JP2004504002A - ヒトシャペロンタンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトシャペロンタンパク質（ＨＣＨＰ）と、ＨＣＨＰを同定しコードするポリヌクレオチドとを提供する。本発明はまた、発現ベクター及び宿主細胞、抗体、アゴニスト、アンタゴニストを提供する。更に、本発明は、ＨＣＨＰの発現に関連する疾患の診断または治療方法、予防方法を提供する。

Description

【０００１】
（技術分野）
本発明は、ヒトシャペロンタンパク質の核酸配列及びアミノ酸配列、並びにこれらの配列を用いた神経変性性の疾患、代謝異常、発達障害、自己免疫／炎症性疾患、及び癌を含む細胞増殖異常症の診断及び治療、予防に関する。
【０００２】
（発明の背景）
分子シャペロンは、他の細胞タンパク質と相互作用するタンパク質である。シャペロンは、例えば新合成ポリペプチドのフォールディング、多サブユニットタンパク質構造形成、タンパク質膜透過輸送、及び不活性構造タンパク質安定化等の通常の細胞機能に影響を与える。シャペロンは、毒性、熱ショック等のストレスへの細胞反応にも影響を与えるので、熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）と呼ばれている。シャペロンは、Ｈｓｐ６０（ＴＣＰ１）、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０（ＤｎａＪとも呼ばれる）、Ｈｓｐ９０等、幾つかに分類できる。タンパク質−タンパク質相互作用の一例として、細胞質ゾルからミトコンドリアへの転座がある。
【０００３】
主要なミトコンドリアのタンパク質は、核遺伝子がコードし、ミトコンドリアに輸送する。これらのタンパク質はシトレートシンターゼ及び他のクエン酸サイクル酵素、Ｆ１ＡＴＰアーゼのサブユニット、チトクロームｃ及びチトクロームｃオキシダーゼのサブユニットを含み、これらはミトコンドリアの酸化的リン酸化機能に必須である。核がコードするミトコンドリアのタンパク質は、Ｎ末端標的配列とともにプレタンパク質として細胞質ゾルのリボソーム上で合成される。細胞質ゾルのＨｓｐ７０タンパク質は、分子シャペロンとして働き、新合成プレタンパク質をゆるいフォールディング（ｌｏｏｓｅｌｙ−ｆｏｌｄｉｎｇ）状態に維持して転座に備える。プレタンパク質をミトコンドリアに輸送後、標的配列は除去される。プレタンパク質はミトコンドリアへの輸送の際、膜の外側、内側で各々Ｔｏｍ、Ｔｉｍとして知られる多サブユニットトランスロカーゼを必要とする。Ｔｉｍは少なくとも３個の内膜タンパク質、Ｔｉｍ２３、Ｔｉｍ１７、及びＴｉｍ４４で構成される。Ｔｉｍ２３−Ｔｉｍｌ７は内膜を透過する転座チャネルの成分である（Ｄｅｋｋｅｒ， Ｐ．Ｊ．ら（１９９７）ＥＭＢＯ Ｊ． １６（１７）：５４０８−５４１９）。
【０００４】
Ｔｉｍ４４は、内膜の基質側でＴｉｍ２３−Ｔｉｍｌ７転座チャネルと会合する。Ｔｉｍ４４は、ミトコンドリアのシャペロンＨｓｐ７０及びそのコシャペロン Ｍｇｅｌを補充し、これらはエネルギー源としてＡＴＰを用いて基質へのタンパク質転座を推進する（Ｓｉｒｒｅｎｂｅｒｇ， Ｃ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８４（６６０９）：５８２−５８５．）。Ｔｉｍ４４は、外来プレタンパク質及びミトコンドリアのＨｓｐ７０の双方に結合する。プレタンパク質がＴｉｍ４４−Ｈｓｐ７０複合体から基質へ解放された後、多数の異なる経路を経由してフォールディングが発生する可能性がある。輸送されたポリペプチドは「ｆｏｌｄａｓｅ」分子シャペロンＨｓｐ６０に形質転換され、Ｈｓｐ６０はフォールディング及びオリゴマー形成の媒介となる（Ｈａｒｔｌ， Ｆ．Ｕ．（１９９１）Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３（１）：５−１６．）。ｍｔＨｓｐ７０のＴｉｍ４４との動的相互作用は、転座中に完成していないフォールディング（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）を支持するプレタンパク質上で引張力を発生させる（Ｖｏｏｓ， Ｗ．ら（１９９６）ＥＭＢＯ Ｊ． １５（１ ｌ）：２６６８−２６７７）。
【０００５】
マウスＴｉｍ４４は、１７６２ ｂｐのｃＤＮＡクローンから発現した。マウスＴｉｍ４４は外見上疎水性の膜貫通ドメインを有しない４４ｋＤａのタンパク質である。マウスＴｉｍ４４のＮ末端アミノ酸は、アルギニン及びヒドロキシル化アミノ酸に豊み、延長された疎水性ストレッチがないことから、ミトコンドリアの輸送標的配列であろう。標的配列の６４個のアミノ酸中、１アミノ酸残基（グルタミン酸）のみが存在し、１２塩基性残基（８個のアルギニン）及び１８極性残基（１１個のセリン）とは対照的である。
【０００６】
マウスＴｉｍ４４は、酵母Ｔｉｍ４４と２９％の同一性及び５０％の類似性を有し、Ｔｉｍ４４が極めてよく保存されていることを示している（Ｗａｄａ， Ｊ．ら（１９９８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５（１）：１４４−１４９．）。この保存は、ミトコンドリアのタンパク質輸送システムの基本的重要性を実証している。ミトコンドリアのシャペロンはバクテリアのシャペロンに高度に類似しており、一般には分子シャペロンのファミリーはバクテリアからヒトまで遍在しており、極めてよく保存されている（Ｍａｒｔｉｎｕｓ， Ｒ．Ｄ．ら（１９９５）ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９（５）：３７１−３７８．）。分子シャペロン遺伝子は熱ショック以外に、グルコース欠失、エタノール、重金属等の種々のストレスによっても活性化されるが、熱ショックはタンパク質フォールディングに影響を及ぼし、温度上昇をもたらす異常においても活性化が予測される。分子シャペロンは、自己免疫性状態の発達において役割を演じるよう示唆されており、外傷反応の他、神経変性障害、代謝障害、及び発達障害に関与している。更に、主要ミトコンドリア機能、酸化的リン酸化反応を行うタンパク質の多くは必ず細胞形質から輸送されるので、代謝に影響する異常はミトコンドリアの輸送トランスロカーゼに影響を与える。
【０００７】
多数のミトコンドリアの異常は、核がコードするタンパク質の欠損に関与している。核遺伝子のうちミトコンドリアの機能欠損に関与している症候群に関係があるのは聴覚消失遺伝子ＤＦＮＢ８／１０（Ｋｒｏｈｎ， Ｋら（１９９７）２３８（３）：８０６−８１０）である。癌細胞は、核がコードするミトコンドリアの酸化的リン酸化酵素遺伝子の転写の促進を示しており（Ｃａｐｕａｎｏ， Ｆ（１９９７）Ｊ． Ｂｉｏｅｎｅｒｇ． Ｂｉｏｍｅｍｂｒ． ２９（４）：３７９−３８４）、乳児期及び幼児期の最も一般的なミトコンドリアの異常であるリー症候群は、核チトクロームｃオキシダーゼ遺伝子の突然変異に関連している。
【０００８】
神経系統の疾患は、欠陥的カルシウム緩衝、遊離基の発生、ミトコンドリアの透過性遷移活性及びその結果生ずる二次毒性を導くミトコンドリアのエネルギー代謝障害にしばしば影響を与える。種々の要素を含む遺伝的起源の神経変性疾患は、ミトコンドリアの機能障害を共同経路として共有する。ミトコンドリアの機能障害は、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、家族性筋萎縮性側索硬化症、及びフリードライヒ運動失調症に関連している（Ｂｅａｌ， Ｍ．Ｆ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔｓ １３６６ （１−２）：２１ １−２２３）。ハンチントン舞踏病に関連しているタンパク質（ｈｕｎｓｉｎｇｔｉｎ）及びフリードライヒ運動失調症に関連しているタンパク質（ｆｒａｔａｘｉｎ）は核ＤＮＡがコードする（Ｓｃｈａｐｉｒａ， ＡＨＶ（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １３６６（ｌ−２）：２２５−２３３）。ミトコンドリアの脳疾患は核遺伝子欠損から最も頻繁に起こる（Ｍａｅｒｔｏｎｓ， Ｐ（１９９６）Ｓｅｍｉｎ． Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｎｅｕｒｏｌ． ３（４）：２７９−２９７）。ミトコンドリアの分子シャペロンをコードする遺伝子の突然変異は、ミトコンドリアのＦ_１Ｆ_０−ＡＴＰシンターゼのＦ−ＡＴＰアーゼサブユニット９の蓄積によって特徴付けられる神経変性疾患群、バッテン病の原因として示唆されている（Ｔａｎｎｅｒ， ＡＪら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ５７（１）：１−９）。代謝脳疾患はミトコンドリアの異常にも関連している。遺伝性運動失調において、ミトコンドリアの標識の不規則性は共通である（Ｂｌａｓｓ， Ｊ．Ｐ．ら（１９８８）Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｌ． Ｐａｒｉｓ １４４（１０）：５４３−５６３．）。ミトコンドリアの輸送タンパク質Ｈｓｐ６０を含む不規則免疫反応性は、精神分裂病患者に観察される（Ｋｉｌｉｄｉｒｅａｓ， Ｋ．ら（１９９２）Ｌａｎｃｅｔ ３４０（８８１９）：５６９−５７２）。核がコードする酸化マンガンジスムターゼのミトコンドリア標的配列の突然変異は、パーキンソン病に関連している（Ｓｈｉｍｏｄａ−Ｍａｔｓｕｂａｙａｓｈｉ， Ｓ．ら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２２６（２）：５６１−５６５）。糖タンパク様封入体は、正常な加齢とともに、進行性ミトコンドリア損傷の結果として、アルツハイマー病またはその他の神経変性疾患に及ぶヒト中枢神経系内に蓄積される（Ｃｉｓｓｅ， Ｓ．ら（１９９５）Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２１（５）：４２３−４３１）。
【０００９】
インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は、ミトコンドリアのタンパク質異常であるフリードライヒ運動失調症に関連している。Ｔｉｍ４４は高血糖状態で上方制御される（Ｗａｄａ、上述）。カルニチンの１次及び２次欠失は、ミトコンドリア膜を透過して基質を輸送する際の欠点の一例である。脂質保存ミオパシーは、しばしば表れる。核がコードするクエン酸回路タンパク質は、フマラーゼ、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ、及びαケトグルタル酸塩デヒドロゲナーゼを含む欠乏疾患に関与している（ＤｅＶｉｖｏ， Ｄ．Ｃ．（１９９３）Ｂｒａｉｎ Ｄｅｖ． １５（１）：１−２２）。
【００１０】
平常状態または無ストレス状態下で、構成性発現Ｈｓｐは固有タンパク質のフォールディング及び成熟を促進し、タンパク質の膜透過転座を促進し、ホルモン受容体及びタンパク質キナーゼ活性（Ｈｉｇｈｔｏｗｅｒ， Ｌ．Ｅ．ら（１９９１）Ｃｅｌｌ ６６： １９１−１９７）、抗原提示、リソソーム内のタンパク質分解、及びクラスリンでコートされた小胞体を調節する。Ｈｓｐは全主要細胞区画に存在し、Ｈｓｐ作用の速度及び特異性を決定する単量体、多量体、または他の細胞タンパク質との複合体としての機能する。ヒトＨｓｐ７０の酵母及びバクテリアの相同体は、タンパク質フォールディング及びタンパク質複合体形成中にＡＴＰ加水分解速度を加速するＤｎａＪ遺伝子生成物の複合体として機能する。ＤｎａＪタンパク質のヒト相同体は、最近同定され、熱ショックにより強く誘発され、ＤｎａＪタンパク質ファミリーと類似の配列を有する。ＤｎａＪ相同体Ｈｓｐ４０は、核及び熱ショックＨｅＬａ細胞の核小体内でＨｓｐ７０とｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚｅすることを示す（Ｏｈｔｓｕｋａ， Ｋ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍ． １９７：２３５−２４０．）。Ｈｓｐ６０はＨｓｐ１０にとともに間違ってフォールド（ｍｉｓｆｏｌｄ）されたタンパク質と結合し、正しくリフォールド（ｒｅｆｏｌｄ）する機会を与える（Ａｌｂｅｒｔｓ， Ｂ．ら（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ． ｐ６０８）。
【００１１】
Ｈｓｐ７０は、遍在する二量体のタンパク質であり、疎水性相互作用により拡張配座でタンパク質基質と結合する。Ｈｓｐ７０は新合成タンパク質に結合し、タンパク質輸送のために必要とされる。Ｈｓｐ７０とタンパク質基質との相互作用の強さは、ＡＴＰの結合及び加水分解によって変化する。Ｈｓｐ７０は、ＡＴＰ結合状態ではタンパク質親和性が低く、ＡＤＰがＡＴＰ加水分解するとタンパク質親和性が増加する（Ｂｕｒｓｔｏｎ， Ｓ．Ｇ．とＣｌａｒｋｅ， Ａ．Ｒ．（１９９５）２９：１２５．１３６．）。ＤｎａＪシャペロンはＨｓｐ７０と協同して働く。特に、ＤｎａＪはＨｓｐ７０のＡＴＰアーゼドメインと相互作用する。ＤｎａＪシャペロンファミリー末端のｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃは、Ｊドメインと呼ばれる７０付近のアミノ酸サインであるＮ末端であり、Ｈｓｐ７０との相互作用を必要とする（Ｋｅｌｌｅｙ， Ｗ．（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２３：２２２−２２７．）。ＤｎａＪはＡＴＰ加水分解を誘導し、別のコシャペロンであるＧｒｐＥはＡＴＰを結合させるＨｓｐ７０からＡＤＰ解離を促進する（ＢｕｒｓｔｏｎとＣｌａｒｋｅ、上述）。ＤｎａＪ及びＧｒｐＥは極めてよく保存されている。ＤｎａＪの相同性は真核細胞に見出せる。ＧｒｐＥの同族体は、ウシ、ブタ、及びラット細胞に認められる（Ｎａｙｌｏｒ， Ｄ．Ｊ．ら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １２４８：７５−７９．）。
【００１２】
熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）の導入は、高温または重金属、アミノ酸類似体、毒素、及び酸化性ストレスを含む種々の他の代謝発作にさらされたときの剥離増加への生理学的及び生化学的反応である。反応は全ての原核及び真核細胞で発生し、通常のタンパク質合成及びＨｓｐコード遺伝子の転写開始抑制に特徴付けられる（Ｈｉｇｈｔｏｗｅｒ、上述）。細胞ストレス下で、Ｈｓｐは間違ってフォールドされた（ｍｉｓｆｏｌｄ）、またはフォールドが完成していない（ｕｎｆｏｌｄ）タンパク質から複合体を形成し、回復不能の損傷からタンパク質を「救出」するか、タンパク分解アタックへの感受性を増加させる。遺伝子導入マウス及びラット内でのＨｓｐの過剰発現、すなわち通常動物にＨｓｐを誘導する熱処理は、虚血性外傷から心筋を保護する。熱ショック導入Ｈｓｐ及び外因性Ｈｓｐは共に血清剥奪導入細胞の死から平滑筋細胞を保護する。Ｈｓｐの過剰発現も、紫外線損傷及び紫外線被曝中に解放された炎症誘発性サイトカインからマウス線維芽細胞を保護する。特異Ｈｓｐは免疫抑制薬と結合し、免疫反応を変調させる役割を演じる。癌細胞に発現したＨｓｐは、抗癌治療に用いる薬剤の細胞毒効果から癌細胞を保護する。腫瘍細胞から単離した精製Ｈｓｐ及び抗原として用いられる精製Ｈｓｐは、単離元の腫瘍に免疫を与えることが明らかにされた（Ｕｄｏｎｏ， Ｈ．ら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：５３９８−５４０３、Ｙｏｕｎｇ Ｒ．Ａ．（１９９０）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８：４０１−４２０、Ｍａｒｂｅｒ， Ｍ．Ｓ．ら（１９９５）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９５：１４４６−１４５６； Ｓｉｍｏｎ， Ｍ．Ｍ．ら（１９９５）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９５：９２６−９３３．）。
【００１３】
シャペロンは、環境ストレス及び疾患のマーカーとして有用であり、種々の疾患及び免疫反応、薬物反応に関与している。幾つかの構成Ｈｓｐ遺伝子は、染色体６の主要組織適合抗原複合体に位置する。Ｈｓｐファミリーの構成要素も、炎症及び免疫認識のＴ細胞媒介制御で役割を演じることが明らかにされた。Ｈｓｐはステロイドホルモン受容体に結合し、リガンド不在下で転写を抑制し、ホルモン存在下でリガンド結合ドメインの固有フォールディングを与える。Ｂ細胞の熱ショック処理は、抗原処理及び分子のＭＩ−ＩＣ ｃｌａｓｓ ＩＩの形成及び機能を向上させる（Ｓａｒｇｅｎｔ， Ｃ．Ａ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１９６８−１９７２、Ｆａｎｇ， Ｖ．ら（１９９６）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２８６９７−２８７０２、Ｈｅｎｄｒｉｃｋ， Ｊ．Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１０２１６−１０２２０．）。Ｈｓｐ７０の不規則転写は、主要な抑うつ症に関与している（Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｓ．ら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２１９：７４５−７５２．）。Ｈｓｐ７０の発現は、タバコ喫煙に応じて増加する（Ｖａｙｓｓｉｅｒ， Ｍ．ら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２５２：２４９−２５６．）。Ｈｓｐ７０は、併用化学療法を受けた乳癌患者の薬物抗体に影響を与える（Ｖａｒｇａｓ−Ｒｏｉｇ， Ｌ．Ｍ．ら（１９９８）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７９：４６８−４７５）。Ｈｓｐ７０変異株は、クロザピン含有無顆粒球症、医薬品副作用に関与している（Ｔｕｒｂａｙ， Ｄ．ら（１９９７）８９：４１６７−４１７４．）。
【００１４】
この新たなヒトシャペロンタンパク質及びそれをコードするヌクレオチドの発見は、神経変性障害、代謝障害、発達障害、自己免疫疾患、炎症性障害、及び癌を含む細胞増殖性障害の診断、予防、及び治療に有用な新たな組成を与えることで当業者の需要を満足させる。
【００１５】
新規のヒトシャペロンタンパク質及びそれらをコードするポリヌクレオチドの発見により、神経変性性の疾患、代謝異常、発達障害、自己免疫／炎症性疾患、及び癌を含む細胞増殖異常症の診断及び治療、予防に有用な新規の組成物を提供することで当分野のニーズに答えることができる。
【００１６】
（発明の要約）
本発明は、総称して「ＨＣＨＰ」、個別には「ＨＣＨＰ−１」、「ＨＣＨＰ−２」、「ＨＣＨＰ−３」、「ＨＣＨＰ−４」、「ＨＣＨＰ−５」及び「ＨＣＨＰ−６」と呼ばれる実質的に精製されたポリペプチドであるヒトシャペロンタンパク質を提供する。本発明の一実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６（配列番号：１−６）及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチドを提供する。
【００１７】
更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列の少なくとも１つと９０％以上のアミノ酸同一性を有する実質的に精製された変異体を提供する。本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配を含むポリペプチドをコードする単離され実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと７０％以上のポリヌクレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供する。
【００１８】
更に、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと厳密な条件の下でハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１９】
本発明はまた、核酸を含むサンプルにおいて、ポリヌクレオチドを検出する方法であって、（ａ）ポリヌクレオチド配列の相補体を、少なくとも１つのサンプルのポリヌクレオチドとハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、（ｂ）そのハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを含み、そのハイブリダイゼーション複合体の存在とサンプルにおけるポリヌクレオチドの存在とが相関性を有する、検出方法を提供する。本発明の一実施態様では、ハイブリダイゼーションの前にポリヌクレオチドを増幅する過程を含む。
【００２０】
本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２及びそれらの断片からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２及びそれらの断片からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列と７０％以上のポリヌクレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供する。更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２及びそれらの断片からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２１】
本発明は更に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つの断片を含む発現ベクターを提供する。別の実施態様では、この発現ベクターは宿主細胞内に含まれる。
【００２２】
本発明はまた、ポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）ポリペプチドの発現に好適な条件の下、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの断片を有する発現ベクターを含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）その宿主細胞の培地からそのポリペプチドを回収する過程とを含む製造方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に提供する。
【００２４】
更に本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６及びそれらの断片からなる一群から選択されたポリペプチドと結合する精製された抗体を提供する。また、本発明は、そのポリペプチドの精製されたアゴニスト及びアンタゴニストを提供する。
【００２５】
本発明はまた、ＨＣＨＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防方法であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に患者に効果的な量投与することを含む、治療または予防方法を提供する。
【００２６】
本発明はまた、ＨＣＨＰの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防方法であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−６及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのアンタゴニストを患者に効果的な量投与することを含む、治療または予防方法を提供する。
【００２７】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、ここに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更できることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説明する目的で用いられたものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい。
【００２８】
本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。
【００２９】
本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての装置及び材料、方法は本発明の実施及びテストに使用できるが、好適な装置及び材料、方法をここに記す。本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用した。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈されるものではない。
【００３０】
定義
「ＨＣＨＰ」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及び好ましくは人類を含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたＨＣＨＰのアミノ酸配列を指す。
【００３１】
用語「アゴニスト」は、ＨＣＨＰと結合したとき、ＨＣＨＰの効果を増大する、或いはその持続時間を延長する分子を指す。このアゴニストには、ＨＣＨＰに結合してその効果を変調するタンパク質、核酸、糖質、任意の他の分子を含み得る。
【００３２】
「アレル変異配列」は、ＨＣＨＰをコードする遺伝子の別の形を指す。アレル変異配列は、核酸配列における少なくとも１つの変異によって生じ、変異ｍＲＮＡ若しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能は変わる場合もあれば変わらない場合もある。天然或いは組換え体のすべての遺伝子には、アレル形が存在しないもの、１つ或いは多数存在するものがある。一般にアレル変異配列を生じる変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは置換による。これらの各変異は、単独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配列内で一回或いはそれ以上生じる。
【００３３】
ＨＣＨＰをコードする「変異」核酸配列は、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、ＨＣＨＰと同じポヌクレオチド或いはＨＣＨＰの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドである。この定義には、ＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチド配列の正常の染色体の遺伝子座ではない位置でアレル変異配列と不適当或いは予期せずハイブリダイゼーション、及びＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、容易に検出可能な或いは検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質も変異され得り、サイレント変化を生じＨＣＨＰと機能的に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にＨＣＨＰの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。たとえば、負の電荷をもつアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含み得り、正の電荷をもつアミノ酸は、リジン及びアルギニンを含み得り、そして近い親水性値をもち非電荷極性頭基を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン及びチロシンを含みうる。
【００３４】
用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質配列、それらの任意の断片、天然の分子または合成された分子を指す。ＨＣＨＰの断片である「断片」及び「免疫原性断片」、「抗原性断片」は、好ましくはアミノ酸約５〜約１５個の長さであり、最も好ましくはアミノ酸１４個の長さであり、ＨＣＨＰのある生物学的活性または免疫学的活性を保持する。ここでは、「アミノ酸配列は自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列であるが、アミノ酸配列及び類似の用語は、列記したタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定されるわけではない。
【００３５】
「増幅」は、核酸配列の追加的な複製を生成することに関連する。増幅は、一般にはこの技術分野では周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて行われる。
【００３６】
「アンタゴニスト」は、ＨＣＨＰと結合したとき、ＨＣＨＰの生物学的または免疫学的活性の効果の程度を低下させたり、その持続時間を短縮する分子を指す。アンタゴニストは、タンパク質、核酸、糖質、抗体またはＨＣＨＰの効果を減少させるの他の分子である。
【００３７】
用語「抗体」は、抗原決定基と結合可能なＦａｂ及びＦ（ａｂ’）_２及びそれらの断片などの、無傷の分子及びＦｖ断片を指す。ＨＣＨＰポリペプチドと結合する抗体は、抗体を免疫する目的の小さなペプチドを含む無傷の分子またはその断片を用いて調整可能である。動物（例えば、マウス、ラット、若しくはウサギ）を免疫化するのに使用されるポリペプチド或いはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳から引き出されたり、化学的に合成され得り、必要に応じて担体プロテインと結合することも可能である。ペプチドと化学的に結合した一般に用いられる担体は、ウシ血清アルブミン、チログロビン、及びキーホールリンペットヘモニアン（ＫＬＨ）を含む。次ぎに、この結合したペプチドを用いて動物を免疫化する。
【００３８】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子のフラグメント（即ちエピトープ）を指す。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主動物を免疫化するのに用いられるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決定基（タンパク質上の所定の領域或いは三次元構造体）に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００３９】
用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列のセンス鎖と相補的な核酸配列を含む全ての組成物を指す。アンチセンス分子は、合成や転写を含む任意の方法で作り出すことができる。相補的ヌクレオチドは、一度細胞に導入されると、細胞によって作られた天然の配列と結合して二重鎖を形成し、転写や翻訳を阻害する。「マイナス（−）」という表現はアンチセンス鎖、「プラス（＋）」という表現はセンス鎖を指す。
【００４０】
用語「生物学的活性」は、自然発生分子の構造的、調節的、或いは生化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に、「免疫学的に活性」とは、天然或いは組換え体のＨＣＨＰ、合成のＨＣＨＰまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力のことである。
【００４１】
用語「相補的」及び「相補性」は、許容の塩と許容の温度条件の下で、塩基対の形成によってポリヌクレオチドが自然に結合することを指す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」と相補的な配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸が結合するのみの部分的な場合、或いは一本鎖間に完全な相補性が存在して完全な相補性となる場合があり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖間の結合に左右される増幅反応、並びにペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の設計若しくは使用において特に重要である。
【００４２】
「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のアミノ酸配列を含む組成物」は広い意味で、所定のヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物は、乾燥した製剤或いは水溶液、無菌組成物を含み得る。ＨＣＨＰ若しくはＨＣＨＰの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合可能である。ハイブリダイゼーションにおいて、プローブは、塩（例えば、ＮａＣｌ）及び界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、その他の物質（例えば、デンハート液、乾燥ミルク、サケ精子ＤＮＡなど）を含む水溶液に展開され得る。
【００４３】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するために再配列された核酸配列であって、ＸＬ−ＰＣＲ^ＴＭ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ）を用いて５’及び／または３’の方向に延長されて再配列された核酸配列、或いはＧＥＬＶＩＥＷ 断片構築システム（ＧＣＧ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）などのフラグメントの構築のためのコンピュータプログラムを用いて２つ以上のインサイトクローン社の重複配列から構築された核酸配列を指す。延長及び構築の両方によってコンセンサス配列に構築されるものもある。
【００４４】
用語「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」は、ノーザン分析によるＨＣＨＰをコードする核酸配列と同じ或いは関連する核酸の検出が、サンプル内のＨＣＨＰをコードする核酸の存在を示すことから、ＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチドからの転写物の発現と相関性を有すること指す。
【００４５】
「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基若しくは核酸残基が欠如するアミノ酸配列若しくは核酸配列の変化を指す。
【００４６】
本明細用語「誘導体」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の化学修飾のことである。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、アルキル基、アシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌクレオチドは、自然分子（未修飾の分子）の生物学的或いは免疫学的機能を少なくとも１つ保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もとのポリペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能を少なくとも１つ保持する、グリコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによって修飾されたものである。
【００４７】
「類似性」とは、相補性の程度を表す用語である。これには、部分的類似性と完全な類似性とがあり得る。この「同一性」は「類似性」とも言える。同一の配列が標的の核酸とハイブリダイゼーションするのを少なくとも部分的に阻止する部分的に相補的な配列は、「実質的に同様」と呼ばれる。完全に相補的な配列と標的の配列とのハイブリダイゼーションの抑制は、厳密性を低下させた条件の下ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロッティング或いはノーザンブロッティング法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検査される。実質的に同様の配列或いはハイブリダイゼーションプローブは、厳密性を低下させた条件の下、完全に相補的な配列と標的の配列との結合に対して競合して抑制する。これは、厳密性を低下させた条件では、２つの配列の互いへの結合が特異的（即ち、選択的）に相互作用しなけらばならず、厳密性を低下させた条件の下では非特異的な結合が許容されるということではない。部分的な相補性ともいえない（例えば、３０％未満の類似性或いは同一性）第２の標的配列を用いて、非特異的結合が存在しないことの検査が可能である。非特異的結合が存在しない場合は、実質的に類似配列或いはプローブが第２の非相補的標的配列とハイブリダイゼーションしない。
【００４８】
句「百分率同一性」又は「％同一性」とは、２つ以上のアミノ酸配列或いは核酸配列の比較で見つかった配列類似性の百分率のことである。この百分率同一性は、例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）など電子装置を用いて決定可能である。このＭＥＧＡＬＩＧＮプログラムは、様々な方法、例えば、クラスター方法に従って、２つ以上の配列間のアライメントを作り出すことが可能である（例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．及びＰ．Ｍ． Ｓｈａｒｐ （１９８８） Ｇｅｎｅ７３：２３７−２４４．を参照）。各方法のパラメーターは、ＭＥＧＡＬＩＧＮによるデフォルトパラメーター或いはユーザが指定する。クラスターアルゴリズムが、全ての組の間の距離を測って、配列を各クラスターに分類する。これらのクラスターは、組によって整列され、次ぎにグループに分けられる。２つのアミノ酸の配列間の百分率類似性、例えば配列Ａと配列Ｂの百分率類似性は、配列Ａと配列Ｂの一致する残基の合計数を、配列Ａの長さから配列Ａのギャップ残基数と配列Ｂのギャップ残基数とを差し引いたもので除し、それに１００を掛けることによって得られる。２つのアミノ酸配列間の低い類似性或いは非類似性のギャップは、百分率類似性の決定には含まれない。核酸配列間の百分率同一性はまた、クラスター法或いはＪｏｔｕｎ Ｈｅｉｎ法などの当分野で周知の別の方法によってカウント或いは計算することも可能である（例えば、Ｈｅｉｎ． Ｊ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３：６２６−６４５．を参照）。配列間の同一性はまた、例えば、ハイブリダイゼーションの条件を変えるなどの当分野で周知の別の方法によって決定することも可能である。
【００４９】
「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」は、６ｋｂ〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含み得り、安定した分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微小染色体である（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｊ．Ｊ．等 （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５を参照）。
【００５０】
用語「ヒト化抗体」とは、もとの結合能力を保持しつつよりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変異された抗体分子である。
【００５１】
「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の一本鎖が相補的な一本鎖と塩基対を形成して結合する全てのプロセスである。
【００５２】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」とは、相補的な塩基対間の水素結合の形成によって、２つの核酸配列間に形成された複合体のことである。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中（例えば、Ｃ_０ｔまたはＲ_０ｔ分析）で形成されるか、或いは溶液中の１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、膜、フィルター、チップ、ピン、或いはスライドガラス、または細胞及びその核酸を固定する任意の適当な基板）に固定されたもう一つの核酸配列との間で形成され得る。
【００５３】
用語「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子の配列に対して、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【００５４】
「免疫応答」とは、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症、遺伝病などと関係する症状のことである。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に影響を及ぼすサイトカイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子の発現によって特徴づけられ得る。
【００５５】
本明細書において「マイクロアレイ」とは、基板上に配列された様々なポリヌクレオチドのアレイのことである。
【００５６】
本明細書のマイクロアレイの記述における「エレメント」或いは「アレイエレメント」とは、基板の表面に配列されたハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドのことである。
【００５７】
用語「変調」とは、ＨＣＨＰの活性の変化のことである。変調の例として、ＨＣＨＰのタンパク質活性の特性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化がある。
【００５８】
句「核酸」或いは「核酸配列」とは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、或いはそれらの断片を指す。また、一本鎖若しくは二本鎖のセンス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム若しくは合成起源のＤＮＡ或いはＲＮＡと、またペプチド核酸（ＰＮＡ）や任意のＤＮＡ様物質、ＲＮＡ様物質も指す。本明細書において「断片（またはフラグメント）」とは、（例えば、同じゲノム内の任意の別の配列とは異なる）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２を特別に同定する独特のポリヌクレオチド配列の領域を含む核酸配列のことである。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２は、ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用であり、更に、関連ポリヌクレオチド配列からＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２を区別する類似性の検査にも有用である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２の断片は、少なくともヌクレオチド１５〜２０個の長さである。この断片に対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２の正確な長さ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２の領域は、断片の使用目的に基づいた当分野で一般的な技術の１つを用いて日常業務的に決定できる。また、断片は翻訳された場合、完全長のポリペプチドの抗原性などのいくつかの機能的特徴或いはＡＴＰ結合部位などの構造的ドメイン特徴を維持したポリペプチドを形成し得る。
【００５９】
用語「機能的に関係した」及び「機能的に結合した」とは、機能的に関係する核酸配列のことである。コードされたポリペプチドの転写をプロモータが制御する場合、そのプロモーターはコードする配列と機能的に関係する或いは機能的に結合する。機能的に関係した或いは機能的に結合した核酸配列は近接して同じ読み枠内に存在し得るが、リプレッサー遺伝子などのある種の遺伝子要素は、ポリペプチドをコードする配列とは近接して結合していないが、ポリペプチドの発現を調節するオペレーター配列とは結合したままである。
【００６０】
用語「オリゴヌクレオチド」とは、ＰＣＲ増幅、ハイブリダイゼーション、或いはマイクロアレイに使用可能な核酸配列のことであり、その長さは少なくとも６ヌクレオチドから６０ヌクレオチドである。好ましくは約１５から３０ヌクレオチドであり、さらに好ましいくは約２０から２５のヌクレオチドである。本明細書において、オリゴヌクレオチドは、当技術分野では同一と定義される「アンプリマー」及び「プライマー」、「オリゴマー」と実質的に同じである。
【００６１】
「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）とは、末端がリジンで終わるアミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、約５ヌクレオチド以上の長さのオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤のことである。この末端のリジンにより、この組成物が溶解性を有する。ＰＮＡは、相補的な一本鎖ＤＮＡやＲＮＡに優先的に結合して転写物の伸長を止め、ポリエチレングリコール化して細胞において寿命を延ばし得る。（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｐ．Ｅ．他（１９９３） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． ８：５３−６３を参照）。
【００６２】
用語「サンプル」とは、その最も広い意味で用いられている。ＨＣＨＰをコードする核酸若しくはその断片、ＨＣＨＰ自体を含むと推測される生物学的サンプルには、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中又は固体の支持物に固定されたゲノムＤＮＡ，ＲＮＡ，ｃＤＮＡと、組織又は組織プリント等も含まれ得る。
【００６３】
用語「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、タンパク質或いはペプチドとアゴニスト或いは抗体、アンタゴニストとの間の相互作用のことである。この相互作用は、結合する分子によって認識される、例えば、抗原決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特定の構造の存在によって左右される。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及びその抗体を含む反応において、エピトープＡを含むポリペプチドが存在するか或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【００６４】
用語「厳密な（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件」とは、ポリヌクレオチドと請求項に記載されたポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な条件である。厳密な条件は、塩濃度及び有機溶剤（例えば、ホルムアミド）の濃度、温度、及び当分野で周知の別の条件によって決められる。詳細には、塩の濃度を下げたり、ホルムアミドの濃度を上げたり、またハイブリダイゼーションの温度を上げることで厳密性を高めることができる。
【００６５】
用語「実質的に精製された」とは、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している構成要素が少なくとも約６０％以上除去されたものであり、好ましくは約７５％以上の除去、最も好ましいのは約９０％以上除去されたものである。
【００６６】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。
【００６７】
「基板」とは、膜、フィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気或いは非磁気のビード、ゲル、管、プレート、ポリマー、微細粒子、毛管を含む好適な固体或いは半固体の支持物のことである。基板は、ポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する壁及び溝、ピン、チャネル、孔などの様々な表面形態を有する。
【００６８】
「形質転換」とは、外来ＤＮＡが入り込み受容体細胞を変化させるプロセスのことである。形質転換は、当分野で周知の種々の方法により、自然或いは人工の条件の下で起こり得り、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞の中に外来核酸配列を挿入する任意の周知の方法によって行うことができる。この形質転換の方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される。この方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェクション、及び微粒子照射が含まれるが、限定されるものではない。「形質転換された」細胞には、導入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一時的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細胞も含まれる。
【００６９】
「変異体」とは、一つ以上のアミノ酸が変異したアミノ酸配列である。この変異体には、例えばロイシンとイソロシンとの置換のような、置換されたアミノ酸が類似の構造或いは類似の化学特性を有する「保存的」変異が含まれる。稀ではあるが、変異体には、グリシンをトリプトファンで置換する「非保存的」変異も含まれる。また、類似の小さな変異には、アミノ酸の欠失、挿入、或いはその両方が含まれる。当分野で周知の例えばＬＡＳＥＲＧＥＮＥ^ＴＭソフトウエアを用いて、生物学的或いは免疫学的活性を損なうことなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入、或いは欠失させるかを決めることができるであろう。
【００７０】
ポリヌクレオチド配列の文脈の中で用いられる用語「変異配列」とは、ＨＣＨＰに関連したポリヌクレオチド配列を含み得る。この定義は、例えば、「アレル」、「スプライス」、「種」、「多形性」変異配列についてもあてはまる。スプライ変異配列は基準分子と極めて同一性が高い可能性があるが、ｍＲＮＡプロセシング中のエキソンの交互のスプライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなったり、少なくなったりする。対応するポリペプチドは、機能ドメインが加わったり、ドメインが減ったりし得る。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。できたポリペプチドは、互いに高いアミノ酸同一性を有する。多形性変異配列は、所定の種と種の間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における変異である。多形性変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つの塩基が異なる「１つのヌクレオチド多形性」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は、例えば、或る集団、病態、病態の特徴を表し得る。
【００７１】
（発明）
本発明は、新規のヒトシャペロンタンパク質（ＨＣＨＰ）及びＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチドの発見に基づき、神経変性性の疾患、代謝異常、発達障害、自己免疫／炎症性疾患、及び癌を含む細胞増殖異常症の診断、治療、及び予防におけるそれらの組成物の使用に関する。
【００７２】
表１は、ＨＣＨＰをコードする完全長のヌクレオチド配列の構築に用いたＩｎｃｙｔｅクローンを示す。列１及び列２はそれぞれ、ポリペプチド及びポリヌクレオチドのＳＥＱ ＩＤ ＮＯを示す。列３は、各ＨＣＨＰをコードする核酸が同定されたＩｎｃｙｔｅクローンのクローンＩＤを示し、列４は、それらのクローンが単離されたｃＤＮＡライブラリを示す。列５は、Ｉｎｃｙｔｅクローン及びそれらに対応するｃＤＮＡライブラリを示す。ｃＤＮＡライブラリが示されていないクローンは、プールされたｃＤＮＡライブラリに由来する。列５のクローンは、各ＨＣＨＰのコンセンサスヌクレオチド配列の組み立てに用いられ、ハイブリダイゼーション技術における断片として有用である。
【００７３】
表２の各列は、本発明の各ポリペプチドの様々な特性を示し、列１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ、列２は各ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の数、列３は潜在リン酸化部位、列４は潜在グリコシル化部位、列５はサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列及びモチーフを有するアミノ酸残基、列６はそれぞれのポリペプチドの識別、列７は配列相同性及びタンパク質モチーフから各ポリペプチドを同定するために用いる分析方法を示す。列５に示されているように、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５は、ＨＣＨＰ−５を熱ショックタンパク質として同定する際の一助となるＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位コンセンサス配列を含む。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の場合は、列５に示されるｄｎａＪタンパク質に対する２つのサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）配列が、ＨＣＨＰ−６を熱ショックタンパク質として同定する際の助けとなる。ＢＬＡＳＴ解析から得られた相同ペプチド配列のアラインメントが、化学的及び構造的類似性を示唆している。図１Ａ及び図１Ｂに示されているように、ＨＣＨＰ−１は、マウスミトコンドリア内膜のタンパク質移入成分であるマウスＴｉｍ４４ （ＧＩ ２３５１４１０； ＳＥＱ ＩＤＮＱ：２５）と化学的及び構造的類似性を有している。詳細には、ＨＣＨＰ−１とＴｉｍ４４との同一性は８９％である。図２に示されているように、ＨＣＨＰ−３は、マウスコシャペロン （ｃｏ−ｃｈａｐｅｒｏｎｅ） ｍｔ−ＧｒｐＥ＃２ 前駆体 （ＧＩ ３４１１０７２； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６） と化学的及び構造的類似性を有している。詳細には、ＨＣＨＰ−３とｍｔ−ＧｒｐＥ＃２ 前駆体との全体の同一性は８４％である。図３Ａ及び図３Ｂに示されているように、ＨＣＨＰ−４は、ヒト熱ショックタンパク質 ｈｓｐ４０ （ＧＩ １８１６４５２； ＳＥＱ ＩＤＮＯ：２７）と化学的及び構造的類似性を有している。詳細には、ＨＣＨＰ−４とヒト熱ショックタンパク質 ｈｓｐ４０との全体の同一性は６６％である。
【００７４】
表３の列は、組織特異性と、ＨＣＨＰをコードするヌクレオチド配列に関連した疾患若しく異常症、症状とを示している。表３の列１は、ヌクレオチドの配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）を示している。列２は、ＨＣＨＰを発現する組織カテゴリー、及びＨＣＨＰを発現する全組織におけるその割合を示す。列３は、ＨＣＨＰを発現する組織に関連する、疾患若しくは異常症、症状、並びにＨＣＨＰを発現する全組織におけるそれらの割合を示す。列４は、各ｃＤＮＡライブラリをサブクローニングするために用いたベクターを示す。
【００７５】
表４の列は、ＨＣＨＰをコードするｃＤＮＡのクローンが単離されたｃＤＮＡライブラリの作製に用いられた組織の説明を示す。列１は、ヌクレオチドのＳＥＱ ＩＤ ＮＯを示し、列２はそれらのクローンが単離されたｃＤＮＡライブラリを示し、列３は列２のｃＤＮＡライブラリに対応する組織の由来及び詳細を示す。
【００７６】
ＨＣＨＰをコードする次のヌクレオチドの断片が、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２を同定し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２を区別するハイブリダイゼーション及び増幅技術において有用である。その有用な断片とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のヌクレオチドの約１７２から約２０４と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のヌクレオチドの約６９８から約７４２までと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のヌクレオチドの約８から約５２までと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のヌクレオチドの約２２５から約２６９までと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のヌクレオチドの約１０００から約１０４６まで及び約１６０２から約１６４７までと、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のヌクレオチドの約４０２から約４４８まで及び約１１５４から約１１９９までとである。
【００７７】
本発明はまた、ＨＣＨＰの変異体を含む。好適なＨＣＨＰの変異体は、ＨＣＨＰアミノ酸配列と少なくとも約８０％、より好適には少なくとも約９０％、最も好適には少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有し、ＨＣＨＰの機能的若しくは構造的特徴の少なくとも１つを有する。
【００７８】
本発明はまた、ＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施例では、本発明は、ＨＣＨＰをコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２からなる一群から選択された配列を有するポリヌクレオチド配列を含む。
【００７９】
本発明はまた、ＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、そのようなポリヌクレオチド変異配列は、ＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、より好適には少なくとも約８５％、もっとも好適には少なくとも約９５％のポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の特定の実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２からなる一群から選択された核酸配列と少なくとも約７０％、より好適には少なくとも約８５％、最も好適には約９５％のポリヌクレオチド配列同一性を有する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２からなる一群から選択された配列を有するポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変異配列は、ＨＣＨＰの機能的若しくは構造的特徴の少なくとも一つを有するアミノ酸配列をコードし得る。
【００８０】
遺伝暗号の縮重により作り出され得るＨＣＨＰをコードする種々のポリヌクレオチド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したがって本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作り出され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの組み合わせは、自然発生のＨＣＨＰのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。
【００８１】
ＨＣＨＰをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、好適に選択された厳密な条件の下で、自然発生のＨＣＨＰのヌクレオチドとハイブリダイズ可能なことが望ましいが、非自然発生のコドンを含めるなどの実質的に異なったコドンの使用を有するＨＣＨＰ又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基づいてコドンを選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞又は原核宿主に発生する割合を高めることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、ＨＣＨＰ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、自然発生の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるＲＮＡ転写物を作ることにある。
【００８２】
本発明はまた、ＨＣＨＰ及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列又はそれらの断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、ＨＣＨＰまたはその任意の断片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。
【００８３】
更に本発明には、種々の厳密性条件の下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる。詳しくは、記載のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２またはその断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる。（例えば、Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．及びＳ．Ｌ． Ｂｅｒｇｅｒ （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３９９−４０７； 及び Ｋｉｍｍｅｌ． Ａ．Ｒ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：５０７−５１１．を参照）。例えば、厳密な塩濃度は、通常は約７５０ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、好ましくは約５００ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、最も好ましくは約２５０ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。例えば、ホルムアミドなどの有機溶剤を使用しないと、厳密性の低いハイブリダイゼーションになり、約３５％以上のホルムアミド、更に好ましくは５０％以上のホルムアミドを使用すると、厳密性の高いハイブリダイゼーションになる。温度の厳密条件は、通常は約３０℃以上であり、より好ましくは約３７℃以上であり、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の変更できるパラメーターには、ハイブリダイゼーション時間、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの薬品の濃度、キャリアＤＮＡの含有の有無があり、当分野の技術者には周知である。必要な様々な条件を組み合わせることで、厳密性の程度を変えることができる。好適な実施例では、ハイブリダイゼーションは、温度が３０℃で、７５０ｍＭの塩化ナトリウムと７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳで行う。より好適な実施例では、温度が３７℃で、５００ｍＭの塩化ナトリウムと５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド、１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）で行う。最も好適な実施例では、温度が４２℃で、２５０ｍＭの塩化ナトリウムと２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡで行う。これらの条件の有用な変更は、当分野の技術者には明らかである。
【００８４】
ハイブリダイゼーションの後の洗浄過程にも、様々な厳密性の程度がある。洗浄の厳密な条件は、塩濃度と温度によって決められる。上記したように、塩濃度を下げること或いは温度を上げることで洗浄の厳密性を高めることができる。例えば、洗浄過程での塩濃度の厳密な条件は、好ましくは約３０ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、更に好ましくは約１５ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約１．５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。洗浄過程の温度の厳密な条件は、通常は約２５℃以上であり、好ましくは約４２℃以上であり、更に好ましくは約６８℃以上である。好適な実施例では、洗浄過程は、温度が２５℃で、３０ｍＭの塩化ナトリウムと３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１％ＳＤＳで行われる。より好適な実施例では、洗浄過程は、温度が４２℃で、１５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１％ＳＤＳで行われる。最も好適な実施例では、洗浄過程は、温度が６８℃で、１５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１％ＳＤＳで行われる。更なるこれらの条件の変更は、当分野の技術者には明らかである。
【００８５】
当分野で周知のＤＮＡのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施例も実行可能である。この方法には、例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）、或いはＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）にみられるような校正エキソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素が用いられる。好ましくは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００液体転移システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ， ＮＶ）、ＰＴＣ２００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）及びＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ） などの装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ＡＢＩ ３７３或いは３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ． Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）または当分野で周知の他の方法を用いてシークエンシングを行う。得られた配列を当分野で周知の様々なアルゴリズムを用いて分析する（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． （１９９７） Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｕｎｉｔ ７．７； Ｍｅｙｅｒｓ， Ｒ．Ａ． （１９９５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐｐ． ８５６−８５３．を参照）。
【００８６】
部分的なヌクレオチド配列を利用し、当分野で周知のＰＣＲ法をベースにした種々の方法を用いてＨＣＨＰをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節要素などの上流にある配列を検出する。例えば制限部位ＰＣＲ法を利用する１つの方法では、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する。（例えば、Ｓａｒｋａｒ， Ｇ． （１９９３） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ ２：３１８−３２２を参照）。逆ＰＣＲ法を用いる別法では、広範な方向に伸長して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライマーを用いる。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限断片に由来する。（例えば、Ｔｒｉｇｌｉａ， Ｔ．等（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８１８６を参照）。キャプチャＰＣＲ法を用いる第３の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡの既知の配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む。（例えば、Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ， Ｍ．他（１９９１）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ １：１１１−１１９を参照）。この方法では、多数の制限酵素による消化及びライゲ−ションを用いて、ＰＣＲを行う前に未知の配列の領域の中に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、当分野で周知の別の方法を用いて未知の配列を得ることも可能である。（例えば、Ｐａｒｋｅｒ， Ｊ．Ｄ． 他 （１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：３０５５−３０６０を参照）。更に、ＰＣＲ、ネスト化プライマー、ＰＲＯＭＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリを用いれば、ゲノムＤＮＡ内の歩行が可能である（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）。この方法ではライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を探すのに有用である。全てのＰＣＲ法をベースにした方法では、プライマーは、市販のＯＬＩＧＯ ４．０６ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）或いは別の好適なプログラムなどを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５０％以上、約６８℃〜７２℃の温度で鋳型に対してアニールするよう設計される。
【００８７】
完全長ｃＤＮＡのスクリーニングのときは、大きなｃＤＮＡを含むようにサイズが選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全な長さのｃＤＮＡを産生できない場合は、遺伝子の５’領域を有する配列を含むものが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用である。ゲノムライブラリは、５’非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【００８８】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣＲ産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは、キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリマー、及び４つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色素、放出された波長の検出に利用するＣＣＤカメラを使用することが可能である。出力／光強度は、適切なソフトウェア（例えば、ＧＥＮＯＴＹＰＥＲ 及び ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ， Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒを参照）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングからコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しない場合もあるＤＮＡの小片のシークエンシングに特に適している。
【００８９】
本発明の別の実施例では、ＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えＤＮＡ分子に用いて、適切な宿主細胞内にＨＣＨＰ、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の宿重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列が作られ得り、これらの配列をＨＣＨＰのクローン化及び発現に利用可能である。
【００９０】
種々の目的でＨＣＨＰをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセシング及び／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるＤＮＡの混合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再組み立てを用いて、ヌクレオチド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの仲介による定方向突然変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライスバリアントの生成等が可能である。
【００９１】
別の実施例によれば、ＨＣＨＰをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ． Ｍ．Ｈ．等（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ ７：２１５−２２３； 及びＨｏｒｎ， Ｔ．他（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．２２５−２３２を参照）。別法として、化学的方法を用いてＨＣＨＰ自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の固相技術を用いて実行可能である（例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅ， Ｊ．Ｙ．等（１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４を参照）。また、合成の自動化は例えばＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて達成し得る。更にＨＣＨＰのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、変異体ポリペプチドを作ることが可能である。
【００９２】
このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｈｉｅｚ， Ｒ．Ｍ． 及び Ｆ．Ｚ． Ｒｅｇｎｉｅｒ （１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：３９２−４２１を参照）を用いて実質的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシークエンシングにより確認することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ． Ｔ． （１９８３） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹを参照）。
【００９３】
生物学的に活性なＨＣＨＰを発現させるために、ＨＣＨＰをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な要素を含む。これらの要素には、ベクター及びＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５’及び３’の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、その長さ及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、ＨＣＨＰをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及びコザック配列などの近傍の配列が含まれる。ＨＣＨＰをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれなければならない。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、自然及び合成の様々なものから得ることが可能である。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である。（例えば、Ｓｃｈａｒｆ， Ｄ． 他 （１９９４） Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ． Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０１−１８−１６２．を参照）。
【００９４】
当業者に周知の方法を用いて、ＨＣＨＰをコードする配列、好適な転写及び翻訳調節要素を含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術が含まれる。（例えば、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． 他． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ， ４章及び８章， 及び１６−１７章； 及び Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． 他． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｃｈ． ９章及び１３章、１６章を参照）。
【００９５】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＨＣＨＰをコードする配列の保持及び発現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【００９６】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、ＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、ＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、増殖には、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多数のクローニング部位にＨＣＨＰをコードする配列をライゲーションするとｌａｃＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クローニングされた配列のｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパーファージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である。（例えば、Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ， Ｇ．及びＳ．Ｍ． Ｓｃｈｕｓｔｅｒ （１９８９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：５５０３−５５０９．を参照）。例えば、抗体の産生のためなどに多量のＨＣＨＰが必要な場合は、ＨＣＨＰの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現を誘発するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使用できる。
【００９７】
ＨＣＨＰの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子やアルコールオキシダーゼやＰＧＨプロモーターなどの構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多種のベクターが、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む。（例えば、上記のＡｕｓｕｂｅｌ．； 及びＢｉｔｔｅｒ， Ｇ．Ａ． 他 （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−７９４： Ｓｃｏｒｅｒ． Ｃ． Ａ． 他 （１９９４） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２１−１８１−１８４．を参照）
植物系もＨＣＨＰの発現に使用可能である。ＨＣＨＰをコードする配列の転写は、例えば、ＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターが単独で、或いはＴＭＶ（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， Ｎ．等（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ ６：３０７−３１１）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直接のＤＮＡ形質転換或いは病原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の中に導入可能である。（例えば、Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ ＮＹ， ｐｐ．１９１−１９６を参照）。
【００９８】
哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にＨＣＨＰをコードする配列を結合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により、感染した宿主細胞にＨＣＨＰを発現する生ウイルスを得ることが可能である（Ｌｏｇａｎ， Ｊ．及びＳｈｅｎｋ， Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：３６５５−３６５９を参照）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タンパク質を高レベルで発現させるために、ＳＶ４０またはＥＢＶを基にしたベクターを用いることが可能である。
【００９９】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているものより大きなＤＮＡの断片を供給可能である。治療のために約６ｋｂ〜１０ＭｂのＨＡＣｓを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で供給する。（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ． Ｊ．Ｊ． 他 （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１５：３４５−３５５．を参照）。
【０１００】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるＨＣＨＰの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、ＨＣＨＰをコードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベクターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別のベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択培地に移す前に、強化培地で約１〜２日の間増殖させる。選択マーカーの目的は選択的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により導入された配列をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１０１】
任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能である。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ、それぞれｔｋ⁻又はａｐｒ⁻細胞において使用される。（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． 他 （１９７７） Ｃｅｌｌ １１：２２３−２３２； 及びＬｏｗｙ， Ｉ． 他（１９８０） Ｃｅｌｌ ２２：８１７−８２３を参照）。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いることができる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え、ｎｅｏはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え、ａｌｓ或いはｐａｔはクロルスルフロン（ｃＨＣＨＰｓｕｌｆｕｒｏｎ）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）に対する耐性を与える（例えば、Ｗｉｇｌｅｒ， Ｍ． 他． （１９８０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７：３５６７−３５７０； Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｆ． 他（１９８１） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１−１４を参照）。さらに選択に利用できる遺伝子、例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるｔｒｐＢ及びｈｉｓＤが文献に記載されている（例えば、Ｈａｒｔｍａｎ， Ｓ．Ｃ．及びＲ．Ｃ． Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：８０４７−５１を参照）。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、βグルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ，ルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンなどの可視マーカーが用いられる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）も使用できる。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である（例えば、Ｒｈｏｄｅｓ， Ｃ．Ａ．他（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５５：１２１−７９１を参照）。
【０１０２】
マーカー遺伝子の発現の存在／不在によって目的の遺伝子の存在が示されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＨＣＨＰをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＨＣＨＰをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がＨＣＨＰをコードする配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１０３】
一般に、ＨＣＨＰをコードする核酸配列を含み、ＨＣＨＰを発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや、ＰＣＲ法、核酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０４】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるＨＣＨＰの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。このような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）などがある。ＨＣＨＰ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ， ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている。（例えば、 Ｈａｍｐｔｏｎ． Ｒ． 他．（１９９０） Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ． Ｓｔ Ｐａｕｌ． ＭＮ， Ｓｅｃｔ． ＩＶ； Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ． Ｅ． 他Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ＮＹ； 及びＰｏｕｎｄ， Ｊ．Ｄ． （１９９０） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎｓ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ）。
【０１０５】
種々の標識方法及び結合方法が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイに用いられ得る。ＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる。別法として、ＨＣＨＰをコードする配列、またはその任意の断片をｍＲＮＡプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。当分野では周知であり市販されているこのようなベクターを、Ｔ７，Ｔ３，またはＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＲＮＡプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ及びＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、Ｕ．Ｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＯＨ）が市販する種々のキットを用いて行うことができる。容易な検出のために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、コファクター、インヒビター、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色素産生剤などが含まれる。
【０１０６】
ＨＣＨＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件の下で培養される。形質転換された細胞から産生されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用されるその配列及び／またはそのベクターによる。ＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するＨＣＨＰの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１０７】
更に、挿入した配列の発現調節能力または発現したタンパク質を所望の形にプロセシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。タンパク質の「ｐｒｅｐｒｏ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タンパク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ種種の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、ＷＩ３８）がＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ； Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）より入手可能であり、外来のタンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確実にするために選択される。
【０１０８】
本発明の別の実施例では、ＨＣＨＰをコードする自然或いは変更された、または組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラＨＣＨＰタンパク質が、ＨＣＨＰの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分が、市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＧＳＴ及びＭＢＰ、Ｔｒｘ、ＣＢＰ、６−Ｈｉｓによって、固定されたグルタチオン、マルトース、フェニルアルシン酸化物（ｐｈｅｎｙｌａｒｓｉｎｅ ｏｘｉｄｅ）、カルモジュリン、金属キレート樹脂のそれぞれで同族の融合タンパク質の精製が可能となる。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、及び赤血球凝集素（ＨＡ）によって、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクロナール抗体及びポリクロナール抗体を用いた融合タンパク質の免疫親和性の精製ができる。また、ＨＣＨＰをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、ＨＣＨＰが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現と精製の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ． （１９９５、前出 ｃｈ １０）．に記載されている。市販されている様々なキットを用いて、融合タンパク質の発現及び精製を促進できる。
【０１０９】
本発明の別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで放射能標識したＨＣＨＰの合成が可能である。これらの系は、Ｔ７またはＴ３、ＳＰ６プロモーターと機能的に結合したタンパク質をコードする配列の転写と翻訳をつなげる。翻訳は、好ましくは^３５Ｓメチオニンである放射能標識されたアミノ酸前駆体の存在の下で起こる。
【０１１０】
ＨＣＨＰの断片は、組換え生成物だけでなく固相技術を用いて直接的なペプチド合成によって作製され得る（例えば、前出のＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， ｐｐ． ５５−６０．を参照）。タンパク質の合成は、手動或いは自動で行われ得る。自動合成は、例えば４３１Ａペプチドシンセサイザ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて行うことが可能である。ＨＣＨＰの種々の断片は別々に合成して、次ぎに結合させて完全長分子を生成する。
【０１１１】
（治療）
ＨＣＨＰのある領域とヒトシャペロンタンパク質のある領域との間に、例えば配列及びモチーフの文脈における化学的及び構造的類似性が存在する。更に、ＨＣＨＰの発現は、細胞増殖、癌、炎症、免疫応答、外傷と密接な関係がある。従って、ＨＣＨＰは、神経変性性の疾患、代謝異常、発達障害、自己免疫／炎症性疾患、及び癌を含む細胞増殖異常症においてある役割を果たすと考えられる。ＨＣＨＰの発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、ＨＣＨＰの発現または活性を低下させることが望ましい。また、ＨＣＨＰの発現または活性の低下に関連する上記した疾患の治療においては、ＨＣＨＰの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０１１２】
従って、一実施例において、ＨＣＨＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＨＣＨＰまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、神経変性性の疾患が含まれ、その中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含むプリオン病（ｐｒｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、中枢神経系性精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症（ｎｅｕｒｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィー及び他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性精神障害、及び妄想性精神病と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病が含まれ、また、代謝異常も含まれ、その中には副腎機能不全、嚢胞性線維症、糖尿病、脂肪性肝硬変、ガラクトース血症、甲状腺腫、アドレナリン過剰症、低アドレナリン症、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、高コレステロール血症、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、高脂血症、高脂肪血症、脂質筋障害（ｌｉｐｉｄ ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ）、肥満症、脂肪異栄養症、フェニールケトン尿症が含まれ、また、発達障害も含まれ、その中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィ、癲癇、性腺形成異常、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群（Ｓｍｉｔｈ− Ｍａｇｅｎｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失とが含まれ、また、自己免疫／炎症性疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及び細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が含まれ、また、細胞増殖異常が含まれ、その中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが含まれる。
【０１１３】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＨＣＨＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＨＣＨＰまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。
【０１１４】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＨＣＨＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたＨＣＨＰを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与することも可能である。
【０１１５】
更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＨＣＨＰの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＨＣＨＰの活性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。
【０１１６】
更なる実施例では、ＨＣＨＰの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、患者にＨＣＨＰのアンタゴニストを投与することが可能である。このような疾患の例には、上記した疾患が含まれるが、それらに限定するものではない。一実施態様では、ＨＣＨＰと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはＨＣＨＰを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング或いは運搬機構として間接的に用いられ得る。
【０１１７】
別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＨＣＨＰの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、ＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチドの相補体を発現するベクターを患者に投与することも可能である。
【０１１８】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。
【０１１９】
ＨＣＨＰのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。詳しくは、精製されたＨＣＨＰを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてＨＣＨＰと特異的に結合するものを同定が可能である。ＨＣＨＰの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリによって作られたフラグメントが含まれる。但し、これらに限定されるものではない。治療用には、中和抗体（即ち、二量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。
【０１２０】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、ＨＣＨＰまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバントにはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界面活性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが特に好ましい。
【０１２１】
ＨＣＨＰに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、約５以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列が望ましく、更に望ましいのは約１０以上のアミノ酸からなるものである。これらのオリゴペプチド或いはペプチド、またはそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることが望ましく、小さな自然発生の分子のアミノ酸配列全体も含む。ＨＣＨＰアミノ酸の短い伸展部は、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生され得る。
【０１２２】
ＨＣＨＰに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． 等． （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７； Ｋｏｚｂｏｒ， Ｄ． 等． （１９８５） ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１−８−４２； Ｃｏｔｅ， Ｒ．Ｊ． 等． （１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８０：２０２６−２０３０； Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｐ． 等． （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０を参照）。
【０１２３】
更に、「キメラ抗体」の作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．他． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：６８５１−６８５５； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．他． （１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８； Ｔａｋｅｄａ， Ｓ．等． （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２，４５４を参照）。別法では、当分野で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、ＨＣＨＰ特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオタイプの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから鎖混合によって生成することもできる（例えば、Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８：１１１２０−３を参照）。
【０１２４】
抗体は、リンパ球集団の中のｉｎ ｖｉｖｏ産生を誘発することによって、または免疫グロブリンライブラリのスクリーニング又は文献に示されているような、高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、産生することもできる（例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ， Ｒ． 他． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６： ３８３３−３８３７； Ｗｉｎｔｅｒ， Ｇ． 他． （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９を参照）。
【０１２５】
ＨＣＨＰに対する特異的な結合部位を含む抗体も産生することができる。例えば、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）に断片と、Ｆ（ａｂ’）に断片のジスルフィド架橋を減じることによって生成されるＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクローナルＦａｂ断片の迅速且つ容易な同定が可能となる（例えば、Ｈｕｓｅ， Ｗ．Ｄ． 等． （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１２７５−１２８１を参照）。
【０１２６】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、ＨＣＨＰとその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性ＨＣＨＰエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイも利用することができる（Ｐｏｕｎｄ、前出）。
【０１２７】
ラジオイムノアッセイ技術と共にＳｃａｔｃｈａｒｄ分析などの様々な方法を用いて、ＨＣＨＰ抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは、平衡状態の下でＨＣＨＰ抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で割ったものである。多数のＨＣＨＰエピトープに対して親和性が不均一なポリクロナール抗体試薬の測定値Ｋａは、ＨＣＨＰ抗体の平均親和性または結合活性を表す。特定のＨＣＨＰエピトープに単一特異的なモノクロナール抗体試薬のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａ値が１０^９〜１０^１２Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体試薬は、ＨＣＨＰ抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａ値が１０^６〜１０^７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体試薬は、ＨＣＨＰが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）及び類似の処理に用いるのが好ましい。（Ｃａｔｔｙ， Ｄ． （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ； Ｌｉｄｄｅｌｌ， Ｊ． Ｅ． ａｎｄ Ｃｒｙｅｒ， Ａ． （１９９１） Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【０１２８】
ポリクロナール抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、あるダウンストリーム適用に対するこのような試薬の品質及び適性を調べる。例えば、少なくとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクロナール抗体試薬の使用は、ＨＣＨＰ抗体複合体を沈殿させなければならない処理に適している。様々な適用例における抗体の特異性及び抗体価、結合活性、抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である。（例えば、Ｃａｔｔｙ， 前出， 及びＣｏｌｉｇａｎ 他、前出を参照）。
【０１２９】
本発明の別の実施例では、ＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片または相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施形態では、ＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチドの相補配列がｍＲＮＡの転写を阻止するのに好適である場合、これを使用することができる。特に細胞は、ＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換することもできる。したがって、相補的分子または断片は、ＨＣＨＰの活性の調節、または遺伝子機能の調節のために使用することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、ＨＣＨＰをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。
【０１３０】
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス又はワクシニア、又は様々な細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的の器官、組織又は細胞集団に運ぶこともできる。当業者に周知の方法を用いてＨＣＨＰをコードポリヌクレオチドと相補的な核酸配列を発現するベクターを作製することができる（例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ 他、及び前出のＡｕｓｕｂｅｌ 他によるものを参照）。
【０１３１】
ＨＣＨＰをコードする遺伝子は、ＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチド又はその断片を高いレベルで発現する発現ベクターで、細胞又は組織を形質転換することによって止めることができる。このような作製物を用いて翻訳できないセンス又はアンチセンス配列を細胞の中に導入することができる。ＤＮＡの中に組み入れられない場合でも、このようなベクターは内在性のヌクレアーゼによって機能が損なわれるまでｍＲＮＡ分子を転写し続ける。非複製ベクターでも一過性の発現を一ヶ月以上に亘って続け、好適な複製要素がベクター系の一部である場合はさらに長く持続し得る。
【０１３２】
上記した通り、遺伝子の発現は、ＨＣＨＰをコードする遺伝子の制御５’または調節領域に対する相補的な配列またはアンチセンス分子（ＤＮＡ或いはＲＮＡ、ＰＮＡ）を設計することによって調節することができる。転写開始部位、即ち開始部位から−１０と＋１０との間の領域に由来するオリゴヌクレオチドが好適である場合と同様に、「三重らせん」と塩基対合法を用いて阻止することができる。三重らせん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合のために十分に広がるのを阻止するため有益である。三重式ＤＮＡを用いる最近の治療の進歩は文献に記載されている（例えば、Ｇｅｅ， Ｊ．Ｅ． 等． （１９９４） Ｉｎ： Ｈｕｂｅｒ， Ｂ．Ｅ． 及び Ｂ．Ｉ． Ｃａｒｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ， ＮＹを参照）。相補的な配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計できる。
【０１３３】
酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために用いることができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断が続く。例えば、ＨＣＨＰをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。
【０１３４】
任意の潜在的ＲＮＡ標的の中の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキャニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について評価することが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性をテストすることによって評価することが可能である。
【０１３５】
本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用いて、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホスホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含まれる。別法では、ＲＮＡ分子がｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＨＣＨＰをコードするＤＮＡ配列の転写によって生成され得る、このようなＤＮＡ配列はＴ７またはＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み入れることが可能である。別法では、相補的なＲＮＡを構成的または誘導的に合成するこれらのｃＤＮＡ作製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入することができる。
【０１３６】
ＲＮＡ分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くすることができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフランキング配列の追加、または分子のバックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合よりむしろホスホロチオネート又は２’Ｏメチルの使用が含まれる、がこれらに限定されるものではない。ＰＮＡの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけでなく、イノシン、キュエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、及びワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）などの従来のものでない塩基を含めることによって、これらの分子の全体に拡大することができる。
【０１３７】
ベクターを細胞又は組織に導入する多数の方法が利用でき、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、及びｅｘ ｖｉｖｏでの使用に等しく適している。ｅｘ ｖｉｖｏでの治療の場合、患者から採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すためにクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行することができる（例えば、Ｇｏｌｄｍａｎ， Ｃ．Ｋ． 他． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：４６２−６６：を参照）。
【０１３８】
上記したいかなる治療方法も、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及び最も好ましいヒトなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適用できる。
【０１３９】
本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬品組成物は、ＨＣＨＰ、ＨＣＨＰに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、又はＨＣＨＰのインヒビターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤などの１種類以上の別の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与することができる。このような医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び水などが含まれるがこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独或いは薬物又はホルモンなどの別の薬剤と共に投与することができる。
【０１４０】
本発明に用いられる医薬品組成物は、任意の数の経路を用いて投与することもできる。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮性、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、異所性、舌下、または直腸が含まれるがこれらに限定されるものではない。
【０１４１】
活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物には、活性化合物を医薬的に使用可能な薬剤にするのを容易にする、医薬品添加物及び補助剤を含む好適な薬学的に認められる担体が含まれ得る。製剤及び投与についての詳しい技術については、最新版のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ＰＡ）に記載されている。
【０１４２】
経口投与用の医薬品組成物が、経口投与に好適な投与量において当分野で周知の薬学的に許容される担体を用いて、製剤することができる。このような担体により、医薬品組成物が患者が摂取するために、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル状、シロップ剤、泥状物、懸濁液として製剤される。
【０１４３】
経口用に用いられる医薬品は、活性化合物と固体の薬品添加物とを混合し、得られた顆粒の混合物を処理して、（所望に応じてすりつぶした後）タブレット或いは糖衣錠コア（ｄｒａｇｅｅ ｃｏｒｅｓ）にする。好適な医薬品添加物とは、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、又はその他の植物からのでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース、アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、ゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物又はタンパク質賦形剤である。必要に応じて、例えば、架橋結合したポリビニルピロリドン、かんてん、アルギン酸、またはその塩であるアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤が加えられる。
【０１４４】
糖衣錠コアは、濃縮糖溶剤などの好適なコーティングと共に用いられる。このような濃縮糖溶剤には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポルゲル（ｃａｒｂｏｐｏｌ ｇｅｌ）、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタン、ラッカー溶剤、及び好適な有機溶媒または混合溶剤などが含まれ得る。染料または色素が、製品の識別又は活性化合物の量、即ち薬用量を示すため、錠剤または糖衣錠に加えられる。
【０１４５】
経口用に用いられる医薬品製剤には、ゼラチンから作られたプッシュ−フィット型のカプセル、グリセロールまたはソルビトールなどのコーティングとゼラチンからなる封入されたカプセルが含まれる。プッシュ−フィット型のカプセルには、ラクトース又はスターチなどの賦形剤や結合材、タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、所望に応じて安定剤と混合された活性処方成分が含まれる。ソフトカプセルでは、活性化合物が、安定剤と共に或いは安定剤なしで、脂肪油、溶液、またはポリエチレングリコール溶液などの好適な溶液に溶解或いは懸濁され得る。
【０１４６】
非経口投与用に好適な医薬品剤が、水溶液で製剤されるが、ハンクス液、リンガー液、生理緩衝食塩水などの生理学的に適合性のある緩衝剤が好ましい。水性懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなどの懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性化合物の懸濁液は、好適な油性注入懸濁液として製剤され得る。好適な親水性溶液または媒体には、ごま油などの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド又はリボソームなどの合成脂肪酸が含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、運搬目的で使用される。随意選択により、懸濁液は高濃度の溶液が可能となるよう化合物の溶解性を高める好適な安定剤または薬剤を含み得る。
【０１４７】
局部または鼻腔投与のために、特定の障壁に浸透する好適な浸透剤が製剤に用いられる。このような浸透剤は当業者には周知である。
【０１４８】
本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の方法、例えば従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣化、溶離（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥処理を用いて製造され得る。
【０１４９】
医薬品組成物は塩類として製剤され、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸と共に形成可能である。塩分は対応する遊離塩基系よりも、水溶剤または他のプロトン溶剤に溶けやすい。別の場合の好ましい薬剤の形態には、１から５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スクロース、及び２〜７％マンニトールの幾つか或いは全てを含み、ｐＨの範囲が４．５〜５．５であり、使用前に緩衝剤と結合する凍結乾燥粉末を用いることができる。
【０１５０】
医薬品組成物が調合された後、それらは適当な箱に詰められ、指定した症状の薬としてラベルが貼られる。ＨＣＨＰの投与のため、このようなラベルには、量、頻度、及び投与の方法が含まれるであろう。
【０１５１】
本発明に用いる好適な医薬品組成物には、目的を達成するため、効果的な量の活性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、自分の能力で十分に効果的な服用量を決めることができる。
【０１５２】
どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができる。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタなどが用いられる。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることができる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定することができる。
【０１５３】
医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばＨＣＨＰ又はその断片、ＨＣＨＰの抗体、ＨＣＨＰのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなどの活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば、ＥＤ_５０（服用に対して集団の５０％に医薬的効果がある）またはＬＤ_５０（服用に対して集団の５０％に致命的である）統計を計算するなど、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって決定することができる。毒性効果と治療効果との薬用量比は治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０と示すことができる。高い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いられる。このような組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ＥＤ_５０を含む血中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられる投与形態及び患者の感受性、投与の経路によって、この範囲内で様々である。
【０１５４】
正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるため或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮されるものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答が含まれる。作用器官が長い医薬品組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投与され得る。
【０１５５】
通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約０．１〜１００，０００μｇまでの最大約１グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダンスは文献に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することができる。当業者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの運搬は、特定の細胞、状態、位置などに対して特異的であろう。
【０１５６】
（診断）
別の実施例では、ＨＣＨＰに特異的に結合する抗体が、ＨＣＨＰの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはＨＣＨＰやＨＣＨＰのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断に有用な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤される。ＨＣＨＰの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取されたものからＨＣＨＰを検出する方法が含まれる。これらの抗体は、修飾をして或いはしないで使用され、レポーター分子の共有結合性或いは非共有結合性の接着によって標識化され得る。当分野で周知の種々のレポーター分子が用いられるが、その内の幾つかは上記した。
【０１５７】
ＨＣＨＰを測定するためのＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，及びＦＡＣＳを含む種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのＨＣＨＰの発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なＨＣＨＰの発現の値は、複合体の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、好ましくはヒトである被験者から採取した体液または細胞とＨＣＨＰに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準的な複合体形成の量は種々の方法で定量され得るが、測光法（ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ）が好ましい。被験者のＨＣＨＰの発現の量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが標準値と比較される。標準値と被験者との間の偏差が、疾患を診断するパラメーターとなる。
【０１５８】
別の実施例によれば、ＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドを用いて、疾患と相関し得るＨＣＨＰを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出及び定量する。この診断アッセイを用いて、ＨＣＨＰの不在、存在、及び過度の発現を調べ、治療中のＨＣＨＰレベルの制御を監視する。
【０１５９】
ある実施形態では、ＨＣＨＰまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、ＨＣＨＰをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５’調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特異性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅の厳密性（最大、高い、中間、または低い）は、プローブがＨＣＨＰをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。
【０１６０】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、ＨＣＨＰをコードする任意の配列からのヌクレオチドを５０％以上含むのが望ましい。目的の本発明のハイブリダイゼーションプローブには、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２の配列、或いはＨＣＨＰ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０１６１】
ＨＣＨＰをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、ＨＣＨＰ及びＨＣＨＰ誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。このようなベクターは市販されており、当業者には周知であり、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば^３２Ｐ或いは^３５Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）結合系によってプローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識等の種々のレポーターの集団によって標識され得る。
【０１６２】
ＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、ＨＣＨＰの発現に関連する疾患を診断することが可能である。このような疾患の例には、神経変性性の疾患が含まれ、その中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側策硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、ゲルストマン症候群、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群を含むプリオン病（ｐｒｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｒｅｔｉｎａｌ ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａｔｏｓｉｓ）、脳３叉神経血管症候群、中枢神経系性精神薄弱及び他の発生障害、脳性麻痺、神経骨格異常症（ｎｅｕｒｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄病、筋ジストロフィー及び他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性精神障害、及び妄想性精神病と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群、ジストニー、分裂病性精神障害、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病が含まれ、また、代謝異常も含まれ、その中には副腎機能不全、嚢胞性線維症、糖尿病、脂肪性肝硬変、ガラクトース血症、甲状腺腫、アドレナリン過剰症、低アドレナリン症、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症、高コレステロール血症、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、高脂血症、高脂肪血症、脂質筋障害（ｌｉｐｉｄ ｍｙｏｐａｔｈｉｅｓ）、肥満症、脂肪異栄養症、フェニールケトン尿症が含まれ、また、発達障害も含まれ、その中には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ‐ベッカー型筋ジストロフィ、癲癇、性腺形成異常、ＷＡＧＲ症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神薄弱）、スミス‐マジェニス症候群（Ｓｍｉｔｈ− Ｍａｇｅｎｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、脊髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症、シャルコー‐マリー‐ツース病及び神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症、舞踏病（Ｓｙｎｄｅｎｈａｍ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）及び脳性小児麻痺などの発作障害、脊髄二分裂、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感覚神経性聴力損失とが含まれ、また、自己免疫／炎症性疾患も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及び細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が含まれ、また、細胞増殖異常が含まれ、その中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが含まれる。ＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、ピン（ｐｉｎ）、ＥＬＩＳＡ式アッセイ、及び変異ＨＣＨＰの発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイに使用することが可能である。このような質的或いは量的方法は、当分野では周知である。
【０１６３】
特定の形態において、ＨＣＨＰをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。ＨＣＨＰをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のＨＣＨＰをコードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監視における、特定の治療効果を推定することが可能である。
【０１６４】
ＨＣＨＰの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、正常あるいは標準的な発現の概要が確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出された体液或いは細胞と、ＨＣＨＰをコードする配列或いはその断片とを結合させることにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験者から得た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験からの値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得た標準的な値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。標準値と被験者の値との偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０１６５】
疾患の存在が確定され治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返し行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用いることができる。
【０１６６】
癌では、個体からの生体組織における異常な量の転写物が、疾患の発生の素因を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供することが可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或いは積極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能となる。
【０１６７】
ＨＣＨＰをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な合成、酵素を用いた生成、或いはｉｎ ｖｉｔｒｏで生成され得る。オリゴマーは、好ましくはＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはＨＣＨＰをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや低い厳密性条件の下、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出及び／または定量のため用いることが可能である。
【０１６８】
ＨＣＨＰの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、及び標準的な曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Ｍｅｌｂｙ， Ｐ．Ｃ．等（１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５９：２３５−４４；Ｄｕｐｌａａ， Ｃ．等（１９９３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２９−２３６を参照）。多数のサンプルの定量速度が、目的のオリゴマーが種々の希釈液に含まれ、分光光度法或いは非色応答により迅速に定量するＥＬＩＳＡ型のアッセイを用いることによって加速された。
【０１６９】
別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはそれより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として用いる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多くの遺伝子の発現レベルを監視し、遺伝子の変異、突然変異及び多形性を識別する。この情報は、遺伝子機能の決定、疾患の遺伝的根拠の解釈、疾患の診断、及び治療薬剤の活性の監視及び開発に有用である。
【０１７０】
当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｔ．Ｍ． 他 （１９９５） 米国特許第５，４７４，７９６号；Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他 （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：１０６１４−１０６１９； Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ 他（１９９５） ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／２５１１１６； Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．他 （１９９５） ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／３５５０５； Ｈｅｌｌｅｒ， Ｒ．Ａ． 他（１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：２１５０−２１５５； 及び Ｈｅｌｌｅｒ， Ｍ．Ｊ． 他 （１９９７） 米国特許第５，６０５，６６２号を参照）
本発明の別の実施例ではまた、ＨＣＨＰをコードする核酸配列を用いて、自然発生のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを生成することが可能である。この配列は、以下のものに対してマッピングされる。特定の染色体、染色体の特定領域または人工生成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１生成物或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリである。（例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， １．３． 他 （１９９７） Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １５：３４５−３５５； Ｐｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９３） Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ． ７：１２７−１３４， 及びＴｒａｓｋ， Ｂ．Ｊ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ７：１４９−１５４を参照）
ｉｎ ｓｉｔ蛍光ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、他の物理的染色体マッピング技術及び遺伝マップデータと相関するであろう（例えば、Ｈｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈ， 他による（１９９５） ｉｎ Ｍｅｙｅｒｓ， 前出， ｐｐ． ９６５−９６８．を参照）。遺伝子マップデータの例は、種々の科学誌あるいはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）のサイトで見付けることができる。物理的な染色体マップ上のＨＣＨＰをコードする遺伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このような疾患と関係するＤＮＡの領域を決定するのに役立つ。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者と、保有者、及び感染した者との遺伝子配列における違いを検出することもある。
【０１７１】
染色体標本のｉｎ ｓｉｔハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子マップを拡張することもできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上での遺伝子の配置により、たとえ特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていなくても、関連するマーカーが明らかになることが多い。新規の配列を、物理的なマッピングによって、染色体アームに割り付けることもできる。このことは、位置クローニング或いは別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって、価値ある情報である。疾患或いは症候群の位置が、例えば血管拡張性失調症の１１ｑ２２−２３などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは調節遺伝子を表す（例えば、Ｇａｔｔｉ， Ｒ．Ａ．他による（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３６：５７７−５８０を参照）。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出することもある。
【０１７２】
本発明の別の実施例では、ＨＣＨＰ、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニングに用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或いは細胞内に存在する。ＨＣＨＰとテストされる薬剤との複合体を結合することによる形成は計測されることもある。
【０１７３】
薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる（例えば、Ｇｅｙｓｅｎ，他による（１９８４） ＰＣＴ出願番号 ＷＯ８４／０３５６４を参照）。この方法では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基板の上に合成される。試験用化合物は、ＨＣＨＰ、或いはその断片と反応してから洗浄される。次ぎに、結合されたＨＣＨＰが、当分野で周知の方法で検出される。精製されたＨＣＨＰはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレート上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて、ペプチドを捕らえ、固体支持物に固定することもできる。
【０１７４】
別の実施例では、ＨＣＨＰと結合可能な中和抗体がＨＣＨＰと結合するため試験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、ＨＣＨＰと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【０１７５】
別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にＨＣＨＰをコードするヌクレオチド配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供することができる。
【０１７６】
当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで最大限に本発明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する特定の実施例は、例示目的であって本発明を限定するものではない。
【０１７７】
前出及び以下に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国出願（１９９８年９月１２日に提出した、代理人整理番号ＰＦ−０５９５Ｐ）、米国出願（１９９９年１月１９日に提出した、代理人整理番号ＰＦ−０６５６Ｐ）及び米国出願（１９９９年４月１９日に提出した、代理人整理番号ＰＦ−０６８５Ｐ）を引用することをもって本明細書の一部とする。
【０１７８】
（実施例）
１　 ｃＤＮＡ ライブラリの作製
ＲＮＡは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入、或いは表４に列記した組織から単離した。ある組織をホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した。一方では、別の組織をホモジナイズしてフェノールに溶解するか、或いはＴＲＩＺＯＬ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、グアニジニウムイソチオシアネート及びフェノールの単相溶液などの好適な変性剤の混合液に溶解した。この溶解物を塩化セシウムにおいて遠心分離またはクロロホルムで抽出した。イソプロパノール或いは酢酸ナトリウムのどちらかとエタノール、或いは別の方法でこの溶解物からＲＮＡを沈殿させた。
【０１７９】
ＲＮＡの純度を高めるためにＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、ＤＮＡ分解酵素でＲＮＡを処理する。殆どのライブラリでは、オリゴｄ（Ｔ）連結常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＯＬＩＧＯＴＥＸラテックス粒子（ＱＩＡＧＥＮ． Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）、ＯＬＩＧＯＴＥＸ ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてポリ（Ａ＋）ＲＮＡを単離した。別法では、ＰＯＬＹ（Ａ）ＰＵＲＥ ｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｂｉｏｎ， Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）などの別のＲＮＡ単離キットを用いて組織溶解物から直接単離した。
【０１８０】
ある場合には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社にＲＮＡを提供しＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社が対応するｃＤＮＡライブラリを作製した。そうでない場合は、ＵＮＩＺＡＰベクターシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ プラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて当分野で公知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成してｃＤＮＡライブラリを作製した。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９７，前出，ユニット５．１−６．６を参照）。逆転写は、オリゴｄ（Ｔ）またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに結合させてから、好適な１つの制限酵素或いは複数の制限酵素でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリでは、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ Ｓ １０００または ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ２Ｂ、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラムクロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、アガロースゲル電気泳動法によってｃＤＮＡの大きさ（３００〜１０００ｂｐ）を選択した。ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐｌＮＣＹ （Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）などの好適なプラスミドのポリリンカーの適合性制限酵素部位にｃＤＮＡを結合させた。この組換えプラスミドを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＸＬ１−Ｂｌｕｅ， ＸＬ１−ＢＩｕｅＭＲＦ、ＳＯＬＲ、またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＤＨ５αまたはＤＨ １０Ｂ、ＥＬＥＣＴＲＯＭＡＸ ＤＨ １０Ｂを含むコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。
【０１８１】
２　 ｃＤＮＡ クローンの単離
ＵＮＩＺＡＰベクター系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）或いは細胞溶解を利用して、ｉｎ ｖｉｖｏ切除によって宿主細胞からプラスミドを回収した。ＭａｇｉｃまたはＷＩＺＡＲＤ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及びＡＧＴＣ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キット（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）、ＱＩＡＧＥＮ社のＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄ、ＱＩＡＷＥＬＬ ８ Ｕｌｔｒａ Ｐｌａｓｍｉｄ 精製システム、ＲＥＡＬ Ｐｒｅｐ ９６プラスミドキットの内の少なくとも１つを用いてプラスミドを精製した。沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０１８２】
別法では、高スループットの直接結合ＰＣＲ法によって宿主細胞溶解物からプラスミドＤＮＡを増幅した。（Ｒａｏ， Ｖ．Ｂ． （１９９４） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１６：１−１４）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で行った。サンプルを処理してから３８４−ウエルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドＤＮＡの濃度をＰＩＣＯＧＲＥＥＮ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）及びＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ蛍光スキャナー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて蛍光定量的に測定した。
【０１８３】
３　シークエンシング及び分析
ｃＤＮＡのシークエンシング反応は、標準的な方法で、或いはＡＢＩ ＣＡＴＡＬＹＳＴ ８００ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ） ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒまたはＰＴＣ−２００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ （ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） またはＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００ （Ｈａｍｉｌｔｏｎ） 液体転移システムとの組み合わせなどの高スループット装置で行った。ｃＤＮＡのシークエンシング反応の準備には、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社の試薬、またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）などのＡＢＩシークエンシングキットに含まれる試薬を用いた。ｃＤＮＡのシークエンシング反応の電気泳動的な分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、ＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、標準ＡＢＩプロトコル及び塩基対呼び出しソフトウェアを用いるＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７３または３７７シークエンシングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、当分野で周知のその他の配列解析システムを用いた。ｃＤＮＡ配列の読み枠は、標準的な方法（Ａｕｓｕｂｅｌ， １９９７， 前出， ｕｎｉｔ ７．７）を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、本実施例の５に記載した方法で配列を延長した。
【０１８４】
ｃＤＮＡのシークエンシングから得たポリヌクレオチド配列の構築及び解析は、当分野の技術者に周知のアルゴリズムを利用したソフトウェアを組合せて行った。表５は、利用したツール、ソフトウェア、アルゴリズム、それらの説明、引用文献、閾値パラメーターの概要を示す。表５の列１は用いたツール及びプログラム、アルゴリズム、列２はそれらの簡単な説明、列３は引用することで本明細書の一部とした引用文献、列４の記載部分は２つの配列の一致度の評価に用いたスコア及び確率値、他のパラメータを示す（確率値が高ければ高いほど配列間の相同性が高くなる）。配列の解析には、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）及びＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア （ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いた。
【０１８５】
ポリヌクレオチド配列の確証は、ＢＬＡＳＴ及び動的計画法、ジヌクレオチド最近接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター及びリンカー、ポリＡ配列を取り除き、あいまいな塩基対をマスクすることで行った。次に、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳに基づいたプログラムを用いて、公共のデータベースであるＧｅｎＢａｎｋの霊長類及びげっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベースやＢＬＯＣＫＳデータベースなどから選択した配列に対してこれらの配列を問合わせて注釈を得た。Ｐｈｒｅｄ及びＰｈｒａｐ、Ｃｏｎｓｅｄに基づいたプログラムを用いて完全長のポリヌクレオチド配列の中にこれらの配列を構築して、ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ、ＢＬＩＭＰＳに基づいたプログラムでオープンリーディングフレームのためにスクリーンした。完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳して対応する完全長のアミノ酸配列を引き出し、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（上記）及びＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＰＦＡＭ、Ｐｒｏｓｉｔｅなどのデータベース、またはＰＦＡＭなどのＨｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ Ｍｏｄｅｌ （ＨＭＭ）に基づいたタンパク質ファミリーデータベースに対して問い合わせてこれらの完全長の配列を分析した。ＨＭＭは、確率を利用して遺伝子ファミリーのコンセンサス一次構造を解析する（例えば、Ｅｄｄｙ， ＳＲ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒ． Ｂｉｏｌ． ６：３６１−３６５を参照）。
【０１８６】
完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の構築及び分析に用いる上記のプログラムは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２からのポリヌクレオチド配列の断片の同定にも使用できる。約２０から４０００までのヌクレオチドの断片はハイブリダイゼーション及び増幅に有用であり、上記の発明で説明した。
【０１８７】
４　ノーザン分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，前出， ７章； 及び Ａｕｓｕｂｅｌ． Ｆ．Ｍ． 他、前出， ４章及び１６章を参照）。
【０１８８】
ＢＬＡＳＴに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ或いはＬＩＦＥＳＥＱ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のようなヌクレオチドデータベース内の同一或いは関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションより非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れかとして分類されるかを確定することができる。検索の基準は、
（％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００
として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１〜２％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。類似分子は通常、１５〜４０の範囲の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが、それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。
【０１８９】
ノーザン分析の結果は、ＨＣＨＰをコードする転写物が発生したライブラリの分布割合として報告される。分析には、器官／組織及び疾患によるｃＤＮＡライブラリの分類も含まれる。器官／組織のカテゴリーには、心血管、皮膚、発生、内分泌、胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖、泌尿が含まれる。疾患のカテゴリーには、癌、炎症／外傷、細胞増殖、神経、貯留（ｐｏｏｌｅｄ）が含まれる。それぞれのカテゴリーについて、目的の配列を発現するライブラリの数を数えて、それを全ての範囲のライブラリの数で割った。各組織に特異的に発現する割合（パーセント）と各疾患で発現する割合を表３に示した。
【０１９０】
５　 ＨＣＨＰ をコードするポリヌクレオチドの延長
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２の完全長の核酸配列は、完全長分子の好適な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてその完全長分子の好適な断片を延長して作製した。一方のプライマーは既知の断片の５’の延長を開始するために合成し、他方のプライマーは既知の断片の３’の延長を開始するために合成した。開始プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）或いは他の適切なプログラムを用いて、約２２個から約３０個のヌクレオチドの長さで約５０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じないようにヌクレオチドを延長した。
【０１９１】
選択されたヒトｃＤＮＡライブラリーを用いてこの配列を延長した。２段階以上の延長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、追加或いはネスト化プライマーの組を設計する。
【０１９２】
当分野で既知の方法を利用したＰＣＲ法で高い忠実度で増幅した。ＰＣＲはＰＴＣ−２００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ （ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．）用いて９６ウェルブロックプレートで行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡ及び２００ｎｍｏｌの各プライマー、Ｍｇ^{２ ＋}と（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４とβ−メルカプトエタノールを含むバッファー、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含む。プライマーの組、ＰＣＩ ＡとＰＣＩ Ｂに対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　６０℃で１分間
ステップ４　　６８℃で２分間
ステップ５　　ステップ２及び３、４を２０回繰り返す
ステップ６　　６８℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管
別法では、プライマーの組、Ｔ７とＳＫ＋に対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　５７℃で１分間
ステップ４　　６８℃で２分間
ステップ５　　ステップ２及び３、４を２０回繰り返す
ステップ６　　６８℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
【０１９３】
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１Ｘ ＴＥ及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物に溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５％ （ｖ／ｖ） ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各ウェルに分配してＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定する。このプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンして、サンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量化する。反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを１％のアガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れの反応物が配列を延長することに成功したかを決定する。
【０１９４】
延長したヌクレオチドを脱塩及び濃縮してから３８４ウェルプレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウィルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）で消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結する前に音波処理またはせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上に分離して断片を切断し、寒天をＡｇａｒ ＡＣＥ （Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。Ｔ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いて延長したクローンをｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で制限部位の延び出しを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液の３８４ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。
【０１９５】
細胞を溶解して、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　６０℃で１分間
ステップ４　　７２℃で２分間
ステップ５　　ステップ２及び３、４を２９回繰り返す
ステップ６　　７２℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
上記したようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でＤＮＡを定量化した。ＤＮＡ回収率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを２０％のジメチルサルホサイド（ｄｉｍｅｔｈｙｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）（ １：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いてシークエンシングした。
【０１９６】
同様に上述の手順で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２のヌクレオチド配列を利用し、この延長のために設計したオリゴヌクレオチドと好適な遺伝子ライブラリを用いて５′調節配列を得た。
【０１９７】
６　個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７−１２から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、ＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０μＣｉの［γ‐^３２Ｐ］アデノシン三リン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ ＭＡ）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５超精細排除デキストランビードカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて実質的に精製する。毎分１０^７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、次のエンドヌクレアーゼ、Ａｓｅ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｘｂａ１或いはＰｖｕ ＩＩ（ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮ）の１つを用いて切断したヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。
【０１９８】
各切断物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製メンブラン（Ｎｙｔｒａｎ Ｐｌｕｓ， Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄｕｒｈａｍ ＮＨ）に転写する。ハイブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くため、ブロットを、段階的に厳密性が増す条件で最大０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまで順次室温にて洗浄する。ハイブリダイゼーションパターンをオートラジオグラフィーで視覚化して比較する。
【０１９９】
７　マイクロアレイ
化学結合方法及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上でアレイ要素を合成することが可能である（例えば、上記Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒを参照）。ドットブロット法またはスロットブロット法に類似したアレイを利用し、要素を熱、ＵＶ、機械的または化学的結合方法を用いて基板の表面に配置し結合させる。典型的なアレイは、手作業または利用可能な方法や機械を用いて作製することができ、任意の適正な数の要素を含み得る。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしていないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターンを決定する。スキャンした画像を分析して、マイクロアレイ上で要素にハイブリダイズする各プローブの相補性の程度及び相対的な量／発現レベルを調べることが可能である。
【０２００】
完全長のｃＤＮＡ、発現遺伝子配列断片（ＥＳＴ）、或いはそれらの断片が、マイクロアレイの要素を構成し得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片を、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）などの当分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。本発明の核酸配列の１つに対応する完全長のｃＤＮＡ、ＥＳＴ、或いはそれらの断片、或いは本発明に関連するｃＤＮＡライブラリから任意に選択されたｃＤＮＡを、ガラススライドなどの好適な基質に整列する。ｃＤＮＡは、例えばＵＶ交差結合（ＵＶ ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）を利用してスライドに固定してから、熱処理及び化学処理を施し、最後に乾燥させる（例えば、 Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． 他． （１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７−４７０； 及び Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ． 他． （１９９６） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６：６３９−６４５を参照）。蛍光プローブを準備して、基質上の要素にハイブリダイゼーションするために用いる。上記した方法でこの基質を分析する。
【０２０１】
８　相補的ポリヌクレオチド
ＨＣＨＰをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、自然発生のＨＣＨＰの発現の低下即ち阻害するために用いられる。約１５〜約３０個の塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或いはより大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Ｏｌｉｇｏ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＨＣＨＰのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５′配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＨＣＨＰをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０２０２】
９　 ＨＣＨＰ の発現
ＨＣＨＰの発現及び精製は、細菌またはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌でＨＣＨＰが発現するために、抗生物質耐性及びｃＤＮＡの転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。このようなプロモーターには、ｌａｃオペレーター調節要素に関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。組換えベクターを、ＢＬ２１（ＤＥ３）などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘発されるとＨＣＨＰを発現する。真核細胞でのＨＣＨＰの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多面性ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、ＨＣＨＰをコードするｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強いポリヘドリンプロモータによって高いレベルのｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （Ｓｆ９）昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる。（例えば、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ． Ｅ． Ｋ．他 （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：３２２４−３２２７； Ｓａｎｄｉｇ， Ｖ． 他 （１９９６） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：１９３７−１９４５．を参照）。
【０２０３】
殆どの発現系では、ＨＣＨＰが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはＦＬＡＧや６−Ｈｉｓなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製が素早く１回で行うことができる。Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍからの２６キロダルトンの酵素ＧＳＴによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製の後、ＧＳＴ部分を特定の操作部位でＨＣＨＰからタンパク分解的に切断できる。アミノ酸８個のペプチドであるＦＬＡＧで、市販のモノクロナール及びポリクロナール抗ＦＬＡＧ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）を用いた免疫親和性の精製が可能となる。６個のヒスチジン残基が連続して伸展した６−Ｈｉｓによって、金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）で精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５，前出， ｃｈ １０， １６）に記載されている。これらの方法で精製したＨＣＨＰを直接用いて以下のアッセイを行うことができる。
【０２０４】
１０　 ＨＣＨＰ 活性の実証
熱または毒素によるＨＣＨＰ誘導は、ＣＣＬ−１３、ＨＥＫ２９３、またはＨＥＰ Ｇ２ （ＡＴＣＣ）等のヒト線維芽細胞またはヒト細胞株の初代培養を用いて実証可能である。誘導ＨＣＨＰ発現を上昇するには、細胞のアリコートを４２℃で１５分、３０分、または６０分間アークインキュベートする。対照アリコートは、３７℃で同時間インキュベートする。ＨＣＨＰ発現を毒素によって誘導するために、細胞のアリコートを１００μＭの亜ヒ酸塩または２０ ｍＭのアゼチジン−２−カルボン酸で０時間、３時間、６時間または１２時間処理する。熱にさらした後、アミノ酸同族体である亜ヒ酸塩の処理済み細胞サンプルを収穫し、ウェスタン法で分析するために細胞溶解産物を準備する。
【０２０５】
細胞は、１％ノニデットＰ−４０、０．１５ ＭのＮａＣｌ、５０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５ ｍＭのＥＤＴＡ、２ ｍＭのＮ−エチルマレイミド、２ ｍＭのフェニルメチルスルホニルフッ化物、１ ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、及び１ ｍｇ／ｍｌのペプスタチンを含む溶解緩衝液中で溶解する。２０μｇの細胞溶解産物を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に輸送する。５％脱脂粉乳／リン酸緩衝生理食塩水で１時間阻害後、２％脱脂粉乳／リン酸緩衝生理食塩水中で抗ＨＣＨＰ血清の１：１０００希釈液を用いて、４℃で一晩または室温で２〜４時間、膜をインキュベートする。その後、膜を洗浄し、２％粉乳／リン酸緩衝生理食塩水中でホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ウサギＩｇＧの１：１０００希釈液でインキュベートする。リン酸緩衝生理食塩水中で０．１％トウィーン２０を用いて洗浄後、ＨＣＨＰタンパク質を検出し、化学ルミネセンスを用いて対照アリコートと比較する。ストレス条件下でのＨＣＨＰ導入は、ＨＣＨＰ活性の証拠である。
【０２０６】
あるいは、ＨＣＨＰ活性は、ＡＴＰ不在下で、ＡＴＰ存在下ではなく、ＨＣＨＰ抗体を用いた共免疫沈降により測定するミトコンドリアのＨｓｐ７０との相互作用能力によって実証される（Ｉｓｈｉｈａｒａ， Ｎ．ら（１９９８）Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （Ｔｏｋｙｏ） １２３（４）：７２２−７３２）。ミトコンドリアは、ＨＣＨＰ発現細胞から単離する。ミトコンドリアは、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアンチパイン、１０μｇ／ｍｌのキモスタチン、及び１０μｇ／ｍｌのペプスタチンからなるプロテアーゼ抑制体混合物及びＡＴＰ除去成分またはＡＴＰ富化成分のいずれかを含む均質化緩衝液（Ｈａｃｈｉｙａ， Ｎ．ら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ． １２：１５７９−１５８６）１ ｍｌ当たりミトコンドリア１ ｍｇが含まれる溶液中で、３０℃で２０分間インキュベートする。ＡＴＰ除去のため、１０単位のアピラーゼ及び１２．５μｇ／ｍｌのオリゴマイシンを添加し、ＡＴＰ再貯留のために１ ｍＭのＡＴＰを添加する。ミトコンドリアは、ｐＨ ７．４で０．２５％ジギトニン、５０ ｍＭのＮａＣｌ、及び上述のプロテアーゼ抑制体混合物を含む１０ ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＢ緩衝液を含む可溶化緩衝液で、０℃で３０分間処理する。ミトコンドリア溶液は１５，０００ ｇで５分間遠心分離する。４μｇのＨＣＨＰに対する単一特異性ＩｇＧを１０μｌのプロテインＡセファロースと共に上澄み液に添加し、混合液を４℃で９０分間インキュベートする。プロテインＡセファロースは可溶化緩衝液で３回洗浄し、ゲル負荷緩衝液で処理する。溶出タンパク質はドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって単離し、ゲルはＨＣＨＰに対する単一特異性ＩｇＧ 及びミトコンドリアのＨａｐ７０に対するモノクローナル抗体を用いて免疫ブロット法により分析する。ＭＩＴ免疫沈降反応におけるＨＣＨＰ及びミトコンドリアのＨａｐ７０双方の検出能力は、ＨＣＨＰ及びミトコンドリアのＨａｐ７０の相互作用を示している。
【０２０７】
１１　機能的アッセイ
ＨＣＨＰの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでのＨＣＨＰをコードする配列の発現によって評価する。ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。このようなベクターには、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴ^ＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．）及びｐＣＲ ３．１ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを含んでいる。５〜１０μｇの組換えベクターを、好ましくは内皮由来か造血由来のヒト細胞株にリポソーム製剤或いは電気穿孔法によって一過性に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とを区別できる。また、標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。このような標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、及びＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰ融合タンパク質が含まれる。レーザー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法（ＦＣＭ）を用いて、ＧＦＰまたはＣＤ６４−ＧＦＰを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。また、ＦＣＭで、先行した或いは同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取り込みを検出して計量する。これらの現象には、プロピジウムヨウ化物でのＤＮＡの染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化と、ブロモデオキシウリジンの取り込み量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節と、特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内のタンパンク質の発現の変化と、蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細胞計測法は、Ｏｒｍｅｒｏｄ， Ｍ． Ｇ．による （１９９４） Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｏｘｆｏｒｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．に記載されている。
【０２０８】
遺伝子発現におけるＨＣＨＰの影響は、ＨＣＨＰをコードする配列とＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。ＣＤ６４またはＣＤ６４−ＧＦＰは形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換されない細胞とは、ヒトＩｇＧかＣＤ６４に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビードを用いて分離することができる（ＤＹＮＡＬ． Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ． ＮＹ）。ｍＲＮＡは、当分野で公知の方法で細胞から精製することができる。ＨＣＨＰ及び目的の他の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０２０９】
１２　 ＨＣＨＰ に特異的な抗体の産生
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；例えば、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｍ．Ｇ． （１９９０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：４８８−４９５を参照）または他の精製技術で実質的に精製されたＨＣＨＰを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。
【０２１０】
別法では、ＨＣＨＰアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を産生させる。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周知である（例えば、前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５，１１章を参照）。
【０２１１】
通常、約１５残基の長さのオリゴペプチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのペプチドシンセサイザＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いてｆｍｏｃ法のケミストリにより合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によりＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）に結合させて、免疫原性を高める（例えば、前出のＡｕｓｕｂｅｌ， １９９５を参照）。フロイントの完全アジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性を検査するには、例えばペプチドをプラスチックに結合し、１％ＢＳＡを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。
【０２１２】
１３　特異的抗体を用いる自然発生 ＨＣＨＰ の精製
自然発生ＨＣＨＰ或いは組換えＨＣＨＰを、ＨＣＨＰに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗ＨＣＨＰ抗体とを共有結合させることにより構築する。結合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従って、ブロックし洗浄する。
【０２１３】
ＨＣＨＰを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、ＨＣＨＰを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とＨＣＨＰとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、ＨＣＨＰを回収する。
【０２１４】
１４　 ＨＣＨＰ と相互作用する分子の同定
ＨＣＨＰ又は生物学的に活性なその断片を、^１２５Ｉボルトンハンター試薬（例えば、Ｂｏｌｔｏｎ他 （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９を参照）で標識する。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＨＣＨＰと共にインキュベートし、洗浄して、標識したＨＣＨＰ複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なＨＣＨＰ濃度で得られたデータを用いて、候補の分子とＨＣＨＰとの関連、親和性、数について数値を計算する。
【０２１５】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適実施例に基づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連する分野の専門家には明らかな、本明細書に記載の本発明の実施方法における様々な改変は、特許請求の範囲に含まれるものである。
【０２１６】
（表の簡単な説明）
表１は、ＨＣＨＰをコードする完全長の配列を作り出すために用いた、ポリペプチド配列及びヌクレオチド配列の配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）、クローンＩＤ番号、ｃＤＮＡライブラリ、ｃＤＮＡ断片を示す。
【０２１７】
表２は、潜在モチーフ及び相同配列を含む各ポリペプチド配列の特徴、及びＨＣＨＰの同定に用いた方法及びアルゴリズムを示す。
【０２１８】
表３は、ノーザン分析によって決定された各核酸配列の組織特異的発現パターンと、これらの組織に関連した疾患や異常症、症状と、各ＤＮＡがクローニングされたベクターとを示す。
【０２１９】
表４は、ＨＣＨＰをコードするｃＤＮＡクローンを単離したｃＤＮＡライブラリを作製するために用いた組織を示す。
【０２２０】
表５は、ＨＣＨＰの分析に用いたツール及びプログラム、アルゴリズム、その説明、引用文献、閾値パラメーターを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＥＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）のマルチシーケンスアラインメントプログラムを用いて作成したＨＣＨＰ−１ （１５５６１３９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１） とマウスＴｉｍ４４ （ＧＩ ２３５１４１０： ＳＥＱ ＩＤＮＱ：２５）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図１Ｂ】ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＥＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）のマルチシーケンスアラインメントプログラムを用いて作成したＨＣＨＰ−１ （１５５６１３９； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１） とマウスＴｉｍ４４ （ＧＩ ２３５１４１０； ＳＥＱ ＩＤＮＱ：２５）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図２】ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのマルチシーケンスアラインメントプログラムを用いて作成したＨＣＨＰ−３ （Ｉｎｃｙｔｅ Ｃｌｏｎｅ ３６５８４５１； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３） とマウスコシャペロン （ｃｏ−ｃｈａｐｅｒｏｎｅ） ｍｔ−ＧｒｐＥ＃２ 前駆体 （ＧＩ ３４１１０７２； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図３Ａ】ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのマルチシーケンスアラインメントプログラムを用いて作成したＨＣＨＰ−４ （Ｉｎｃｙｔｅ Ｃｌｏｎｅ ４２１７６１０； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）とヒト熱ショックタンパク質 ｈｓｐ４０ （ＧＩ １８１６４５２； ＳＥＱ ＩＤＮＯ：２７）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図３Ｂ】ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのマルチシーケンスアラインメントプログラムを用いて作成したＨＣＨＰ−４ （Ｉｎｃｙｔｅ Ｃｌｏｎｅ ４２１７６１０； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）とヒト熱ショックタンパク質 ｈｓｐ４０ （ＧＩ １８１６４５２； ＳＥＱ ＩＤＮＯ：２７）との間のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

Claims (20)

1. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（配列番号：１−６）及びそれらの断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチド。
2. 請求項１のアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する実質的に精製された変異体。
3. 請求項１のポリペプチドをコードする単離され精製されたポリヌクレオチド。
4. 請求項３のポリヌクレオチドと少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
5. 厳密な条件の下で請求項３のポリヌクレオチドとハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。
6. 請求項３のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチド。
7. ポリヌクレオチドの検出法であって、
   （ａ）請求項６のポリヌクレオチドをサンプル内の少なくとも一つの核酸とハイブリダイズさせて、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、
   （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイブリダイゼーション複合体の存在が、前記サンプル内の前記ポリヌクレオチドの存在と相関性を有する、該過程とを含むことを特徴とする検出法。
8. 前記ハイブリダイゼーションの前に前記ポリヌクレオチドの増幅過程をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の検出法。
9. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２及びそれらの断片からなる一群より選択されたポリヌクレオチド配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチド。
10. 請求項９のポリヌクレオチドと少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
11. 請求項９のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌクレオチド。
12. 請求項３のポリヌクレオチドの少なくとも一つの断片を含む発現ベクター。
13. 請求項１２の発現ベクターを含む宿主細胞。
14. ポリペプチドの製造方法であって、
    （ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件の下で、請求項１３の宿主細胞を培養する過程と、
    （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを特徴とする製造方法。
15. 好適な医療用担体と共に請求項１のポリペプチドを含む医薬品組成物。
16. 請求項１のポリペプチドと特異的に結合する精製された抗体。
17. 請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
18. 請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
19. ＨＣＨＰの発現または活性の低下に関連する疾患の治療または予防が必要な患者に、請求項１５の医薬品組成物を効果的な量投与する過程を含む、ＨＣＨＰの発現または活性の低下に関連する疾患を治療または予防する方法。
20. ＨＣＨＰの発現または活性の増大に関連する疾患の治療または予防が必要な患者に、請求項１８のアンタゴニストを効果的な量投与する過程を含む、ＨＣＨＰの発現または活性の増加に関連する疾患を治療または予防する方法。

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