JP2002523089A - タンパク質輸送関連分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒトタンパク質輸送分子（PTAM）と、PTAMを同定しコードするポリヌクレオチドとを提供する。また、本発明は、発現ベクター及び宿主細胞、抗体、アゴニスト、アンタゴニストを提供する。更に、本発明は、PTAMの発現に関連する疾患の診断または治療方法、予防方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の技術分野 本発明は、タンパク質輸送関連分子の核酸配列及びアミノ酸配列、並びにこれ
らの配列を用いた、細胞増殖異常症及び分泌異常症の診断及び治療、予防に関連
する。

【０００２】 発明の背景 細胞の機構は、最適な構造で最適に機能するように設計されている。細胞によ
って産生される分子は、好適な細胞内の部位に輸送されなければならない。適正
な局在化のために、各分子は細胞内のアドレス情報を含んでいなければならない
。輸送装置が、この情報に基づいて分子を目的の位置に正確に輸送する。これは
動的なプロセスであり、分子の位置は時間によって変わる。分子の正確な局在化
に関与する任意のステップの異常は、糖尿病やアルツハイマー病などの疾患につ
ながり得る（James, D.E., 及び Piper, R.C. (1994) J. Cell Biol. 126:1123-
1126; 及び Nordstedt, C., 他 (1993) J. Biol. Chem. 268:608-612）。

【０００３】 この情報には、タンパク質の一次構造内の標的残基のアドレスが含まれる。あ
るアミノ酸配列が、分子のプロセシング及びリサイクリングの間、「輸送コード
」として働き、分子が正確に局在化される。幾つかのモチーフが同定された。主
要な２つのモチーフは、核局在化シグナル及びシグナルペプチドである。核局在
化シグナル（NLS）は、塩基性残基の多いアミノ酸の短い伸展からなる。NLSは、
グルココルチコイド受容体などの核に輸送されるタンパク質に見られる。NLSはN
LS受容体であるimportinによって認識され、単量体GTP結合タンパク質Ranと相互
作用する。このNLSタンパク質／受容体／Ran複合体は、ホモ二量体タンパク質核
輸送因子２（NTF2）の助けを受けて核膜孔を進む。NTF2は、GDP結合型のRan及び
p62などの多くの核膜孔複合体タンパク質と結合する。

【０００４】 シグナルペプチドは、小胞体（ER）に輸送されるタンパク質に見られる。シグ
ナルペプチドは、疎水性残基の多いアミノ酸の伸展からなる。通常、シグナルペ
プチドは、タンパク質のN末端の端部に見られ、サイトゾルシグナル認識ペプチ
ド（SRP）によって認識される。SRPは、シグナルペプチドに結合し、ERの内在性
膜タンパク質であるSRP受容体に結合する。SRP受容体に結合すると、シグナルペ
プチドを含む新たに形成されたタンパク質が、ER膜を貫通して転位置される。シ
グナルペプチド含有タンパク質は、脂質二重層に挿入されるか、細胞小器官の管
腔の中に入るか、或いは細胞から分泌される。

【０００５】 また、タンパク質は、細胞内部位に留まるか或いは輸送されるかを決定する異
なるモチーフを含む。例えば、トランスゴルジ網内在性膜タンパク質TGN38は、
トランスゴルジ網（TGN）と細胞膜との間を行き来する。TGN38は２つの別のモチ
ーフを含み、そのうちの1つは細胞質尾部にあって、ゴルジ体への輸送に関与し
、もう１つのモチーフは疎水性膜貫通領域内にあって、タンパク質をTGN内へ留
めることに関与する（Stephens, D.J., 他 (1997) J. Biol. Chem. 272:14104-1
4109）。モチーフの修飾によって、タンパク質のアドレスが変えられて再度局在
化され得る。例えば、上皮細胞成長因子（EGF）受容体及びT細胞受容体（TCR）
などの細胞膜受容体には、リガンドが結合するとリン酸化する標的モチーフが含
まれる。標的モチーフのリン酸化によって、受容体がリソソームに内部移行或い
は輸送されて分解される（Dietrich, J. 他 (1994) EMBO J. 13:2156-2166）。

【０００６】 アミノ酸モチーフの情報を輸送装置が利用して、小胞内に隔離してパッケージ
ングし、好適な部位に輸送する。ソーティングネキシン−1（SNX-1）は、リソソ
ーム輸送に関与するモチーフの認識に関係するタンパク質の１つである。SNX-1
を必要とするリソソームに輸送される分子には、カルボキシペプチダーゼYソー
ティング受容体及びEGF受容体がある。SNX-1が存在しないと、これらのタンパク
質は誤った部位に局在化される（Kurten, R.C., Cadena. D.L., 及び Gill, G.N
. (1996) Science 272:1008-1010; 及び Horazdovsky, B.F.他 (1997) Mol. Bio
l. Cell 8:1529-1541）。膜にクラスリンを構築して小胞の形成を開始させるア
ダプタータンパク質（AP）複合体も、細胞内部位へのタンパク質の輸送のための
隔離に関与する。ゴルジ体で形成されるAP-1小胞には、陽イオン非依存性及び陽
イオン依存性のマンノース6-リン酸受容体（MRP）が含まれる。これらの小胞は
、リソソームに輸送される。細胞膜で形成されるAP-2小胞には、TGN38（Stephen
s、上記）及びリガンド結合TCR（Dietrich、前出）が含まれる。TGN38含有小胞
はTGNに輸送され、TCR含有小胞はリソソームに輸送される。

【０００７】 標的モチーフを含む分子が小胞に隔離されてパッケージングされた後、小胞は
好適な部位に輸送されなければならない。この輸送プロセスには、別の一連のタ
ンパク質が関与する。GTPアーゼのRabファミリーが、ある機構を介してこのプロ
セスに関与するが、その機構ははっきりとはわかっていない。それぞれが特定の
細胞小器官に関連する幾つかのRabタンパク質を記載する。例えば、Rab3は細胞
膜に関連し、Rab4はソーティングエンドソームに関連し、Rab11はリサイクリン
グエンドソームに関連する。Rabの中には細胞型や機能に特異的なものもある。
例えば、Rab3Aは刺激された神経細胞におけるシナプス小胞のエキソサイトーシ
スに特異的に関与し、Rab4はインスリン刺激を受けた脂肪細胞におけるグルコー
ス輸送体-4（GluT4）の転位置に関与する（James及びPiper、前出）。

【０００８】 新規のタンパク質輸送関連分子及びそれらをコードするポリヌクレオチドの発
見により、細胞増殖異常症及び分泌異常症の診断及び治療、予防に有用な新規の
組成物を提供することで当分野のニーズに答えることができる。

【０００９】 発明の要約 本発明は、総称して「PTAM」と呼ぶタンパク質輸送関連分子である実質的に精
製されたポリペプチドを提供する。本発明の一実施態様では、SEQ ID NO:1−8（
配列番号：1−8）及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を
含む実質的に精製されたポリペプチドを提供する。

【００１０】 更に本発明は、SEQ ID NO:1−8及びそれらの断片からなる一群から選択された
アミノ酸配列の少なくとも１つと９０％以上のアミノ酸同一性を有する実質的に
精製された変異体を提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:1−8及びそれらの断片
からなる一群から選択されたアミノ酸配を含むポリペプチドをコードする単離さ
れ実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:
1−8及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上のポリヌクレオチド
配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供する。

【００１１】 更に、本発明は、SEQ ID NO:1−8及びそれらの断片からなる一群から選択され
たアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと厳密な条件
の下でハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。ま
た本発明は、SEQ ID NO:1−8及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列を含
む単離され精製されたポリヌクレオチドとを提供する。

【００１２】 本発明はまた、SEQ ID NO:9−16及びそれらの断片からなる一群から選択され
たポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する
。また、本発明は、SEQ ID NO:9−16及びそれらの断片からなる一群から選択さ
れたポリヌクレオチド配列と９０％以上のポリヌクレオチド配列同一性を有する
単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供する。更に本発明は、SEQ
ID NO:9−16及びそれらの断片からなる一群から選択されたポリヌクレオチド配
列を含むポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離され精製されたポリヌク
レオチドを提供する。

【００１３】 本発明はまた、核酸を含むサンプルにおいて、ポリヌクレオチドを検出する方
法であって、（ａ）ポリヌクレオチド配列を、少なくとも１つのサンプルのポリ
ヌクレオチドとハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション複合体を形成する
過程と、（ｂ）そのハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを含み、そ
のハイブリダイゼーション複合体の存在とサンプルにおけるポリヌクレオチドの
存在とが相関性を有する、検出方法を提供する。本発明の一実施態様では、ハイ
ブリダイゼーションの前にポリヌクレオチドを増幅する過程を含む。

【００１４】 本発明は更に、SEQ ID NO:1−8及びそれらの断片からなる一群から選択された
アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１
つの断片を含む発現ベクターを提供する。別の実施態様では、発現ベクターは宿
主細胞内に含まれる 本発明はまた、ポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）ポリペプチドの
発現に好適な条件の下、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの断片を有する発現
ベクターを含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）その宿主細胞の培地からその
ポリペプチドを回収する過程とを含む製造方法を提供する。

【００１５】 本発明はまた、SEQ ID NO:1−8及びそれらの断片からなる一群から選択された
アミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を好
適な医薬用担体と共に提供する。

【００１６】 更に本発明は、SEQ ID NO:1−8及びそれらの断片からなる一群から選択された
ポリペプチドと結合する精製された抗体を提供する。また、本発明は、そのポリ
ペプチドの精製されたアゴニスト及びアンタゴニストを提供する。

【００１７】 本発明はまた、PTAMの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防
が必要な患者にSEQ ID NO:1−8及びそれらの断片からなる一群から選択されたア
ミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を好適
な医薬用担体と共に効果的な量投与することを含む、PTAMの発現または活性の低
下に関連した疾患の治療または予防方法を提供する。

【００１８】 本発明はまた、PTAMの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防
が必要な患者にSEQ ID NO:1−8及びそれらの断片からなる一群から選択されたア
ミノ酸配列を有するポリペプチドのアンタゴニストを効果的な量投与することを
含む、PTAMの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防方法を提供
する。

【００１９】 本発明の記載について 本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、こ
こに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更でき
ることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説
明する目的で用いられたものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、
本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい
。

【００２０】 本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」
は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って
、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体
は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。

【００２１】 本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、
本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。
本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての装置及び材料、方法は本発
明の実施及びテストに使用できるが、好適な装置及び材料、方法をここに記す。
本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に
記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用し
た。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈さ
れるものではない。

【００２２】 定義 本明細書において「PTAM」とは、天然、合成、半合成或いは組換え体など全て
の種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及び好ましくは人類を含む哺乳動
物）から得られる実質的に精製されたPTAMのアミノ酸配列のことである。

【００２３】 本明細書において「アゴニスト」とは、PTAMと結合したとき、PTAMの効果を増
大する、或いはその持続時間を延長する分子のことである。このアゴニストには
、PTAMに結合してその効果を変調するタンパク質、核酸、糖質、任意の他の分子
を含み得る。

【００２４】 本明細書において、「アレル変異配列」とは、PTAMをコードする遺伝子の別の
形である。アレル変異配列は、核酸配列における少なくとも１つの変異によって
生じ、変異ｍＲＮＡ若しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能は変
わる場合もあれば変わらない場合もある。天然或いは組換え体のすべての遺伝子
には、アレル形が存在しないもの、１つ或いは多数存在するものがある。一般に
アレル変異配列を生じる変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは置換
による。これらの各変異は、単独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配列内
で一回或いはそれ以上生じる。

【００２５】 本明細書において、PTAMをコードする「変異」核酸配列とは、様々なヌクレオ
チドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、PTAMと同じポヌクレオチド或いは
PTAMの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドのことである。この定義
には、PTAMをコードするポリヌクレオチド配列の正常の染色体の遺伝子座ではな
い位置でアレル変異配列と不適当或いは予期せずハイブリダイゼーション、及び
PTAMをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用い
て、容易に検出可能な或いは検出困難な多形性を含む。コードされたタンパク質
も変異され得り、サイレント変化を生じPTAMと機能的に等価となるアミノ酸残基
の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或い
は免疫学的にPTAMの活性が保持される範囲で、残基の極性、電荷、溶解度、疎水
性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。た
とえば、負の電荷をもつアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含み得
り、正の電荷をもつアミノ酸は、リジン及びアルギニンを含み得り、そして近い
親水性値をもち非電荷極性頭基を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、
バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン
、フェニルアラニン及びチロシンを含みうる。

【００２６】 本明細書において「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」とは、オリゴペプチド、
ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列及びその断片であり、天然の分子
または合成された分子である。PTAMの断片である「断片」及び「免疫原性断片」
、「抗原性断片」は、好ましくはアミノ酸約５〜約１５個の長さであり、最も好
ましくはアミノ酸１４個の長さであり、PTAMのある生物学的活性または免疫学的
活性を保持する。ここでは、「アミノ酸配列は自然発生タンパク質分子のアミノ
酸配列であるが、アミノ酸配列及び類似の用語は、列記したタンパク質分子に関
連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定されるわけではない。

【００２７】 本明細書において用語「増幅」とは、核酸配列の追加的な複製を生成すること
に関連する。増幅は、一般にはこの技術分野では周知のポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）技術を用いて行われる。

【００２８】 本明細書において、「アンタゴニスト」とは、PTAMと結合したとき、PTAMの生
物学的または免疫学的活性の効果の程度を低下させたり、その持続時間を短縮す
る分子である。アンタゴニストは、タンパク質、核酸、糖質、抗体またはPTAMの
効果を減少させるの他の分子である。

【００２９】 本明細書において「抗体」とは、Fab及びＦ(ab')₂、及びそれらの断片、Ｆｖ
断片などの無傷の分子であり、抗原決定基と結合可能である。PTAMポリペプチド
と結合する抗体は、抗体を免疫する目的の小さなペプチドを含む無傷の分子また
はその断片を用いて調整可能である。動物（例えば、マウス、ラット、若しくは
ウサギ）を免疫化するのに使用されるポリペプチド或いはオリゴペプチドは、Ｒ
ＮＡの翻訳から引き出されたり、化学的に合成され得り、必要に応じて担体プロ
テインと結合することも可能である。ペプチドと化学的に結合した一般に用いら
れる担体は、ウシ血清アルブミン、チログロビン、及びキーホールリンペットヘ
モニアン（ＫＬＨ）を含む。次ぎに、この結合したペプチドを用いて動物を免疫
化する。

【００３０】 本明細書において「抗原決定基」とは、特定の抗体と接触する分子のフラグメ
ント（即ちエピトープ）である。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主動
物を免疫化するのに用いられるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決定
基（タンパク質上の所定の領域或いは三次元構造体）に特異的に結合する抗体の
産生を誘発し得る。抗原決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、免
疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。

【００３１】 本明細書において「アンチセンス」とは、特定の核酸配列のセンス鎖と相補的
な核酸配列を含む全ての組成物である。アンチセンス分子は、合成や転写を含む
任意の方法で作り出すことができる。相補的ヌクレオチドは、一度細胞に導入さ
れると、細胞によって作られた天然の配列と結合して二重鎖を形成し、転写や翻
訳を阻害する。「マイナス（−）」という表現はアンチセンス鎖と言え、「プラ
ス（＋）」という表現はセンス鎖と言える。

【００３２】 本明細書において「生物学的活性」とは、自然発生分子の構造的、調節的、或
いは生化学的機能を有するタンパク質のことである。同様に、「免疫学的に活性
」とは、天然或いは組換え体のPTAM、合成のPTAMまたはそれらの任意のオリゴペ
プチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合
する能力のことである。

【００３３】 本明細書において「相補的」若しくは「相補性の」とは、許容の塩と許容の温
度条件の下で、塩基対の形成によってポリヌクレオチドが自然に結合することで
ある。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」と相補的な配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と結合する。
２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸が結合するのみの部分的な場合、
或いは一本鎖間に完全な相補性が存在して完全な相補性となる場合があり得る。
核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度
に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖間の結合に左右される増幅反応、並
びにペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の設計若しくは使用において特に重要である。

【００３４】 本明細書において「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定
のアミノ酸配列を含む組成物」とは広い意味で、所定のヌクレオチド配列或いは
アミノ酸配列を含む任意の組成物のことである。この組成物は、乾燥した製剤或
いは水溶液、無菌組成物を含み得る。PTAM若しくはPTAMの断片をコードするポリ
ヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用
され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化
剤と結合可能である。ハイブリダイゼーションにおいて、プローブは、塩（例え
ば、ＮａＣｌ）及び界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、その他の物質（例えば、デ
ンハート液、乾燥ミルク、サケ精子ＤＮＡ等）を含む水溶液に展開され得る。

【００３５】 本明細書において「コンセンサス配列」とは、不要な塩基を分離するために再
配列された核酸配列であって、ＸＬ−ＰＣＲ^ＴＭ（Perkin Elmer, Norwalk, CT
）を用いて５'及び／または３'の方向に延長されて再配列された核酸配列、或い
はGELVIEW Fragment Assembly system（GCG, Madison, WI）などのフラグメント
の構築のためのコンピュータプログラムを用いて２つ以上のインサイトクローン
社の重複配列から構築された核酸配列のことである。延長及び構築の両方によっ
てコンセンサス配列に構築されるものもある。

【００３６】 本明細書において「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」とは、ノーザ
ン分析によるPTAMをコードする核酸配列と同じ或いは関連する核酸の検出が、サ
ンプル内のPTAMをコードする核酸の存在を示すことから、PTAMをコードするポリ
ヌクレオチドからの転写物の発現と相関性を有することを意味する。

【００３７】 本明細書において「欠失」とは、１個以上のアミノ酸残基若しくは核酸残基が
欠如するアミノ酸配列若しくは核酸配列の変化である。

【００３８】 本明細書において「誘導体」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド
配列の化学修飾のことである。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、
アルキル基、アシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌ
クレオチドは、自然分子（未修飾の分子）の生物学的或いは免疫学的機能を少な
くとも１つ保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もと
のポリペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能を少なくとも１つ保持する
、グリコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによ
って修飾されたものである。

【００３９】 本明細書において「類似性」とは、相補性の程度を表すものである。これには
、部分的類似性と完全な類似性とがあり得る。この「同一性」は「類似性」とも
言える。同一の配列が標的の核酸とハイブリダイゼーションするのを少なくとも
部分的に阻止する部分的に相補的な配列は、「実質的に同様」と呼ばれる。完全
に相補的な配列と標的の配列とのハイブリダイゼーションの抑制は、厳密性を低
下させた条件の下ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロッティング或い
はノーザンブロッティング法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検査さ
れる。実質的に同様の配列或いはハイブリダイゼーションプローブは、厳密性を
低下させた条件の下、完全に相補的な配列と標的の配列との結合に対して競合し
て抑制する。これは、厳密性を低下させた条件では、２つの配列の互いへの結合
が特異的（即ち、選択的）に相互作用しなけらばならず、厳密性を低下させた条
件の下では非特異的な結合が許容されるということではない。部分的な相補性と
もいえない（例えば、３０％未満の類似性或いは同一性）第２の標的配列を用い
て、非特異的結合が存在しないことの検査が可能である。非特異的結合が存在し
ない場合は、実質的に類似配列或いはプローブが第２の非相補的標的配列とハイ
ブリダイゼーションしない。

【００４０】 本明細書において「百分率同一性」又は「％同一性」とは、２つ以上のアミノ
酸配列或いは核酸配列の比較で見つかった配列類似性の百分率のことである。こ
の百分率同一性は、例えば、MEGALIGNプログラム(DNASTAR, Madison WI)など電
子装置を用いて決定可能である。このMEGALIGNプログラムは、様々な方法、例え
ば、クラスター方法 (例えば、Higgins, D.G.及びP.M. Sharp (1988) Gene73:23
7-244.を参照)に従って、２つ以上の配列間のアライメントを作り出すことが可
能である。クラスターアルゴリズムが、全ての組の間の距離を測って、配列を各
クラスターに分類する。これらのクラスターは、組によって整列され、次ぎにグ
ループに分けられる。２つのアミノ酸の配列間の百分率類似性、例えば配列Ａと
配列Ｂの百分率類似性は、配列Ａと配列Ｂの一致する残基の合計数を、配列Ａの
長さから配列Ａのギャップ残基数と配列Ｂのギャップ残基数とを差し引いたもの
で除し、それに１００を掛けることによって得られる。２つのアミノ酸配列間の
低い類似性或いは非類似性のギャップは、百分率類似性の決定には含まれない。
核酸配列間の百分率同一性はまた、クラスター法或いはJotun Hein法などの当分
野で周知の別の方法によってカウント或いは計算することも可能である(例えば
、Hein. J. (1990) Methods Enzymol. 183:626-645.を参照)。配列間の同一性は
また、例えば、ハイブリダイゼーションの条件を変えるなどの当分野で周知の別
の方法によって決定することも可能である。

【００４１】 「ヒト人工染色体（ＨＡＣ）」は、６Ｋｂ〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を
含み得り、安定した分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状
の微小染色体である（Harrington, J.J.等 (1997) Nat Genet. 15:345-355を参
照）。

【００４２】 本明細書において「ヒト化抗体」とは、もとの結合能力を保持しつつよりヒト
の抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変異された抗体分子で
ある。

【００４３】 本明細書において「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の一本鎖が相補的な
一本鎖と塩基対を形成して結合する全てのプロセスである。

【００４４】 本明細書において「ハイブリダイゼーション複合体」とは、相補的な塩基対間
の水素結合の形成によって、２つの核酸配列間に形成された複合体のことである
。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中（例えば、Ｃ_０ｔまたはＲ_０ｔ分析）
で形成されるか、或いは溶液中の１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、
膜、フィルター、チップ、ピン、或いはスライドガラス、または細胞及びその核
酸を固定する任意の適当な基板）に固定されたもう一つの核酸配列との間で形成
され得る。

【００４５】 本明細書において「挿入」或いは「付加」とは、自然発生の分子の配列に対し
て、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸
配列或いは核酸配列の変化のことである。

【００４６】 本明細書において「免疫応答」とは、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症
、遺伝病などと関係する症状である。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に
影響を及ぼすサイトカイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子
の発現によって特徴づけられ得る。

【００４７】 本明細書において「マイクロアレイ」とは、基板上に配列された様々なポリヌ
クレオチドのアレイのことである。

【００４８】 本明細書のマイクロアレイの記述における「要素」或いは「アレイ要素」とは
、基板の表面に配列されたハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドのこ
とである。

【００４９】 本明細書において「変調」とは、PTAMの活性の変化のことである。変調の例と
して、PTAMのタンパク質活性の特性、或いは結合特性、またはその他の生物学的
特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化がある。

【００５０】 本明細書において「核酸」或いは「核酸配列」とは、ヌクレオチド、オリゴヌ
クレオチド、ポリヌクレオチド、或いはそれらの断片を指す。また、一本鎖若し
くは二本鎖のセンス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム若しくは合成起源のＤ
ＮＡ或いはＲＮＡと、またペプチド核酸（PNA）や任意のＤＮＡ様物質、ＲＮＡ
様物質も指す。本明細書において「断片（またはフラグメント）」とは、（例え
ば、同じゲノム内の任意の別の配列とは異なる）SEQ ID NO:9−16を特別に同定
する独特のポリヌクレオチド配列の領域を含む核酸配列のことである。例えば、
SEQ ID NO:9−16は、ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用であり、更に
、関連ポリヌクレオチド配列からSEQ ID NO:9−16を区別する類似性の検査にも
有用である。SEQ ID NO:9−16の断片は、少なくともヌクレオチド１５〜２０個
の長さである。この断片に対応するSEQ ID NO:9−16の正確な長さ及びSEQ ID NO
:9−16の領域は、断片の使用目的に基づいた当分野で一般的な技術の１つを用い
て日常業務的に決定できる。また、断片は翻訳された場合、完全長のポリペプチ
ドの抗原性などのいくつかの機能的特徴或いはＡＴＰ結合部位などの構造的ドメ
イン特徴を維持したポリペプチドを形成し得る。

【００５１】 本明細書において「機能的に関係した」及び「機能的に結合した」とは、機能
的に関係する核酸配列のことである。コードされたポリペプチドの転写をプロモ
ータが制御する場合、そのプロモーターはコードする配列と機能的に関係する或
いは機能的に結合する。機能的に関係した或いは機能的に結合した核酸配列は近
接して同じ読み枠内に存在し得るが、リプレッサー遺伝子などのある種の遺伝子
要素は、ポリペプチドをコードする配列とは近接して結合していないが、ポリペ
プチドの発現を調節するオペレーター配列とは結合したままである。

【００５２】 本明細書において「オリゴヌクレオチド」とは、ＰＣＲ増幅、ハイブリダイゼ
ーション、或いはマイクロアレイに使用可能な核酸配列のことであり、その長さ
は少なくとも６ヌクレオチドから６０ヌクレオチドである。好ましくは約１５か
ら３０ヌクレオチドであり、さらに好ましいくは約２０から２５のヌクレオチド
である。本明細書において、オリゴヌクレオチドは、当技術分野では同一と定義
される「アンプリマー」及び「プライマー」、「オリゴマー」と実質的に同じで
ある。

【００５３】 本明細書において「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）とは、末端がリジンで終わるア
ミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、約５ヌクレオチド以上の長さの
オリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤のことである。この
末端のリジンにより、この組成物が溶解性を有する。ＰＮＡは、相補的な一本鎖
ＤＮＡやＲＮＡに優先的に結合して転写物の伸長を止め、ポリエチレングリコー
ル化して細胞において寿命を延ばし得る。（例えば、Nielsen, P.E.他(1993) An
ticancer Drug Des. 8:53-63を参照）。

【００５４】 本明細書において「サンプル」とは、その最も広い意味で用いられている。PT
AMをコードする核酸若しくはその断片、PTAM自体を含むと推測される生物学的サ
ンプルには、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や細胞内小
器官、膜と、細胞と、溶液中又は固体の支持物に固定されたゲノムＤＮＡ，ＲＮ
Ａ，ｃＤＮＡと、組織又は組織プリント等も含まれ得る。

【００５５】 本明細書において「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、タンパク
質或いはペプチドとアゴニスト或いは抗体、アンタゴニストとの間の相互作用の
ことである。この相互作用は、結合する分子によって認識される、例えば、抗原
決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特定の構造の存在によって左右され
る。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していな
い標識した「Ａ」及びその抗体を含む反応において、エピトープＡを含むポリペ
プチドが存在するか或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と
結合する標識Ａの量が減少する。

【００５６】 本明細書において「厳密な条件」とは、ポリヌクレオチドと請求項に記載され
たポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な条件である。厳密な条
件は、塩濃度及び有機溶剤（例えば、ホルムアミド）の濃度、温度、及び当分野
で周知の別の条件によって決められる。詳細には、塩の濃度を下げたり、ホルム
アミドの濃度を上げたり、またハイブリダイゼーションの温度を上げることで厳
密性を高めることができる。

【００５７】 本明細書において「実質的に精製された」とは、自然の環境から取り除かれて
から、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合
している構成要素が少なくとも約６０％以上除去されたものであり、好ましくは
約７５％以上の除去、最も好ましいのは約９０％以上除去されたものである。

【００５８】 本明細書において「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそ
れぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。

【００５９】 本明細書において「基板」とは、膜、フィルター、チップ、スライド、ウエハ
、ファイバー、磁気或いは非磁気のビード、ゲル、管、プレート、ポリマー、微
細粒子、毛管を含む好適な固体或いは半固体の支持物のことである。基板は、ポ
リヌクレオチドやポリペプチドが結合する壁及び溝、ピン、チャンネル、孔など
の様々な表面形態を有する。

【００６０】 本明細書において「形質転換」とは、外来ＤＮＡが入り込み受容体細胞を変化
させるプロセスのことである。形質転換は、当分野で周知の種々の方法により、
自然或いは人工の条件の下で起こり得り、原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞の
中に外来核酸配列を挿入する任意の周知の方法によって行うことができる。この
形質転換の方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される。この
方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフェク
ション、及び微粒子照射が含まれるが、限定されるものではない。「形質転換さ
れた」細胞には、導入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして或いは
宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる
。さらに、限られた時間に一時的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現する細
胞も含まれる。

【００６１】 本命鎖書において「変異体」とは、一つ以上のアミノ酸が変異したアミノ酸配
列である。この変異体には、例えばロイシンとイソロシンとの置換のような、置
換されたアミノ酸が類似の構造或いは類似の化学特性を有する「保存的」変異が
含まれる。稀ではあるが、変異体には、グリシンをトリプトファンで置換する「
非保存的」変異も含まれる。また、類似の小さな変異には、アミノ酸の欠失、挿
入、或いはその両方が含まれる。当分野で周知の例えばＬＡＳＥＲＧＥＮＥ^ＴＭ ソフトウエアを用いて、生物学的或いは免疫学的活性を損なうことなく、どのア
ミノ酸残基を置換、挿入、或いは欠失させるかを決めることができるであろう。

【００６２】 ポリヌクレオチド配列の文脈の中で用いられる「変異配列」とは、PTAMに関連
したポリヌクレオチド配列を含み得る。この定義は、例えば、「アレル」、「ス
プライス」、「種」、「多形性」変異配列についてもあてはまる。スプライ変異
配列は基準分子と極めて同一性が高い可能性があるが、ｍＲＮＡプロセシング中
のエキソンの交互のスプライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなった
り、少なくなったりする。対応するポリペプチドは、機能ドメインが加わったり
、ドメインが減ったりし得る。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオチ
ド配列である。できたポリペプチドは、互いに高いアミノ酸同一性を有する。多
形性変異配列は、所定の種と種の間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列にお
ける変異である。多形性変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つの塩基が
異なる「１つのヌクレオチド多形性」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は、
例えば、或る集団、病態、病態の特徴を表し得る。

【００６３】 発明 本発明は、新規のヒトタンパク質輸送関連分子(PTAM)、及びPTAMをコードする
ポリヌクレオチドの発見に基づいた、細胞増殖異常症及び分泌異常症の診断及び
治療、予防におけるこれらの組成物の使用法に関する。

【００６４】 表１は、PTAMをコードする完全長のヌクレオチド配列を得るために用いたイン
サイト社クローンのリストである。列１及び列２は、アミノ酸配列及び核酸配列
の配列番号（SEQ ID NO）を示す。列３は、それぞれのPTAMをコードする核酸が
同定されたインサイト社クローンのクローンＩＤを示し、列４は、これらのクロ
ーンを単離したｃＤＮＡライブラリを示す。列５は、インサイト社クローン、そ
れぞれに対応するｃＤＮＡライブラリ、ショットガン配列を示す。各インサイト
社クローン及び各ショットガン配列は、各PTAMのコンセンサスヌクレオチド配列
の一部であるハイブリダイゼーション技術に有用である。

【００６５】 表２の各列は、本発明の各ポリペプチドの様々な特性を示す。列１はアミノ酸
の配列番号(SEQ ID NO)、列２はそれぞれのポリペプチドのアミノ酸残基の数、
列３及び列４はそれぞれ、潜在リン酸化部位、潜在グリコシル化部位を示す。列
５はサイン配列及びモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列６は、各タンパク質
の識別を示す。列７は各タンパク質の相同配列、列７は配列相同性及びタンパク
質モチーフによって各タンパク質を同定するために用いた分析方法をそれぞれ示
す。

【００６６】 表３の各列は、PTAMをコードするヌクレオチド配列の組織特異性及び関連する
疾患を示す。表３の列１はポリヌクレオチド配列番号を示す。列２は、PTAMを発
現する組織、及び全組織におけるその組織の発現割合を示す。列３は、PTAMを発
現する組織と関連する病気の分類を示す。列４は、ｃＤＮＡライブラリのサブク
ローニングに用いたベクターを示す。

【００６７】 以下に、PTAMをコードするヌクレオチド配列の固有の断片を示す。その断片に
は、SEQ ID NO:9の概ねヌクレオチド1324から1422までの断片と、SEQ ID NO:10
の概ねヌクレオチド455から499までの断片と、SEQ ID NO:11の概ねヌクレオチド
101から145までの断片と、SEQ ID NO:12の概ねヌクレオチド178から240までの断
片と、SEQ ID NO:13の概ねヌクレオチド543から590までの断片と、SEQ ID NO:14
の概ねヌクレオチド525から584までの断片と、SEQ ID NO:15の概ね371から433ま
での断片と、SEQ ID NO:16の概ねヌクレオチド86から145までの断片とが含まれ
る。

【００６８】 本発明はまた、PTAMの変異体を含む。PTAMの変異体は、PTAMのアミノ酸配列と
好ましくは約８０％以上の配列同一性、更に好ましくは約９０％以上の配列同一
性、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有し、PTAMの機能的特性或いは
構造的特性のうちの少なくとも１つを含む。

【００６９】 本発明はまた、PTAMをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施例にお
いて、本発明は、PTAMをコードするSEQ ID NO:9−16からなる一群から選択され
た配列を有するポリヌクレオチド配列を含む。

【００７０】 本発明はまた、PTAMをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳
細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、好ましくはPTAMをコー
ドするポリヌクレオチド配列と約７０％以上の配列同一性、更に好ましくは約８
５％以上の配列同一性、最も好ましくは約９５％以上の配列の同一性を有する。
また本発明の特定の実施態様では、SEQ ID NO:9−16からなる一群から選択され
た核酸配列と少なくとも約７０％の配列同一性、好ましくは約８５％以上の配列
同一性、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有するSEQ ID NO:9−16か
らなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。
上記の各ポリヌクレオチド変異配列のすべてが、PTAMの機能的或いは構造的特徴
の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。

【００７１】 遺伝暗号の縮重により作り出され得るPTAMをコードする種々のポリヌクレオチ
ド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最小の
類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。したが
って本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作り出
され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの組み
合わせは、自然発生のPTAMのポリヌクレオチド配列に適用される標準的なトリプ
レット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考慮する。

【００７２】 PTAMをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、好適に選択された厳
密な条件の下で、自然発生のPTAMのヌクレオチドとハイブリダイズ可能なことが
望ましいが、非自然発生のコドンを含めるなどの実質的に異なったコドンの使用
を有するPTAM又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有
益となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基づいてコドンを
選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞又は原核宿主に発生する割合を高め
ることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、PTAM及びその誘
導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、自然発生の
配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるＲＮＡ
転写物を作ることにある。

【００７３】 本発明はまた、PTAM及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列又はそれらの断片
を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、当分
野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何
れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、PTAMまたはその任意の断
片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。

【００７４】 更に本発明には、種々の厳密性条件の下で、請求項に記載されたポリヌクレオ
チド配列とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる。詳しくは、
記載のSEQ ID NO:9−16またはその断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチ
ド配列が含まれる。(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzy
mol. 152:399-407; 及び Kimmel. A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511.
を参照)。例えば、厳密な塩濃度は、通常は約７５０ｍＭ未満の塩化ナトリウム
と約７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、好ましくは約５００ｍＭ未満
の塩化ナトリウムと約５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、最も好まし
くは約２５０ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウ
ムである。例えば、ホルムアミドなどの有機溶剤を使用しないと、厳密性の低い
ハイブリダイゼーションになり、約３５％以上のホルムアミド、更に好ましくは
５０％以上のホルムアミドを使用すると、厳密性の高いハイブリダイゼーション
になる。温度の厳密条件は、通常は約３０℃以上であり、より好ましくは約３７
℃以上であり、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の変更できるパラメ
ーターには、ハイブリダイゼーション時間、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
などの薬品の濃度、キャリアＤＮＡの含有の有無があり、当分野の技術者には周
知である。必要な様々な条件を組み合わせることで、厳密性の程度を変えること
ができる。好適な実施例では、ハイブリダイゼーションは、温度が３０℃で、７
５０ｍＭの塩化ナトリウムと７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳで
行う。より好適な実施例では、温度が３７℃で、５００ｍＭの塩化ナトリウムと
５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド、１０
０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）で行う。最も好適な実施例で
は、温度が４２℃で、２５０ｍＭの塩化ナトリウムと２５ｍＭのクエン酸三ナト
リウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ
で行う。これらの条件の有用な変更は、当分野の技術者には明らかである。

【００７５】 ハイブリダイゼーションの後の洗浄過程にも、様々な厳密性の程度がある。洗
浄の厳密な条件は、塩濃度と温度によって決められる。上記したように、塩濃度
を下げること或いは温度を上げることで洗浄の厳密性を高めることができる。例
えば、洗浄過程での塩濃度の厳密な条件は、好ましくは約３０ｍＭ未満の塩化ナ
トリウムと約３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、更に好ましくは約１５
ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約１．５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。
洗浄過程の温度の厳密な条件は、通常は約２５℃以上であり、好ましくは約４２
℃以上であり、更に好ましくは約６８℃以上である。好適な実施例では、洗浄過
程は、温度が２５℃で、３０ｍＭの塩化ナトリウムと３ｍＭのクエン酸三ナトリ
ウム、０．１％ＳＤＳで行われる。より好適な実施例では、洗浄過程は、温度が
４２℃で、１５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０
．１％ＳＤＳで行われる。最も好適な実施例では、洗浄過程は、温度が６８℃で
、１５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１％Ｓ
ＤＳで行われる。更なるこれらの条件の変更は、当分野の技術者には明らかであ
る。

【００７６】 当分野で周知のＤＮＡのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施
例も実行可能である。この方法には、例えばＤＮＡポリメラーゼIのクレノウ断
片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin E
lmer）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech Piscataway N
J）、或いはELONGASE増幅システム(Life Technologies, Gaithersburg MD)にみ
られるような校正エキソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素
が用いられる。好ましくは、MICROLAB2200（Hamilton, Reno, NV）、Peltier Th
ermal Cycler（PTC200；MJ Research, Watertown MA）、ABI CATALYST 800 (Per
kin-Elmer) を用いて自動化する。次に、ABI 373または377 DNAシークエンシン
グシステム(Perkin-Elmer)、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Mole
cular Dynamics. Sunnyvale CA)を用いてシークエンシングを行う。得られた配
列を当分野で周知の様々なアルゴリズムを用いて分析する(例えば、Ausubel, F.
M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New Y
ork NY, unit 7.7; Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnolog
y, Wiley VCH, New York NY, pp. 856-853.を参照)。

【００７７】 部分的なヌクレオチド配列を利用し、当分野で周知のＰＣＲ法をベースにした
種々の方法を用いてPTAMをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節要
素などの上流にある配列を検出する。例えば制限部位ＰＣＲ法を利用する１つの
方法では、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを用いてクローニングベ
クター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する。（例えば、Sarkar, G. (19
93) PCR Methods Applic 2:318-322を参照）。逆ＰＣＲ法を用いる別法では、広
範な方向に伸長して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライマーを用い
る。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限断片に由
来する。（例えば、Triglia, T.等（1988）Nucleic Acids Res. 16:8186を参照
）。キャプチャＰＣＲ法を用いる第３の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮ
Ａの既知の配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む。（例えば、Lagerstr
om, M.他（1991）PCR Methods Applic 1:111-119を参照）。この方法では、多数
の制限酵素による消化及びライゲ−ションを用いて、ＰＣＲを行う前に未知の配
列の領域の中に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、当分野で
周知の別の方法を用いて未知の配列を得ることも可能である。(例えば、Parker,
J.D. 他 (1991)Nucleic Acids Res. 19:3055-3060を参照)。更に、ＰＣＲ、ネ
スト化プライマー、PROMTERFINDERライブラリを用いれば、ゲノムＤＮＡ内の歩
行が可能である（Clontech, Palo Alto CA）。この方法ではライブラリをスクリ
ーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を探すのに有用である。
全てのＰＣＲ法をベースにした方法では、プライマーは、市販のOLIGO 4.06 Pri
mer Analysis software（National Biosciences社, Plymouth MN）或いは別の好
適なプログラムなどを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５
０％以上、約６８℃〜７２℃の温度で鋳型に対してアニールするよう設計される
。

【００７８】 完全長ｃＤＮＡのスクリーニングのときは、大きなｃＤＮＡを含むようにサイ
ズが選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴｄ（Ｔ）ライブ
ラリが完全な長さのｃＤＮＡを産生できない場合は、遺伝子の５'領域を有する
配列を含むものが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用である
。ゲノムライブラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。

【００７９】 市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣ
Ｒ産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは
、キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリ
マー、及び４つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光
色素、放出された波長の検出に利用するＣＣＤカメラを使用することが可能であ
る。出力／光強度は、適切なソフトウェア（例えば、GENOTYPER 及び SEQUENCE
NAVIGATOR, Perkin-Elmerを参照）を用いて電気信号に変換され、サンプルのロ
ーディングからコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュ
ータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存
在しない場合もあるＤＮＡの小片のシークエンシングに特に適している。

【００８０】 本発明の別の実施例では、PTAMをコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を組換えＤＮＡ分子に用いて、適切な宿主細胞内にPTAM、その断片または機
能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の宿重により、実質的
に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列が作られ
得り、これらの配列をPTAMのクローン化及び発現に利用可能である。

【００８１】 種々の目的でPTAMをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知られ
ている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この
目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセシング及び／または発現の調節が含
まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるＤＮＡの混
合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再組み立てを用いて、ヌクレ
オチド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの仲介による定
方向突然変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入、グリ
コシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライスバリアントの生成等が
可能である。

【００８２】 別の実施例によれば、PTAMをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を
用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.等（1980
）Nucl. Acids Res. Symp. Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acid
s Res. Symp. Ser.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてPTAM自体
またはその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の固
相技術を用いて実行可能である（例えば、Roberge, J.Y.等(1995) Science 269:
202-204を参照）。また、合成の自動化は例えばABI 431Aペプチドシンセサイザ
（Perkin Elmer）を用いて達成し得る。更にPTAMのアミノ酸配列または任意のそ
の一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他のタン
パク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、変異体ポリペプ
チドを作ることが可能である。

【００８３】 このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Chiez, R.M.
及び F.Z. Regnier (1990)Methods Enzymol. 182:392-421を参照)を用いて実質
的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシーク
エンシングにより確認することができる(例えば、Creighton. T. (1983) Protei
ns, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York, NYを参照)
。

【００８４】 生物学的に活性なPTAMを発現させるために、PTAMをコードするヌクレオチド配
列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクターは、好
適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な要素を含
む。これらの要素には、ベクター及びPTAMをコードするポリヌクレオチド配列に
おけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、５'及び３'の非翻
訳領域などの調節配列が含まれる。このような要素は、その長さ及び特異性が様
々である。特定の開始シグナルによって、PTAMをコードする配列のより効果的な
翻訳を達成することが可能である。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドン
及びコザック配列などの近傍の配列が含まれる。PTAMをコードする配列及びその
開始コドン、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる
転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要なくなるであろう。しかしながら、
コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのＡＴ
Ｇ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれなければ
ならない。外来性の翻訳要素及び開始コドンは、自然及び合成の様々なものから
得ることが可能である。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含
めることで発現の効率を高めることが可能である。(例えば、Scharf, D. 他 (19
94) Results Probl. Cell Differ. 201−8-162.を参照)。

【００８５】 当業者に周知の方法を用いて、PTAMをコードする配列、好適な転写及び翻訳調
節要素を含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、in
vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる
。(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manu
al, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章, 及び１6-17章; 及
び Ausubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley & Sons, New York NY, ch. 9章及び13章、16章を参照)。

【００８６】 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、PTAMをコードする配列の保持及び発
現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオファ
ージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌な
どの微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発現ベ
クター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベ
クター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウ
イルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プ
ラスミド）で形質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる。本発明
は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。

【００８７】 細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、PTAMをコード
するポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、PTAMを
コードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、
増殖には、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはpSPORT１プラスミド(G
IBCO BRL)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多
数のクローニング部位にＨＬＯＲをコードする配列をライゲーションするとlac
Ｚ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色
スクリーニング法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クローニン
グされた配列のin vitroでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパーファ
ージによる一本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である。(例
えば、Van Heeke, G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509
.を参照)。例えば、抗体の産生のためなどに多量のPTAMが必要な場合は、PTAMの
発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現を誘発
するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使用でき
る。

【００８８】 PTAMの発現に酵母の発現系の使用が可能である。α因子やアルコールオキシダ
ーゼやＰＧＨなどの構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多種のベクターが
,、酵母菌サッカロミセス−セレビジエまたはPichia pastorisに使用可能である
。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持の
どちらかを誘導し、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む
。(例えば、上記のAusubel.; 及び Grant 他 (1987) Methods Enzymol.153:51-7
94: Scorer. C. A. 他 (1994) Bio/Technology 12:181-184.を参照) 植物系もPTAMの発現に使用可能である。PTAMをコードする配列の転写は、例え
ば、ＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーター
が単独で、或いはＴＭＶ（Takamatsu, N.等（1987）EMBO J 6:307-311）由来の
オメガリーダー配列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直接のＤＮ
Ａ形質転換或いは病原体を介したトランスフェクションによって、植物細胞の中
に導入可能である。（例えば、McGraw Hill Yearbook of Science and Technolo
gy（1992）McGraw Hill NY, pp.191-196を参照）。

【００８９】 哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウ
イルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダ
ー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にPTAMをコードする配列を結
合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により、感
染した宿主細胞にPTAMを発現する生ウイルスを得ることが可能である（Logan, J
.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照）。さら
に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて
、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タンパク質を
高レベルで発現させるために、ＳＶ４０またはＥＢＶを基にしたベクターを用い
ることが可能である。

【００９０】 ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているも
のより大きなＤＮＡの断片を供給可能である。治療のために約６ｋｂ〜１０Ｍｂ
のＨＡＣｓを作製し、従来の輸送方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマ
ー、またはベシクル）で供給する。(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Nat
Genet.15:345-355.を参照)。

【００９１】 哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞にお
けるPTAMの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、PTAMをコ
ードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような発現ベク
ターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現要素や、同じ或いは別の
ベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後、細胞を選択培
地に移す前に、強化培地で約１〜２日の間増殖させる。選択マーカーの目的は選
択的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により導入された配列
をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細
胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて増殖可能である
。

【００９２】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能であ
る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ
、それぞれtk⁻又はapr⁻細胞において使用される。(例えば、Wigler, M. 他 (1
977) Cell 11:223-232; 及びLowy, I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また
代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いること
ができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグ
リコシッドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロル
スルフロン（chlorsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラー
ゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える(例えば、Wigl
er, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570; Colbere-Garapin,
F. 他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14を参照)。さらに選択に利用できる遺伝子
、例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるtrpB及びhisDが文献に記載さ
れている（例えば、Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan（1988）Proc. Natl. Acad
. Sci. 85:8047-51を参照）。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；C
lontech)、βグルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ，ルシフェラーゼ及びその基
質ルシフェリンなどの可視マーカーが用いられる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ
）(Clontech, Palo Alto, CA)も使用できる。これらのマーカーを用いて、トラ
ンスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或
いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である（例えば、Rhodes, C.
A.他（1995）Methods Mol. Biol. 55:121−791を参照）。

【００９３】 マーカー遺伝子の発現の存在／不在によって目的の遺伝子の存在が示されても
、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、PTAMをコード
する配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、PTAMをコードする配列を
含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能である。
または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がPTAMをコードする配列
と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子
の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。

【００９４】 一般に、PTAMをコードする核酸配列を含み、PTAMを発現する宿主細胞は、当業
者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方法には、
ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや、ＰＣＲ法、核
酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベース、或い
はチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイ
が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【００９５】 特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるPT
AMの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。この
ような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオ
イムノアッセイ（RIA）、蛍光標示式細胞分取器（FACS）などがある。PTAM上の
２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノ
クローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）
が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及
びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている。(例えば、 Hampton. R
. 他.(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul
. MN, Sect. IV; Coligan, J. E. 他Current Protocols in Immunology, Greene
Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York. NY; 及びPound, J.D. (
1990) Immunochemical Protocols, Humans Press, Totowa NJ)。

【００９６】 種々の標識方法及び結合方法が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイお
よびアミノ酸アッセイに用いられ得る。PTAMをコードするポリヌクレオチドに関
連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或い
はＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーショ
ン、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる
。別法として、PTAMをコードする配列、またはその任意の断片をｍＲＮＡプロー
ブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。当分野では
周知であり市販されているこのようなベクターを、Ｔ７，Ｔ３，またはＳＰ６な
どの好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によって、in
vitroでのＲＮＡプローブの合成に用いることができる。これらの方法は、例え
ば、Amersham Pharmacia Biotech及びPromega（Madison WI）、U.S. Biochemica
l Corp（Cleveland OH）が市販する種々のキットを用いて行うことができる。容
易な検出のために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、コファ
クター、インヒビター、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤
、色素産生剤などが含まれる。

【００９７】 PTAMをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地で
のこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件の下で培養される。形質転換され
た細胞から産生されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用され
るその配列及び／またはそのベクターによる。PTAMをコードするポリヌクレオチ
ドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するPTAMの分泌を誘
導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。

【００９８】 更に、挿入した配列の発現調節能力または発現したタンパク質を所望の形にプ
ロセシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチド
の修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（
lipidation）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。
タンパク質の「prepro」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タ
ンパク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の
活性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ種種の宿主細胞（例えば
、CHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38）がAmerican Type Culture Collection（ATC
C; Bethesda, MD）より入手可能であり、外来のタンパク質の正しい修飾及びプ
ロセシングを確実にするために選択される。

【００９９】 本発明の別の実施例では、PTAMをコードする自然或いは変更された、または組
換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種配列
に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメラPT
AMタンパク質が、PTAMの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリのスク
リーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分が、
市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部分
には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク
質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢ
Ｐ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）が含まれるが、
これらに限定されるものではない。ＧＳＴ及びＭＢＰ、Ｔｒｘ、ＣＢＰ、６−Ｈ
ｉｓによって、固定されたグルタチオン、マルトース、フェニルアルシン酸化物
（phenylarsine oxide）、カルモジュリン、金属キレート樹脂のそれぞれで同族
の融合タンパク質の精製が可能となる。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、及び赤血球凝集素
（ＨＡ）によって、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクロ
ナール抗体及びポリクロナール抗体を用いた融合タンパク質の免疫親和性の精製
ができる。また、PTAMをコードする配列と異種タンパク質配列との間にあるタン
パク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作すると、PTAMが精
製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現と精製の方法は、Au
subel. (1995、前出 ch 10).に記載されている。市販されている様々なキットを
用いて、融合タンパク質の発現及び精製を促進できる。

【０１００】 本発明の別の実施例では、ＴＮＴウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽
抽出系(Promega)を用いてin vitroで放射能標識したPTAMの合成が可能である。
これらの系は、Ｔ７またはＴ３、ＳＰ６プロモーターと機能的に結合したタンパ
ク質をコードする配列の転写と翻訳をつなげる。翻訳は、好ましくは^３５Ｓメチ
オニンである放射能標識されたアミノ酸前駆体の存在の下で起こる。

【０１０１】 PTAMの断片は、組換え生成物だけでなく固相技術を用いて直接的なペプチド合
成によって作製され得る(例えば、前出のCreighton, pp. 55-60.を参照)。タン
パク質の合成は、手動或いは自動で行われ得る。自動合成は、例えば431Aペプチ
ドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行うことが可能である。PTAMの種々の
断片は別々に合成して、次ぎに結合させて完全長分子を生成する。

【０１０２】 治療 例えば、配列及びモチーフにおける化学的及び構造的類似性が、PTAMとタンパ
ク質輸送関連分子との間に存在する。更に、PTAMの発現は、細胞増殖と密接な関
係がある。従ってPTAMの発現または活性が低下する細胞増殖異常症及び分泌異常
症の治療において、PTAMの発現または活性を増大させることが望ましい。また、
PTAMの発現または活性が増大する細胞増殖異常症及び分泌異常症の治療において
、PTAMの発現または活性を低下させることが望ましい。

【０１０３】 従って、一実施例において、PTAMの発現または活性が低下する細胞増殖異常症
または分泌異常症に関連する疾患の治療または予防のために、患者にPTAMまたは
その断片や誘導体を投与することが可能である。このような疾患の例には、癌が
含まれ、その中には腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌
などがあり、詳しくは副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、
消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、
唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、また、免疫異常
症も含まれ、その中には日光性角化症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び
副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症
、貧血、動脈硬化、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自
己免疫性甲状腺炎、気管支炎、滑液包炎、胆嚢炎、硬変、接触皮膚炎、クローン
病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、赤芽球症、結節性紅斑、萎
縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲
状腺炎、発作性夜間血色素尿症、肝炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、リ
ンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、混合型結合織病（MCTD）、多発性硬化症、
重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨髄線維症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎
、真性多血症、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症
、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全
身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候
群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及び細菌感染症、真菌感
染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が含まれ、また、分泌異
常症も含まれ、その中には、嚢胞性線維症及びグルコース‐ガラクトース吸収不
全症候群、高コレステロール血症、尿崩症、高血糖及び低血糖、甲状腺腫、クッ
シング病、また、枯草熱及び喘息、じんま疹を含むアレルギーなどの小胞輸送異
常に関連するその他の症状、自己免疫性溶血性貧血、チェディアック‐東症候群
、毒素ショック症候群が含まれるが、ここに列記したものに限定されるわけでは
ない。

【０１０４】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した異常症を含む疾患の治
療または予防のために、PTAMまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを患
者に投与することも可能である。

【０１０５】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した異常症を含む疾患
の治療または予防のために、実質的に精製されたPTAMを含む医薬品組成物を好適
な医薬用担体と共に患者に投与することも可能である。

【０１０６】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した異常症を含む疾患
の治療または予防のために、PTAMの活性を調節するアゴニストを患者に投与する
ことも可能である。

【０１０７】 更なる実施例では、PTAMの発現または活性が増大する疾患の治療または予防の
ために、患者にPTAMのアンタゴニストを投与することが可能である。このような
疾患の例には、限定されるものではないが、上記した異常症を含む疾患が含まれ
る。一実施態様では、PTAMと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして
、或いはPTAMを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶ標的或いは運搬機構として
間接的に用いられ得る。

【０１０８】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した異常症を含む疾患の治
療または予防のために、PTAMをコードするポリヌクレオチドの相補体を発現する
ベクターを患者に投与することも可能である。

【０１０９】 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与すること
もできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療
薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の
治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤
で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。

【０１１０】 PTAMのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能
である。詳しくは、精製されたPTAMを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラ
リをスクリーニングしてPTAMと特異的に結合するものを同定が可能である。PTAM
の抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このよう
な抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、
Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリによって作られたフラグメント
が含まれる。但し、これらに限定されるものではない。治療用には、中和抗体（
即ち、二量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。

【０１１１】 抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のも
のを含む種々の宿主が、PTAMまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備える
そのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々の
アジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバント
にはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバ
ント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳
剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界面活
性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるアジュ
バントの中では、ＢＣＧ（bacilli Calmette-Guerin）及びCorynebacterium par
vumが特に好ましい。

【０１１２】 PTAMに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、ま
たは断片は、約５以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列が望ましく、更に望まし
いのは約１０以上のアミノ酸からなるものである。これらのオリゴペプチド或い
はペプチド、またはそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と
同一であることが望ましく、小さな自然発生の分子のアミノ酸配列全体も含む。
PTAMアミノ酸の短い伸展部は、ＫＬＨなどの別のタンパク質の配列と融合し、キ
メラ分子に対する抗体が産生され得る。

【０１１３】 PTAMに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体
分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技術に
は、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶ−ハイブ
リドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Kohler
, G. 等. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. 等. (1985) .J. Immunol. M
ethods 81−8-42; Cote, R.J. 等. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-20
30; Cole, S.P. 等. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120を参照）。

【０１１４】 更に、「キメラ抗体」の作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺
伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を
備える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604
-608; Takeda, S.等. (1985) Nature 314:452,454を参照）。別法では、当分野
で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、
PTAM特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオタイ
プの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから鎖混
合によって生成することもできる（例えば、Burton D.R. (1991) Proc. Natl. A
cad. Sci. 88:11120-3を参照）。

【０１１５】 抗体は、リンパ球集団の中のin vivo生成を誘発することによって、または免
疫グロブリンライブラリのスクリーニング又は文献に示されているような、高度
に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、産生すること
もできる（例えば、Orlandi, R. 他. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833
-3837; Winter, G. 他. (1991) Nature 349:293-299を参照）。

【０１１６】 PTAMに対する特異的な結合部位を含む抗体も産生することができる。例えば、
このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）
２断片と、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減じることによって生成さ
れるＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では、Ｆ
ａｂ発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクローナルＦ
ａｂ断片の迅速且つ容易な同定が可能となる（例えば、Huse, W.D. 等. (1989)
Science 254:1275-1281を参照）。

【０１１７】 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプ
ロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、PTAM
とその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性PTAMエ
ピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナル
ベースのイムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイも利用することがで
きる(Pound、前出）。

【０１１８】 本発明の別の実施例では、PTAMをコードするポリヌクレオチド、またはその任
意の断片または相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施形態で
は、PTAMをコードするポリヌクレオチドの相補配列がｍＲＮＡの転写を阻止する
のに好適である場合、これを使用することができる。特に細胞は、PTAMをコード
するポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換することもできる。したがって
、相補的分子または断片は、PTAMの活性の調節、または遺伝子機能の調節のため
に使用することができる。このような技術は当分野では周知であり、センスまた
はアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、PTAMをコードする配列
の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である
。

【０１１９】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス又はワクシニア、又は様々な細菌
性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的の器官、組
織又は細胞集団に運ぶこともできる。当業者に周知の方法を用いてPTAMをコード
ポリヌクレオチドと相補的な核酸配列を発現するベクターを作製することができ
る(例えば、前出のSambrook 他、及び前出のAusubel 他によるものを参照)。

【０１２０】 PTAMをコードする遺伝子は、PTAMをコードするポリヌクレオチド又はその断片
を高いレベルで発現する発現ベクターで、細胞又は組織を形質転換することによ
って止めることができる。このような作製物を用いて翻訳できないセンス又はア
ンチセンス配列を細胞の中に導入することができる。ＤＮＡの中に組み入れられ
ない場合でも、このようなベクターは内在性のヌクレアーゼによって機能が損な
われるまでｍＲＮＡ分子を転写し続ける。非複製ベクターでも一過性の発現を一
ヶ月以上に亘って続け、好適な複製要素がベクター系の一部である場合はさらに
長く持続し得る。

【０１２１】 上記した通り、遺伝子の発現は、PTAMをコードする遺伝子の制御５’または調
節領域に対する相補的な配列またはアンチセンス分子（ＤＮＡ或いはＲＮＡ、Ｐ
ＮＡ）を設計することによって調節することができる。転写開始部位、即ち開始
部位から−１０と＋１０との間の領域に由来するオリゴヌクレオチドが好適であ
る場合と同様に、「三重らせん」と塩基対合法を用いて阻止することができる。
三重らせん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結
合のために十分に広がるのを阻止するため有益である。三重式ＤＮＡを用いる最
近の治療の進歩は文献に記載されている（例えば、Gee, J.E. 等. (1994) In: H
uber, B.E. 及び B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura
Publishing Co., Mt. Kisco, NYを参照）。相補的な配列またはアンチセンス分
子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮＡの
翻訳を阻止するように設計できる。

【０１２２】 酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために
用いることができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的ＲＮＡへのリボ
ザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断
が続く。例えば、PTAMをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且つ効
果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。

【０１２３】 任意の潜在的ＲＮＡ標的の中の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列Ｇ
ＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキ
ャニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含
む標的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮ
Ａ配列を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について
評価することが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセ
イを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性
をテストすることによって評価することが可能である。

【０１２４】 本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用い
て、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホ
スホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含ま
れる。別法では、ＲＮＡ分子がin vitro及びin vivoでPTAMをコードするＤＮＡ
配列の転写によって生成され得る、このようなＤＮＡ配列はＴ７またはＳＰ６等
の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組み入
れることが可能である。別法では、相補的なＲＮＡを構成的または誘導的に合成
するこれらのｃＤＮＡ作製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入すること
ができる。

【０１２５】 ＲＮＡ分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くす
ることができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフラン
キング配列の追加、または分子のバックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合
よりむしろホスホロチオネート又は２’Ｏメチルの使用が含まれる、がこれらに
限定されるものではない。ＰＮＡの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌ
クレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミ
ン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけで
なく、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（wybutosine）
などの従来のものでない塩基を含めることによって、これらの分子の全体に拡大
することができる。

【０１２６】 ベクターを細胞又は組織に導入する多数の方法が利用でき、in vivo、in vitr
o、及びex vivoでの使用に等しく適している。ex vivoでの治療の場合、患者か
ら採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すため
にクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリ
カチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行するこ
とができる（例えば、Goldman, C.K. 他. (1997) Nature Biotechnology 15:462
-66:を参照）。

【０１２７】 上記したいかなる治療方法も、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル
、及び最も好ましいヒトなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適
用できる。

【０１２８】 本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる
担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬品組成物
は、PTAM、PTAMに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、又はPTAMの
インヒビターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤などの１種類
以上の別の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与することができる。
このような医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、及び水などが
含まれるがこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独或いは薬物又
はホルモンなどの別の薬剤と共に投与することができる。

【０１２９】 本発明に用いられる医薬品組成物は、任意の数の経路を用いて投与することも
できる。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内
、心室内、経皮性、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、異所性、舌下、または直腸が
含まれるがこれらに限定されるものではない。

【０１３０】 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物には、活性化合物を医薬的に使
用可能な薬剤にするのを容易にする、医薬品添加物及び補助剤を含む好適な薬学
的に認められる担体が含まれ得る。製剤及び投与についての詳しい技術について
は、最新版のRemington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing, PA)に
記載されている。

【０１３１】 経口投与用の医薬品組成物が、経口投与に好適な投与量において当分野で周知
の薬学的に許容される担体を用いて、製剤することができる。このような担体に
より、医薬品組成物が患者が摂取するために、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、
液体、ゲル状、シロップ剤、泥状物、懸濁液として製剤される。

【０１３２】 経口用に用いられる医薬品は、活性化合物と固体の薬品添加物とを混合し、得
られた顆粒の混合物を処理して、（所望に応じてすりつぶした後）タブレット或
いは糖衣錠コア（dragee cores）にする。好適な医薬品添加物とは、ラクトース
、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小
麦、米、ジャガイモ、又はその他の植物からのでんぷん、メチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウ
ムなどのセルロース、アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、ゼラチン
及びコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物又はタンパク質賦形剤である。
必要に応じて、例えば、架橋結合したポリビニルピロリドン、かんてん、アルギ
ン酸、またはその塩であるアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤が
加えられる。

【０１３３】 糖衣錠コアは、濃縮糖溶剤などの好適なコーティングと共に用いられる。この
ような濃縮糖溶剤には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボ
ポルゲル（carbopol gel）、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタ
ン、ラッカー溶剤、及び好適な有機溶媒または混合溶剤などが含まれ得る。染料
または色素が、製品の識別又は活性化合物の量、即ち薬用量を示すため、錠剤ま
たは糖衣錠に加えられる。

【０１３４】 経口用に用いられる医薬品製剤には、ゼラチンから作られたプッシュ−フィッ
ト型のカプセル、グリセロールまたはソルビトールなどのコーティングとゼラチ
ンからなる封入されたカプセルが含まれる。プッシュ−フィット型のカプセルに
は、ラクトース又はスターチなどの賦形剤や結合材、タルク又はステアリン酸マ
グネシウムなどの潤滑剤、所望に応じて安定剤と混合された活性処方成分が含ま
れる。ソフトカプセルでは、活性化合物が、安定剤と共に或いは安定剤なしで、
脂肪油、溶液、またはポリエチレングリコール溶液などの好適な溶液に溶解或い
は懸濁され得る。

【０１３５】 非経口投与用に好適な医薬品剤が、水溶液で製剤されるが、ハンクス液、リン
ガー液、生理緩衝食塩水などの生理学的に適合性のある緩衝剤が好ましい。水性
懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデ
キストランなどの懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性化合物の懸
濁液は、好適な油性注入懸濁液として製剤され得る。好適な親水性溶液または媒
体には、ごま油などの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド又はリボソー
ムなどの合成脂肪酸が含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、運搬目
的で使用される。随意選択により、懸濁液は高濃度の溶液が可能となるよう化合
物の溶解性を高める好適な安定剤または薬剤を含み得る。

【０１３６】 局部または鼻腔投与のため、特定の障壁に浸透する好適な浸透剤が製剤に用い
られる。このような浸透剤は当業者には周知である。

【０１３７】 本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の方法、例えば従来の混合、溶解、顆
粒化、糖衣化、溶離（levigating）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥
処理を用いて製造され得る。

【０１３８】 医薬品組成物は塩類として製剤され、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸と共に形成可能である。塩分は対
応する遊離塩基系よりも、水溶剤または他のプロトン溶剤に溶けやすい。別の場
合の好ましい薬剤の形態には、１から５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スク
ロース、及び２〜７％マンニトールの幾つか或いは全てを含み、ｐＨの範囲が４
．５〜５．５であり、使用前に緩衝剤と結合する凍結乾燥粉末を用いることがで
きる。

【０１３９】 医薬品組成物が調合された後、それらは適当な箱に詰められ、指定した症状の
薬としてラベルが貼られる。PTAMの投与のため、このようなラベルには、量、頻
度、及び投与の方法が含まれるであろう。

【０１４０】 本発明に用いる好適な医薬品組成物には、目的を達成するため、効果的な量の
活性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、自分の能力で十分に効果的な
服用量を決めることができる。

【０１４１】 どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍
細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができ
る。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタなどが用いられる
。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることが
できる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定す
ることができる。

【０１４２】 医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばPTAM又はその
断片、PTAMの抗体、PTAMのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど
の活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば、ＥＤ_５０（
服用に対して集団の５０％に医薬的効果がある）またはＬＤ_５０（服用に対して
集団の５０％に致命的である）統計を計算するなど、細胞培養または動物実験に
おける標準的な薬剤手法によって決定することができる。毒性効果と治療効果と
の薬用量比は治療指数であり、ＥＤ_５０／ＬＤ_５０と示すことができる。高い治
療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得ら
れたデータが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するのに用いられる
。このような組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ＥＤ_{５ ０} を含む血中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられる投与形態
及び患者の感受性、投与の経路によって、この範囲内で様々である。

【０１４３】 正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって
決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるた
め或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮され
るものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の
性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答
が含まれる。作用器官が長い医薬品組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度
、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投
与され得る。

【０１４４】 通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約０．１〜１００，０００μｇ
までの最大約１グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダ
ンスは文献に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することがで
きる。当業者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製
剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの運搬は、
特定の細胞、状態、位置などに対して特異的であろう。

【０１４５】 診断 別の実施例では、PTAMに特異的に結合する抗体が、PTAMの発現によって特徴付
けられる細胞増殖異常症及び分泌異常症の診断、またはPTAMやPTAMのアゴニスト
またはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするた
めのアッセイに用いることが可能である。診断に有用な抗体は、治療のところで
記載した方法と同じ方法で製剤される。PTAMの診断アッセイには、抗体及び標識
を用いてヒトの体液或いは細胞や組織から採取されたものからPTAMを検出する方
法が含まれる。これらの抗体は、修飾をして或いはしないで使用され、レポータ
ー分子の共有結合性或いは非共有結合性の接着によって標識化され得る。当分野
で周知の種々のレポーター分子が用いられるが、その内の幾つかは上記した。

【０１４６】 PTAMを測定するためのＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，及びＦＡＣＳを含む種々のプロト
コルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのPTAMの発現を診
断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なPTAMの発現の値は、複合体
の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、好ましくはヒトである被験者から採
取した体液または細胞とPTAMに対する抗体とを結合させることによって決定する
。標準的な複合体形成の量は種々の方法で定量され得るが、測光法（photometri
c）が好ましい。被験者のPTAMの発現の量、制御及び疾患、生検組織からのサン
プルが標準値と比較される。標準値と被験者との間の偏差が、疾患を診断するパ
ラメーターとなる。

【０１４７】 別の実施例によれば、PTAMをコードするポリヌクレオチドを診断のために用い
ることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、
相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドを用
いて、疾患と相関し得るPTAMを発現する生検組織における遺伝子の発現を検出及
び定量する。この診断アッセイを用いて、PTAMの不在、存在、及び過度の発現を
調べ、治療中のPTAMレベルの制御を監視する。

【０１４８】 ある実施形態では、PTAMまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含むポリ
ヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーション
によって、PTAMをコードする核酸配列を同定することが可能である。例えば５'
調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであるやや特
異性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーシ
ョン或いは増幅の厳密性（最大、高い、中間、または低い）は、プローブがPTAM
をコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いはアレルや関連配列コ
ードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであろう。

【０１４９】 プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、PTAMをコードする任意の配
列からのヌクレオチドを５０％以上含むのが望ましい。目的の本発明のハイブリ
ダイゼーションプローブには、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、SEQ ID NO:
9−16の配列、或いはPTAM遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを
含むゲノム配列に由来し得る。

【０１５０】 PTAMをコードするＤＮＡに特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方
法には、PTAM及びPTAM誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をｍＲＮＡプロ
ーブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。このようなベクタ
ーは市販されており、当業者には周知であり、好適なＲＮＡポリメラーゼ及び好
適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでＲＮＡプローブ
を合成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプローブは、例えば^３２ Ｐ或いは^３５Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／ビオチン（biotin）結合系
によってプローブに結合されたアルカリホスファターゼなどの酵素標識等の種々
のレポーターの集団によって標識され得る。

【０１５１】 PTAMをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、PTAMの発現に関連する疾患
を診断することが可能である。このような疾患の例には、癌などの細胞増殖異常
症が含まれ、そのような癌には腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉
腫、奇形癌などがあり、詳しくは副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢
、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎
、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、子宮の癌が含まれ、また
、免疫異常症も含まれ、その中には日光性角化症、後天性免疫不全症候群（ＡＩ
ＤＳ）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、ア
ミロイド症、貧血、動脈硬化、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血
性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、滑液包炎、胆嚢炎、硬変、接触皮膚炎
、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、赤芽球症、結節
性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス
病、橋本甲状腺炎、発作性夜間血色素尿症、肝炎、過好酸球増加症、過敏性大腸
症候群、リンパ球毒素性一時性リンパ球減少症、混合型結合織病（MCTD）、多発
性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨髄線維症、骨関節炎、骨粗しょ
う症、膵炎、真性多血症、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節
炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマト
ーデス、全身性硬化症、原発性血小板血症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェ
ルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及び細菌感染
症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が含まれ、更
に、分泌異常症も含まれ、その中には、嚢胞性線維症及びグルコース‐ガラクト
ース吸収不全症候群、高コレステロール血症、尿崩症、高血糖及び低血糖、甲状
腺腫、クッシング病、また、枯草熱及び喘息、じんま疹を含むアレルギーなどの
小胞輸送異常に関連するその他の症状、自己免疫性溶血性貧血、チェディアック
‐東症候群、毒素ショック症候群が含まれるが、ここに列記したものに限定され
るわけではない。PTAMをコードするポリヌクレオチド配列は、サザーン法やノー
ザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、ディップス
ティック（dipstick）、ピン（pin）、ＥＬＩＳＡアッセイ、及び変異PTAMの発
現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用するマイクロアレイ
に使用することが可能である。このような質的或いは量的方法は、当分野では周
知である。

【０１５２】 特定の形態において、PTAMをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾患、
特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。PTAMをコードする
ヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合
体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加え
ることができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シグナルを
定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サンプルと
較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のPTAMをコードするヌクレオチド
配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッ
セイを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監視における、
特定の治療効果を推定することが可能である。

【０１５３】 PTAMの発現に関連する疾患の診断の基準となるものを提供するために、正常あ
るいは標準的な発現の概要が確立される。これは、ハイブリダイゼーション或い
は増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽出され
た体液或いは細胞と、PTAMをコードする配列或いはその断片とを結合させること
により達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験者から得
た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験からの
値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得た標準的な
値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。標準値と被験者の
値との偏差を用いて疾患の存在を確定する。

【０１５４】 疾患の存在が確定され治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患
者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返し
行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用いる
ことができる。

【０１５５】 癌では、個体からの生体組織における異常な量の転写物が、疾患の発生の素因
を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供することが
可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或いは積
極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能となる
。

【０１５６】 PTAMをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への
利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な合成
、酵素を用いた生成、或いはin vitroで生成され得る。オリゴマーは、好ましく
はPTAMをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはPTAMをコードするポリヌク
レオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の下、特定の遺
伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩い厳密性
条件の下、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出及び／または定量のため用いる
ことが可能である。

【０１５７】 PTAMの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射標識
或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び標準的な
曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Melby, P.C.等(1993) J. Imm
unol. Methods, 159:235-44；Duplaa, C.等(1993) Anal. Biochem. 229-236を参
照）。多数のサンプルの定量速度が、目的のオリゴマーが種々の希釈液に含まれ
、分光光度法或いは非色応答により迅速に定量するＥＬＩＳＡ型のアッセイを用
いることによって加速された。

【０１５８】 別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリ
ゴヌクレオチドまたはそれより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多くの遺伝子の発現レベルを監
視し、遺伝子の変異、突然変異及び多形性を識別する。この情報は、遺伝子機能
の決定、疾患の遺伝的根拠の解釈、疾患の診断、及び治療薬剤の活性の監視及び
開発に有用である。

【０１５９】 当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。(例えば
、Brennan, T.M. 他 (1995) 米国特許第5,474,796号;Schena, M. 他 (1996) Pro
c. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweiler 他(1995) PCT出願番号W
O95/251116; Shalon, D.他 (1995) PCT出願番号WO95/35505; Heller, R.A. 他(1
997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 及び Heller, M.J. 他 (1997) 米
国特許第5,605,662号を参照) 本発明の別の実施例ではまた、PTAMをコードする核酸配列を用いて、自然発生
のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを生
成することが可能である。この配列は、以下のものに対してマッピングされる。
特定の染色体、染色体の特定領域または人工生成の染色体、例えば、ヒト人工染
色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌
Ｐ１生成物或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリである。（例えば、Harrington
, 1.3. 他 (1997) Nat Genet. 15:345-355; Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:
127-134, 及びTrask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154を参照） in sit蛍光ハイブリダイゼーション（FISH）は、他の物理的染色体マッピング
技術及び遺伝マップデータと相関するであろう（例えば、Heinz-Ulrich, 他によ
る(1995) in Meyers, 前出, pp. 965-968.を参照）。遺伝子マップデータの例は
、種々の科学誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のサイ
トで見付けることができる。物理的な染色体マップ上のPTAMをコードする遺伝子
の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このような
疾患と関係するＤＮＡの領域を決定するのに役立つ。本発明のヌクレオチド配列
を用いて、正常者と、保有者、及び感染した者との遺伝子配列における違いを検
出することもある。

【０１６０】 染色体標本のin sitハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを
用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子マップを拡張する
こともできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上での遺伝子の配置により、
たとえ特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていなくても、関連するマー
カーが明らかになることが多い。新規の配列を、物理的なマッピングによって、
染色体アームに割り付けることもできる。このことは、位置クローニング或いは
別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって、価値
ある情報である。疾患或いは症候群の位置が、例えば血管拡張性失調症の11q22-
23などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領
域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは
調節遺伝子を表す（例えば、Gatti, R.A.他による（1988）Nature 336:577-580
を参照）。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、
即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出することも
ある。

【０１６１】 本発明の別の実施例では、PTAM、その触媒作用断片或いは免疫原断片またはそ
のオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物のラ
イブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニングに
用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或いは細
胞内に存在する。PTAMとテストされる薬剤との複合体を結合することによる形成
は計測されることもある。

【０１６２】 薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な
結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる
（例えば、Geysen,他による(1984) PCT出願番号 WO84/03564を参照）。この方法
では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基
板の上に合成される。試験用化合物は、PTAM、或いはその断片と反応してから洗
浄される。次ぎに、結合されたPTAMが、当分野で周知の方法で検出される。精製
されたPTAMはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレー
ト上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて、ペプチドを
捕らえ、固体支持物に固定することもできる。

【０１６３】 別の実施例では、PTAMと結合可能な中和抗体がPTAMと結合するため試験用化合
物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。
この方法では、抗体が、PTAMと１つ以上の抗原決定因子を共有するどのペプチド
の存在も検出する。

【０１６４】 別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にPTAMをコードするヌクレオチド
配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び特異
的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を提供
することができる。

【０１６５】 当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで十分に本発
明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する特定の実施例は、例示目
的であって本発明を限定するものではない。

【０１６６】 前出及び以下に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、特に米国出願６０／
０９８、２０６を引用することをもって本明細書の一部とする。

【０１６７】

【実施例】

１ ｃＤＮＡライブラリの作製 ＲＮＡにはClontech社から購入したものと、表４に列記した組織から単離した
ものとがある。ある組織をホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート
溶液に溶解した。一方で別の組織をホモジナイズしてフェノールに溶解するか、
或いはTRIZOL (Life Technologies)、グアニジニウムイソチオシアネート及びフ
ェノールの単相溶液などの好適な変性剤の混合液に溶解した。この溶解物を塩化
セシウムにおいて遠心分離またはクロロホルムで抽出した。イソプロパノール或
いは酢酸ナトリウムのどちらかとエタノール、或いは別の方法でこの溶解物から
ＲＮＡを沈殿させた。

【０１６８】 ＲＮＡの純度を高めるためにＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な
回数繰り返した。場合によっては、ＤＮＡ分解酵素でＲＮＡを処理する。殆どの
ライブラリでは、オリゴd(T)連結常磁性粒子(Promega)またはOLIGOTEXラテック
ス粒子(QIAGEN. Valencia CA)、OLIGOTEX mRNA精製キット(QIAGEN)を用いてポリ
（Ａ＋）ＲＮＡを単離した。別法では、POLY(A)PURE mRNA精製キット(Ambion, A
ustin TX)などの別のＲＮＡ単離キットを用いて組織溶解物から直接単離した。

【０１６９】 ある場合には、Stratagene社にＲＮＡを提供しStratagene社が対応するｃＤＮ
Ａライブラリを作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム(Stratag
ene)またはSUPERSCRIPT プラスミドシステム(Life Technologies)を用いて当分
野で公知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成してｃＤＮＡライブラリ
を作製した。(例えば、Ausubel, 1997,前出,ユニット5.1-6.6を参照)。逆転写は
、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオ
チドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに結合させてから、好適な１つの制限酵素或い
は複数の制限酵素でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリでは、SEPHACRYL S
1000または SEPHAROSE CL2B、SEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー(Amersh
am Pharmacia Biotech)、アガロースゲル電気泳動法によってｃＤＮＡの大きさ
（300〜1000bp）を選択した。PBLUESCRIPTプラスミド(Stratagene)またはpSPORT
1プラスミド(Life Technologies)、plNCY (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto
CA)などの好適なプラスミドのポリリンカーの適合性制限酵素部位にｃＤＮＡを
結合させた。この組換えプラスミドを、Stratagene社のXL1-Blue, XL1-BIueMRF
、SOLR、またはLife Technologies社のDH5αまたはDH 10B、ELECTROMAX DH 10B
を含むコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。

【０１７０】 ２ ｃＤＮＡクローンの単離 UNIZAPベクターシステム(Stratagene)或いは細胞溶解を利用して、in vivo切
除によって宿主細胞からプラスミドを回収した。MagicまたはWIZARD Minipreps
DNA精製システム(Promega)、及びAGTC Miniprep精製キット(Edge Biosystems, G
aithersburg MD)、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus Plasmid、QI
AWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、REAL Prep 96プラスミドキットの内の少
なくとも１つを用いてプラスミドを精製した。沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留
水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。

【０１７１】 別法では、高スループットの直接結合ＰＣＲ法によって宿主細胞溶解物からプ
ラスミドＤＮＡを増幅した。(Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14)。宿
主細胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で行った。サンプルを処
理してから３８４−ウエルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドＤＮＡ
の濃度をPICOGREEN色素(Molecular Probes, Eugene OR)及びFluoroskan II蛍光
スキャナー(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を用いて蛍光定量的に測定した
。

【０１７２】 ３ シークエンシング及び分析 シークエンシング用のｃＤＮＡの準備に、ABI CATALYST 800 (Perkin-Elmer)
またはHYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific, Sunnyvale CA)、MIC
ROLAB 2200 システム(Hamilton)をPTC-200 thermal cyclers (MJ Research, Wat
ertown MA)と共に用いた。ｃＤＮＡのシークエンシングには、ABI PRISM 373ま
たは377シークエンシングシステム(Perkin-Elmer)及び標準ABIプロトコル、塩基
対呼び出しソフトウェア、キットを用いた。別法では、ｃＤＮＡのシークエンシ
ングには、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamics,
Sunnyvale CA)を用いた。更なる別法では、ｃＤＮＡの増幅及びシークエンシン
グにABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reactionキット(Pe
rkin-Elmer)を用いた。また、更なる別法では、ｃＤＮＡのシークエンシングにA
mersham Pharmacia Biotech社の溶液と色素を用いた。ESTの読み枠は、標準的な
方法( Ausubel, 1997, 前出, unit 7.7を参照)を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列
の幾つかを選択して、本実施例の５に記載した方法で延長した。

【０１７３】 ｃＤＮＡ及び延長、ショットガンシークエンシングから得たポリヌクレオチド
配列の構築及び分析は、当分野の技術者に既知のアルゴリズムを利用したソフト
ウェアを組合せて行った。表５は、利用したソフトウェアのプログラム名、プロ
グラムの説明、引用文献、閾値パラメーターの要約である。表５の第１の列は用
いたツール及びプログラム、アルゴリズムであり、第２の列はそれらの簡単な説
明であり、第３の列は引用することで本明細書の一部とした引用文献であり、第
４の列は２つの配列の一致度の評価に用いたスコア及び確率値、他のパラメータ
である（確率値が高ければ高いほど相同性が高くなる）。配列の分析には、MACD
NASIS PROソフトウェア(Hitachi Software Engineering, S. San Francisco CA)
及びLASERGENEソフトウェア (DNASTAR)を用いた。

【０１７４】 ポリヌクレオチド配列の確証は、BLAST及び動的計画法、ジヌクレオチド最近
接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター及びリンカー
、ポリＡ配列を取り除き、あいまいな塩基対をマスクすることで行った。次に、
BLAST及びFASTA、BLIMPSに基づいたプログラムを用いて、公共のデータベースで
あるGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベー
スやBLOCKSデータベースなどから選択した配列に対してこれらの配列を問合わせ
て注釈を得た。Phred及びPhrap、Consedに基づいたプログラムを用いて完全長の
ポリヌクレオチド配列の中にこれらの配列を構築して、BLAST及びFASTA、BLIMPS
に基づいたプログラムでオープンリーディングフレームのためにスクリーンした
。完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳して対応する完全長のアミノ酸配列を引
き出し、GenBankデータベース(上記)及びSwissProt、BLOCKS、PRINTS、PFAM、Pr
ositeなどのデータベースに対して問い合わせてこれらの完全長の配列を分析し
た。HMMは、確率を利用して遺伝子ファミリーのコンセンサス一次構造を解析す
る。

【０１７５】 完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の構築及び分析に用いる上記
のプログラムは、SEQ ID NO:8−14からポリヌクレオチド配列の断片を同定する
際にも使用できる。約２０から４０００までのヌクレオチドの断片はハイブリダ
イゼーション及び増幅に有用であり、上記の発明で説明した。

【０１７６】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識さ
れたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(例えば、Sambrook,前出
, 7章; 及び Ausubel. F.M. 他、前出, 4章及び16章を参照)。

【０１７７】 ＢＬＡＳＴに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank或いはLIFESEQ
データベース（Incyte Pharmaceuticals）のようなヌクレオチドデータベース内
の同一或いは関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼー
ションより非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意
の特定の一致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れかとして分類されるかを確
定することができる。検索の基準は、 （％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００ として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列
一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１〜２
％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。類似分子は通
常、１５〜４０の範囲の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが
、それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。

【０１７８】 ノーザン分析の結果は、PTAMをコードする転写物が発生したライブラリのリス
トとして報告する。存在度数即ち存在率も報告する。存在度数は、特定の転写物
があるcDNAライブラリに存在する回数を直接表し、存在率は、存在度数をcDNAラ
イブラリで検査した配列の総数で除したものである。更なる分析によって、組織
特異性及び発現疾患の％値を表３に示した。

【０１７９】 ５ PTAMをコードするポリヌクレオチドの延長 インサイトESTの12033及び1209687、1717058、1749964、1856357、1871275、2
645806、3437773の核酸配列を用いて、部分ヌクレオチド配列を完全長にするた
めのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。各ヌクレオチド配列用に、アン
チセンスポリヌクレオチドの延長を開始するためのプライマーと、センスポリヌ
クレオチドの延長を開始するためのプライマーとをそれぞれ合成した。これらの
プライマーを用いて既知の配列の「外側への」延長を促進し、目的の領域の新し
い未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを作り出す。開始プライマーは、
ＯＬＩＧＯ ４．０６（National Biosciences,）或いは他の適切なプログラムを
用いて、約２２個から約３０個のヌクレオチドからなる長さで、約５０％以上の
ＧＣ含量を有し、かつ約６８〜約７２℃の温度で標的配列にアニールするように
ｃＤＮＡから設計する。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体化を生
ずるようなヌクレオチドのストレッチは避ける。

【０１８０】 選択されたヒトｃＤＮＡライブラリ（Life Technologies）を用いて、この配
列を延長した。２段階以上の延長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、既知
領域をさらに延長するための別のプライマーの組を設計する。

【０１８１】 ＸＬ−ＰＣＲキット（Perkin Elmer Co.）の説明書の指示に従って処理を行い
、また酵素と反応混合物とを徹底的に混合することにより、高い忠実度の増幅を
行う。それぞれ４０ｐｍｏｌの各プライマーと、推奨された濃度のキットの他の
全ての成分とから増幅を開始する場合、PTC-−200thermal cycler（M.J. Reserc
h, Watertown MA）を用いて、以下のパラメータ、即ち、 ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性） ステップ２ ６５℃で１分間 ステップ３ ６８℃で６分間 ステップ４ ９４℃で１５秒間 ステップ５ ６５℃で１分間 ステップ６ ６８℃で７分間 ステップ７ ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復 ステップ８ ９４℃で１５秒間 ステップ９ ６５℃で１分間 ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間 ステップ１１ ステップ８〜１０を１２サイクル反復 ステップ１２ ７２℃で８分間 ステップ１３ ４℃（その温度を保持） でＰＣＲを行う。

【０１８２】 反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度の（約０．６〜０．８％）
アガロースミニゲル上での電気泳動で解析して、何れの反応物が配列を延長する
ことに成功したかを決定する。最も大きな生成物を含むと考えられるバンドを選
択して、ゲルから切り出し、QIAQUICKキット（QIAGEN Inc.）を用いて精製し、
クレノウ酵素を用いて末端の延び出しを切り取って、再連結及びクローニングが
容易になる平滑末端を作る。

【０１８３】 エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌの連結バッファーに再溶解し、１μｌ
のＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを加えて、その混合物を室温で２〜３時間、或いは１６℃で終夜インキュベー
トする。（４０μｌの適切な培養液の中の）コンピテントな大腸菌細胞を、３μ
ｌの連結混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培養液で（例えば、Semb
roo、前出、Appendix A, p. 2を参照）で培養する。３７℃で１時間インキュベ
ートした後、大腸菌混合物を、カルベニシリン（２ｘ ｃａｒｂ）を含むLuria B
ertani（ＬＢ）アガー（例えば、Sembrook、前出、Appendix A, p. 1を参照）上
に蒔く。後日、いくつかのコロニーを各プレートから無作為に選択し、適切な市
販の滅菌９６穴マイクロタイタープレートの各ウェル内に入れられた１５０μｌ
の液状のＬＢ／２ｘＣａｒｂ培地で培養する。さらに後日、それぞれ５μｌの終
夜培養した各培養物を非滅菌９６穴プレート内に移し、水で１：１０に希釈した
後、各サンプルの内の５μｌをＰＣＲアレイに移す。

【０１８４】 ＰＣＲ増幅のため、４単位のｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを含む１８μｌの濃
縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用い
られる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加える。増幅は以
下の条件、即ち ステップ１ ９４℃で６０秒間 ステップ２ ９４℃で２０秒間 ステップ３ ５５℃で３０秒間 ステップ４ ７２℃で９０秒間 ステップ５ ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復 ステップ６ ７２℃で１８０秒間 ステップ７ ４℃（そのまま保持） で行う。

【０１８５】 ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動
させる。ＰＣＲ産物のサイズを元の部分的なｃＤＮＡと比較して、適切なクロー
ンを選択し、プラスミドに連結して、配列決定を行う。

【０１８６】 同様に上述の手順で、SEQ ID NO:9−16のヌクレオチド配列を利用し、この延
長のために設計したオリゴヌクレオチドと好適な遺伝子ライブラリを用いて５′
調節配列を作製した。

【０１８７】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 SEQ ID NO:9−16から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて
、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基
対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなｃＤＮＡ
フラグメントの場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OL
IGO4.06ソフトウェア（National Bioscience）のような最新式のソフトウェアを
用いてデザインし、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０μＣｉの[γ‐^３２
Ｐ]アデノシン三リン酸（Amersham, Chicago, IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（DuPont NEN、Boston MA）とを組み合わせて用いることにより標識する
。標識されたオリゴヌクレオチドを、SEPHADEX G-25超精細排除デキストランビ
ードカラム（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて実質的に精製する。毎分１
０^７カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、次のエンドヌクレアー
ゼ、Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1或いはPvu II（DuPont NEN）の１つを
用いて切断したヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション
解析において用いる。

【０１８８】 各切断物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製
メンブラン（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に転写する。ハ
イブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り
除くため、ブロットを、段階的に厳密性が増す条件で最大０．１ｘクエン酸ナト
リウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまで順次室温にて洗浄する。
XOMAT ARフィルム（Eastman Kodak, Rochester, NY）を、ブロットに数時間露光
した後、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。

【０１８９】 ７ マイクロアレイ 化学結合方法及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上でアレイ要素を
合成することが可能である（例えば、上記Baldeschweilerを参照）。ドットブロ
ット法またはスロットブロット法に類似したアレイを利用し、要素を熱、ＵＶ、
機械的または化学的結合方法を用いて基板の表面に配置し結合させる。典型的な
アレイは、手作業または利用可能な方法や機械を用いて作製することができ、任
意の適正な数の要素を含み得る。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズ
していないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターン
を決定する。スキャンした画像を分析して、マイクロアレイ上で要素にハイブリ
ダイズする各プローブの相補性の程度及び相対的な量／発現レベルを調べること
が可能である。

【０１９０】 完全長のｃＤＮＡ、発現配列タグ（ＥＳＴ）、或いはそれらの断片が、マイク
ロアレイの要素を含み得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片を、LASERGEN
Eソフトウェア（DNASTAR）などの当分野で公知のソフトウェアを用いて選択する
ことが可能である。本発明の核酸配列の１つに対応する完全長のｃＤＮＡ、ＥＳ
Ｔ、或いはそれらの断片、或いは本発明に関連するｃＤＮＡライブラリから任意
に選択されたｃＤＮＡを、ガラススライドなどの好適な基板に整列する。ｃＤＮ
Ａは、例えばＵＶ交差結合（UV cross-linking）を利用してスライドに固定して
から、熱処理及び化学処理を施し、最後に乾燥させる(例えば、 Schena, M. 他.
(1995) Science 270:467-470; 及び Shalon, D. 他. (1996) Genome Res. 6:63
9-645を参照)。蛍光プローブを準備して、基板上の要素にハイブリダイゼーショ
ンするために用いる。上記した方法でこの基板を分析する。

【０１９１】 ８ 相補的ポリヌクレオチド PTAMをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、自然発
生のPTAMの発現の低下即ち阻害するために用いられる。約１５〜約３０個の塩基
対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或いはより大き
な配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4.06ソ
フトウェア（National Biosciences）及びPTAMのコーディング配列を用いて、適
切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５′
配列から相補的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコ
ーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオ
リゴヌクレオチドを設計して、リボソームがPTAMをコードする転写物に結合する
のを阻害する。

【０１９２】 ９ PTAMの発現 PTAMの発現及び精製は、細菌またはウイルスを基にした発現系を用いて行うこ
とができる。細菌でPTAMが発現するために、抗生物質耐性及びｃＤＮＡの転写レ
ベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡをサブクロ
ーニングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節要素に関連
するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びtrp-lac(tac)ハイブリ
ッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではない。組換えベク
ターを、BL21(DE3)などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ
細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとＨＬ
ＯＲを発現する。真核細胞でのPTAMの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株
に一般にバキュロウイスルスとして知られているAutographica californica核多
面性ウイルス(AcMNPV)を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリ
ン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺
伝子転移のどちらかによって、PTAMをコードするｃＤＮＡと置換する。ウイルス
の感染力は維持され、強いポリヘドリンプロモータによって高いレベルのｃＤＮ
Ａの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera fru
giperda (Sf9)昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられ
ることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必
要になる。(例えば、Engelhard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:3224-3227; Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.を参照)。

【０１９３】 殆どの発現系では、PTAMが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)
、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパク
質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベース
の精製が素早く１回で行うことができる。Schistosoma japonicumからの２６キ
ロダルトンの酵素ＧＳＴによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態
で固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる(Amersham Phar
macia Biotech)。精製の後、ＧＳＴ部分を特定の操作部位でＨＬＯＲからタンパ
ク分解的に切断できる。アミノ酸８個のペプチドであるＦＬＡＧで、市販のモノ
クロナール及びポリクロナール抗FLAG抗体(Eastman Kodak)を用いた免疫親和性
の精製が可能となる。６個のヒスチジン残基が連続して伸展した6-Hisによって
、金属キレート樹脂(QIAGEN)で精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の
方法は、Ausubel (1995,前出, ch 10, 16)に記載されている。これらの方法で精
製したPTAMを直接用いて以下のアッセイを行うことができる。

【０１９４】 １０ 機能的アッセイ PTAMの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでの
PTAMをコードする配列の発現によって評価する。ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡを高いレ
ベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニン
グする。このようなベクターには、pCMV SPORT^TM (Life Technologies.)及びpCR
3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプ
ロモーターを含んでいる。５〜１０μｇの組換えベクターを、好ましくは内皮由
来か造血由来のヒト細胞株にリポソーム製剤或いは電気穿孔法によって一過性に
形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μｇのプラ
スミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入された細
胞と形質移入されていない細胞とを区別できる。また、標識タンパク質の発現に
よって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。このような
標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質(GFP；Clontech)、及びCD64またはCD6
4-GFP融合タンパク質が含まれる。レーザー光学に基づいた技術を利用した自動
流動細胞計測法(FCM)を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細
胞を同定し、例えば、その細胞のアポトーシス状態などの細胞特性を評価する。
また、ＦＣＭで、先行した或いは同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取り
込みを検出して計量する。これらの現象には、プロピジウムヨウ化物でのＤＮＡ
の染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化と、ブロモデオキシウリジンの
取り込み量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方調節と、特異的な抗体と
の反応性によって計測される細胞表面及び細胞内のタンパンク質の発現の変化と
、蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形
質膜組成の変化とが含まれる。流動細胞計測法は、Ormerod, M. G.による (1994
) Flow Cytometry Oxford, New York, NY.に記載されている。

【０１９５】 遺伝子発現におけるPTAMの影響は、PTAMをコードする配列とCD64またはCD64-G
FPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価すること
ができる。CD64またはCD64-GFPは形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グ
ロブリンG(IgG)の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形質転換さ
れない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビー
ドを用いて分離することができる(DYNAL. Lake Success. NY)。ｍＲＮＡは、当
分野で公知の方法で細胞から精製することができる。PTAM及び目的の他の遺伝子
をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析する
ことができる。

【０１９６】 １１ PTAMに特異的な抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE；例えば、Harrington, M.G. (1990)
Methods Enzymol. 182:488-495を参照)または他の精製技術で実質的に精製され
たPTAMを用いて、標準的なプロトコルでウサギを免疫化して抗体を作り出す。

【０１９７】 別法では、PTAMアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（DNASTAR）
を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成
してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を産生させる。Ｃ末端付近の、或い
は隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については
、当分野で周知である(例えば、前出のAusubel, 1995,11章を参照)。

【０１９８】 通常、約１５残基の長さのオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペプチド
シンセサイザABI 431Aペプチドシンセサイザー（Perkin-Elmer）を用いてｆｍｏ
ｃ法のケミストリにより合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によりＫＬＨ（Sigma-Aldrich, S
t. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める(例えば、前出のAusubel, 1995
を参照)。フロイントの完全アジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合
体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性を検査するに
は、例えばペプチドをプラスチックに結合し、１％ＢＳＡを用いてブロックし、
ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギ
ＩｇＧと反応させる。

【０１９９】 １２ 特異的抗体を用いる自然発生PTAMの精製 自然発生PTAM或いは組換えPTAMを、PTAMに特異的な抗体を用いるイムノアフィ
ニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラ
ムは、CNBr-活性化SEPHAROSE（Amersham Pharmacia Biotech）のような活性化ク
ロマトグラフィー用レジンとPTAM抗体とを共有結合させることにより構築する。
結合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従って、ブロックし洗浄する。

【０２００】 PTAMを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、PTAMを優先的に吸着
できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファー
で）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とPTAMとの結合を切るような条
件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン
酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、PTAMを回収する。

【０２０１】 １３ PTAMと相互作用する分子の同定 PTAM又は生物学的に活性なその断片を、^１２５Ｉボルトンハンター試薬（例え
ば、Bolton他 (1973) Biochem. J. 133:529を参照）で標識する。マルチウェル
プレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したPTAMと共にインキュベー
トし、洗浄して、標識したPTAM複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様
々なPTAM濃度で収集したデータを用いて、候補の分子とPTAMとの関連、親和性、
数についての値を計算する。

【０２０２】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適実施例に基
づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に
制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連す
る分野の専門家には明らかな本明細書に記載の本発明の実施のための方法の様々
な改変は、特許請求の範囲に含まれることが意図されている。

【０２０３】 表の簡単な説明 表１は、PTAMをコードする完全長の配列を作り出すために用いた、ポリペプチ
ド配列及びヌクレオチド配列の配列番号(SEQ ID NO)、クローンＩＤ番号、ｃＤ
ＮＡライブラリ、ｃＤＮＡ断片を示す。

【０２０４】 表２は、潜在モチーフ及び相同配列を含む各ポリペプチド配列の特徴、及びPT
AMの同定に用いた方法及びアルゴリズムを示す。

【０２０５】 表３は、ノーザン分析によって決定された各核酸配列の組織特異的発現パター
ンと、これらの組織に関連した疾患や異常症と、各ＤＮＡがクローニングされた
ベクターとを示す。

【０２０６】 表４は、PTAMをコードするｃＤＮＡクローンを単離したｃＤＮＡライブラリを
作製するために用いた組織を示す。

【０２０７】 表５は、PTAMの分析に用いたプログラム及びその説明、引用文献、閾値パラメ
ーターを示す。

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 11/06 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 3/00 29/00 １０１ ４Ｃ０８５ 11/06 35/00 ４Ｈ０４５ 29/00 １０１ 37/02 35/00 37/08 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/47 37/08 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 21/08 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 21/08 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 バンドマン、オルガ アメリカ合衆国カリフォルニア州94043・ マウンテンビュー・アンナアベニュー 366 (72)発明者 ユエ、ヘンリー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・ルイスアベニュー 826 (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ サニーベイル・＃30・デールアベニュー 1240 (72)発明者 ゲグラー、カール・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・オークランドアベニュー 1048 (72)発明者 ゴルゴン、ジーナ・エイ アメリカ合衆国カリフォルニア州95006・ ボールダークリーク・パインクレストドラ イブ 1253 (72)発明者 ボーグン、マライア・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・サンティアゴロード 14244 (72)発明者 パターソン、チャンドラ アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ メンロパーク・＃１・シャーウッドウェイ 490 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA34 AA35 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA09 CA20 DA01 DA02 DA05 DA12 HA13 HA14 4B063 QA01 QQ43 QQ53 QR08 QR32 QR40 QR42 QR56 QR62 QS16 QS25 QS34 QX02 4B064 AG01 AG27 CA01 CA10 CA19 CA20 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA58X AA72X AA87X AA90Y AB01 AC14 BA02 BA16 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA17 BA01 BA05 BA08 BA22 CA01 CA04 CA17 CA18 CA25 CA49 CA51 CA53 CA56 CA59 DC50 MA01 MA17 MA23 MA35 MA52 MA57 MA59 MA60 MA63 MA66 MA67 NA14 ZB072 ZB082 ZB092 ZB132 ZB152 ZB262 ZC032 ZC212 ZC332 4C085 AA14 AA16 AA25 AA26 BB11 BB36 BB41 BB43 CC02 CC03 CC04 CC05 CC21 CC23 DD16 DD22 DD23 DD86 DD88 EE01 FF02 FF03 FF13 FF17 FF20 GG02 GG03 GG04 GG08 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 EA20 EA50 FA71 FA74

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 SEQ ID NO:1−8（配列番号：1−8）及びそれらの断片から
   なる一群から選択されたアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一
   性を有する実質的に精製された変異体。
3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離され精製された
   ポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチドと９０％以上のポリヌクレオ
   チド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
5. 【請求項５】 厳密な条件の下で請求項３のポリヌクレオチドとハイブリ
   ダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離
   され精製されたポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 ポリヌクレオチドを検出する方法であって、 （ａ）請求項６のポリヌクレオチドをサンプルの少なくとも１つの核酸とハイ
   ブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイ
   ブリダイゼーション複合体の存在が、前記サンプルに前記ポリヌクレオチドが存
   在することと相関性を有する、該過程とを含むことを特徴とする検出方法。
8. 【請求項８】 前記ハイブリダイゼーションの前に前記ポリヌクレオチド
   を増幅する過程を更に含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 SEQ ID NO:9−16及びそれらの断片からなる一群から選択
   されたポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 請求項９のポリヌクレオチドと９０％以上のポリヌクレ
    オチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
11. 【請求項１１】 請求項９のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単
    離され精製されたポリヌクレオチド。
12. 【請求項１２】 請求項３のポリヌクレオチドの少なくとも１つの断片を
    含む発現ベクター。
13. 【請求項１３】 請求項１２の発現ベクターを含む宿主細胞。
14. 【請求項１４】 ポリペプチドの製造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件の下で、請求項１３の宿主細胞を
    培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
    を特徴とする製造方法。
15. 【請求項１５】 好適な医薬用担体と共に請求項１のポリペプチドを含む
    医薬品組成物。
16. 【請求項１６】 請求項１のポリペプチドと特異的に結合する精製された
    抗体。
17. 【請求項１７】 請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
18. 【請求項１８】 請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
19. 【請求項１９】 PTAMの発現または活性の低下に関連する疾患の治療また
    は予防が必要な患者に、請求項１５の医薬品組成物を効果的な量投与する過程を
    含む、PTAMの発現または活性の低下に関連する疾患を治療または予防する方法。
20. 【請求項２０】 PTAMの発現または活性の増大に関連する疾患の治療また
    は予防が必要な患者に、請求項１８のアンタゴニストを効果的な量投与する過程
    を含む、PTAMの発現または活性の増加に関連する疾患を治療または予防する方法
    。