ
ント・ネガティブの影響を示す図である。

【図９】Ｃ末端欠失したＳｐｒｅｄ−１変異体、ドミナ
ント・ネガティブの影響を示す図である。

【図１０】Ｃ２Ｃ１２細胞に筋肉様細胞分化の間のＳｐ
ｒｅｄ−１の発現のタイムコースを示す図である。

【図１１】野生型Ｓｐｒｅｄ−１（Ｓｐｒｅｄ−１ Ｗ
Ｔ）、野生型Ｓｐｒｅｄ−２（Ｓｐｒｅｄ−１ Ｗ
Ｔ）、またはドミナントネガティブＲａｓ（Ｎ１７−Ｒ
ａｓ）の、Ｃ２Ｃ１２細胞分化への影響を示す図であ
る。

【図１２】野生型Ｓｐｒｅｄ−１（Ｓｐｒｅｄ−１ Ｗ
Ｔ）または野生型Ｓｐｒｅｄ−２（Ｓｐｒｅｄ−１ Ｗ
Ｔ）が、Ｅｒｋ２活性化を抑制することを示す図であ
る。

【図１３】Ｃ末端欠失したＳｐｒｅｄ−１（Ｓｐｒｅｄ
−１ΔＣ）またはＳｐｒｅｄ−２（Ｓｐｒｅｄ−２Δ
Ｃ）のＣ２Ｃ１２細胞分化への影響を示す図である。

【図１４】Ｃ末端欠失したＳｐｒｅｄ−１またはＳｐｒ
ｅｄ−２構築物（Ｓｐｒｅｄ−１ΔＣまたはＳｐｒｅｄ
−２ΔＣ）、あるいは構築物中に活性化されたＲａｆ
（ΔＮ−Ｒａｆ）でトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２
細胞が、高いＭＡＰキナーゼ活性を維持することを示す
図である。

【図１５】ＥＧＦ誘導されたＲａｓおよびＲａｆ活性化
に関するＳｐｒｅｄ−１の影響を示した図である。

【図１６】ＭＡＰキナーゼカスケード構成物とミエリン
塩基蛋白質（ＭＢＰ）を用いるイン・ビトロ キナーゼ
・アッセイにより、Ｒａｆキナーゼ活性を抑制すること
を示した図である。

【図１７】Ｒａｆリン酸化におけるＳｐｒｅｄ−１の影
響を示した図である。

【図１８】Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＲａｓおよびＲａｆ
とのＳｐｒｅｄの相互作用について試験した結果を示す
図である。

【図１９】Ｒａｓ、ＲａｆおよびＳｐｒｅｄ−１の免疫
局在を示す図である。

【図２０】Ｒａｆと活性化したＲａｆ（Ｖ１２−Ｒａ
ｓ）の間の相互作用に関してＳｐｒｅｄの効果を示した
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ａ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/64 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB24 CB01 DA13 DA36 FA16 FB01 FB02 FB03 FB12 GC15 4B024 AA01 AA11 BA80 CA01 GA11 HA11 HA20 4B063 QA18 QQ53 QQ95 QR07 QR08 QR42 QR48 QR55 QR62 QS26 QS33 QS34 QX01 4B065 AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 AA07 AA13 BA01 BA02 BA08 BA22 CA18 DC50 NA14 NA20 ZB261 ZC192 ZC412 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA55 EA28 EA51 FA74

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の（ａ）から（ｆ）のいずれかのポリ
   ヌクレオチドを含むヒト遺伝子： （ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポ
   リペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相
   補鎖、（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列から
   なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し
   て少なくとも９５％の相同性を持っている塩基配列から
   なり、かつＭＡＰキナーゼ活性抑制作用を有するポリペ
   プチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補
   鎖、（ｃ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列におい
   て、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは
   付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＡＰキナーゼ
   活性抑制作用を有するポリペプチドをコードするポリヌ
   クレオチドまたはその相補鎖、（ｄ）配列番号：２で示
   されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする
   ポリヌクレオチドまたはその相補鎖、（ｅ）配列番号：
   ２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコー
   ドするポリヌクレオチドに対して少なくとも９５％の相
   同性を持っている塩基配列からなり、かつＭＡＰキナー
   ゼ活性抑制作用を有するポリペプチドをコードするポリ
   ヌクレオチドまたはその相補鎖、（ｆ）配列番号：２で
   示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のア
   ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列か
   らなり、かつＭＡＰキナーゼ活性抑制作用を有するポリ
   ペプチド、をコードするポリヌクレオチドまたはその相
   補鎖。
2. 【請求項２】配列番号：１で示されるアミノ酸配列から
   なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは
   その相補鎖からなる請求項１に記載の遺伝子。
3. 【請求項３】配列番号：２で示されるアミノ酸配列から
   なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは
   その相補鎖からなる請求項１に記載の遺伝子。
4. 【請求項４】以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかのポリ
   ヌクレオチドからなるヒト遺伝子： （ａ）配列番号：３で示される塩基配列からなるポリヌ
   クレオチドまたはその相補鎖、（ｂ）配列番号：３で示
   される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジ
   ェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
   からなり、かつＭＡＰキナーゼ活性抑制作用を有するポ
   リペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相
   補鎖、（ｃ）配列番号：４で示される塩基配列からなる
   ポリヌクレオチドまたはその相補鎖、（ｄ）配列番号：
   ４で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとスト
   リンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレ
   オチドからなり、かつＭＡＰキナーゼ活性抑制作用を有
   するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは
   その相補鎖。
5. 【請求項５】配列番号：３で示される塩基配列である請
   求項４に記載の遺伝子。
6. 【請求項６】配列番号：４で示される塩基配列である請
   求項４に記載の遺伝子。
7. 【請求項７】請求項１から６のいずれか１項に記載の遺
   伝子発現産物。
8. 【請求項８】請求項１から６のいずれか１項に記載の遺
   伝子が挿入された組換え体発現ベクター。
9. 【請求項９】請求項８に記載の組換え体発現ベクターを
   有する宿主細胞。
10. 【請求項１０】請求項７に記載の遺伝子発現産物または
    それらの部分断片に結合性を有する抗体または抗体断
    片。
11. 【請求項１１】以下の（ａ）から（ｆ）のいずれかのポ
    リペプチド： （ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるポ
    リペプチド、（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配
    列からなるポリペプチドに対して少なくとも９５％の相
    同性を持っているアミノ酸配列からなり、かつＭＡＰキ
    ナーゼ活性抑制作用を有するポリペプチド、（ｃ）配列
    番号：１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは
    複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
    ノ酸配列からなり、かつＭＡＰキナーゼ活性抑制作用を
    有するポリペプチド、（ｄ）配列番号：２で示されるア
    ミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｅ）配列番号：２
    で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して
    少なくとも９５％の相同性を持っているアミノ酸配列か
    らなり、かつＭＡＰキナーゼ活性抑制作用を有するポリ
    ペプチド、（ｆ）配列番号：２で示されるアミノ酸配列
    において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若
    しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＡＰキ
    ナーゼ活性抑制作用を有するポリペプチド。
12. 【請求項１２】配列番号：１で示されるアミノ酸配列か
    らなる請求項１１に記載のポリペプチド。
13. 【請求項１３】配列番号：２で示されるアミノ酸配列か
    らなる請求項１１に記載のポリペプチド。
14. 【請求項１４】請求項１１に記載のポリペプチドまたは
    それらの部分断片に結合性を有する抗体または抗体断
    片。
15. 【請求項１５】ａ）生理的条件下において、ＭＡＰキナ
    ーゼ活性抑制作用を促進するために被検物質を処理する
    のに十分な時間の間、適当な反応培地／溶液中において
    請求項１から６のいずれか１項に記載の遺伝子発現産物
    に対して被検物質を提示させる工程、 ｂ）被検物質の存在下の前記ＭＡＰキナーゼ活性抑制作
    用に対する比較において、請求項１から６のいずれか１
    項に記載の遺伝子発現産物の該ＭＡＰキナーゼ活性抑制
    作用の促進を検出し、そしてＭＡＰキナーゼ活性抑制作
    用を促進する被検物質の存在を特定する工程を含む、請
    求項１から６のいずれか１項に記載の遺伝子発現産物の
    ＭＡＰキナーゼ活性抑制作用を促進する候補化合物のス
    クリーニング方法。
16. 【請求項１６】ａ）生理的条件下において、Ｒａｆ活性
    の抑制を促進するために被検物質を処理するのに十分な
    時間の間、適当な反応培地／溶液中において請求項１か
    ら６のいずれか１項に記載の遺伝子発現産物に対して被
    検物質を提示させる工程、 ｂ）被検物質の存在下の前記Ｒａｆ活性抑制に対する比
    較において、請求項１から６のいずれか１項に記載の遺
    伝子発現産物の該Ｒａｆ活性抑制の促進を検出し、そし
    てＲａｆ活性の抑制を促進する被検物質の存在を特定す
    る工程を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の
    遺伝子発現産物のＲａｆ活性の抑制を促進する候補化合
    物のスクリーニング方法。
17. 【請求項１７】請求項１５または１６に記載のスクリー
    ニング方法を用いて、抗腫瘍作用を有する化合物を特定
    する医薬のスクリーニング方法。
18. 【請求項１８】請求項１から６のいずれか１項に記載の
    遺伝子発現産物または請求項１１から１３に記載のいず
    れか１項に記載のポリペプドを有効成分として用いる抗
    腫瘍剤。