JP3294575B2 - Ｉｇｆ−１レセプターと相互作用するタンパク質、それをコードする遺伝子及びそれらの使用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＩＧＦ−１レセプ
ターと相互作用するタンパク質（ＩＩＰｓ）、それをコ
ードする核酸、特に癌の分野における、診断及び治療の
ためのそれらの使用に関する。特に、本発明は、哺乳動
物細胞、特に悪性腫瘍細胞における前記遺伝子の診断
に、ＩＧＦ−１レセプターとＩＩＰとの間の相互作用を
阻害するための遺伝子治療方法に、潜在的な癌治療剤に
ついてスクリーニングする方法に、並びにＩＩＰとＩＧ
Ｆ−１レセプターとの間の相互作用を阻害する潜在的に
役立つ医薬剤をスクリーニングし、及び評価するのに役
立つ細胞系及び動物モデルに関する。

【０００２】本発明は、特に、遺伝子ＩＩＰ−１０及び
その遺伝子産物のクローニング及びキャラクタリゼーシ
ョンに関する。該遺伝子産物（ポリペプチド、ｍＲＮ
Ａ）は、特にＩＧＦ−１レセプターシグナル伝達経路を
調節する能力を有するとしてキャラクタライズされる。
それゆえ、本発明による遺伝子産物の機能は、ＩＧＦレ
セプターのシグナル伝達を調節することである。それゆ
え、ＩＩＰの強制的な活性化は、腫瘍細胞増殖性、生存
性及びアポトーシスの回避性の増加と相関する。

【０００３】

【従来の技術】ＩＧＦ−１レセプターシグナル伝達シス
テムは、腫瘍増殖及び生存に重要な役割を果たし、腫瘍
アポトーシスの阻害に関連する。加えて、そしてその有
系分裂促進特性と独立して、ＩＧＦ−１Ｒ活性化は、試
験管内及び生体内でプログラムされた細胞死に対して保
護し、又は少くともそれを遅らせることができる（Harr
ingtonら、EMBO J. 13 (1994) 3286-3295 ; Sellら、Ca
ncer Res. 55 (1995) 303-305 ; Singleton ら、Cancer
Res. 56 (1996) 4522-4529)。野生型のレベル未満のＩ
ＧＦ−１Ｒのレベルの減少は、生体内での腫瘍細胞の広
範囲のアポトーシスを引きおこすことも示されている。
リガンド（ＩＧＦ）及び／又はレセプターのいずれかの
過剰発現は種々の腫瘍細胞系の特徴であり、動物モデル
において腫瘍形成を導き得る。ヒトＩＧＦ−１Ｒの過剰
発現はＮＩＨ３Ｔ３又はＲａｔ−１繊維芽細胞のリガン
ド依存性固着独立性の増殖を導き、これらの細胞の接種
はヌードマウスにおいて迅速な腫瘍形成を引きおこす
（Kalekoら、Mol. Cell. Beiol. 10 (1990) 464-473 ;
Pragerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 218
1-2185) 。乳腺において特異的にＩＧＦ−IIを過剰な発
現するトランスジェニックマウスは乳癌を発達させ（Ba
ste ら、Br. J. Cancer 72 (1995) 1189-1193)、より一
般的なプロモーターの制御下でＩＧＦ−IIを過剰発現す
るトランスジェニックマウスは多数の広範囲の腫瘍型を
発達させる（Roglerら、J. Biol. Chem. 269 (1994) 13
779-13784)。極めて高頻度（８０％超）でＩＧＦ−１又
はＩＧＦ−IIを過剰発現するヒト腫瘍についての多くの
うちの一例は、小細胞肺癌である（Quinn ら、J. Biol.
Chem. 271 (1996) 11477-11483)。ＩＧＦシステムによ
るシグナル伝達は、特定のオンコジーンの形質転換活性
のためにも必要とされるようである。ＩＧＦ−１Ｒ遺伝
子の破壊を伴う胎児繊維芽細胞は、ＳＶ４０Ｔ抗原、活
性化Ｈａ−ｒａｓ、両方の組合せによって形質転換する
ことができず（Sellら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
0 (1993) 11217-11221 : Sell ら、Mol. Cell.Biol. 14
(1994) 3604-3612) 、ウシパピローマウイルスのＥ５
タンパク質も、もはや形質転換することができない（Mo
rrioneら、J. Virol. 69 (1995) 5300-5303)。ＩＧＦ／
ＩＧＦ−１Ｒシステムでの干渉が形質転換された表現型
を逆転し、腫瘍増殖を阻害することも示された（Trojan
et al., Science 259 (1993) 94-97 ; Kalebic et a
l., Cancer Res. 54 (1994) 5531-5534 ; Prager et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 2181-2185
; Resnicoff et al., CancerRes. 54 (1994) 2218-222
2 ; Resnicoff et al., Cancer Res. 54 (1994) 4848-4
850 ; Resnicoff et al., Cancer Res. 55 (1995) 2463
-2469)。例えば、ＩＧＦ−１ＲアンチセンスｃＤＮＡ
（７２９bp）がトランスフェクトされたラット前立腺癌
細胞（ＰＡ−III ）を注入したマウスは、６０日後の観
察で、対照より９０°に小さい、腫瘍を発達させ、又は
腫瘍のない状態を維持した（Burfeindら、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 93 (1996) 7263-7268) 。アポトーシス
に対するＩＧＦ−１Ｒが媒介する保護は新たな遺伝子発
現及びタンパク質合成と独立している。これにより、Ｉ
ＧＦ−１は、予め形成されたサイトソルメディエーター
の活性化により抗アポトーシス機能を発揮する。

【０００４】ＩＧＦ−１Ｒに結合する特定のシグナル伝
達基質（例えば、ＩＲＳ−１，ＳＨＣ，ｐ８５ Ｐ１３
キナーゼ等、詳細については以下を参照のこと）が開示
されている。しかしながら、ＩＧＦ−１Ｒに特有である
これらの伝達体はなく、インスリンレセプターを含む他
のレセプターチロシンキナーゼと比べてＩＧＦ−１Ｒの
特有の生物学的特徴についての排他的な原因となり得
た。これは、ＩＧＦ−１Ｒ（又は少くともＩＧＦ−レセ
プターサブファミリー）の特定の標的が生存能を誘発
し、アポトーシスを打ち消す存在であり得、これにより
抗癌治療のための主な医薬標的であることを示す。

【０００５】イースト２−ハイブリッドシステムを用い
ることにより、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ
（ＰＩ３Ｋ）の調節ドメイン、ｐ８５がＩＧＦ−１Ｒと
相互作用することが示された（Lamothe, Bら、FEBS Let
t. 373 (1995) 51-55 ; Tartare - Decker, S ら、Endo
crinology 137 (1996) 1019-1024) 。しかしながら、ｐ
８５の、本質的に全てのファミリーの多くの他のレセプ
ターチロシンキナーゼへの結合も見られる。２−ハイブ
リッドスクリーニングにより規定されるＩＧＦ−１Ｒの
別の結合パートナーは、ｔｒｋ，ｍｅｔ，ＥＧＦ−Ｒ及
びインスリンレセプターのような他のチロシンキナーゼ
にも結合するＳＨＣである（Tarare - Deckert, S ら、
J. Biol. Chem. 270 (1995) 23456-23460)。インスリン
レセプター基質１（ＩＲＳ−１）及びインスリンレセプ
ター基質２（ＩＲＳ−２）はＩＧＦ−１Ｒ及びインスリ
ンレセプターの両方と相互作用することも見い出されて
いる（Tartare - Deckert, S., et al., J. Biol. Che
m. 270 (1995) 23456-23460; He, W., et al., J. Bio
l. Chem. 271 (1996) 11641-11645 ; Dey, R.B., eta
l., Mol. Endocrinol. 10 (1996) 631-641) 。ＩＧＦ−
１Ｒと相互作用するＧｒｂｌｏは結合パートナーとして
多くのチロシンキナーゼ、例えばｍｅｔ、インスリンレ
セプター、ｋｉｔ及びａｂｌを共有する（Dey, R.B
ら、Mol. Endocrinol. 10 (1996) 631-641 ; Morrione,
A. ら、Cancer Res. 56 (1996) 3165-3167)。ホスファ
ターゼＰＴＰＩＤ（ｓｙｐ）は、極めて無差別的な結合
能力も示し、即ちＩＧＦ−１Ｒ、インスリンレセプタ
ー、ｍｅｔ及び他のものにも結合する（Rocchi, S.,
ら、Endocrinology 137 (1996) 4944-4952) 。より最近
になって、ｍＳＨ２−Ｂ及びｖａｖがＩＧＦ−１Ｒの結
合体として記述されたが、他のチロシンキナーゼとの相
互作用も見られる。例えば、ｍＳＨ２−Ｂはｒｅｔ及び
インスリンレセプターとも結合する（Wang, J. and Rie
del., J. Biol. Chem. 273(1998) 3136-3139)。一緒
に、これまで記述されたＩＧＦ−１Ｒ結合タンパク質
は、治療的アプローチのための比較的非特異的な標的を
示し、又はインスリンレセプター基質（ＩＲＳ−１，Ｉ
ＲＳ−２）の場合、インスリン由来活性のために欠くこ
とができない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＩＧ
Ｆ−１Ｒと本発明によるＩＩＰとの間の相互作用の調節
（好ましくは阻害）に基づく新しい癌治療のための基礎
となるＩＧＦ−１Ｒの結合タンパク質をコードする新規
の遺伝子及び対応するポリペプチドを供することであ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、 ａ）配列番号：５に記載の核酸配列又はそれに相補的で
ある核酸配列、 ｂ）配列番号：６に記載のポリペプチドと相同性を示す
ポリペプチドをコードする、ａ）の核酸配列のうちの１
つとストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸
配列、又は ｃ）遺伝子コードの縮重により、ａ）又はｂ）の配列に
よりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を有する
ＩＩＰ−１０ポリペプチドをコードする配列を含む群か
ら選択される、ＩＧＦ−１レセプターに結合するタンパ
ク質をコードする核酸（ＩＩＰ−１０）に関する。

【０００８】前記核酸は、好ましくは、配列番号：５に
記載の配列を有する。ハイブリダイゼーションは、好ま
しくは、５．０×ＳＳＣ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ，７％
ＳＤＳ，０．５Ｍリン酸緩衝液pH７．０，１０％デキ
ストランスルフェート及び１００μｇ／mlサケ精子ＤＮ
Ａ中で約５０℃〜６８℃で行われ、次に１×ＳＳＣで６
８℃での２回の洗浄ステップが行われる。

【０００９】本発明は、更に、本発明による核酸分子の
発現のために適した組換え発現ベクターに関する。本発
明は、また、本発明による核酸により形質転換された宿
主細胞に関する。本発明は、また、本発明による核酸に
よりコードされたＩＧＦ−１レセプターに結合する組換
えポリペプチドに関する。

【００１０】本発明は、更に、原核生物又は真核生物宿
主細胞において外来ＤＮＡを発現させ、そして要求され
るタンパク質を単離することにより、ＩＧＦ−１レセプ
ターに結合するタンパク質を生産するための方法であっ
て、該タンパク質が、配列番号：５に記載のＤＮＡ配列
又は配列番号：５に記載の核酸配列と相補的な核酸配列
とストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸に
よりコードされることを特徴とする方法に関する。

【００１１】本発明は、更に、癌細胞の増殖能力を検出
するための方法であって、 ａ）癌を患う被検体の体液、腫瘍細胞、又は該腫瘍細胞
の細胞抽出物もしくは細胞培養物上清のサンプルをイン
キュベートするステップであって、該サンプルが、
（ｉ）配列番号：１，３又は５に記載の核酸又はそれに
相補的である核酸及び（ii）（ｉ）からの核酸のうちの
１つとハイブリダイズする核酸からなる群から選択され
る核酸プローブと一緒に核酸を含むステップと、 ｂ）前記サンプルの核酸及び／又は前記核酸プローブの
更なる結合パートナーによるハイブリダイゼーションを
検出するステップと、を含む方法に関する。

【００１２】前記ハイブリダイゼーションは、好ましく
は、少くとも、配列番号：１もしくは配列番号：５に記
載の核酸フラグメント又はその相補的フラグメントで行
われる。好ましくは、検出すべき核酸は検出前に増幅さ
せる。本発明は、更に、ＩＧＦ−１ＲとＩＩＰ−１０と
の間の相互作用を阻害する化合物をスクリーニングする
ための方法であって、 ａ）前記ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＩＰポリペプチドが複合体
を形成することができるように、ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＩ
Ｐポリペプチドを、候補の化合物を含む溶液に組み合わ
せるステップと、 ｂ）前記化合物の欠如下における所定の結合のレベルに
対する複合体の量を決定し、それから、前記化合物が、
ＩＧＦ−１ＲのＩＩＰへの結合を阻害する能力を評価す
るステップと、を含む方法に関する。

【００１３】本発明は、更に、被検体における癌腫の治
療のための治療剤を生産するための方法であって、該方
法は、細胞アッセイにおいてＩＧＦ−１ＲとＩＩＰ−１
０との間の相互作用を調節する治療に有効な量の化合物
に、医薬として許容される担体を組み合わせることを含
み、ここで前記細胞アッセイにおいて、腫瘍細胞又はＩ
ＧＦ−１Ｒの発現構成物及びＩＩＰの発現構成物がトラ
ンスフェクトされた細胞を前記化合物で処理し、そして
ＩＧＦ−１Ｒと各々のＩＩＰとの間の複合体形成を分析
し、ここで阻害の場合の複合体形成の程度が、同じ細胞
アッセイにおける前記化合物なしでの複合体形成１００
％に対して５０％を超えないことを特徴とする方法に関
する。

【００１４】好ましくは、前記化合物は前記相互作用を
阻害する。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明は、好ましくは、 ａ）配列番号：５に記載の核酸配列又はそれに相補的で
ある核酸配列、 ｂ）配列番号：６に記載のポリペプチドと少くとも７５
％の相同性を示すポリペプチドをコードする、ａ）の核
酸配列のうちの１つとストリンジェント条件下でハイブ
リダイズする核酸配列、又は ｃ）遺伝コードの縮重により、ａ）又はｂ）の配列によ
りコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を有するＩ
ＩＰ−１０ポリペプチドをコードする配列を含む群から
選択される、ＩＧＦ−１レセプターに結合するタンパク
質をコードする核酸（ＩＩＰ−１０）を含む。

【００１６】ＩＩＰ−１０のｃＤＮＡは２５，６９７の
計算した分子量で２２６ａａの新しいタンパク質をコー
ドする。ＩＩＰ−１０はリシンが豊富なタンパク質であ
る（１１％）。ＩＩＰ−１０は、Ｎ−グリコシル化部
位、いくつかのＮ−ミリストイル化部位、ＣＫ２及びＰ
ＫＣリン酸化部位、１つのチロシンキナーゼリン酸化部
位及び１つの推定上の核局在化シグナルを含む（図
５）。ＩＩＰ−１０のｃＤＮＡ配列は、ニワトリ胸腺細
胞タンパク質ｃｔｈｙ２８kD（ＥＭＢＬアクセス番号：
ＧＧ３４３５０）のｃＤＮＡと６５％の相同性を示す。
ＩＩＰ−１０及びｃｔｈｙ２８kDのアミノ酸配列は、７
０％の同一性を示す。ＩＩＰ−１０ｃＤＮＡのｎｔ３８
３〜ｎｔ５８４はＷＯ９５／１４７７２に記載される部
分的ｃＤＮＡ（ヒト遺伝子ＨＵＭＧＳＯ６２７１；アク
セス番号Ｔ２４２５３）と９４％同一である。免疫蛍光
法により、フラグ標識したＩＩＰ−１０は、ＩＧＦ−１
レセプターを過剰発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞において細
胞質及び核局在化の両方を示す。更なるイースト２−ハ
イブリッド分析は、ＩＩＰ−１０がＩＧＦ−１レセプタ
ーとリン酸化依存様式で相互作用することを示す。ＩＩ
Ｐ−１０はインスリンレセプターと相互作用しない。Ｉ
ＩＰ−１０の欠失分析は、ａａ１９〜ａａ２６がＩＧＦ
−１Ｌレセプターへの結合のために十分であることを示
した。

【００１７】“ＩＩＰ１０及びＩＧＦ−１レセプターの
間の相互作用又は結合”とは、イースト２−ハイブリッ
ドシステムにおいてラミンのような調節タンパク質でな
くＩＧＦ−１レセプターへのＩＩＰ１０ポリペプチドの
特異的結合を意味する。ＩＧＦ−１レセプターへの特異
的結合は、細菌内で発現されるグルタチオン−Ｓ−トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）−IIＰ融合タンパク質及び哺
乳動物細胞内で発現されるＩＧＦ−１レセプターを用い
て証明することができる。更に、Ｆｌａｇ標識化ＩＩＰ
−１０融合タンパク質（例えばWeidner, M. ら、Nature
384 (1996) 173-176)及びＩＧＦ−１レセプターの間の
会合は、哺乳動物細胞システムにおいてモニターするこ
とができる。この目的のため、各々のｃＤＮＡをトラン
スフェクトするために真核細胞発現ベクターが用いられ
る。タンパク質間の相互作用は抗Ｆｌａｇ又は抗ＩＧＦ
−１レセプター抗体を用いて同時免疫沈降実験又は亜細
胞局在化研究により視覚化される。

【００１８】本発明は更に、本発明による遺伝子のため
のプローブ及びプライマー並びに本発明による遺伝子産
物の抗原決定基をコードする核酸を供する。それゆえ好
ましい実施形態は、開示される配列以外の好ましくは１
０〜５０、より好ましくは１０〜２０の連続ヌクレオチ
ドの核酸を含む。用語“核酸”とは、例えば、ＤＮＡ，
ＲＮＡ、又は誘導化した活性なＤＮＡ又はＲＮＡであり
得るポリペプチドをいう。しかしながら、ＤＮＡ及びｍ
ＲＮＡ分子が好ましい。

【００１９】用語“ストリンジェント条件下でハイブリ
ダイズする”とは、２つの核酸フラグメントが、Sambro
okら（Molecular Cloning ; A laboratory manual (198
9) Cold Spring Harbor Laboratory. Press, New York,
USA) に記載される標準ハイブリダイゼーション条件下
で互いにハイブリダイズすることができることをいう。

【００２０】より詳しくは、本明細書に用いる“ストリ
ンジェント条件”とは、５．０×ＳＳＣ，５×Ｐｅｎｈ
ａｒｄｔ，７％ ＳＤＳ，０．５Ｍリン酸緩衝液pH７．
０，１０％デキストランスルフェート及び１００μｇ／
mlサケ精子ＤＮＡ中での約５０℃〜６８℃でのハイブリ
ダイゼーション、次の１×ＳＳＣでの６８℃での２回の
洗浄ステップをいう。更に、洗浄ステップの温度は、室
温約２２℃の低ストリンジェンシー条件から約６８℃の
高ストリンジェンシー条件まで増加させることができ
る。

【００２１】本発明は、更に、ＩＩＰ−１０の発現のた
めに適した組換え発現ベクター、該発現ベクターを移入
した組換え宿主細胞、及びＩＩＰ−１０遺伝子によりコ
ードされるタンパク質の組換え生産のための方法を含
む。本発明は、更に、本発明による核酸によりコードさ
れ、及び好ましくは配列番号：５に記載のＤＮＡ配列に
よりコードされる合成及び組換えポリペプチド並びにそ
れらに基づくペプチド擬態物を含む。このようなペプチ
ド擬態物は細胞膜について高いアフィニティーを有し、
細胞により直ちに取り込まれる。ペプチド擬態物は、好
ましくはペプチド及びタンパク質由来の化合物であり、
非天然アミノ酸、コンホメーション制限、等配電子置
換、環化等を用いる構造改変によって得られる。それら
は好ましくは、２４又はそれ未満、好ましくは２０又は
それ未満のアミノ酸に基づくが、約１２アミノ酸に基づ
くものが特に好ましい。

【００２２】ポリペプチド及びペプチド擬態物は、それ
らの対応するＤＮＡ配列により及びそれら由来のアミノ
酸配列によって規定することができる。その単離された
ＩＩＰポリペプチドは、個体間で異なる天然の対立遺伝
子変異体内でおこり得る。このようなアミノ酸のバリエ
ーションは、通常、アミノ酸置換である。しかしなが
ら、それらは、生物学的に活性なフラグメントを導く全
配列へのアミノ酸の欠失、挿入又は付加でもあり得る。
範囲及び型の両方に関して、その中で発現される細胞及
び細胞型に依存する本発明によるＩＩＰタンパク質は、
グリコシル化又は非グリコシル化形態であり得る。殺腫
瘍性及び／又は転移性活性を有するポリペプチドは、該
ポリペプチドを発現する癌細胞を用い、該ポリペプチド
を発現しない癌細胞に関連する増殖能力及びアポトーシ
スを測定する腫癌進行阻害アッセイによって容易に同定
することができる。

【００２３】それゆえ、“ＩＩＰ−１０活性又はＩＩＰ
−１０を有するポリペプチド”は、小さなアミノ酸変異
を有するがＩＩＰ−１０と実質的に同じ活性を有するタ
ンパク質を意味する。それは、実質的に、活性が同じ生
物特性のものであることを意味し、そのポリペプチド
は、ＩＩＰ−１０とアミノ酸配列において少くとも７５
％の相同性（同一性）を示す。より好ましくは、アミノ
酸配列は少くとも９０％の同一性である。本発明による
相同性は、コンピュータープログラムＧａｐ又はＢｅｓ
ｔＦｉｔ（University of Wisconsin ; Needleman and
Wunsch, J. Biol.Chem. 48 (1970) 443-453 ; Smith an
d Waterman, Adv. Appl. Math-2 (1981)482-489)により
決定することができる。

【００２４】本発明による、及び本発明により用いられ
る他のＩＩＰは特に以下のものがある： ＩＩＰ−１ ＩＩＰ−１と呼ぶＩＧＦ−１レセプターに相互作用する
タンパク質をコードするｃＤＮＡ（配列番号：１）を単
離した。そのＩＩＰ−１のｃＤＮＡは３５，７２７の計
算した分子量で３３３ａａの新しいタンパク質をコード
する。ＩＩＰ−１はグリシンが豊富なタンパク質である
（１３％）。ＩＩＰ−１は、いくつかのＮ−ミリストイ
ル化部位、ＰＫＣ及びＣＫ２リン酸化部位：並びに２つ
の推定上の核局在化シグナルを含む。第２の異型、２
６，０７１の計算した分子量の２３６ａａの長さのＩＩ
Ｐ−１（ｐ２６）を同定した。それは、最も確からしく
は、交互のスプライシングによって作られる（図３）。
両方の異型はＩＧＦ−１レセプターに結合する。

【００２５】ＩＩＰ−１のｃＤＮＡ配列は以前に報告さ
れている（Ｄａｔａｂａｓｅ ＥＭＢＬ Ｎｏｓ．ＡＦ
０８９８１８及びＡＦ０６１２６３；Devries, L. ら、
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 12340-12345)
。２つの重複するｃＤＮＡクローン（図４）を同定
し、それは、ヒトＴＩＰ−２部分ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａ
ｎｋアクセス番号：ＡＦ０２８８２４）（Rousset ら、
Oncogene 16 (1998) 643-654) に対して高い相同性を有
し、それらをＩＩＰ−１ａ及びＩＩＰ−１ｂとした。Ｉ
ＩＰ−１ａ ｃＤＮＡはＩＩＰ−２のｎｔ１１７〜７５
１に相当する。ＩＩＰ−１ｂ ｃＤＮＡは、ＴＩＰ−２
配列（ｎｔ１〜１０６）の他に、ＷＯ９７／２７２９６
の配列Ｙ２Ｈ３５に相同である更なる５′配列（ｎｔ２
５〜１５８）を示す。

【００２６】ＩＩＰ−１ａ及びＩＩＰ−１ｂは両方と
も、周知のタンパク質間相互作用ドメインであるＴＩＰ
−２のＰＤＺドメインをコードする配列（ｎｔ１５６〜
４１０）を有する（Ponting, C.P. ら、BioEssays 19
(1997) 469-479)。欠失分析により、ＰＤＺドメインは
ＩＩＰ−１の本質的かつ十分なＩＧＦ−１レセプター結
合ドメインとして決定された（図４）。

【００２７】更なるイースト２−ハイブリッド分析は、
ＩＩＰ−１タンパク質のＩＧＦ−１レセプターへの結合
がこのレセプターチロシンキナーゼに特異的であること
を示した。インスリンレセプター又はＲｏｓへの相互作
用は見られなかった。他のファミリーのレセプターチロ
シンキナーゼはＩＩＰ−１（例えばＭｅｔ，Ｒｅｔ，Ｋ
ｉｔ，Ｆｍｓ，Ｎｅｕ，ＥＧＦレセプター）と相互作用
しなかった。これにより、ＩＩＰ−１は最も確からしく
は、ＩＧＦ−１レセプターチロシンキナーゼに特異的で
あることが示された最初の相互作用タンパク質である。
ＩＩＰ−１はＩＧＦ−１レセプターのキナーゼ不活性変
異体にも結合する。

【００２８】ＩＩＰ−２ ＩＩＰ−２は、ヒトＡＰＳ（ＥＭＢＬアクセス番号：Ｈ
ＳＡＢ５２０）に対応するＩＧＦ−１レセプターの細胞
質部分の新しい結合体として同定された。ＡＰＳは、以
前に、食餌としてオンコジーンｃ−ｋｉｔキナーゼを用
いるイースト２−ハイブリッドスクリーンにおいて単離
されている（Yokouchi, M ら、Oncogene15 (1998) 7-1
5)。ＩＩＰ−２はキナーゼ依存様式でＩＧＦ−１レセプ
ターと相互作用する。ＩＩＰ−２の結合は、インスリン
レセプターファミリーの他の膜（インスリンレセプタ
ー、Ｒｏｓ）に対して観察されたが、関連しないレセプ
ターチロシンキナーゼ（Ｍｅｔ）に対しては観察されな
かった。ＩＧＦ−１レセプターと相互作用することが見
い出されたＩＩＰ−２の領域はＡＰＳのＳＨ２ドメイン
（ｎｔ１２４９〜１５４５）を含むヒトＡＰＳ（ｎｔ１
１２６〜１６７４，ＥＭＢＬ Ａｃｃ Ｎｏ．ＡＢ００
０５２０）に対応する。

【００２９】ＩＩＰ−３ ＩＩＰ−３は、新しいＩＧＦ−１レセプターに相互作用
するタンパク質として単離され、それはＰＳＭ（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋアクセス番号：ＡＦ０２０５２６）と同一であ
る。ＰＳＭは、活性化インスリンレセプターに結合する
シグナル伝達タンパク質を含むＰＨ及びＳＨ２ドメイン
として知られる（Riedel, H ら、J. Biochem. 122 (199
7) 1105-1113) 。ＰＳＭの変異体は公開されている（Ri
edel, Hら、J. Biochem. 122 (1997) 1105-1113) 。Ｉ
ＩＰ−３のＩＧＦ−１レセプターへの結合はレセプター
のチロシルリン酸化に依存する。

【００３０】ＰＳＭの変異型のｎｔ１８６２〜２１８４
に対応するｃＤＮＡクローンを同定した。その単離した
ｃＤＮＡクローンはＩＧＦ−１レセプター結合領域をコ
ードすることが判明した。ＰＳＭのＳＨ２ドメイン（ｎ
ｔ１８６４〜２１４８，ＥＭＢＬ Ａｃｃ Ｎｏ．ＡＦ
０２０５２６）は単離されたＩＩＰ−３の部分的ｃＤＮ
Ａクローンの配列によりコードされる。

【００３１】ＩＩＰ−４ ＩＩＰ−４は、ＩＧＦ−１レセプターの細胞質ドメイン
の新しい相互作用タンパク質として単離された。ＩＩＰ
−４はｐ５９ｆｙｎ，ｓｒｃ様チロシンキナーゼ（ＥＭ
ＢＬアクセス番号：ＭＭＵ７０３２４及びヒトｆｙｎＥ
Ｍ−ＨＵＭ１：ＨＳ６６Ｈ１４）（Cooke, M.P.,及びPe
rlmutter, R.M., New Biol. 1 (1989) 66-74) 。ＩＩＰ
−４はキナーゼ依存様式でＩＧＦ−１レセプターに、及
びインスリンレセプター及びＭｅｔのようないくつかの
他のレセプターチロシンキナーゼに結合する。ＩＧＦ−
１レセプターと相互作用するＩＩＰ−４の領域（ｎｔ６
６５〜１０４４）はｐ５９ｆｙｎのＳＨ２ドメイン（Ｅ
ＭＢＬ Ａｃｃ Ｎｏ．Ｖ７０３２４）を含む。

【００３２】ＩＩＰ−５ ＩＩＰ−５は、新しいＩＧＦ−１レセプターと相互作用
するタンパク質として単離された。ＩＩＰ−５は、ジン
クフィンガータンパク質Ｚｆｐ３８（ＥＭＢＬアクセス
番号：ＭＭＺＦＰＴＡ）と高い相同性を示し、対応する
ヒト遺伝子と少くとも８０％の相同性を有する。Ｚｆｐ
−３８は転写因子として知られている（Chowdhury, K
ら、Mech. Der. 39 (1992) 129-142) 。ＩＩＰ−５は活
性化及びリン酸化ＩＧＦ−１レセプターと排他的に相互
作用するが、キナーゼ不活性変異体とは相互作用しな
い。ＩＩＰ−５のＩＧＦ−１レセプターへの結合に加え
て、ＩＩＰ−５の、インスリンレセプターファミリーの
レセプターチロシンキナーゼ（インスリンレセプター、
Ｒｏｓ）との相互作用が観察された。ＩＩＰ−５はより
遠くで関連したチロシンキナーゼＭｅｔに結合しない。 Ｚｆｐ３８（ＥＭＢＬ Ａｃｃ Ｎｏ．ＭＭＺＦＰＩ
Ａ）のｎｔ７５６〜１１９４をコードし、第１のジンク
フィンガー（ｎｔ１０７５〜１１５８）を含むＩＧＦ−
１レセプターに結合する１つのｃＤＮＡクローンを単離
した。このドメインは活性化ＩＧＦ−１レセプターへの
結合のために十分である。

【００３３】ＩＩＰ−６ ＩＩＰ−６は、新しいＩＧＦ−１レセプターと相互作用
するタンパク質として同定された。ＩＩＰ−６は、Ｚｆ
ｐ２９（ＥＭＢＬアクセス番号：ＭＭＺＥＰ２９）のジ
ンクフィンガードメインと小さな類似性を示す。Ｚｆｐ
２９はＮ末端の転写活性化ドメイン及び１４のＣ末端Ｃ
ｙｓ² ＨｉＳ² ジンクフィンガーからなる（Denny, P.,
及びAshworth, A., Gene 106 (1991) 221-227)。ＩＩＰ
−６のＩＧＦ−１レセプターへの結合はＩＧＦ−１レセ
プターキナーゼのリン酸化に依存する。ＩＩＰ−６はイ
ンスリンレセプターとも結合するがＭｅｔとは相互作用
しない。ＩＧＦ−１レセプターと相互作用することが見
い出されたＩＩＰ−６の領域（配列番号：３、配列番
号：４）はＣｙｓ² Ｈｉｓ² 型の２つのジンクフィンガ
ードメインを含む。

【００３４】ＩＩＰ−７ ＩＩＰ−７は、Ｐａｘ−３（ＥＭＢＬアクセス番号：Ｍ
ＭＰＡＸ３Ｒ及びヒトＰａｘ３ＥＭ−ＨＵＭ２：Ｓ６９
３６９）に対応する新しいＩＧＦ−１レセプターと相互
作用するタンパク質として単離された。Ｐａｘ−３は、
初期の胚形成の間に発現されるＤＮＡ結合タンパク質と
して知られている（Goulding, M.D.ら、EMBO J. 10 (19
91) 1135-1147)。ＩＩＰ−７はリン酸化依存様式でＩＧ
Ｆ−１レセプターに結合する。ＩＩＰ−７はインスリン
レセプター及びＭｅｔとも相互作用する。部分的なＩＩ
Ｐ−７ｃＤＮＡクローンはＰａｘ３のＩＧＦ−１レセプ
タードメイン（ｎｔ８１５〜１１９９，ＥＭＢＬ Ａｃ
ｃ Ｎｏ．ＭＭＰＡＸ３Ｒ）をコードすることが判明し
た。この領域はＰａｘ−３の対になったドメインオクタ
ペプチド（ｎｔ８５３〜８７６）及び対の型のモメオド
メイン（ｎｔ９５２〜１１３４）を含む。

【００３５】ＩＩＰ−８ ＩＩＰ−８はＧｒｂ７（ＥＭＢＬアクセス番号：ＭＭＧ
ＲＢ７Ｐ、ヒトＧｒｂ７ ＥＭ−ＨＵＭ１：ＡＢ００８
７８９）の全長のｃＤＮＡをコードする。Ｇｒｂ７，Ｐ
Ｈドメイン及びＳＨ３ドメイン含有シグナル伝達タンパ
ク質はＥＧＦレセプター結合タンパク質（Margolis, B.
L.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992) 8894-889
8) として最初に公開された。ＩＩＰ−８はＩＧＦ−１
レセプターのキナーゼ不活性変異体と相互作用しない。
ＩＩＰ−８の、いくつかの他のレセプターチロシンキナ
ーゼ（例えばインスリンレセプター、Ｒｏｓ及びＭｅ
ｔ）への結合も観察された。

【００３６】ＩＩＰ−９ ＩＩＰ−９は新しいＩＧＦ−１レセプター相互作用タン
パク質として同定された。ＩＩＰ−９はｎｃｋ−β（Ｅ
ＭＢＬ Ａｃｃ Ｎｏ．ＡＦ０４３２６０）と同一であ
る。ＮｃｋはＳＨ２及びＳＨ３ドメインからなる細胞質
シグナル伝達タンパク質である（Lehmann, J. M ら、Nu
cleic Acids Res. 18 (1990) 1048)。ＩＩＰ−９はリン
酸化依存様式でＩＧＦ−１レセプターと相互作用する。
ｎｃｋはＩＧＦ−１レセプターの膜近傍領域に結合す
る。ＩＩＰ−９のＩＧＦ−１レセプターへの結合の他
に、インスリンレセプターとの相互作用が見られたが、
Ｒｏｓ又はＭｅｔとの相互作用は見られなかった。

【００３７】本発明の好ましい対象は、相同であるポリ
ペプチド、より好ましくは、配列番号：６のポリペプチ
ドに実質的に同一であるポリペプチド（ＩＩＰ−１０）
である。相同性は、Pearson, W.R., Methods in Enzymo
logy 183 (1990) 63-68, Academic Press, San Diego,
USにより記載されるＦａｓｔＡアルゴリズムを用いるこ
とによって検査することができる。“実質的に同一”と
は、保存性アミノ酸置換、例えば１のアミノ酸の同じク
ラスの別のアミノ酸への置換（例えばグリシンについて
バリン、リシンについてアルギニン等）により、又はそ
のポリペプチドの生物機能を破壊しないアミノ酸配列の
位置に位置した１又は複数の非保存性アミノ酸置換、欠
失又は挿入によってのみ異なるアミノ酸配列を意味す
る。これは、そのポリペプチド内の別の共有ペプチド結
合の置換を含む。“ポリペプチド”は、長さ又は翻訳後
修飾（例えばグリコシル化又はリン酸化）にかかわらず
アミノ酸のいずれかの鎖を意味し、用語“タンパク質”
と交換可能に用いることができる。

【００３８】本発明によれば、“生物学的に活性なフラ
グメント”とは、全長の天然のタンパク質の生理学的効
果（例えばその生物学的基質を結合し、抗原性応答を引
きおこす等）を発揮することができるフラグメントを意
味する。本発明は、抗原性である本発明によるポリペプ
チドのフラグメントを特徴とする。本明細書に用いる用
語“抗原性”は、特定の免疫原応答、例えば本発明によ
るタンパク質に特異的に結合する抗体を生産する免疫原
応答を誘導することができる。そのフラグメントは、好
ましくは少くとも８アミノ酸、そして好ましくは２５ア
ミノ酸までの長さである。１つの好ましい実施形態にお
いて、そのフラグメントは、ＩＧＦ−１レセプターへの
ＩＩＰの結合の原因であるドメイン（即ちＩＩＰ−１の
ＰＤＺドメイン）を含む。“ドメイン”とは、その結合
パートナーとの相互作用に直接関連したタンパク質中の
アミノ酸の領域を意味する。ＰＤＺドメインは、イオン
^- 、チャンネル及びレセプタークラスター化並びにエフ
ェクター酵素へのレセプターの連結に関連するいくつか
のタンパク質において見い出される約９０残基の反復で
ある。このようなＰＤＺは、一般に、Cabral, J.H.ら、
Nature 382 (1996) 649-652 に記載される。

【００３９】本発明は、更に、原核又は真核宿主細胞に
おいて外来ＤＮＡを発現させ、そして要求されるタンパ
ク質を単離するか、又は医薬的手段のため生体内で外来
ＤＮＡを発現させることにより、その発現又は活性が腫
瘍増殖と相関した本発明によるタンパク質を生産するた
めの方法を含む。ここで、前記タンパク質は、好ましく
はＩＩＰ−１０をコードするＤＮＡ配列、より好ましく
は配列番号：５に記載のＤＮＡ配列によりコードされ
る。

【００４０】本発明によるポリペプチドは、組換え手段
により又は合成によっても生産することができる。原核
生物において組換え生産した場合には非グリコシル化Ｉ
ＩＰ−１０ポリペプチドが得られる。本発明により供さ
れる核酸配列により、（例えばヒト細胞と別の、他の哺
乳動物の細胞でも）いずれかの要求される細胞のゲノム
内のＩＩＰ−１０遺伝子又はその変異体について調査す
ること、これらを同定すること、及びＩＩＰ−１０タン
パク質をコードする要求される遺伝子を単離することが
可能になる。このような方法及び適切なハイブリダイゼ
ーション条件（上記参照のこと、“ストリンジェント条
件”）は当業者に周知であり、例えばSambrookら（Mole
cular Cloning ; A laboratory manual (1989) Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press, New York, USA 、及び
Hames, B.D., Higgins, S.G., Nucleic acid hybridisa
tion - a practical approach (1985) IRL Press, Oxfo
rd, England を参照のこと。この場合、これらの出版物
に記載される標準プロトコルが通常、実験のために用い
られる。

【００４１】組換えＤＮＡ技術の使用は多数の活性なＩ
ＩＰ−１０誘導体の生産を可能にする。このような誘導
体は、例えば置換、欠失又は付加により個々の又はいく
つかのアミノ酸において修飾することができる。誘導体
は、例えば、部位特異的変異誘発により行うことができ
る。このような変異は、当業者により容易に行うことが
できる（J. Sambrook, B.D. Hames 、前掲）。それは、
単に、ＩＩＰ−１０の特徴的な特性が保存される後述の
腫瘍細胞増殖阻害アッセイにより確実にされなければな
らない。

【００４２】ＩＩＰ−１０タンパク質をコードするこれ
らの核酸により、本発明によるタンパク質は、再現可能
に大量に得ることができる。原核生物又は真核生物、例
えば原核生物宿主細胞又は真核生物宿主細胞のために、
核酸は、当業者に周知の方法に従って、適切な発現ベク
ターに組み込まれる。このような発現ベクターは、好ま
しくは、調節可能な／誘導可能なプロモーターを含む。
次に、これらの組換えベクターは、発現のために、適切
な宿主細胞、例えば原核生物宿主細胞として大腸菌又は
真核生物宿主細胞としてサッカロマイセス・セレビシア
エ、奇形癌細胞系ＰＡ−ｌｓｃ９１１７（Buettnerら、
Mol. Cell. Biol. 11 (1991) 3573-3583) 、昆虫細胞、
ＣＨＯ又はＣＯＳ細胞に導入され、そしてその形質転換
され又は形質導入された宿主細胞は、異種遺伝子の発現
を許容する条件下で培養される。そのタンパク質の単離
は、宿主細胞から又は宿主細胞の培養上清から周知の方
法に従って行うことができる。このような方法は、例え
ばAusubel I., FrederickM., Current Protocols in Mo
l. Biol. (1992), John Wiley and Sons, New York に
記載される。また、そのタンパク質の試験管内再活性化
は、細胞培養物内で可溶性形態で見い出されないなら、
必要であり得る。

【００４３】それゆえ、本発明は、更に、外来ＤＮＡの
原核生物又は真核生物発現の産物であるＩＩＰポリペプ
チドに関する。そのタンパク質は、細胞又は培養上清か
ら単離し、クロマトグラフィー手段により、好ましくは
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー及び／又は逆相ＨＰＬＣにより精製するこ
とができる。

【００４４】ＩＩＰ−１０は、周知のタンパク質精製技
術、例えば免疫沈降法、ゲルろ過、イオン交換クロマト
グラフィー、クロマトフォーカシング、等電点電気泳
動、選択的沈降法、電気泳動等を用いてアフィニティー
クロマトグラフィーにより組換え生産後に精製すること
ができる。 診断法：本発明は、更に、ＩＩＰ−遺伝子をコードする
核酸分子を検出するための方法であって、サンプル（例
えば体液、例えば血液、細胞ライゼート）を本発明によ
る核酸分子と共にインキュベートし、そして前記ＩＩＰ
遺伝子である核酸分子の存在を決定するために標的核酸
分子への前記核酸分子のストリンジェント条件下でのハ
イブリダイゼーションを決定することを含む方法並び
に、それゆえ、哺乳動物細胞又は体液内でのＩＧＦ−１
Ｒ活性化又は阻害の同定のための方法を含む。

【００４５】それゆえ、本発明は、腫瘍細胞の増殖能力
を検出するための方法であって、 ａ）癌を患う被検体の体液のサンプル、癌細胞のサンプ
ル、又は該癌細胞の細胞抽出物もしくは細胞培養物上清
のサンプルをインキュベートするステップであって、前
記サンプルは、（ｉ）配列番号：１，３もしくは５に記
載の核酸又はそれに相補的である核酸、並びに（ii）
（ｉ）からの核酸のうちの１つとストリンジェント条件
下でハイブリダイズする核酸からなる群から選択された
核酸プローブと共に核酸を含むステップと、 ｂ）前記サンプルの核酸の更なる結合パートナー及び／
又は核酸プローブにより又はＸ線ラジオグラフィーによ
りハイブリダイゼーションを検出するステップと、を含
む方法も包含する。

【００４６】プローブとサンプルからの核酸との間のハ
イブリダイゼーションは、このようなタンパク質のＲＮ
Ａの存在を示す。このような方法は当業者に周知であ
り、例えばＷＯ８９／０６６９８，ＥＰ−Ａ ０２００
３６２，ＵＳＰ ２９１５０８２，ＥＰ−Ａ ００６３
８７９，ＥＰ−Ａ ０１７３２５１，ＥＰ−Ａ ０１２
８０１８に記載される。

【００４７】本発明の好ましい実施形態において、サン
プルのコーディング核酸は、テストの前に、例えば周知
のＰＣＲ技術により増幅される。通常、誘導化された
（標識された）核酸プローブは核酸診断の枠組の中にあ
る。このプローブは、担体に結合したサンプルからの変
性したＤＮＡ又はＲＮＡに接触され、この過程におい
て、温度、イオン強度、pH及び他の緩衝条件は核酸プロ
ーブの長さ及び組成並びに結果として生じる予想される
ハイブリッドの融点により選択される−標識されたＤＮ
Ａ又はＲＮＡが相同なＤＮＡ又はＲＮＡに結合できるよ
うに選択される（ハイブリダイゼーションについて、Wa
hl, G.M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 3
683-3687も参照のこと）。適切な担体はニトロセルロー
スに基づく膜又は担体材料（例えばSchleicher及びSchu
ell, BA85, Amersham. Hybond, C.)、粉末形態の強化又
は結合したニトロセルロース又は種々の官能基（例えば
ニトロ基）で誘導化したナイロン膜（例えばSchlescher
及びSchuell, Nytran ; NEN, Gene Screen ; Amersham
Hybond M. ; Pall Biodyne) である。

【００４８】次に、ＤＮＡ又はＲＮＡへのハイブリダイ
ゼーションは、非特異的結合を防ぐために洗浄し、飽和
させた後に、抗体又は抗体フラグメントと担体をインキ
ュベートすることにより検出される。その抗体又は抗体
フラグメントは、誘導化の間に核酸プローブに組み込ま
れる基質に対して生ずる。次に抗体が標識される。しか
しながら、直接的に標識されたＤＮＡを用いることも可
能である。抗体とのインキュベーションの後、それは、
特異的に結合した抗体コンジュゲートのみを検出するた
めに再び洗浄される。次にその測定は、抗体又は抗体フ
ラグメントへの標識により周知の方法に従って行われ
る。

【００４９】その発現の検出は例えば次の通り行うこと
ができる。 − 固定化された完全な細胞と、固定化された組織スミ
アと、及び単離された中期染色体とのイン・シトゥハイ
ブリダイゼーション − コロニーハイブリダイゼーション（細胞）及びプラ
ークハイブリダイゼーション（ファージ及びウイル
ス）、 − サザンハイブリダイゼーション（ＤＮＡ検出） − ナーザンハイブリダイゼーション（ＲＮＡ検出） − 血清分析（例えばスロット・ブロット分析による血
清中の細胞の細胞型分析） − 増幅後（例えばＰＣＲ技術） 好ましくは、核酸プローブは、サンプルの核酸とインキ
ュベートされ、ハイブリダイゼーションは、任意に、サ
ンプルの核酸のための更なる結合パートナー及び／又は
核酸プローブにより検出される。

【００５０】本発明により核酸は、従って、患者の腫瘍
細胞の転移及び進行能力の診断における価値ある予後マ
ーカーである。ＩＩＰ又はインヒビターのアンタゴニス
ト及びアゴニストのためのスクリーニング 本発明によれば、ＩＩＰ−１０のアンタゴニスト又はＩ
ＩＰの発現のためのインヒビター（例えばアンチセンス
核酸）は、腫瘍進行を阻害し、好ましくは体の遺伝子療
法により、生体内での腫瘍細胞の大量のアポトーシスを
引きおこすのに用いることができる。

【００５１】それゆえ、本発明は、癌、糖尿病、神経退
化疾患、骨の疾患のための治療可能性についてのスクリ
ーニングの方法に、病気のための治療の方法に、及びこ
のような病気のための潜在的に役立つ治療をスクリーニ
ングし及び評価するのに役立つ動物モデルにも関する。
それゆえ、本発明の別の対象は、上述の及び関連の疾患
の治療の利用性を有する化合物を同定するための方法で
ある。これらの方法は、本発明によるポリペプチドの発
現を調節するための方法、本発明によるタンパク質に選
択的に結合することができる化合物を同定するための方
法及び前記ポリペプチドの活性を調節することができる
化合物を同定する方法を含む。これらの方法は、試験管
内で及び生体内で行うことができ、本発明の形質転換さ
れた細胞系及びトランスジェニック動物モデルを用いる
ことができる。

【００５２】ＩＩＰのアンタゴニスト又はＩＩＰのイン
ヒビターは、ＩＧＦ−１ＲとＩＩＰ、好ましくはＩＩＰ
−１０との間の相互作用を阻害する物質又は化合物とし
て定義される。それゆえ、ＩＧＦ−１Ｒの生物活性はこ
のような化合物の存在下で減少する。一般に、ＩＩＰア
ンタゴニストについてのスクリーニング手順は、候補の
物質を、ＩＩＰを有する宿主細胞と、結合のために好ま
しい条件下で接触させ、そしてレセプターの媒介するシ
グナル伝達の減少の程度を測定する（アンタゴニストの
場合）ことに関する。このようなアンタゴニストは腫瘍
治療に用いるための医薬剤として役立つ。糖尿病、神経
疾患、又は骨の疾患の治療のために、シグナル伝達経路
の刺激が必要とされ、即ちアゴニストのためのスクリー
ニングが役立つ。

【００５３】ＩＩＰ活性化は、いくつかの方法で測定す
ることができる。典型的には、活性化は、細胞生理学上
の変化、例えば成長率の増加もしくは減少により、分化
状態の変化により、又は標準的な細胞アッセイ、例えば
ＭＴＴ又はＸＴＴアッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏ
ｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，ＤＥ）において検出できる細胞
代謝の変化により明らかになる。

【００５４】それゆえ、本発明による核酸及びタンパク
質は、ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＩＰの相互作用を妨害する薬
剤を同定し、デザインするのにも用いることができる。
例えば、そのタンパク質の１つと相互作用する薬剤は、
その天然の対の他方への結合を許容するかわりにそれに
優先的に結合することができる。ＩＧＦ−１レセプター
に結合することができ、それによりＩＩＰの結合を防ぐ
ことができ、又はその逆もできるいずれかの薬剤はＩＩ
Ｐに結合することができ、それによりＩＧＦ−１レセプ
ターの結合を防ぐ。両方の場合において、ＩＧＦ−１レ
セプターシステムのシグナル伝達は調節する（好ましく
は阻害する）されるであろう。この容易さについて薬剤
をスクリーニングすることは、テスト化合物とＩＩＰ及
びＩＧＦ−１レセプターの相互作用との間の競合アッセ
イ（当該技術分野のアッセイ標準）を確立し、結合パー
トナーと同じ特性の精製タンパク質又はフラグメントを
用いることにより行われる。

【００５５】本発明によるタンパク質は、本発明による
タンパク質の活性を調節する化合物の同定のためのアッ
セイ手順に用いるのに適する。本明細書に記載されるよ
うに活性を調節することには、タンパク質の阻害又は活
性化があり、前記タンパク質活性の正常な調節に直接又
は間接的に作用することを含む。タンパク質活性を調節
する化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト及び本発
明によるタンパク質の活性の調節に直接もしくは間接的
に作用する化合物がある。本発明によるタンパク質は、
モジュレーターを同定するためのアッセイ手順に用いる
ためにネイティブ及び組換え源の両方から得ることがで
きる。一般に、モジュレーターを同定するためのアッセ
イ手順は、ＩＧＦレセプター、本発明のタンパク質、及
び該タンパク質活性のモジュレーターと予想されるもの
を含むテスト化合物又はサンプルを含むであろう。テス
ト化合物又はサンプルは、例えば、ネイティブであるか
組換え体であるかにかかわらず、本発明の精製タンパク
質、ネイティブであるか組換え体であるかにかかわら
ず、該タンパク質を生産する細胞の亜細胞画分、及び／
又はネイティブであるか組換え体であるかにかかわら
ず、該タンパク質を発現する完全な細胞に基づいて、直
接テストすることができる。テスト化合物又はサンプル
は、本発明によるタンパク質に、該タンパク質の周知の
モジュレーターの存在又は欠如下で添加することができ
る。テスト化合物又はサンプルの調節活性は、例えばテ
スト化合物もしくはサンプルが前記タンパク質に結合
し、前記タンパク質を活性化し、その活性を阻害し、他
の化合物の前記タンパク質への結合を阻害しもしくは増
強し、レセプター制御を調節し又は細胞内活性を調節す
ることにより決定することができる。

【００５６】タンパク質活性のモジュレーターの同定
は、そのタンパク質活性に関する病状を治療するのに役
立つ。他の化合物は、本発明によるタンパク質の活性を
刺激し又は阻害するために役立ち得る。このような化合
物は、本発明によるタンパク質の活性化又は不活性化が
細胞増殖、細胞死、非増殖、細胞の新形成形質転換体の
誘導、又は転移性腫瘍増殖のいずれかを生ずる病気の治
療に用いることができ、従って、癌、例えば前立腺及び
乳癌の予防及び／又は治療に用いることができよう。本
発明によるタンパク質をコードするＤＮＡ分子の単離及
び精製は、前記タンパク質の組織分布を確立すること、
並びに前記タンパク質の活性及び／又はその発現を調節
する化合物を同定するための方法を確立することのため
に役立つであろう。

【００５７】それゆえ、本発明の更なる実施形態は、Ｉ
ＧＦ−１ＲとＩＩＰ−１又はＩＩＰ−１０との間の相互
作用を阻害する化合物をスクリーニングするための方法
であって、 ａ）ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＩＰ−１又はＩＩＰ−１０ポリ
ペプチドを、候補化合物を含む溶液に、該ＩＧＦ−１Ｒ
及びＩＩＰ−１又はＩＩＰ−１０ポリペプチドが複合体
を形成することができるように組み合わせ、 ｂ）前記候補化合物の欠如下の所定の結合のレベルに対
する複合体の量を決定し、それから、前記候補化合物が
ＩＧＦ−１ＲのＩＩＰ−１又はＩＩＰ−１０ポリペプチ
ドへの結合を阻害する能力を評価することを含む方法で
ある。

【００５８】このようなスクリーニングアッセイは、好
ましくは、ＩＧＦ−１Ｒ又はＩＩＰ−１又はＩＩＰ−１
０が固相に結合するＥＬＩＳＡアッセイとして行われ
る。本発明の更なる実施形態は、患者における癌腫の治
療のための治療剤の生産のための方法であって、生化学
及び／又は細胞アッセイにおいてＩＧＦ−１ＲとＩＩＰ
との間の相互作用を少くとも５０％の程度まで阻害する
治療に有効な量の化合物を組み合わせることを含む方法
である。生化学アッセイは、好ましくはＥＬＩＳＡベー
スのアッセイ又はホモジニアスアッセイである。ＥＬＩ
ＳＡシステムの場合、２つの結合パートナーに特異的な
抗体が複合体の検出のために用いられる。ホモジニアス
アッセイの場合、少くとも１の結合パートナーは、複合
体の分析を許容する蛍光体で標識される。細胞アッセイ
は、好ましくは、腫瘍細胞又はＩＧＦ−１Ｒ及び各々の
結合タンパク質の発現構成物がトランスフェクトされた
細胞が薬剤あり又はなしで処理され、次に２つの構成物
間の複合体形成が標準細胞アッセイを用いて分析される
アッセイである。

【００５９】本発明の好ましい実施形態は、患者におい
て癌腫の治療のための治療剤の生産のための方法であっ
て、医薬として許容される担体を、細胞アッセイにおい
てＩＧＦ−１ＲとＩＩＰ−１又はＩＩＰ−１０との間の
相互作用を阻害する治療に有効な量の化合物と組み合わ
せることを含み、ここで前記細胞アッセイにおいて、腫
瘍細胞又はＩＧＦ−１Ｒ及び各々のＩＩＰの発現構成物
は前記化合物で処理され、そしてＩＧＦ−１Ｒと前記各
々のＩＩＰとの間の複合体形成が分析され、そして阻害
の場合の前記化合物形成の程度は同じ細胞アッセイにお
ける前記化合物なしでの複合体形成について１００％に
対して５０％を超えない。

【００６０】本発明の更なる実施形態は、細胞アッセイ
においてＩＧＦ−１ＲとＩＩＰ−１又はＩＩＰ−１０と
の間の相互作用を阻害する治療に有効な量の化合物で癌
腫を患う患者を処理する方法であり、ここで前記細胞ア
ッセイにおいて腫瘍細胞又はＩＧＦ−１Ｒ及び各々のＩ
ＩＰの発現構成物がトランスフェクトされた細胞は前記
化合物で処理され、そしてＩＧＦ−１Ｒと前記各々のＩ
ＩＰとの間の複合体形成が分析され、そして阻害の場合
の前記複合体形成の程度は同じ細胞アッセイにおける前
記化合物なしでの複合体形成について１００％に対して
５０％を超えない。

【００６１】本発明の更なる実施形態は本発明によるＩ
ＩＰ−１又はＩＩＰ−１０に対する抗体である。抗体
は、ヒト、マウス、又はラットポリペプチドから作っ
た。ＩＩＰ−１又はＩＩＰ−１０を特異的に認識する抗
体は本発明に含まれる。このような抗体は標準的免疫学
的技術を用いて生ずる。抗体は、ポリクローナルでもモ
ノクローナルでもよく、又はヒトに適合させた抗体のよ
うに組換えにより生産することができる。ＩＩＰ−１又
はＩＩＰ−１０と相互作用する能力を保持する抗体フラ
グメントも供される。このようなフラグメントは、全長
の抗体のタンパク質による開裂によって生産することが
でき、又は組換えＤＮＡ法によって生産することができ
る。本発明の抗体は診断的及び治療的適用に役立つ。そ
れらは、生物サンプル、特に組織サンプル及び体液中で
ＩＩＰ−１又はＩＩＰ−１０を検出し及び定量するため
に用いられる。それらは、アゴニスト又はアンタゴニス
トとして機能することにより、ＩＩＰ−１又はＩＩＰ−
１０の活性を調節するのにも用いられる。

【００６２】以下の実施例、引用文献、配列表及び図面
は、本発明の理解を助けるために供され、その真の範囲
は添付の請求の範囲に記載される。本発明の精神から離
れることない手順において改良を行うことができること
が理解される。 図面及び配列の記載 図１は、ＩＧＦ−１レセプターの細胞質結合タンパク質
のためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするた
めに用いられるイースト２−ハイブリッドベイト（ｂａ
ｉｔｓ）のドメイン構造を示す。ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合
ドメインを野生型ＩＧＦ−１レセプター（ａ）又はキナ
ーゼ不活性変異体（ａａ１００３でのＫ／Ａ変異）
（ｂ）（Ullrich, Aら、EMBO J. ら（1986) 2503-2512
; Weidner, M. ら、Nature 384 (1996) 173-176)の細
胞質（ｃｐ）ドメイン（ｎｔ２９２３〜４１５４）に融
合した。ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインとレセプタード
メインとの間に挿入された２つの異なるリンカーのヌク
レオチド及びアミノ酸配列を以下に示す。Ｉ１（ｗｔ
ＩＧＦ−１レセプター）及びＫ１（キナーゼ不活性変異
体ＩＧＦ−１レセプター）構成物は、Ｉ２及びＫ２構成
物に比べて更なるプロリン及びグリシンを含む。

【００６３】図２は、イースト２−ハイブリッドＬｅｘ
Ａ／ＩＧＦ−１レセプターベイト構成物の改良を示す。
ａ）は、ＩＧＦ−１レセプターの細胞質結合部位の概略
図である。ＩＧＦ−１レセプターのα−サブユニットは
ジスルフィド結合によりβ鎖に連結される。そのβ鎖の
細胞質部分は膜近傍及び（末端ドメイン内に基質のため
の結合部位を含む。ｂ）は、膜近傍ＩＧＦ−１レセプタ
ー結合部位のみを含む２−ハイブリッドベイトのドメイ
ン構造を示す。ＩＧＦ−１レセプターの膜近傍ドメイン
（ｎｔ２９２３〜３０５１）（Ullrich, Aら、EMBO J.
ら（1986) 2503-2512)はｔｐｒｍｅｔのキナーゼドメイ
ン（ｎｔ３４５６〜４２２９）に融合した（ＧｅｎＢａ
ｎｋアクセス番号：ＨＳＵ１９３４８）。ｃ）は、Ｃ末
端ＩＧＦ−１レセプター結合部位のみを含む２−ハイブ
リッドベイトのドメイン構造を示す。ＩＧＦ−１レセプ
ターのＣ末端ドメイン（ｎｔ３８２３〜４１４９）（Ul
lrich, Aら、EMBO J. ら（1986) 2503-2512)をｔｐｒｍ
ｅｔのキナーゼドメイン（ｎｔ３４５６〜４２２９）
（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＨＳＵ１９３４８）に
融合した。

【００６４】図３は、ＩＩＰ−１の異型を示す。ａ）
は、ＩＩＰ−１及びＩＩＰ−１（ｐ２６）のｃＤＮＡ配
列の図を示す。ヌクレオチドは上にナンバリングされ
る。ＩＩＰ−１ ｃＤＮＡ内の潜在的な翻訳開始部位は
位置６３である。別のスプライス変異体ＩＩＰ−１（ｐ
２６）内の潜在的な翻訳開始部位としての最初のＡＴＧ
は位置３５３である。両方のｃＤＮＡは位置１０６２に
終止コドンを含む。ｂ）は、ＩＩＰ−１及びＩＩＰ−１
（ｐ２６）のドメイン構造を示す。アミノ酸位置を上に
示す。ＩＩＰ−１（ｐ２６）と比べて、ＩＩＰ−１はＮ
末端に更なる９７アミノ酸を含む。ＩＩＰ−１の両方の
異型は、アミノ酸１２９及び２１３の間の領域を貫くＰ
ＤＺドメインを含む。

【００６５】図４は、ＩＩＰ−１のＩＧＦ−１レセプタ
ー結合ドメインの図である。全長のＩＩＰ−１、その部
分的ｃＤＮＡクローン（ＩＩＰ−１ａ及びＩＩＰ−１
ｂ）及び欠失変異体（ＩＩＰ−１ａ／ｍｕ１，ＩＩＰ−
１ａ／ｍｕ２，ＩＩＰ−１ａ／ｍｕ３，ＩＩＰ−１ｂ／
ｍｕ１）をイースト２−ハイブリッドシステムにおいて
ＩＧＦ−１との相互作用について検査した。イースト細
胞に、ＬｅｘＡ ＩＧＦ−１レセプター融合構成物及び
ＶＰ１６活性化ドメインに融合したＩＩＰ−１又は異な
るＩＩＰ−１変異体をコードする活性化プラスミドを同
時に移入した。ＩＩＰ−１又はその変異体及びＩＧＦ−
１レセプターの間の相互作用を、ヒスチジン欠損培地上
にプレートし、３０℃で６日、インキュベートしたイー
スト形質転換体の成長をモニターすることにより分析し
た（イーストコロニーの直径：＋＋＋、２日で１mm超；
＋＋、４日で１mm超；＋、６日で１mm超；成長は検出さ
れず）。ＰＤＺドメインは、ＩＧＦ−１レセプターとの
相互作用を媒介するために本質的かつ十分であるとして
定着することができる。全長のＩＩＰ−１に対するヌク
レオチド位置を上に示す。

【００６６】図５は、ＩＩＰ−１０のタンパク質配列モ
チーフを示す。ＩＩＰ−１０のアミノ酸配列を、ＰＲＯ
ＳＩＩＥ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙに記載される規則的な
発現パターンについてタンパク質配列を調査することに
よりタンパク質モチーフを捜すコンピュータープログラ
ム“Ｍｏｔｉｆｓ”を用いて分析した。 配列番号：１は、ＩＩＰ−１のヌクレオチド配列（ｃＤ
ＮＡ）である。

【００６７】 配列番号：２は、ＩＩＰ−１の予想されるアミノ酸配列
である。 配列番号：３は、ＩＩＰ−６部分ｃＤＮＡクローンのヌ
クレオチド配列である。 配列番号：４は、ＩＩＰ−６部分ｃＤＮＡクローンの予
想されるアミノ酸配列である。２つのＣｙｓ₂ Ｈｉｓ₂
ジンク・フィンガードメインのシステイン及びヒスチジ
ン残基はアミノ酸７２，７５，８８，９２，１６０，１
０３，１１６、及び１２０である。

【００６８】 配列番号：５は、ＩＩＰ−１０のヌクレオチド配列（ｃ
ＤＮＡ）である。 配列番号：６は、ＩＩＰ−１０の予想されるアミノ酸配
列である。 配列番号：７は、プライマーＴＩＰ２ｃ−ｓである。 配列番号：８は、プライマーＴＩＰ２ｂ−ｒである。 配列番号：９は、プライマーＨｃｔｈｙ−ｓである。

【００６９】 配列番号：１０は、プライマーＨｃｔｈｙ−ｒである。

【００７０】

【実施例】〈実施例１〉ＩＧＦ−１Ｒ結合タンパク質の
単離及びキャラクタリゼーション イースト２−ハイブリッドシステム（Fields, S.及びSo
ng, O., Nature 340 (1989) 245-246)を未知のサイトソ
ルＩＧＦ−１レセプター結合タンパク質を単離するのに
用いた。スクリーニングのために、イースト内のレセプ
ターの鎖間チロシルリン酸化を許容するイースト２−ハ
イブリッドシステムの改良型を用いた。

【００７１】イースト２−ハイブリッドベイトプラスミ
ド（ＢＴＭ１１６−ｃｐＩＧＦ−１レセプター）を、Ｉ
ＧＦ−１レセプターのβ−サブユニットの細胞質ドメイ
ン（ｎｔ２９２３〜４１５４）（Ullrich, Aら、EMBO
J. ら（1986) 2503-2512)を、ダイマーを形成する、活
性化野生型レセプターの状態に擬態するＬｅｘＡ ＤＮ
Ａ結合ドメイン（例えばWeidner, Mら、Nature 384 (19
96) 173-176)に融合することにより作製した。ＬｅｘＡ
ＤＮＡ結合ドメインとレセプタードメインとの間にプ
ロリン−グリシンスペーサーを導入することにより、そ
のベイトがＩＧＦ−１レセプターの周知の基質に結合す
る能力は、他のスペーサーアミノ酸と比べて顕著に増加
した。

【００７２】あるいは、関係していない極めて能力のあ
るレセプターチロシンキナーゼのキナーゼドメインに融
合したＩＧＦ−１レセプターの膜近傍又はＣ末端領域
（ｎｔ２９２３〜３０５１又はｎｔ３８２３〜４１４
６）（Ullrich, Aら、EMBO J. ら（1986) 2503-2512)の
みを含むベイトを作製した。ここで、ｔｐｒｍｅｔのキ
ナーゼドメイン（ｎｔ３４５６〜４２２９）（ＧｅｎＢ
ａｎｋアクセス番号：ＨＳＵ１９３４８）（図２）を用
いた。この方法において、下流のエフェクターへの結合
を媒介するＩＧＦ−１レセプターの領域を図示すること
が可能である。

【００７３】ＩＧＦ−１レセプターベイトプラスミド
を、活性化ドメインｃＤＮＡライブラリー（例えばＶＰ
１６−又はＧａｌ４ベースの活性化ドメイン）（例え
ば、Weidner, Mら、Nature 384 (1996) 173-176)をスク
リーニングするのに用いた。ベイト及びプレイ（ｐｒｅ
ｙ）プラスミドを、Ｈｔｓ３及びｌａｃＺリポーター遺
伝子を含むサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｌ４０
に同時トランスフェクトした。ヒスチジン欠損培地上で
増殖中のイーストコロニーからライブラリープラスミド
を単離し、配列決定し、そしてイースト株Ｌ４０に再導
入した。異なるテストベイトでの同時トランスフェクト
実験、即ちＩＧＦ−１レセプターのキナーゼ不活性変異
体（Ｌ１０３３Ａ）又はインスリンレセプターファミリ
ー（インスリンレセプター、Ｒｏｓ）及び関係のないレ
セプターチロシンキナーゼファミリー（Ｍｅｔ，ＥＧＦ
レセプター、Ｋｉｔ，Ｆｍｓ，Ｎｅｕ）の細胞質ドメイ
ンをコードするＢＴＭ１１６プラスミドでの実験によ
り、予想されるベイト−プレイ相互作用の特異性を評価
した。以前には未知のＩＧＦ−１レセプター相互作用タ
ンパク質（ＩＩＰ）をコードするいくつかのｃＤＮＡを
同定した。更に、ＩＧＦ−１レセプターの周知の物質の
結合ドメイン、例えばｐ８５ＰＩ３ＫのＣ末端ＳＨ２ド
メイン及びＧｒｂ１０のＳＨ２ドメインを見い出した。
結果を表１に示す。

【００７４】

【表１】

【００７５】イースト２−ハイブリッドシステムにおい
てテストした異なるレセプターチロシンキナーゼに対す
るＩＩＰの結合特異性の図。イースト細胞に、異なるレ
セプターチロシンキナーゼをコードするＬｅｘＡ融合構
成物及びＶＰ１６活性化ドメインに融合した異なるＩＩ
Ｐをコードする活性化プラスミドを同時にトランスフェ
クトした。ＩＩＰと異なるレセプターチロシンキナーゼ
との間の相互作用を、ヒスチジン欠損培地上にプレート
し、３０℃で３日、インキュベートしたイースト形質転
換体の成長をモニターすることにより分析した（ｗｔ
ＩＧＦ−１Ｒ、キナーゼ活性ＩＧＦ−１レセプター；ｍ
ｕ ＩＧＦ−１Ｒ、キナーゼ不活性化変異体ＩＧＦ−１
レセプター；ＩＲ、インスリンレセプター；Ｒｏｓ，Ｒ
ｏｓレセプターチロシンキナーゼ；Ｍｅｔ，Ｍｅｔレセ
プターチロシンキナーゼ；＋、３日以内で直径１mm超の
イースト形質転換体の成長；−、検出された成長なし；
ｎｄ、未測定）

【００７６】〈実施例２〉 アッセイシステム： Ａ）インビトロ／生化学アッセイ ＥＬＩＳＡベースのアッセイ／ホモジニアスアッセイ ＩＧＦ−１Ｒ及びその結合タンパク質（ＩＩＰ）を、大
腸菌及び真核細胞内でＴａｑ−酵素あり又はなしで発現
させ、均一になるまで精製する。ＩＧＦ−１Ｒ及び各々
の結合タンパク質の相互作用を薬剤の存在又は欠如下で
分析する。ＩＧＦ−１Ｒ及び各々の結合タンパク質の結
合を阻害し又は促進する化合物を選択する。ＥＬＩＳＡ
システムの場合、２つの結合パートナーに特異的な抗体
を、複合体の検出のために用いる。ホモジニアスアッセ
イの場合、少くとも１の結合パートナーを、複合体の分
析を許容する蛍光染料で標識する。あるいは、抗Ｔａｑ
抗体を相互作用をモニターするために用いる。 Ｂ）細胞アッセイ：腫瘍細胞又はＩＧＦ−１Ｒ及び各々
の結合タンパク質の発現構成物をトランスフェクトした
細胞を薬剤あり又はなしで処理し、次に２つの構成物間
の複合体を標準アッセイを用いて分析する。

【００７７】〈実施例３〉 ＩＩＰ−１及びＩＩＰ−１０のｃＤＮＡクローニング
（及びＲＴ−ＰＣＲアッセイ） 全長のＩＩＰ−１のヌクレオチド配列を、データベース
情報（ＥＳＴ）及びＩＩＰ−１の部分ｃＤＮＡクローン
（ＩＩＰ−１ａ，ＩＩＰ−１ｂ）の配列を用いてアライ
ンした。全長のＩＩＰ−１のｃＤＮＡクローニングを、
ＭＣＦ７ ＡＤＲ乳細胞系から単離した全ＲＮＡでのＲ
Ｔ ＰＣＲにより行った。２つのオリゴヌクレオチドプ
ライマー：ＴＩＰ２ｃ−ｓ（配列番号：７）及びＴＩＰ
２ｂ−ｒ（配列番号：８）でのＲＴ ＰＣＲにより１．
０kb（ＩＩＰ−１）及び０．７kb（ＩＩＰ−１（ｐ２
６））の２つのＤＮＡフラグメントを増幅した。

【００７８】全長のＩＩＰ−１０のヌクレオチド配列
を、データベース情報（ＥＳＴ）及びＩＩＰ−１０の部
分ＤＮＡクローンの配列を用いてアラインした。ＩＩＰ
−１０のｃＤＮＡクローニングを、結腸癌細胞系ＳＷ４
８０から単離した全ＲＮＡで行った。２つのオリゴヌク
レオチドプライマー：Ｈｃｔｈｙ−ｓ（配列番号：９）
及びＨｃｔｈｙ−ｒ（配列番号：１０）でのＲＴ ＰＣ
Ｒにより６７６bpのｃＤＮＡフラグメント（ＩＩＰ−１
０）を増幅した。

【００７９】ＤＮＡ配列決定を、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ登
録商標ＦＳジデオキシターミネーターキット（Ｐｅｒｋ
ｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を
用いてＡＢＩ ３７３Ａシーケンサーでのジデオキシヌ
クレオチド鎖ターミネーション法を用いて行った。ｃＤ
ＮＡ及び予想されるタンパク質配列の比較を、Advanced
Blast Search (Altschul, S.F. ら、J. Mol. Biol. 21
5 (1990) 403-410 ; Altschul, S.Fら、Nucleic Acids
Res. 25 (1997) 3389-3402) を用いて行った。

【００８０】〈実施例４〉 ＩＩＰ−１及びＩＩＰ−１０のウエスタンブロット分析 全細胞ライゼートを、５０mM Ｔｒｉｓ pH８．０，１
５０mM ＮａＣｌ，１％ ＮＰ４０，０．５％デオキシ
コール酸、０．１％ ＳＤＳ、及び１mM ＥＤＴＡを含
む緩衝液中に調製し、４℃で１５分、遠心することによ
り透明にした。その上清のタンパク質濃度を、製造元の
マニュアルに従って、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ａｓｓａｙキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて測定
した。ＩＧＦ−１レセプターを、抗ＩＧＦ−１レセプタ
ー抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて免疫沈降させ
た。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ニト
ロセルロースフィルターに電気泳動により移した。ニト
ロセルロースフィルターを２０mM Ｔｒｉｓ pH７．
５，１５０mM ＮａＣｌ，０．２％ Ｔｗｅｅｎ−２０
中１０％脱脂粉乳と共にプレインキュベートした。フラ
ッグエピトープに対するマウスモノクローナル抗体の結
合を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マ
ウスＩｇＧ抗血清（Ｂｉｏｒａｄ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｄ
Ｅ）により検出し、増強化学発光検出システムＥＣＬ^TM
（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｄ
Ｅ）を用いて視覚化した。

【００８１】〈実施例５〉 リポソーム媒介トランスフェクションによる哺乳動物細
胞内でのＩＩＰ−１へＩＩＰ−１０の過剰発現 ＩＩＰ−１〜−１０についてのｃＤＮＡをｐＢＡＴｆｌ
ａｇ又はｐｃＤＮＡ３ｆｌａｇ（Weidner, Mら、Nature
384 (1996) 173-176 ; Behrens, Jら、Nature382 (199
6) 638-642 ; Behrens, J. ら、Science 280 (1998) 59
6-599) のＮａｔＩ部位にクローン化した。ＮＩＨ３Ｔ
３細胞又は他の受容細胞に、トランスフェクション剤と
してＦｕ ＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ）を用いて、ｐｃＤＮＡｆｌａｇ ＩＩＰ−１
〜−１０又はｐＢＡＴｆｌａｇ ＩＩＰ−１〜−１０をトランスフェクトした。細胞を、
０．４mg／mlのＧ４１８において選択した。単一のコロ
ニーをとり、ＩＩＰ−１〜−１０の発現について分析
し、増殖に関して機能的にキャラクタライズした。

【００８２】ノーザンブロット分析 ヒト及びネズミｍＲＮＡ多重組織ノーザン・ブロット
を、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，
ＵＳ）から購入した。そのコーディング領域のＩＩＰ−
１０ ｎｔ３４３〜ｎｔ６７６を貫くｃＤＮＡプローブ
をＰＣＲ ＤＩＧＬａｂｅｌｉｎｇ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈ
ｅ Ｐｉａｇｈｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，ＤＥ）を用い
てＤＩＧ−ｄＵＴＰで標識した。ジゴキシゲニン標識化
アクチンＲＮＡプローブをＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，ＤＥから購入した。ＤＩＧ Ｅａ
ｓｙＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｒｏｃｈｅ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，ＤＥ）を用いてハ
イブリダイゼーションを行った。ＩＩＰ−１０ ｍＲＮ
Ａを、アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたＤ
ＩＧ特異的抗体及びＣＳＰＤ基質（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａ
ｇｎｏｓｔｉｃｓ．ＧｍｂＨ，ＤＥ）で検出した。

【００８３】〈実施例６〉 癌細胞におけるｍＲＮＡの検出 配列番号：１もしくは配列番号：５又はその相補配列と
ハイブリダイズする核酸によりコードされるタンパク質
が癌細胞内で発現されるか否か、及び結果としてｍＲＮ
Ａが存在するか否かを検出するために、一方で、核酸ハ
イブリダイゼーションの確立された方法、例えばノーザ
ンハイブリダイゼーション、イン・シトゥハイブリダイ
ゼーション、ドット又はスロットハイブリダイゼーショ
ン及びその由来の診断技術を行うことが可能である（Sa
mbrook et al., Molecular Cloning ; A laboratory ma
nual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, N
ewYork, USA ; Hames, B.D., Higgins, S.G., Nucleic
acid hybridisation - apractical approach (1985) IR
L Press, Oxford, England；ＷＯ８９／０６６９８；Ｅ
Ｐ−Ａ ０２００３６２；ＥＰ−Ａ ００６３８７９；
ＥＰ−Ａ ０１７３２５１；ＥＰ−Ａ ０１２８０１
８）。他方、特定のプライマーを用いる増幅の多様なレ
パートリーからの方法を用いることが可能である（PRC
Protocols -A Guide to Methods and Applications (19
90), publ. M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky,
T.J. White, Academic Press Inc. ; PCR - A Practic
al Approach (1991), publ. M.J. McPherson, P. Quirk
e, G.R. Taylor, IRL Press)。

【００８４】このためのＲＮＡは、Chomcszynski及びSa
cchi, Anal. Biochem 162 (1987) 156-159の方法により
癌組織から単離する。２０μｇの全ＲＮＡを１．２％ア
ガロースホルムアルデヒドで分離し、標準的な方法（Sa
mbrookら、Molecular Cloning ; A laboratory manual
(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYor
k, USA)によりナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｒａ
ｕｎｓｔｈｗｅｉｇ，ＤＥ）に移した。ＤＮＡ配列番
号：１又は配列番号：５をプローブとして放射能標識し
た（Feinberg, A.P., 及びVogelstein, B., Anal. Bioc
hem. 137 (1984)266-267)。ハイブリダイゼーション
を、６８℃で、５×ＳＳＣ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ，７
％ ＳＤＳ １０．５Ｍリン酸緩衝液pH７．０，１０％
デキストランスルフェート及び１００μｇ／mlサケ精子
ＤＮＡ中で行った。次に、膜を２回、１時間、１×ＳＳ
Ｃ中で６８℃で洗い、次にＸ線フィルムに露出した。

【００８５】〈実施例７〉 本発明によるタンパク質の活性のモジュレーターの同定
のための手順 実施例５の発現ベクター（ＩＩＰ−１又はＩＩＰ−１０
のいずれかについて、１０μｇ／１０⁶ 細胞）を、当該
技術で周知の標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）によ
りＮＩＨ３Ｔ３細胞に移す。ベクターを摂取した細胞
は、選択の存在下又は選択条件（０．４mg／ml Ｇ４１
８）下で増殖する能力によって同定される。ＩＩＰをコ
ードするＤＮＡを発現する細胞は、実施例５に記載され
るように、ノーザン・ブロット分析によって検出され
る。あるいは、そのタンパク質を発現する細胞は、実施
例４に記載される抗体を用いるウエスタン・ブロット分
析によるタンパク質の同定によって同定される。発現ベ
クターからタンパク質を発現する細胞は、変化した形態
及び／又は増強された成長特性を示すであろう。

【００８６】タンパク質を発現し、上述の変化した特性
の１又は複数を示す細胞を、モジュレーター化合物と予
想されるものあり及びなしで培養する。化学的及び天然
のライブラリーのスクリーニングにより、このような化
合物は、細胞増殖をモニターする高スループット細胞ア
ッセイを用いて同定することができる（色原基質として
テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１，ＭＴＴ、又はＸＴＴを用
いる細胞増殖アッセイ、又はブロモデソキシウリジン
（ＢｒｄＵ）を用いる細胞死検出、ＥＬＩＳＡ；例えば
Boehringer Mannheim GmbH, Apoptosis and Cell Proli
feration；２^nd edition, 1998, pp. 70-84)。

【００８７】モジュレーター化合物は、ＩＩＰタンパク
質活性に対する細胞応答を増加させ又は減少させるであ
ろうし、各々ＩＧＦ−１レセプター機能のアクティベー
ター又はインヒビターであろう。あるいは、モジュレー
ターと予想されるものは、腫瘍細胞の培養物に添加さ
れ、その細胞は、変化した形態を示し、及び／又は減少
した又は増加した成長特性を示す。モジュレーター化合
物と予想されるものは、ＩＩＰタンパク質あり及びなし
で細胞に添加され、細胞応答は、細胞の形態特性の直接
観察により測定され、及び／又は細胞はそれらの成長特
性についてモニターされる。モジュレーター化合物は、
ＩＩＰタンパク質に対する細胞応答を増加又は減少させ
るであろうし、各々ＩＧＦ−１レセプター活性のアクテ
ィベーター又はインヒビターであろう。

【００８８】引用文献の目録 Altschul, S.F., et al., J. Mol. Biol. 215 (1990) 4
03-410 Altschul, S.F., et al., Nucleic Acids Res. 25 (199
7) 3389-3402 Ausubel I., Frederick M., Current Protocols in Mo
l. Biol. (1992), JohnWiley and Sons, New York Bates et al., Br. J. Cancer 72 (1995) 1189-1193 Behrens, J., et al., Nature 382 (1996) 638-642 Behrens, J., et al., Scinece 280 (1998) 596-599 Boehringer Mannheim GmbH, Apoptosis and Cell Proli
feration, 2nd edition, 1998, pp. 70-84 Burfeind et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (19
96) 7263-7268 Buettner et al., Mol. Cell. Biol. 11 (1991) 3573-3
583 Cabral, J.H., et al., Nature 382 (1996) 649-652 Chomcszynski and Sacchi, Anal. Biochem. 162 (1987)
156-159 Chowdhury, K., et al., Mech. Dev. 39 (1992) 129-14
2 Cooke, M.P., and Perlmutter, R.M., New Biol. 1 (19
89) 66-74 Database EMBL Nos. AF089818 and AF061263 Denny, P., and Ashworth, A., Gene 106 (1991) 221-2
27 DeVries, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95
(1998) 12340-12345 Dey, R.B., et al., Mol. Endocrinol. 10 (1996) 631-
641 EP-A 0 063 879 EP-A 0 128 018 EP-A 0 173 251 EP-A 0 200 362 Feinberg, A.P., and Vogelstein, B., Anal. Biochem.
137 (1984) 266-267 Fields, S., and Song, O., Nature 340 (1989) 245-24
6 Goulding, M.D., et al., EMBO J. 10 (1991) 1135-114
7 Hames, B.D., Higgins, S.G., Nucleic acid hybridisa
tion - a practical approach (1985) IRL Press, Oxfo
rd, England Harrington et al., EMBO J. 13 (1994) 3286-3295 He, W., et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 11641-11
645 Kalebic et al., Cancer Res. 54 (1994) 5531-5534 Kaleko et al., Mol. Cell. Biol. 10 (1990) 464-473 Lamothe, B., et al., FEBS Lett. 373 (1995) 51-55 Lehmann, J.M., et al., Nucleic Acids Res. 18 (199
0) 1048) Margolis, B.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89 (1992) 8894-8898 Morrione et al., J. Virol. 69 (1995) 5300-5303 Morrione, A., et al., Cancer Res. 56 (1996) 3165-3
167 Needleman and Wunsch, J. Biol. Chem. 48 (1970) 443
-453 PCR - A Practical Approach (1991), publ. M.J., McP
herson, P. Quirke, G.R. Taylor, IRL Press Pearson, W.R., Methods in Enzymology 183 (1990) 63
-68, Academic Press,San Diego, US Ponting, C.P., et al., BioEssays 19 (1997) 469-479 Prager et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (199
4) 2181-2185 PRC Protocols - A Guide to Methods and Application
s (1990), publ. M.A.Innis, D.H. Gelfand, J.J. Snin
sky, T.J. White, Academic Press Inc. Quinn et al., J. Biol. Chem. 271 (1996) 11477-1148
3 Resnicoff et al., Cancer Res. 54 (1994) 2218-2222 Resnicoff et al., Cancer Res. 54 (1994) 4848-4850 Resnicoff et al., Cancer Res. 55 (1995) 2463-2469 Resnicoff et al., Cancer Res. 55 (1995) 3739-3741 Riedel, H., et al., J. Biochem. 122 (1997) 1105-11
13 Rocchi, S., et al., Endocrinology 137 (1996) 4944-
4952 Rogler et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 13779-137
84 Rousset, R., et al., Oncogene 16 (1998) 643-654 Sambrook et al., Molecular Cloning : A laboratory
manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press,
New York, USA Sell et al., Cancer Res. 55 (1995) 303-305 Sell et al., Mol. Cell. Biol. 14 (1994) 3604-3612 Sell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993)
11217-11221 Singleton et al., Cancer Res. 56 (1996) 4522-4529 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2 (1981) 482-
489 Tartare-Decker, S., et al., Endocrinology 137 (199
6) 1019-1024 Tartare-Deckert, S., et al., J. Biol. Chem. 270 (1
995) 23456-23460 Trojan et al., Science 259 (1993) 94-97 Ullrich, A., et al., EMBO J. 5 (1986) 2503-2512 USP 2915082 Wahl, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76
(1979) 3683-3687 Wang, J., and Riedel, H., J. Biol. Chem. 273 (199
8) 3136-3139 Weidner, M., et al., Nature 384 (1996) 173-176 WO 97/27296 WO 89/06698 WO 95/14722 Yokouchi, M., et al., Oncogene 15 (1998) 7-15

【００８９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG <120> IGF-1 receptor interacting proteins (IIPs), genes coding therefor and uses thereof <130> A997134 <150> EP98122992.5 <151> 1998-12-03 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1707 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaaacccaca ggaggcaacc acactagttt agatcttctg gtgaccccac ttctcgctgc 60 tcatgccgct gggactgggg cggcggaaaa aggcgccccc tctagtggaa aatgaggagg 120 ctgagccagg ccgtggaggg ctgggcgtgg gggagccagg gcctctgggc ggaggtgggt 180 cggggnnccc ccaaatgggc ttncnccccc ctcccccagc cctgcggccc cgcctcgtgt 240 tccacaccca gctggcccat ggcagtccca ctggccgcat cgagggcttc accaacgtca 300 aggagctgta tggcaagatc gccgaggcct tccgcctgcc aactgccgag gtgatgttct 360 gcaccctgaa cacccacaaa gtggacatgg acaagctcct ggggggccag atcgggctgg 420 aggacttcat cttcgcccac gtgaaggggc agcgcaagga ggtggaggtg ttcaagtcgg 480 aggatgcact cgggctcacc atcacggaca acggggctgg ctacgccttc atcaagcgca 540 tcaaggaggg cagcgtgatc gaccacatcc acctcatcag cgtgggcgac atgatcgagg 600 ccattaacgg gcagagcctg ctgggctgcc ggcactacga ggtggcccgg ctgctcaagg 660 agctgccccg aggccgtacc ttcacgctga agctcacgga gcctcgcaag gccttcgaca 720 tgatcagcca gcgttcagcg ggtggccgcc ctggctctgg cccacaactg ggcactggcc 780 gagggaccct gcggctccga tcccggggcc ccgccacggt ggaggatctg ccctctgcct 840 ttgaagagaa ggccattgag aaggtggatg acctgctgga gagttacatg ggtatcaggg 900 acacggagct ggcagccacc atggtggagc tgggaaagga caaaaggaac ccggatgagc 960 tggccgaggc cctggacgaa cggctgggtg actttgcctt ccctgacgag ttcgtctttg 1020 acgtctgggg cgccattggg gacgccaagg tcggccgcta ctaggactgc ccccggaccc 1080 tgcgatgatg acccgggcgc aacctggtgg gggcccccag cagggacact gacgtcagga 1140 cccgagcctc cagcctgagc ctagctcagc agcccaagga cgatggtgag gggaggtggg 1200 gccaggcccc ctgccccgct ccactcggta ccatcccctc cctggttccc agtctggccg 1260 gggtccccgg cccccctgtg ccctgttccc cacctacctc agctgggtca ggcacaggga 1320 ggggagggat cagccaaatt gggcggccac ccccgcctcc accactttcc accatcagct 1380 gccaaactgg tccctctgtc tccctggggc cttgggttct gtttgggggt catgaccttc 1440 ctagtttcct gacgcaggga atacagggga gagggttgtc cttcccccca gcaaatgcaa 1500 taatgccctc acccctcctg agaggagccc cctccctgtg gagcctgtta cctccgcatt 1560 tgacacgagt ctgctgtgaa ccccgcaacc tcctccccac ctcccatctc tccttccagg 1620 cccatccctg gcccagagca ggagggaggg agggacgatg gcggtgggtt tttgtatctg 1680 aatttgctgt cttgaacata aagaatc 1707 <210> 2 <211> 333 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Leu Gly Leu Gly Arg Arg Lys Lys Ala Pro Pro Leu Val Glu 1 5 10 15 Asn Glu Glu Ala Glu Pro Gly Arg Gly Gly Leu Gly Val Gly Glu Pro 20 25 30 Gly Pro Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Xaa Pro Gln Met Gly Xaa Xaa 35 40 45 Pro Pro Pro Pro Ala Leu Arg Pro Arg Leu Val Phe His Thr Gln Leu 50 55 60 Ala His Gly Ser Pro Thr Gly Arg Ile Glu Gly Phe Thr Asn Val Lys 65 70 75 80 Glu Leu Tyr Gly Lys Ile Ala Glu Ala Phe Arg Leu Pro Thr Ala Glu 85 90 95 Val Met Phe Cys Thr Leu Asn Thr His Lys Val Asp Met Asp Lys Leu 100 105 110 Leu Gly Gly Gln Ile Gly Leu Glu Asp Phe Ile Phe Ala His Val Lys 115 120 125 Gly Gln Arg Lys Glu Val Glu Val Phe Lys Ser Glu Asp Ala Leu Gly 130 135 140 Leu Thr Ile Thr Asp Asn Gly Ala Gly Tyr Ala Phe Ile Lys Arg Ile 145 150 155 160 Lys Glu Gly Ser Val Ile Asp His Ile His Leu Ile Ser Val Gly Asp 165 170 175 Met Ile Glu Ala Ile Asn Gly Gln Ser Leu Leu Gly Cys Arg His Tyr 180 185 190 Glu Val Ala Arg Leu Leu Lys Glu Leu Pro Arg Gly Arg Thr Phe Thr 195 200 205 Leu Lys Leu Thr Glu Pro Arg Lys Ala Phe Asp Met Ile Ser Gln Arg 210 215 220 Ser Ala Gly Gly Arg Pro Gly Ser Gly Pro Gln Leu Gly Thr Gly Arg 225 230 235 240 Gly Thr Leu Arg Leu Arg Ser Arg Gly Pro Ala Thr Val Glu Asp Leu 245 250 255 Pro Ser Ala Phe Glu Glu Lys Ala Ile Glu Lys Val Asp Asp Leu Leu 260 265 270 Glu Ser Tyr Met Gly Ile Arg Asp Thr Glu Leu Ala Ala Thr Met Val 275 280 285 Glu Leu Gly Lys Asp Lys Arg Asn Pro Asp Glu Leu Ala Glu Ala Leu 290 295 300 Asp Glu Arg Leu Gly Asp Phe Ala Phe Pro Asp Glu Phe Val Phe Asp 305 310 315 320 Val Trp Gly Ala Ile Gly Asp Ala Lys Val Gly Arg Tyr 325 330 <210> 3 <211> 380 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gccgaggaag gagaaggggc taaaccttgg agagtggatg gctcaaagga ttctcagatc 60 acacctcggg aggatcatgg gcaggagagc ctgttggcag ggctccacgg aacgcatcca 120 ccaaagacaa ggcagaaagt cactgcccaa gccggaggcc ccggggatcc catgcttttt 180 tcaagcccag agacagatga gaagcttttt atatgtgcgc agtgtggcaa aaccttcaac 240 aatacctcca acctgagaac gcaccagcgg atccacactg gcgagaagcc ctacatgtgt 300 tccgagtgtg gcaagagttt ctcccggagc tccaaccgca tccggcacga gcgcatccac 360 ctggaagana agcactctga 380 <210> 4 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Glu Glu Gly Glu Gly Ala Lys Pro Trp Arg Val Asp Gly Ser Lys 1 5 10 15 Asp Ser Gln Ile Thr Pro Arg Glu Asp His Gly Gln Glu Ser Leu Leu 20 25 30 Ala Gly Leu His Gly Thr His Pro Pro Lys Thr Arg Gln Lys Val Thr 35 40 45 Ala Gln Ala Gly Gly Pro Gly Asp Pro Met Leu Phe Ser Ser Pro Glu 50 55 60 Thr Asp Glu Lys Leu Phe Ile Cys Ala Gln Cys Gly Lys Thr Phe Asn 65 70 75 80 Asn Thr Ser Asn Leu Arg Thr His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys 85 90 95 Pro Tyr Met Cys Ser Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Arg Ser Ser Asn 100 105 110 Arg Ile Arg His Glu Arg Ile His Leu Glu Xaa Lys His Ser 115 120 125 <210> 5 <211> 678 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgtcgagac cccggaagag gctggctggg acttctggtt cagacaaggg actatcagga 60 aaacgcacca aaactgagaa ctcaggtgag gcattagcta aagtggagga ctccaaccct 120 cagaagactt cagccactaa aaactgtttg aagaatctaa gcagccactg gctgatgaag 180 tcagagccag agagccgcct agagaaaggt gtagatgtga agttcagcat tgaggatctc 240 aaagcacagc ccaaacagac aacatgctgg gatggtgttc gtaactacca ggctcggaac 300 ttccttagag ccatgaagct gggagaagaa gccttcttct accatagcaa ctgcaaagag 360 ccaggcatcg caggactcat gaagatcgtg aaagaggctt acccagacca cacacagttt 420 gagaaaaaca atccccatta tgacccatct agcaaagagg acaaccctaa gtggtccatg 480 gtggatgtac agtttgttcg gatgatgaaa cgtttcattc ccctggctga gctcaaatcc 540 tatcatcaag ctcacaaagc tactggtggc cccttaaaaa atatggttct cttcactcgc 600 cagagattat caatccagcc cctgacccag gaagagtttg attttgtttt gagcctggag 660 gaaaaggaac caagttaa 678 <210> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ser Arg Pro Arg Lys Arg Leu Ala Gly Thr Ser Gly Ser Asp Lys 1 5 10 15 Gly Leu Ser Gly Lys Arg Thr Lys Thr Glu Asn Ser Gly Glu Ala Leu 20 25 30 Ala Lys Val Glu Asp Ser Asn Pro Gln Lys Thr Ser Ala Thr Lys Asn 35 40 45 Cys Leu Lys Asn Leu Ser Ser His Trp Leu Met Lys Ser Glu Pro Glu 50 55 60 Ser Arg Leu Glu Lys Gly Val Asp Val Lys Phe Ser Ile Glu Asp Leu 65 70 75 80 Lys Ala Gln Pro Lys Gln Thr Thr Cys Trp Asp Gly Val Arg Asn Tyr 85 90 95 Gln Ala Arg Asn Phe Leu Arg Ala Met Lys Leu Gly Glu Glu Ala Phe 100 105 110 Phe Tyr His Ser Asn Cys Lys Glu Pro Gly Ile Ala Gly Leu Met Lys 115 120 125 Ile Val Lys Glu Ala Tyr Pro Asp His Thr Gln Phe Glu Lys Asn Asn 130 135 140 Pro His Tyr Asp Pro Ser Ser Lys Glu Asp Asn Pro Lys Trp Ser Met 145 150 155 160 Val Asp Val Gln Phe Val Arg Met Met Lys Arg Phe Ile Pro Leu Ala 165 170 175 Glu Leu Lys Ser Tyr His Gln Ala His Lys Ala Thr Gly Gly Pro Leu 180 185 190 Lys Asn Met Val Leu Phe Thr Arg Gln Arg Leu Ser Ile Gln Pro Leu 195 200 205 Thr Gln Glu Glu Phe Asp Phe Val Leu Ser Leu Glu Glu Lys Glu Pro 210 215 220 Ser 225 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer TIP2c-s <400> 7 gaaacccaca ggaggcaa 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer TIP2b-r <400> 8 ggtcatcatc gcagggtc 18 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer Hcthy-s <400> 9 agcttgcggc cgcagatgtc gagaccccgg aag 33 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer Hcthy-r <400> 10 agcttgcggc cgcgaattct taacttggtt ccttttcctc 40

【図面の簡単な説明】

【図１】ＩＧＦ−１レセプターの細胞質結合タンパク質
のためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするた
めに用いたイースト２−ハイブリッドベイトのドメイン
構造を示す図である。

【図２】イースト２−ハイブリッドＬｅｘＡ／ＩＧＦ−
１レセプターベイト構成物の改良を示す図である。

【図３】ＩＩＰ−１の異型を示す図である。

【図４】ＩＩＰ−１のＩＧＦ−１レセプター結合ドメイ
ンを示す図である。

【図５】ＩＩＰ−１０のタンパク質配列モチーフを示す
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ミカエル ベイトナー ドイツ連邦共和国，デー−82377 ペン ツベルク，ルトビク−メルツ シュトラ ーセ 39ア (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/435 - 14/79 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ａ）配列番号：５に記載の核酸配列又は
   それに相補的である核酸配列、 ｂ）配列番号：６に記載のポリペプチドと相同性を示す
   ポリペプチドをコードする、ａ）の核酸配列のうちの１
   つとストリンジェント条件下でハイブリダイズする核酸
   配列、又は ｃ）遺伝コードの縮重により、ａ）又はｂ）の配列によ
   りコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を有するＩ
   ＩＰ−１０ポリペプチドをコードする配列を含む群から
   選択される、ＩＧＦ−１レセプターに結合するタンパク
   質をコードする核酸（ＩＩＰ−１０）。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の核酸によりコードされ
   たＩＧＦ−１レセプターに結合する組換えポリペプチ
   ド。