JP2002513554A - ヒト転写調節分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト転写調節分子（ＨＴＲＭ）とそれを同定及びコードするポリヌクレオチドとを提供する。また、本発明は、発現ベクター及び宿主細胞、抗体、アゴニスト、アンタゴニストを提供する。更に、本発明は、ＨＴＲＭの発現に関連する疾患の診断または治療方法、予防方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の技術分野 本発明は、ヒト転写調節分子の核酸配列及びアミノ酸配列、並びにこれらの配
列を用いた細胞増殖異常症及び免疫異常症の診断及び治療、予防に関連する。

【０００２】 発明の背景 全ての多細胞生物の成長及び発達にとって、遺伝子発現の差次適な調節は必須
である。遺伝子の発現はＤＮＡからタンパク質へ移行する多くの過程で調節され
得るが、多くの遺伝子の主な調節点は転写の開始時である。この重要な過程は、
一般転写因子と組織特異性転写因子との組み合わせによって正及び負に調節され
る。この転写因子の多くは1つ以上の標的遺伝子の転写を調節する。

【０００３】 転写因子（ＴＦ：transcription factor）の変異は発癌に関与する。これは、
細胞増殖に関係する遺伝子の発現における転写因子の役割によるものと思われる
。例えば、Fos及びJun、Myc、Rel、Spi-1などのプロトオンコジーンによってコ
ードされる転写因子の変異は、細胞増殖の刺激が増加して発癌性になり得る。逆
に、p53及びRB1、WT1などの腫瘍抑制遺伝子によってコードされる転写因子の変
異は、細胞増殖の抑制が低下して発癌性になり得る。(Latchman. D. (1995) Gen e Regulation: A Eukarvotic Perspective , Chapman and Hall. London, UK, pp
242-255.)。

【０００４】 多くの転写因子は、ＤＮＡ結合ドメインと転写調節ドメインとを別々に有する
モジューラタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、遺伝子のプロモータ領域
内或いはその近傍の特定のＤＮＡ配列（調節エレメント）と相互作用する。この
相互作用によって、ＴＦの調節ドメインが他のタンパク質と相互作用して転写を
刺激したり抑制したりする位置に移動する。十分に機能するためにＴＦの多くは
二量体化または多量体化する必要がある。大きな特徴のある５つの構造的モチー
フに基づいて、転写因子がそれぞれ異なった５つの型に分類される。この５つの
型には、ヘリックス−ターン−ヘリックス及びＺｎフィンガー、ロイシンジッパ
ー、へリックス−ループ−へリックス（ＨＬＨ）タンパク質、ステロイドホルモ
ンレセプターがある。

【０００５】 ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフは、一定角度に保たれた２つのαへ
リックスからなる。２つのへリックスは、「ターン」となるアミノ酸短鎖によっ
て連結される。より多いカルボキシ末端へリックスは認識へリックスと呼ばれ、
ＤＮＡニ重へリックスの主溝に適合する。認識へリックスのアミノ酸側鎖はタン
パク質によって異なり、タンパク質が結合する特異的なＤＮＡ配列を認識すると
いう重要な役割を果たす。全てのヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質は
、認識へリックスの２つの複製がＤＮＡへリックスの１つのターンによって分か
れている二量体としてＤＮＡに結合する。ホームドメイン（homedomain）タンパ
ク質は、ヘリックス−ターン−ヘリックスタンパク質の特別なクラスである。こ
のホームドメインは、疎水作用によって相互にしっかりと集まった３つのαへリ
ックスの中に畳み込まれる。三番目のへリックスが認識へリックスとして作用す
ることから、二重らせんと三重らせんはヘリックス−ターン−ヘリックスモチー
フに酷似している。

【０００６】 Ｚｎフィンガーモチーフは、１つの亜鉛原子によって互いに保持された１つの
αへリックスと非平行βシートとからなる。Ｚｎフィンガーモチーフが通常はタ
ンパク質内の直列アレイの中に反復していて、タンパク質内の各Ｚｎフィンガー
のαへリックスが、ＤＮＡニ重へリックスの主溝に接触している。タンパク質と
ＤＮＡとの間の反復接触によって、特異的で強いＤＮＡとタンパク質の相互作用
が形成される。この相互作用の強度及び特異性は、タンパク質内のＺｎフィンガ
ーの数によって調節され得る。

【０００７】 ロイシンジッパーモチーフは、タンパク質の二量体化及びＤＮＡ結合の両方に
関与する１つのαへリックスからなる。ロイシンジッパーを含む２つのタンパク
質は、それぞれのαらせんの片側から伸長した通常はロイシンである疎水性アミ
ノ酸残基間の相互作用によって二量体化し得る。このように、それぞれのタンパ
ク質単量体のαらせんが二量体化して短コイルドコイルを形成する。このコイル
ドコイルのすぐ先で2つのαらせんが分かれて、ＤＮＡの主溝と接触するＹ型構
造を形成する。ロイシンジッパータンパク質は、２つのタンパク質単量体が同一
であるホモ二量体または２つのタンパク質単量体が同一ではないヘテロ二量体を
形成し得る。それぞれのタンパク質単量体が異なったＤＮＡ結合特異性をもつた
め、ＤＮＡ結合の特異性は形成された二量体によって様々である。

【０００８】 へリックス−ループ−へリックス（ＨＬＨ）モチーフは、ループによって二番
目の長いαへリックスに連結された短いαへリックスからなる。可撓性のループ
によって、２つのらせんが互いにたたみ込まれる。ロイシンジッパーと同様に、
ＨＬＨモチーフは、タンパク質の二量体化及びＤＮＡ結合の双方に関与する。こ
の二量体はホモ二量体或いはヘテロ二量体であるため、ＨＬＨタンパク質が結合
するＤＮＡ結合部位のレパートリーが広がる。

【０００９】 ステロイドホルモンレセプターは、２つの垂直なαへリックスで構成されるモ
チーフを含む。リガンドが存在しない場合は、ステロイドホルモンレセプターは
αへリックスを隔離するコンフォメーションであると推定される。一般にはステ
ロイドホルモンや甲状腺ホルモン、レチノイド、ビタミンＤであるリガンドとレ
セプターとの結合により、コンフォメーションが変化してαへリックスが露出さ
れる。第1のαへリックスは、約７０個の残基および８個の保存されたシステイ
ンを含む。このへリックスはＤＮＡ二重鎖の主溝に適合してＤＮＡレセプターと
結合可能となる。第２のαへリックスはタンパク質の二量体化に必要である。ロ
イシンジッパーやＨＬＨタンパク質と同様に、ステロイドホルモンレセプターに
よってホモ二量体とヘテロ二量体の両方が形成され得る。

【００１０】 様々な生物から数百の調節タンパク質が同定された。これらのタンパク質の殆
どが、記載された少なくとも１つの共通構造のモチーフを有する。しかしながら
、ｐ５３腫瘍サプレッサーを含む幾つかの重要な調節タンパク質は、他の既知の
タンパク質には見られない独特の構造を有する。(Faisst, S. and S. Meyer (19
92)Nucl. Acids Res. 20:3-26.)。更に、他の調節タンパク質のドメインは、Ｄ
ＮＡと重要な接触を形成して結合特異性に影響を及ぼしている場合が多い。副タ
ンパク質（accessory protein）もまた、重要な相互作用をして、特定の調節タ
ンパク質を活性化因子からリプレッサーにしたり、リプレッサーから活性化因子
に換えたり、或いは調節タンパク質によるＤＮＡ結合を完全に阻害したりし得る
。

【００１１】 新規のヒト転写調節分子及びそれをコードするポリヌクレオチドの発見により
、細胞増殖異常症及び免疫異常症の診断及び治療、予防に有用な新規の組成物を
提供することで当分野のニーズに答えることができる。

【００１２】 発明の要約 本発明は、総称してＨＴＲＭと呼ぶヒト転写調節分子である実質的に精製され
たポリヌクレオチドを提供する。本発明の特徴は、SEQ ID NO:1−65及びそれら
の断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリ
ペプチドを提供する。

【００１３】 更に本発明は、SEQ ID NO:1−65及びそれらの断片からなる一群から選択され
たアミノ酸配列の少なくとも１つと９０％以上のアミノ酸同一性を有する実質的
に精製された変異体を提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:1−65及びそれらの
断片からなる一群から選択されたアミノ酸配を含むポリペプチドをコードする単
離され実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、SEQ ID
NO:1−65及びそれらの断片からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含むポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％以上のポリヌクレ
オチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供
する。

【００１４】 更に、本発明は、SEQ ID NO:1−65及びそれらの断片からなる一群から選択さ
れたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと厳密な条
件の下でハイブリダイズする単離され精製されたポリヌクレオチドを提供する。
また本発明は、SEQ ID NO:1−65及びそれらの断片からなる一群から選択された
アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列
を含む単離され精製されたポリヌクレオチドとを提供する。

【００１５】 本発明はまた、SEQ ID NO:66−130及びそれらの断片からなる一群から選択さ
れたポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチドを提供す
る。また、本発明は、SEQ ID NO:66−130及びそれらの断片からなる一群から選
択されたポリヌクレオチド配列と７０％以上のポリヌクレオチド配列同一性を有
する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列を提供する。更に本発明は、
SEQ ID NO:66−130及びそれらの断片からなる一群から選択されたポリヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離され精製されたポ
リヌクレオチドを提供する。

【００１６】 本発明はまた、核酸を含むサンプルにおいて、ポリヌクレオチドを検出する方
法であって、（ａ）ポリヌクレオチド配列を、少なくとも１つのサンプルのポリ
ヌクレオチドとハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション複合体を形成する
過程と、（ｂ）そのハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを含み、そ
のハイブリダイゼーション複合体の存在とサンプルにおけるポリヌクレオチドの
存在とが相関性を有する、検出方法を提供する。本発明の一実施態様では、ハイ
ブリダイゼーションの前にポリヌクレオチドを増幅する過程を含む。

【００１７】 本発明は更に、SEQ ID NO:1−65及びそれらの断片からなる一群から選択され
たアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも
１つの断片を含む発現ベクターを提供する。別の実施態様では、発現ベクターは
宿主細胞内に含まれる 本発明はまた、ポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）ポリペプチドの
発現に好適な条件の下、ポリヌクレオチドの少なくとも１つの断片を有する発現
ベクターを含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）その宿主細胞の培地からその
ポリペプチドを回収する過程とを含む製造方法を提供する。

【００１８】 本発明はまた、SEQ ID NO:1−65及びそれらの断片からなる一群から選択され
たアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を
好適な医薬用担体と共に提供する。

【００１９】 更に本発明は、SEQ ID NO:1−65及びそれらの断片からなる一群から選択され
たポリペプチドと結合する精製された抗体を提供する。また、本発明は、そのポ
リペプチドの精製されたアゴニスト及びアンタゴニストとを提供する。

【００２０】 本発明はまた、ＨＴＲＭの発現または活性の低下に関連した細胞増殖異常症の
治療または予防が必要な患者にSEQ ID NO:1−65及びそれらの断片からなる一群
から選択されたアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医
薬品組成物を好適な医薬用担体と共に効果的な量投与することを含む、ＨＴＲＭ
の発現または活性の低下に関連した細胞増殖異常症の治療または予防方法を提供
する。

【００２１】 本発明はまた、ＨＴＲＭの発現または活性の増加に関連した細胞増殖異常症の
治療または予防が必要な患者にSEQ ID NO:1−65及びそれらの断片からなる一群
から選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのアンタゴニストを効果的な
量投与することを含む、ＨＴＲＭの発現または活性の増加に関連した細胞増殖異
常症の治療または予防方法を提供する。

【００２２】 本発明の記載について 本発明のタンパク質及び核酸配列、方法について説明する前に、本発明は、こ
こに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更でき
ることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説
明する目的で用いられたものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、
本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい
。

【００２３】 本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」
は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って
、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体
は含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。

【００２４】 本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、
本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。
本明細書で記述したものと類似、或いは同等の全ての装置及び材料、方法は本発
明の実施及びテストに使用できるが、好適な装置及び材料、方法をここに記す。
本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に
記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用し
た。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈さ
れるものではない。

【００２５】 定義 本明細書において「ＨＴＲＭ」とは、天然、合成、半合成或いは組換え体など
全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ及び好ましくは人類を含む哺
乳動物）から得られる実質的に精製されたＨＴＲＭのアミノ酸配列のことである
。

【００２６】 本明細書において「アゴニスト」とは、ＨＴＲＭと結合したとき、ＨＴＲＭの
効果を増大する、或いはその持続時間を延長する分子のことである。このアゴニ
ストには、ＨＴＲＭに結合してその効果を変調するタンパク質、核酸、糖質、任
意の他の分子を含み得る。

【００２７】 本明細書において、「アレル変異配列」とは、ＨＴＲＭをコードする遺伝子の
別の形である。アレル変異配列は、核酸配列における少なくとも１つの変異によ
って生じ、変異ｍＲＮＡ若しくは変異ポリペプチドになり、これらの構造や機能
は変わる場合もあれば変わらない場合もある。天然或いは組換え体のすべての遺
伝子には、アレル形が存在しないもの、１つ或いは多数存在するものがある。一
般にアレル変異配列を生じる変異は、ヌクレオチドの自然な欠失、付加、或いは
置換による。これらの各変異は、単独或いは他の変異と同時に起こり、所定の配
列内で一回或いはそれ以上生じる。

【００２８】 本明細書において、ＨＴＲＭをコードする「変異」核酸配列とは、様々なヌク
レオチドの欠失、挿入、或いは置換が起こっても、ＨＴＲＭと同じポヌクレオチ
ド或いはＨＴＲＭの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドのことであ
る。この定義には、ＨＴＲＭをコードするポリヌクレオチド配列の正常の染色体
の遺伝子座ではない位置でアレル変異配列と不適当或いは予期せずハイブリダイ
ゼーション、及びＨＴＲＭをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレ
オチドプローブを用いて、容易に検出可能な或いは検出困難な多形性を含む。コ
ードされたタンパク質も変異され得り、サイレント変化を生じＨＴＲＭと機能的
に等価となるアミノ酸残基の欠失、挿入、或いは置換を含み得る。意図的なアミ
ノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にＨＴＲＭの活性が保持される範囲で、残
基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類
似性に基づいて成され得る。たとえば、負の電荷をもつアミノ酸は、アスパラギ
ン酸及びグルタミン酸を含み得り、正の電荷をもつアミノ酸は、リジン及びアル
ギニンを含み得り、そして近い親水性値をもち非電荷極性頭基を有するアミノ酸
は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グ
ルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン及びチロシンを含みうる。

【００２９】 本明細書において「アミノ酸」或いは「アミノ酸配列」とは、オリゴペプチド
、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列及びその断片であり、天然の分
子または合成された分子である。ＨＴＲＭの断片である「断片」及び「免疫原性
断片」、「抗原性断片」は、好ましくはアミノ酸約５〜約１５個の長さであり、
最も好ましくはアミノ酸１４個の長さであり、ＨＴＲＭのある生物学的活性また
は免疫学的活性を保持する。ここでは、「アミノ酸配列は自然発生タンパク質分
子のアミノ酸配列であるが、アミノ酸配列及び類似の用語は、列記したタンパク
質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定されるわけではない。

【００３０】 本明細書において用語「増幅」とは、核酸配列の付加的な複製を生成すること
に関連する。一般にはこの技術分野では公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
技術を用いて行われる(例えば、Dieffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) P
CR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press,Plainview, NY,
pp. 1-5.を参照)。

【００３１】 本明細書において、「アンタゴニスト」とは、ＨＴＲＭと結合したとき、ＨＴ
ＲＭの生物学的または免疫学的活性の効果の程度を低下させたり、その持続時間
を短縮する分子である。アンタゴニストは、タンパク質、核酸、糖質、抗体また
はＨＴＲＭの効果を減少させるの他の分子である。

【００３２】 本明細書において「抗体」とは、Ｆab及びＦ(ab')₂、及びそれらの断片、Ｆｖ
断片などの無傷の分子であり、抗原決定基と結合可能である。ＨＴＲＭポリペプ
チドと結合する抗体は、抗体を免疫する目的の小さなペプチドを含む無傷の分子
またはその断片を用いて調整可能である。動物（例えば、マウス、ラット、若し
くはウサギ）を免疫化するのに使用されるポリペプチド或いはオリゴペプチドは
、ＲＮＡの翻訳から引き出されたり化学的に合成され得り、必要に応じて担体プ
ロテインと結合することも可能である。ペプチドと化学的に結合した一般に用い
られる担体は、ウシ血清アルブミン、チログロビン、及びキーホールリンペット
ヘモニアン（ＫＬＨ）を含む。次ぎに、この結合したペプチドを用いて動物を免
疫化する。

【００３３】 本明細書において「抗原決定基」とは、特定の抗体と接触する分子のフラグメ
ント（即ちエピトープ）である。タンパク質或いはタンパク質の断片が、宿主動
物を免疫化するのに用いられるとき、このタンパク質の種々の領域は、抗原決定
基（タンパク質上の所定の領域或いは三次元構造体）に特異的に結合する抗体の
産生を誘発し得る。抗原決定基は、抗体と結合するために無傷の抗原（即ち、免
疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。

【００３４】 本明細書において「アンチセンス」とは、特定の核酸配列のセンス鎖と相補的
な核酸配列を含む全ての組成物である。アンチセンス分子は、合成や転写を含む
任意の方法で作り出すことができる。相補的ヌクレオチドは、一度細胞に導入さ
れると、細胞によって作られた天然の配列と結合して二重鎖を形成し、転写や翻
訳を阻害する。「マイナス（−）」という表現はアンチセンス鎖と言え、「プラ
ス（＋）」という表現はセンス鎖と言える。

【００３５】 本明細書において「生物学的活性」とは、自然発生分子の構造的、調節的、或
いは生化学的機能を有するタンパク質のことである。同様に、「免疫学的に活性
」とは、天然或いは組換え体のＨＴＲＭ、合成のＨＴＲＭまたはそれらの任意の
オリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗
体と結合する能力のことである。

【００３６】 本明細書において「相補的」若しくは「相補性の」とは、許容の塩と許容の温
度条件の下で、塩基対の形成によってポリヌクレオチドが自然に結合することで
ある。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」と相補的な配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」と結合する。
２つの一本鎖分子間の相補性は、幾つかの核酸が結合するのみの部分的な場合、
或いは一本鎖間に完全な相補性が存在して完全な相補性となる場合があり得る。
核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度
に大きな影響を与える。このことは、核酸鎖間の結合に左右される増幅反応、並
びにペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の設計若しくは使用において特に重要である。

【００３７】 本明細書において「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定
のアミノ酸配列を含む組成物」とは広い意味で、所定のヌクレオチド配列或いは
アミノ酸配列を含む任意の組成物のことである。この組成物は、乾燥した製剤或
いは水溶液、無菌組成物を含み得る。ＨＴＲＭ若しくはＨＴＲＭの断片をコード
するポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブと
して使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質など
の安定化剤と結合可能である。ハイブリダイゼーションにおいて、プローブは、
塩（例えば、ＮａＣｌ）及び界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、その他の物質（例
えば、デンハート液、乾燥ミルク、サケ精子ＤＮＡ等）を含む水溶液に展開され
得る。

【００３８】 本明細書において「コンセンサス配列」とは、不要な塩基を分離するために再
配列された核酸配列であって、ＸＬ−ＰＣＲ^TM（Perkinn Elmer, Norwalk, CT）
を用いて５'及び／または３'の方向に延長されて再配列された核酸配列、或いは
GELVIEW^TM Fragment Assembly system（GCG, Madison, WI）などのフラグメント
の構築のためのコンピュータプログラムを用いて２つ以上のインサイトクローン
社の重複配列から構築された核酸配列のことである。延長及び構築の両方によっ
てコンセンサス配列に構築されるものもある。

【００３９】 本明細書において「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」とは、ノーザ
ン分析によるＨＴＲＭをコードする核酸配列と同じ或いは関連する核酸の検出が
、サンプル内のＨＴＲＭをコードする核酸の存在を示すことから、ＨＴＲＭをコ
ードするポリヌクレオチドからの転写物の発現と相関性を有することを意味する
。

【００４０】 本明細書において「欠失」とは、１個以上のアミノ酸残基若しくは核酸残基が
欠如するアミノ酸配列若しくは核酸配列の変化である。

【００４１】 本明細書において「誘導体」とは、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド
配列の化学修飾のことである。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、
アルキル基、アシル基、或いはアミノ基による水素の置換がある。誘導体ポリヌ
クレオチドは、自然分子（未修飾の分子）の生物学的或いは免疫学的機能を少な
くとも１つ保持するポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドとは、もと
のポリペプチドの生物学的機能、或いは免疫学的機能を少なくとも１つ保持する
、グリコシル化、ポリエチレングリコール化、或いは任意の同様のプロセスによ
って修飾されたものである。

【００４２】 本明細書において「類似性」とは、相補性の程度を表すものである。これには
、部分的類似性と完全な類似性とがあり得る。この「同一性」は「類似性」とも
言える。同一の配列が標的の核酸とハイブリダイゼーションするのを少なくとも
部分的に阻止する部分的に相補的な配列は、「実質的に同様」と呼ばれる。完全
に相補的な配列と標的の配列とのハイブリダイゼーションの抑制は、厳密性を低
下させた条件の下ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロッティング或い
はノーザンブロッティング法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検査さ
れる。実質的に同様の配列或いはハイブリダイゼーションプローブは、厳密性を
低下させた条件の下、完全に相補的な配列と標的の配列との結合に対して競合し
て抑制する。これは、厳密性を低下させた条件では、２つの配列の互いへの結合
が特異的（即ち、選択的）に相互作用しなけらばならず、厳密性を低下させた条
件の下では非特異的な結合が許容されるということではない。部分的な相補性と
もいえない（例えば、３０％未満の類似性或いは同一性）第２の標的配列を用い
て、非特異的結合が存在しないことの検査が可能である。非特異的結合が存在し
ない場合は、実質的に類似配列或いはプローブが第２の非相補的標的配列とハイ
ブリダイゼーションしない。

【００４３】 本明細書において「百分率同一性」又は「％同一性」とは、２つ以上のアミノ
酸配列或いは核酸配列の比較で見つかった配列類似性の百分率のことである。こ
の百分率同一性は、例えば、MegAlignプログラム(DNASTAR, Inc., Madison Wl)
など電子装置を用いて決定可能である。このMegAlignプログラムは、様々な方法
、例えば、クラスター方法 (Higgins, D.G.及びP.M. Sharp (1988) Gene73:237-
244.)に従って、２つ以上の配列間のアライメントを作り出すことが可能である
。クラスターアルゴリズムが、全ての組の間の距離を測って、配列を各クラスタ
ーに分類する。これらのクラスターは、組によって整列され、次ぎにグループに
分けられる。２つのアミノ酸の配列間の百分率類似性、例えば配列Ａと配列Ｂの
百分率類似性は、配列Ａと配列Ｂの一致する残基の合計数を、配列Ａの長さから
配列Ａのギャップ残基数と配列Ｂのギャップ残基数とを差し引いたもので除し、
それに１００を掛けることによって得られる。２つのアミノ酸配列間の低い類似
性或いは非類似性のギャップは、百分率類似性の決定には含まれない。核酸配列
間の百分率同一性はまた、クラスター法或いはJotun Hein法などの当分野で公知
の別の方法によってカウント或いは計算することも可能である(例えば、Hein. J
. (1990) Methods Enzymol. 183:626-645.を参照)。配列間の同一性はまた、例
えば、ハイブリダイゼーションの条件を変えるなどの当分野で公知の別の方法に
よって決定することも可能である。

【００４４】 ヒト人工染色体（ＨＡＣ）は、６Ｋｂ〜１０ＭｂのサイズのＤＮＡ配列を含み
得り、安定した分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の微
小染色体である（Harrington, J.J.等 (1997) Nat Genet. 15:345-355を参照）
。

【００４５】 本明細書において「ヒト化抗体」とは、もとの結合能力を保持しつつよりヒト
の抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変異された抗体分子で
ある。

【００４６】 本明細書において「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の一本鎖が相補的な
一本鎖と塩基対を形成して結合する全てのプロセスである。

【００４７】 本明細書において「ハイブリダイゼーション複合体」とは、相補的な塩基対間
の水素結合の形成によって、２つの核酸配列間に形成された複合体のことである
。ハイブリダイゼーション複合体は溶液中（例えば、Ｃ₀ｔまたはＲ₀ｔ分析）で
形成されるか、或いは溶液中の１つの核酸配列と固体の支持物（例えば、紙、膜
、フィルター、チップ、ピン、或いはスライドガラス、または細胞及びその核酸
を固定する任意の適当な基板）に固定されたもう一つの核酸配列との間で形成さ
れ得る。

【００４８】 本明細書において「挿入」或いは「付加」とは、自然発生の分子の配列に対し
て、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸
配列或いは核酸配列の変化のことである。

【００４９】 本明細書において「免疫応答」とは、炎症性疾患及び外傷、免疫異常、感染症
、遺伝病などと関係する症状である。これらの症状は、細胞系及び全身防衛系に
影響を及ぼすサイトカイン及びケモカイン、別の情報伝達分子などの様々な因子
の発現によって特徴づけられ得る。

【００５０】 本明細書において「マイクロアレイ」とは、基板上に配列された様々なポリヌ
クレオチドのアレイのことである。

【００５１】 本明細書のマイクロアレイの記述における「要素」或いは「アレイ要素」とは
、基板の表面に配列されたハイブリダイゼーション可能なポリヌクレオチドのこ
とである。

【００５２】 本明細書において「変調」とは、ＨＴＲＭの活性の変化のことである。変調の
例として、ＨＴＲＭのタンパク質活性の特性、或いは結合特性、またはその他の
生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化がある。

【００５３】 本明細書において「核酸」或いは「核酸配列」とは、ヌクレオチド、オリゴヌ
クレオチド、ポリヌクレオチド、或いはそれらの断片を指す。また、一本鎖若し
くは二本鎖のセンス鎖或いはアンチセンス鎖であるゲノム若しくは合成起源のＤ
ＮＡ或いはＲＮＡと、またペプチド核酸（PNA）や任意のＤＮＡ様物質、ＲＮＡ
様物質も指す。「断片（またはフラグメント）」とは、翻訳された場合に完全長
のポリペプチドの抗原性などの機能的特徴或いはＡＴＰ結合部位などの構造的特
徴を維持したポリペプチドを形成する核酸配列のことである。

【００５４】 本明細書において「機能的に関係した」或いは「機能的に結合した」とは、機
能的に関係する核酸配列のことである。コードされたポリペプチドの転写をプロ
モータが制御する場合、そのプロモーターはコードする配列と機能的に関係する
或いは機能的に結合する。機能的に関係した或いは機能的に結合した核酸配列は
近接して同じ読み枠内に存在し得るが、リプレッサー遺伝子などのある種の遺伝
子要素は、ポリペプチドをコードする配列とは近接して結合していないが、ポリ
ペプチドの発現を調節するオペレーター配列とは結合したままである。

【００５５】 本明細書において「オリゴヌクレオチド」とは、ＰＣＲ増幅、ハイブリダイゼ
ーション、或いはマイクロアレイに使用可能な核酸配列のことであり、その長さ
は少なくとも６ヌクレオチドから６０ヌクレオチドである。好ましくは約１５か
ら３０ヌクレオチドであり、さらに好ましいくは約２０から２５のヌクレオチド
である。本明細書において、オリゴヌクレオチドは、当技術分野では同一と定義
される「アンプリマー」及び「プライマー」、「オリゴマー」と実質的に同じで
ある。

【００５６】 本明細書において「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）とは、末端がリジンで終わるア
ミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、約５ヌクレオチド以上の長さの
オリゴヌクレオチドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤のことである。この
末端のリジンにより、この組成物が溶解性を有する。ＰＮＡは、相補的な一本鎖
ＤＮＡやＲＮＡに優先的に結合して転写物の伸長を止め、ポリエチレングリコー
ル化して細胞において寿命を延ばし得る。（例えば、Nielsen, P.E.他(1993) An
ticancer Drug Des. 8:53-63を参照）。

【００５７】 本明細書において「サンプル」とは、その最も広い意味で用いられている。Ｈ
ＴＲＭをコードする核酸若しくはその断片、ＨＴＲＭ自体を含むと推測される生
物学的サンプルには、体液と、細胞からの抽出物や細胞から単離された染色体や
細胞内小器官、膜と、細胞と、溶液中又は固体の支持物に固定されたゲノムＤＮ
Ａ，ＲＮＡ，ｃＤＮＡと、組織又は組織プリント等も含まれ得る。

【００５８】 本明細書において「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、タンパク
質或いはペプチドとアゴニスト或いは抗体、アンタゴニストとの間の相互作用の
ことである。この相互作用は、結合する分子によって認識される、例えば、抗原
決定基つまりエピトープなどのタンパク質の特定の構造の存在によって左右され
る。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していな
い標識した「Ａ」及びその抗体を含む反応において、エピトープＡを含むポリペ
プチドが存在するか或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と
結合する標識Ａの量が減少する。

【００５９】 本明細書において「厳密な条件」とは、ポリヌクレオチドと請求項に記載され
たポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な条件である。厳密な条
件は、塩濃度及び有機溶剤（例えば、ホルムアミド）の濃度、温度、及び当分野
で公知の別の条件によって決められる。詳細には、塩の濃度を下げたり、ホルム
アミドの濃度を上げたり、またハイブリダイゼーションの温度を上げることで厳
密性を高めることができる。

【００６０】 本明細書において「実質的に精製された」とは、自然の環境から取り除かれて
から、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合
している構成要素が少なくとも約６０％以上除去されたものであり、好ましくは
約７５％以上の除去、最も好ましいのは約９０％以上除去されたものである。

【００６１】 本明細書において「置換」とは、一つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドをそ
れぞれ別のアミノ酸またはヌクレオチドに置き換えることである。

【００６２】 本明細書において「基板」とは、膜、フィルター、チップ、スライド、ウエハ
、ファイバー、磁気或いは非磁気のビード、ゲル、管、プレート、ポリマー、微
細粒子、毛管を含む好適な固体或いは半固体の支持物のことである。基板は、ポ
リヌクレオチドやポリペプチドが結合する壁及び溝、ピン、チャンネル、孔など
の様々な表面形態を有する。

【００６３】 本明細書において「形質転換」とは、外来ＤＮＡが入り込みレセプター細胞を
変化させるプロセスのことである。形質転換は、当分野で公知の種々の方法によ
り、自然或いは人工の条件の下で起こり得り、原核宿主細胞若しくは真核宿主細
胞の中に外来核酸配列を挿入する任意の公知の方法によって行うことができる。
この形質転換の方法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択される。
この方法には、ウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リポフ
ェクション、及び微粒子照射が含まれるが、限定されるものではない。「形質転
換された」細胞には、導入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして或
いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含ま
れる。さらに、限られた時間に一時的に導入ＤＮＡ若しくは導入ＲＮＡを発現す
る細胞も含まれる。

【００６４】 本命鎖書において「変異体」とは、一つ以上のアミノ酸が変異したアミノ酸配
列である。この変異体には、例えばロイシンとイソロシンとの置換のような、置
換されたアミノ酸が類似の構造或いは類似の化学特性を有する「保存的」変異が
含まれる。稀ではあるが、変異体には、グリシンをトリプトファンで置換する「
非保存的」変異も含まれる。また、類似の小さな変異には、アミノ酸の欠失、挿
入、或いはその両方が含まれる。当分野で公知の例えばＬＡＳＥＲＧＥＮＥ^TMソ
フトウエアを用いて、生物学的或いは免疫学的活性を損なうことなく、どのアミ
ノ酸残基を置換、挿入、或いは欠失させるかを決めることができるであろう。

【００６５】 ポリヌクレオチド配列の文脈の中で用いられる「変異配列」とは、ＨＴＲＭに
関連したポリヌクレオチド配列を含み得る。この定義は、例えば、「アレル」、
「スプライス」、「種」、「多形性」変異配列についてもいえる。スプライ変異
配列は基準分子と極めて同一性が高い可能性があるが、ｍＲＮＡプロセッシング
中のエキソン交互のスプライシングによってポリヌクレオチドの数が多くなった
り、少なくなったりする。対応するポリペプチドは、機能ドメインが加わったり
、ドメインが減ったりし得る。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオチ
ド配列である。できたポリペプチドは、互いに高いアミノ酸同一性を有する。多
形性変異配列は、所定の種と種の間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列にお
ける変異である。多形性変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つの塩基が
異なる「１つのヌクレオチド多形性」（ＳＮＰ）も含み得る。ＳＮＰの存在は、
例えば、或る集合、病状、病状の性向を表し得る。

【００６６】 発明 本発明は、新規のヒト転写調節分子(ＨＴＲＭ)、及びＨＴＲＭをコードするポ
リヌクレオチドの発見に基づき、細胞増殖異常症及び免疫異常症の診断、治療、
または予防におけるこれらの組成物の使用法に関する。

【００６７】 表１は、ＨＲＴＭをコードする完全長のヌクレオチド配列を得るために用いた
インサイト社クローンのリストである。列１及び列２は、アミノ酸及び核酸の配
列ＩＤ番号（SEQ ID NO）を示す。列３は、それぞれのＨＴＲＭをコードする核
酸が同定されたインサイト社クローンのクローンＩＤを示し、列４は、これらの
クローンを単離したｃＤＮＡライブラリを示す。列５は、インサイト社クローン
のそれぞれに対応するｃＤＮＡライブラリのショットガン配列を示す。

【００６８】 表２の各列は、本発明のポリペプチドの様々な特性を示す。列１はアミノ酸の
配列ＩＤ番号SEQ ID NO、列２はそれぞれのポリペプチドのアミノ酸残基の数、
列３は潜在リン酸化部位、列４は潜在グリコシル化部位、列５はサイン配列及び
モチーフを含むアミノ酸残基、列６は各タンパク質のＩＤ、列７は配列相同性及
びタンパク質モチーフによって各タンパク質を同定するために用いた分析方法を
それぞれ示す。

【００６９】 表３の列は、ＨＴＲＭをコードするヌクレオチド配列と関連する組織特異性、
疾患、異常症、状態を示す。表３の第１の列はヌクレオチド配列ＩＤを示す。第
２の列は、ＨＴＲＭを発現する全組織カテゴリーの断片としてＨＴＲＭを発現す
る組織カテゴリーを示す。第３の列は、ＨＴＲＭをコードする組織と関連する疾
患、異常症、状態を示す。第４の列はｃＤＮＡライブラリのサブクローンに用い
たベクターを示す。

【００７０】 以下に示すＨＴＲＭをコードするヌクレオチド配列の断片は、SEQ ID NO:110
−130の同定するため及びSEQ ID NO:110−130と関連するポリヌクレオチド配列
との区別するためのハイブリダイゼーションや増幅技術に有用である。有用な断
片は、SEQ ID NO:110の概ねヌクレオチド２７３から３１７までの断片と、SEQ I
D NO:111の概ねヌクレオチド２１７から２６１までの断片と、SEQ ID NO:112の
概ねヌクレオチド２７３から３０８までの断片と、SEQ ID NO:113の概ねヌクレ
オチド１６３から２０７までの断片と、SEQ ID NO:114の概ねヌクレオチド４３
３から４７７までの断片と、SEQ ID NO:115の概ねヌクレオチド５９７から６４
１までの断片と、SEQ ID NO:116の概ねヌクレオチド１１１から１４６までの断
片と、SEQ ID NO:117の概ねヌクレオチド２１７から２６１までの断片と、SEQ I
D NO:118の概ねヌクレオチド８６７から９１１までの断片と、SEQ ID NO:119の
概ねヌクレオチド１０８２から１１２６までの断片と、SEQ ID NO:120の概ねヌ
クレオチド７０２から７４８までの断片と、SEQ ID NO:121の概ねヌクレオチド
３８０から４２４までの断片と、SEQ ID NO:122の概ねヌクレオチド３５２から
３９６までの断片と、SEQ ID NO:123の概ねヌクレオチド２１９から２６３まで
の断片と、SEQ ID NO:124の概ねヌクレオチド３２６から３７０までの断片と、S
EQ ID NO:125の概ねヌクレオチド５９５から６３９までの断片と、SEQ ID NO:12
6の概ねヌクレオチド２７２から３１６までの断片と、SEQ ID NO:127の概ねヌク
レオチド１６３から２０７までの断片と、SEQ ID NO:128の概ねヌクレオチド２
７１から３１５までの断片と、SEQ ID NO:129の概ねヌクレオチド８６６から９
１０までの断片と、SEQ ID NO:130の概ねヌクレオチド４８７から５３１までの
断片とである。

【００７１】 本発明はまた、ＨＴＲＭの変異体を含む。ＨＴＲＭの変異体は、好ましくはＨ
ＴＲＭのアミノ酸配列と約８０％以上の配列同一性、更に好ましくは約９０％以
上の配列同一性、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有し、ＨＴＲＭの
機能的特性或いは構造的特性のうちの少なくとも１つが保存されている。

【００７２】 本発明はまた、ＨＴＲＭをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施例
において、本発明は、ＨＴＲＭをコードするSEQ ID NO:66−130からんなる一群
から選択された配列を有するポリヌクレオチド配列を含む。

【００７３】 本発明はまた、ＨＴＲＭをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む
。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、好ましくはＨＴＲ
Ｍをコードするポリヌクレオチド配列と７０％以上の配列同一性、更に好ましく
は８０％以上の配列同一性、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する
。また本発明の特定の実施態様では、SEQ ID NO:66−130からなる一群から選択
された核酸配列と少なくとも約７０％の配列同一性、好ましくは約８０％以上の
配列同一性、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有するSEQ ID NO: 66
−130からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列
を含む。上記の各ポリヌクレオチド変異配列のすべてが、ＨＴＲＭの機能的或い
は構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。

【００７４】 遺伝暗号の縮重により作り出され得るＨＴＲＭをコードする種々のポリヌクレ
オチド配列には、既知の自然発生する任意の遺伝子のポリヌクレオチド配列と最
小の類似性しか有しないものも含まれることを、当業者は理解するであろう。し
たがって本発明には、可能なコドン選択に基づいた組み合わせの選択によって作
り出され得る可能なポリヌクレオチド配列の変異の全てが含まれ得る。これらの
組み合わせは、自然発生のＨＴＲＭのポリヌクレオチド配列に適用される標準的
なトリプレット遺伝暗号を基に作られ、全ての変異が明確に開示されていると考
慮する。

【００７５】 ＨＴＲＭをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、好適に選択され
た厳密な条件の下で、自然発生のＨＴＲＭのヌクレオチドとハイブリダイズ可能
なことが望ましいが、非自然発生のコドンを含めるなどの実質的に異なったコド
ンの使用を有するＨＴＲＭ又はその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り
出すことは有益となり得る。特定のコドンが宿主によって利用される頻度に基づ
いてコドンを選択して、ペプチドの発現が特定の真核細胞又は原核宿主に発生す
る割合を高めることが可能である。コードされたアミノ酸配列を変えないで、Ｈ
ＴＲＭ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理
由は、自然発生の配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特
性を備えるＲＮＡ転写物を作ることにある。

【００７６】 本発明はまた、ＨＴＲＭ及びその誘導体をコードするＤＮＡ配列又はそれらの
断片を完全に合成化学によって作り出すことも含む。作製後にこの合成配列を、
当分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系
の何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、ＨＴＲＭまたはその
任意の断片をコードする配列の中に突然変異を導入することも可能である。

【００７７】 更に本発明には、種々の厳密性条件の下で、請求項に記載されたポリヌクレオ
チド配列とハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる。詳しくは、
記載のSEQ ID NO:66−130またはその断片とハイブリダイズ可能なポリヌクレオ
チド配列が含まれる。(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods En
zymol. 152:399-407; and Kimmel. A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511
.を参照)。例えば、厳密な塩濃度は、通常は約７５０ｍＭ未満の塩化ナトリウム
と約７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、好ましくは約５００ｍＭ未満
の塩化ナトリウムと約５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、最も好まし
くは約２５０ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウ
ムである。例えば、ホルムアミドなどの有機溶剤を使用しないと、厳密性の低い
ハイブリダイゼーションになり、約３５％以上のホルムアミド、更に好ましくは
５０％以上のホルムアミドを使用すると、厳密性の高いハイブリダイゼーション
になる。温度の厳密条件は、通常は約３０℃以上であり、より好ましくは約３７
℃以上であり、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の変更できるパラメ
ーターには、ハイブリダイゼーション時間、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
などの薬品の濃度、キャリアＤＮＡの含有の有無があり、当分野の技術者には公
知である。必要な様々な条件を組み合わせることで、厳密性の程度を変えること
ができる。好適な実施例では、ハイブリダイゼーションは、温度が３０℃で、７
５０ｍＭの塩化ナトリウムと７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳで
行う。より好適な実施例では、温度が３７℃で、５００ｍＭの塩化ナトリウムと
５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミド、１０
０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）で行う。最も好適な実施例で
は、温度が４２℃で、２５０ｍＭの塩化ナトリウムと２５ｍＭのクエン酸三ナト
リウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミド、２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ
で行う。これらの条件の有用な変更は、当分野の技術者には明らかである。

【００７８】 ハイブリダイゼーションの後の洗浄過程にも、様々な厳密性の程度がある。洗
浄の厳密な条件は、塩濃度と温度によって決められる。上記したように、塩濃度
を下げること或いは温度を上げることで洗浄の厳密性を高めることができる。例
えば、洗浄過程での塩濃度の厳密な条件は、好ましくは約３０ｍＭ未満の塩化ナ
トリウムと約３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、更に好ましくは約１５
ｍＭ未満の塩化ナトリウムと約１０５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムである。
洗浄過程の温度の厳密な条件は、通常は約２５℃以上であり、好ましくは約４２
℃以上であり、更に好ましくは約６８℃以上である。好適な実施例では、洗浄過
程は、温度が２５℃で、３０ｍＭの塩化ナトリウムと３ｍＭのクエン酸三ナトリ
ウム、０．１％ＳＤＳで行われる。より好適な実施例では、洗浄過程は、温度が
４２℃で、１５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０
．１％ＳＤＳで行われる。最も好適な実施例では、洗浄過程は、温度が６８℃で
、１５ｍＭの塩化ナトリウムと１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１％Ｓ
ＤＳで行われる。更なるこれらの条件の変更は、当分野の技術者には明らかであ
る。

【００７９】 当分野で既知のＤＮＡのシークエンシング方法を用いて、本発明の何れの実施
例も実行可能である。この方法には、例えばＤＮＡポリメラーゼIのクレノウ断
片であるSequenase（US Biochemical社, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Pe
rkin Elmer）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Chicago IL）、或いはELON
GASE増幅システム(GIBCO/BRL,Gaithersburg, MD)にみられるような校正エキソヌ
クレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせなどの酵素が用いられる。このプロセ
スは、Hamilton Micro Lab2200（Hamilton, Reno, NV）、Peltier Thermal Cycl
er（PTC200；MJ Reserch, Watertown MA）並びにABI Catalyst及び373及び377 D
NAシーケンサ（Perkin Elmer）等の装置を用いて自動化するのが好ましい。次に
、ABI 373または377 DNAシークエンシングシステム(Perkin-Elmer)またはMEGABA
CE 1000 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamics. Sunnyvale CA)の
どちらか１つを用いてシークエンシングを行う。得られた配列を当分野で既知の
様々なアルゴリズムを用いて分析する(例えば、Ausubei, F.M. (1997) Short Pr otocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7;
Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New
York NY, pp. 856-853.を参照)。

【００８０】 部分的なヌクレオチド配列を利用し、当分野で既知のＰＣＲ法をベースにした
種々の方法を用いてＨＴＲＭをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調
節エレメントなどの上流にある配列を検出する。例えば制限部位ＰＣＲ法を利用
する１つの方法では、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを用いてクロ
ーニングベクター内のゲノムＤＮＡから未知の配列を増幅する。（例えば、Sark
ar, G. (1993) PCR Methods Applic 2:318-322を参照）。逆ＰＣＲ法を用いる別
法では、広範な方向に伸長して環状化した鋳型から未知の配列を増幅するプライ
マーを用いる。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制
限断片に由来する。（Triglia, T.等（1988）Nucleic Acids Res 16:8186）。キ
ャプチャＰＣＲ法を用いる第３の方法は、ヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡの既
知の配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む。（例えば、Lagerstrom, M.
他（1991）PCR Methods Applic 1:111-119を参照）。この方法では、多数の制限
酵素による消化及びライゲ−ションを用いて、ＰＣＲを行う前に未知の配列の領
域の中に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。また、当分野で公知の
別の方法を用いて未知の配列を得ることも可能である。(例えば、Parker, J.D.
他 (1991)Nucleic Acids Res. 19:3055-3060を参照)。更に、ＰＣＲ、ネスト化
プライマー、PromoterFinder^TMライブラリを用いれば、ゲノムＤＮＡ内の歩行が
可能である（Clontech, Palo Alto CA）。この方法ではライブラリをスクリーニ
ングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を探すのに有用である。全て
のＰＣＲ法をベースにした方法では、プライマーは、市販のOLIGO 4.06 Primer
Analysis software（National Biosciences社, Plymouth MN）或いは別の好適な
プログラムなどを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５０％
以上、約６８℃〜７２℃の温度で鋳型に対してアニールするよう設計される。

【００８１】 完全な長さのｃＤＮＡのスクリーニングの際は、大きなｃＤＮＡを含むように
サイズが選択されたライブラリを用いるのが好ましい。更に、オリゴｄ（Ｔ）ラ
イブラリが完全な長さのｃＤＮＡを産生できない場合は、遺伝子の５'領域を有
する配列を含むものが多いランダムに初回抗原刺激を受けたライブラリが有用で
ある。ゲノムライブラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう
。

【００８２】 市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシングまたはＰＣ
Ｒ産物のヌクレオチド配列のサイズの分析、または確認が可能である。詳しくは
、キャピラリーシークエンシングには、電気泳動による分離のための流動性ポリ
マー、及び４つの異なったヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光
色素、放出された波長の検出に利用するＣＣＤカメラを使用することが可能であ
る。出力／光強度は、適切なソフトウエア（例えばPerkin Elmer社のGenotyper^{T M} 及びSequence Navigator^TM）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローデ
ィングからコンピュータ分析までのプロセス及び電子データ表示がコンピュータ
制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在し
ない場合もあるＤＮＡの小片のシークエンシングに特に適している。

【００８３】 本発明の別の実施例では、ＨＴＲＭをコードするポリヌクレオチド配列または
その断片を組換えＤＮＡ分子に用いて、適切な宿主細胞内にＨＴＲＭ、その断片
または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の宿重により
、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列
が作られ得り、これらの配列をＨＴＲＭのクローン化及び発現に利用可能である
。

【００８４】 種々の目的でＨＴＲＭをコードする配列を変えるために、当分野で一般的に知
られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。
この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシング及び／または発現の調
節が含まれるが、これらに限定されるものではない。ランダムな断片によるＤＮ
Ａの混合や遺伝子断片と合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再組み立てを用いて、
ヌクレオチド配列の組換えが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの仲介に
よる定方向突然変異誘発を利用して、新しい制限部位を生成する突然変異の導入
、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライスバリアントの生
成等が可能である。

【００８５】 別の実施例によれば、ＨＴＲＭをコードする配列は、当分野で周知の化学的方
法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Caruthers. M.H.等（1
980）Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223; 及びHorn, T.他（1980）Nucl. Acids
Res Symp. Ser.225-232を参照）。別法として、化学的方法を用いてＨＴＲＭ自
体またはその断片を合成することが可能である。例えば、ペプチド合成は種々の
固相技術を用いて実行可能である（例えば、Roberge, J.Y.等(1995) Science 26
9:202-204を参照）。また、合成の自動化は例えばABI 431Aペプチドシンセサイ
ザ（Perkin Elmer）を用いて達成し得る。更にＨＴＲＭのアミノ酸配列または任
意のその一部は、直接的な合成の際の変更、及び／または化学的方法を用いた他
のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、変異体ポ
リペプチドを作ることが可能である。

【００８６】 このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィー(例えば、Chiez, R.M.
及び F.Z. Regnier (1990)Methods Enzymol. 182:392-421を参照)を用いて実質
的に精製可能である。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸分析或いはシーク
エンシングにより確認することができる(例えば、Creighton. T. (1983) Protei n.s, Structures and Molecular Properties , WH Freeman and Co., New York,
NYを参照)。

【００８７】 生物学的に活性のＨＴＲＭを発現させるために、ＨＴＲＭをコードするヌクレ
オチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入する。この発現ベクタ
ーは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な
エレメントを含む。これらのエレメントには、ベクター及びＨＴＲＭをコードす
るポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモ
ーター、５'及び３'の非翻訳領域などの調節配列が含まれる。このようなエレメ
ントは、その長さ及び特異性が様々である。特定の開始シグナルによって、ＨＴ
ＲＭをコードする配列のより効果的な翻訳を達成することが可能である。このよ
うなシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及びコザック配列などの近傍の配列が含ま
れる。ＨＴＲＭをコードする配列及びその開始コドン、上流の調節配列が好適な
発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナル
は必要なくなるであろう。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみ
が挿入された場合は、インフレームのＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節
シグナルが発現ベクターに含まれなければならない。外来性の翻訳エレメント及
び開始コドンは、自然及び合成の様々なものから得ることが可能である。用いら
れる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高める
ことが可能である。(例えば、Scharf, D. 他 (1994) Results Probl. Cell Diff
er. 20:125-162.を参照)。

【００８８】 当業者に周知の方法を用いて、ＨＴＲＭをコードする配列、好適な転写及び翻
訳調節エレメントを含む発現ベクターを作製することが可能である。これらの方
法には、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術
が含まれる。(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Labor atom Manual , Cold Spring Harbor Press,Plainview, NY, 4章及び8章, 及び１6
-17章; 及び Ausubel, F.M. 他. (1995, and periodicsupplements) Current Pr otocols irt Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York,NY. ch. 9章及
び13章、16章を参照)。

【００８９】 種々の発現ベクター／宿主系を利用して、ＨＴＲＭをコードする配列の保持及
び発現が可能である。これらには、限定するものではないが、組換えバクテリオ
ファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細
菌などの微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換された酵母菌や、ウイルス発
現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発
現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイ
クウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２
２プラスミド）で形質転換された植物細胞系や、動物細胞系などが含まれる。本
発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。

【００９０】 細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、ＨＴＲＭをコ
ードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、Ｈ
ＴＲＭをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクロー
ニング、増殖には、Bluescript? (Stratagene)またはpSportlTM plasmid (GIBCO
BRL)などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターの多数の
クローニング部位にＨＬＯＲをコードする配列をライゲーションするとlacＺ遺
伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌の同定のための比色スク
リーニング法が可能となる。更に、これらのベクターを用いて、クローニングさ
れた配列のin vitroでの転写、ジデオキシンスクリーニング、ヘルパーファージ
による一本鎖の救出、入れ子状態の欠失を作り出すことが可能である。(例えば
、Van Heeke. G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509.を
参照)。例えば、抗体の産生のためなどに多量のＨＴＲＭが必要な場合は、ＨＴ
ＲＭの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力に発現
を誘発するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーターを含むベクターを使
用できる。

【００９１】 ＨＴＲＭの発現に酵母の発現系の使用が可能である。酵母菌サッカロミセス−
セレビジエでは、α因子やアルコールオキシダーゼやＰＧＨなどの構成型或いは
誘導型のプロモーターを含む多種のベクターが使用可能である。更に、このよう
なベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内への保持のどちらかを誘導し
、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込む。(例えば、上記
のAusubel.; 及び Grant 他 (1987) Methods Enzymol.153:516-54: Scorer. C.
A. 他 (1994) Bio/Technology 12:181-184.を参照) 植物系もＨＴＲＭの発現に使用可能である。ＨＴＲＭをコードする配列の転写
は、例えば、ＣａＭＶ由来の３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロ
モーターが単独で、或いはＴＭＶ（Takamatsu, N.等（1987）EMBO J 6:307-311
）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて促進される。これらの作製物は、直
接のＤＮＡ形質転換或いは病原体を介したトランスフェクションによって、植物
細胞の中に導入可能である。（例えば、Hobbs, S.又はMurry, L.E. in McGraw H ill Yearbook of Science and Technology（1992）McGraw Hill NY, pp.191-196
を参照）。

【００９２】 哺乳動物細胞では、多種のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウ
イルスが発現ベクターとして用いられる場合、後発プロモーター及び３連リーダ
ー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳複合体にＨＴＲＭをコードする配列
を結合し得る。ウイルスのゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域への挿入により
、感染した宿主細胞にＨＴＲＭを発現する生ウイルスを得ることが可能である（
Logan, J.及びShenk, T.（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659を参照
）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサー
を用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。タン
パク質を高レベルで発現させるために、ＳＶ４０またはＥＢＶを基にしたベクタ
ーを用いることが可能である。

【００９３】 ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドで発現しそれに含まれているも
のより大きなＤＮＡの断片を供給可能である。治療のために約６ｋｂ〜１０Ｍｂ
のＨＡＣｓを作製し、従来の方法（リボソーム、ポリカチオンアミノポリマー、
またはベシクル）で供給する。(例えば、Harrington. J.J. 他 (1997) Nat Gene
t.15:345-355.を参照)。

【００９４】 哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞にお
けるＨＴＲＭの安定した発現が望ましい。例えば、発現ベクターを用いて、ＨＴ
ＲＭをコードする配列を株化細胞に形質転換することが可能である。このような
発現ベクターは、ウイルス起源の複製及び／または内在性の発現エレメントや、
同じ或いは別のベクターの上の選択マーカー遺伝子を含む。ベクターの導入の後
、細胞を選択培地に移す前に、強化培地で約１〜２日の間増殖させる。選択マー
カーの目的は選択的な媒介物に対する抵抗性を与えるとともに、その存在により
導入された配列をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。安定的に形
質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に好適な組織培養技術を用いて
増殖可能である。

【００９５】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収することが可能であ
る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ遺伝子及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ
、それぞれtk^-又はaprt^-細胞において使用される。(例えば、Wigler, M. 他 (19
77) Cell 11:223-232; and Lowy. I. 他(1980) Cell 22:817-823を参照)。また
代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択のベースとして用いること
ができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグ
リコシッドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、als或いはpatはクロル
スルフロン（chlorsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラー
ゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える(例えば、Wigl
er, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-3570; Colbere-Garapin,
F. 他(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14; 及び上記のMurryを参照)。さらに選択に
利用できる遺伝子、例えば、代謝のために細胞が必要なものを変えるtrpB及びhi
sDが文献に記載されている（Hartman, S.C.及びR.C. Mulligan（1988）Proc. Na
tl. Acad. Sci. 85:8047-51を参照）。アニトシアニン、緑色蛍光タンパク質（
ＧＦＰ）(Clontech. Palo Alto. CA)、βグルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ
，ルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンなどの可視マーカーが用いられる。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）(Clontech, Palo Alto, CA)も使用できる。これ
らのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベ
クター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能
である（例えば、Rhodes, C.A.他（1995）Methods Mol. Biol. 55:121-131を参
照）。

【００９６】 マーカー遺伝子の発現の存在／不在によって目的の遺伝子の存在が示されても
、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、ＨＴＲＭをコ
ードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、ＨＴＲＭをコードす
る配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定可能
である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がＨＴＲＭをコ
ードする配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマ
ーカー遺伝子の発現は、通常タンデム遺伝子の発現も示す。

【００９７】 一般に、ＨＴＲＭをコードする核酸配列を含み、ＨＴＲＭを発現する宿主細胞
は、当業者に周知の種々の方法を用いて特定することが可能である。これらの方
法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションや、ＰＣ
Ｒ法、核酸或いはタンパク質の検出及び／または数量化のための膜系、溶液ベー
ス、或いはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的
アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。

【００９８】 特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるＨ
ＴＲＭの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。
このような技法には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラ
ジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光標示式細胞分取器（FACS）などがある。ＨＴ
ＲＭ上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部
位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immun
oassay）が好ましいが、競合の結合アッセイも用いることもできる。これらのア
ッセイ及びその他のアッセイは、当分野では十分に知られている。(例えば、 Ha
mpton. R. 他.(1990) Serological Methods, a Laboratony Manual. APS Press.
St Paul. MN, Section IV; Coligan. J. E. 他 (1997 and periodic supplemen
ts) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-In
terscience, New York. NY: 及び Maddox. D.E. 他 (1983) J. Exp. Med. 158:1
211-1216)。

【００９９】 種々の標識方法及び結合方法が当業者には周知であり、様々な核酸アッセイお
よびアミノ酸アッセイに用いられ得る。ＨＴＲＭをコードするポリヌクレオチド
に関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ
或いはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレー
ション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含ま
れる。別法として、ＨＴＲＭをコードする配列、またはその任意の断片をｍＲＮ
Ａプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。当
分野では周知であり市販されているこのようなベクターを、Ｔ７，Ｔ３，または
ＳＰ６などの好適なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドの追加によ
って、in vitroでのＲＮＡプローブの合成に用いることができる。これらの方法
は、例えば、Pharmacia＆Upjohn（Kalamazoo, MI）及びPromega（Madison WI）
、U.S. Biochemical Corp（Cleveland OH）が市販する種々のキットを用いて行
うことができる。容易な検出のために用い得る好適なレポーター分子或いは標識
には、基質、コファクター、インヒビター、磁気粒子、及び放射性核種、酵素、
蛍光剤、化学発光剤、色素産生剤などが含まれる。

【０１００】 ＨＴＲＭをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培
地でのこのタンパク質の出現及び回収に好適な条件の下で培養される。形質転換
された細胞で作製されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用さ
れるその配列及び／またはそのベクターによる。ＨＴＲＭをコードするポリヌク
レオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を通ってＨＴＲＭの
分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解さ
れよう。別の作製物を用いて、ＨＴＲＭをコードする配列を、可溶性タンパク質
の精製を促すポリペプチド領域をコードするヌクレオチド配列と結合させること
も可能である。このような精製を促す領域には、固定された金属上での精製を可
能とするヒスチジントリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド、固
定された免疫グロブリンでの精製を可能とするタンパク質Ａ領域、ＦＬＡＧＳ伸
長／アフィニティー精製システム（Immunex Corp., Seattle WA）に用いられる
領域が含まれるが、これらに限定されるものではない。精製領域と配列をコード
するＨＴＲＭとの間のXA因子或いはエンテロキナーゼ(Invitrogen, San Diego,
CA)に特異的なものなどの切断可能なリンカー配列を含むものを用いて、精製が
促進され得る。このような発現ベクターの１つは、ＨＴＲＭと、チオレドキシン
或いはエンテロキナーゼ切断部位に先行する６ヒスチジン残基をコードする核酸
とを含む融合タンパク質を発現させる。ヒスチジン残基は、固定された金属イオ
ンアフィニティクロマトグラフィー上で精製を促進する(IMAC)（例えば、Porath
, J他（1992）; Protein Exp. Purif. 3:263-281を参照）。エンテロキナーゼ切
断部位が、融合タンパク質からＨＴＲＭを精製する手段を提供する(例えば、Kro
ll, D.J.他(1993); DNA Cell Biol. 12:441-453を参照)。

【０１０１】 更に、挿入した配列の発現調節能力またはタンパク質の発現を所望の形にプロ
セシングする能力によって宿主細胞株が選択される。このようなポリペプチドの
修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（li
pidation）、及びアシル化が含まれるが、これらに限定されるものではない。タ
ンパク質の「prepro」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、標的タン
パク質、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活
性のための特定の細胞装置及び特徴のある機構をもつ異なった宿主細胞（例えば
、CHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38）がAmerican Type Culture Collection（ATC
C; Bethesda, MD）より入手可能であり、外来のタンパク質の正しい修飾及びプ
ロセシングを確実にするために選択される。

【０１０２】 本発明の別の実施例では、ＨＴＲＭをコードする自然或いは変更された、また
は組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種
配列に結合させる。例えば、市販の抗体によって認識できる異種部分を含むキメ
ラＨＴＲＭタンパク質が、ＨＴＲＭの活性のインヒビターに対するペプチドライ
ブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプ
チド部分が、市販の親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。こ
のような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース
結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、カルモジュリン結合ペ
プチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）が
含まれるが、これらに限定されるものではない。ＧＳＴ及びＭＢＰ、Ｔｒｘ、Ｃ
ＢＰ、６−Ｈｉｓによって、固定されたグルタチオン、マルトース、フェニルア
ルシン酸化物（phenylarsine oxide）、カルモジュリン、金属キレート樹脂のそ
れぞれで同族の融合タンパク質の精製が可能となる。ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｃ、及び
赤血球凝集素（ＨＡ）によって、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市
販のモノクロナール抗体及びポリクロナール抗体を用いた融合タンパク質の免疫
親和性の精製ができる。また、ＨＴＲＭをコードする配列と異種タンパク質配列
との間にあるタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が含むように遺伝子操作
すると、ＨＴＲＭが精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発
現と精製の方法は、Ausubel. F. M. 他による (1995 and periodic supplements
) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons. Ne,,v York.
NY. ch 10.に記載されている。本発明の別の実施例では、ＴＮＴ^TMウサギ網状
赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega. Madison. WI)を用いてin vit ro で放射能標識したＨＴＲＭの合成が可能である。これらの系は、Ｔ７またはＴ
３、ＳＰ６プロモーターと機能的に結合したタンパク質をコードする配列の転写
と翻訳をつなげる。転写は、好ましくは３５Ｓメチオニンである放射能標識され
たアミノ酸前駆体の存在の下で起こる。

【０１０３】 ＨＴＲＭの断片は、組換え生成物だけでなく固相技術を用いて直接的なペプチ
ド合成によって作製され得る(例えば、前出のCreighton, pp. 55-60.を参照)。
タンパク質の合成は、手動或いは自動で行われ得る。自動合成は、例えばApplie
d Biosystem 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行うことが可
能である。ＨＴＲＭの種々の断片は別々に合成して、次ぎに結合させて完全長分
子を生成する。

【０１０４】 治療 例えば、配列及びモチーフの中に化学的及び構造的類似性が、ＨＴＲＭ領域と
ヒト転写調節分子領域の間に存在する。更に、ＨＴＲＭの発現は、細胞増殖及び
炎症、免疫応答と密接な関係がある。従って、ＨＴＲＭが細胞増殖異常症及び免
疫異常症に関与すると思われる。ＨＴＲＭの発現または活性の増加に関連する疾
患の治療において、ＨＴＲＭの発現または活性を低下させることが理想である。
ＨＴＲＭの発現または活性の低下に関連した疾患の治療において、ＨＴＲＭの発
現や活性を高めることが理想である。

【０１０５】 従って、一実施例において、ＨＴＲＭの発現または活性の低下に関連した疾患
の患者に効果的な量のＨＴＲＭまたはその断片や誘導体を投与することが可能で
ある。このような疾患の例には、細胞増殖異常症が含まれ、その中には日光性角
化症及び動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合
組織病、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性
血小板血症があり、また、癌も含まれ、その中には腺癌及び白血病、リンパ腫、
黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、
乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓
、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが
あり、また、免疫異常症も含まれ、その中には後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ
）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロ
イド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免
疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎
、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、偶発性リンパ球減少症、赤芽球症、結節性紅斑、
萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本
甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、
心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライタ
ー症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラ
キシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少症、潰瘍性大腸炎
、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環と、ウィルス感染症及び細
菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫の感染症、外傷が含ま
れるが、これらに限定されるものではない。

【０１０６】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＨＴＲＭの
発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＨＴＲＭまた
はその断片や誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することも可能である。

【０１０７】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＨＴＲ
Ｍの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に
精製されたＨＴＲＭを含む医薬品組成物を好適な医薬用担体と共に患者に投与す
ることも可能である。

【０１０８】 更に別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＨＴＲ
Ｍの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、ＨＴＲＭ
の活性を調節するアゴニストを患者に投与することも可能である。

【０１０９】 更に、別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＨＴ
ＲＭの発現または活性の増加に関連した疾患の治療や予防のために、ＨＴＲＭの
活性を調節するアンタゴニストを投与することが可能である。一実施態様では、
ＨＴＲＭと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはＨＴＲＭ
を発現する細胞または組織に薬剤を運ぶ標的或いは運搬機構として間接的に用い
られ得る。

【０１１０】 別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むＨＴＲＭの
発現または活性の増加に関連した疾患の治療または予防のために、ＨＴＲＭをコ
ードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを患者に投与すること
も可能である。

【０１１１】 別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的な配列、ベクターを別の好適な治療薬と組み合わせて投与すること
もできる。当業者は、従来の医薬原理にしたがって併用療法で用いる好適な治療
薬を選択可能である。治療薬との組み合わせにより、上に列記した種々の疾患の
治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いて少ない量の各薬剤
で医薬効果をあげることが可能であり、広範囲な副作用の可能性を低減し得る。

【０１１２】 ＨＴＲＭのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが
可能である。詳しくは、精製されたＨＴＲＭを用いて抗体を作ったり、治療薬の
ライブラリをスクリーニングしてＨＴＲＭと特異的に結合するものを同定が可能
である。ＨＴＲＭの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能
である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメ
ラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリによって作ら
れたフラグメントが含まれる。但し、これらに限定されるものではない。治療用
には、中和抗体（即ち、二量体の形成を阻害するもの）が特に好ましい。

【０１１３】 抗体の作製のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト及びその他のも
のを含む種々の宿主が、ＨＴＲＭまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備
えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種
々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバ
ントにはフロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジ
ュバント、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油
性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、及びジニトロフェノールなどの界
面活性剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるア
ジュバントの中では、ＢＣＧ（bacilli Calmette-Guerin）及びCorynebacterium parvum が特に好ましい。

【０１１４】 ＨＴＲＭに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド
、または断片は、約５以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列が望ましく、更に望
ましいのは約１０以上のアミノ酸からなるものである。これらのオリゴペプチド
或いはペプチド、またはそれらの断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一
部と同一であることが望ましく、小さな自然発生の分子のアミノ酸配列全体も含
む。ＨＴＲＭアミノ酸の短い伸展部は、ＫＬＨ(キーホールリンペットヘモシニ
アン)などの別のタンパク質の配列と融合し、キメラ分子に対する抗体が産生さ
れ得る。

【０１１５】 ＨＴＲＭに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、
抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。これらの技
術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶ−ハ
イブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されるものではない（例えば、Ko
hler, G. 等. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor, D. 等. (1985) .J. Immuno
l. Methods 81.:31-42; Cote, R.J. 等. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:20
26-2030; Cole, S.P. 等. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120を参照）。

【０１１６】 更に、「キメラ抗体」の作製のために発達したヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺
伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を
備える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604
-608; Takeda, S.等. (1985) Nature 314:452,454を参照）。別法では、当分野
で周知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、
ＨＴＲＭ特異性一本鎖抗体を生成する。関連する特異性を備えるが別のイディオ
タイプの組成の抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリから
鎖混合によって生成することもできる（例えば、Burton D.R. (1991) Proc. Nat
l. Acad. Sci. 88:11120-3を参照）。

【０１１７】 抗体は、in vivoでのリンパ球集団の中の生成を誘発することによって、また
は免疫グロブリンライブラリのスクリーニング又は文献に示されているような、
高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって、作製する
こともできる（例えば、Orlandi, R. 他. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:
3833-3837; Winter, G. 他. (1991) Nature 349:293-299を参照）。

【０１１８】 ＨＴＲＭに対する特異的な結合部位を含む抗体も作製することができる。例え
ば、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ
’）２断片と、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減じることによって生
成されるＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。別法では
、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性とモノクローナ
ルＦａｂ断片の迅速且つ容易な同定が可能となる（例えば、Huse, W.D. 等. (19
89) Science 254:1275-1281を参照）。

【０１１９】 種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体
を同定する。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナ
ル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線活性のための数々のプ
ロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、ＨＴ
ＲＭとその特異性抗体との間の複合体調整の計測が含まれる。二つの非干渉性Ｈ
ＴＲＭエピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２部位モノク
ローナルベースのイムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイも利用する
ことができる(Pound、前出）。

【０１２０】 ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、
ＨＴＲＭ抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Ｋａで表すが、このＫａは
、衡状態の下でＨＴＲＭ抗体複合体のモル濃度を遊離抗体及び遊離抗原のモル濃
度で割ったものである。多数のＨＴＲＭエピトープに対して親和性が不均一なポ
リクロナール抗体試薬の測定値Ｋａは、ＨＴＲＭ抗体の平均親和性または結合活
性を表す。特定のＨＴＲＭエピトープにに単一特異的なモノクロナール抗体試薬
のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ｋａ値が１０⁹〜１０¹²Ｌ／ｍｏｌの高
親和性抗体試薬は、ＨＴＲＭ抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイ
ムノアッセイに用いるのが好ましい。Ｋａ値が１０⁶〜１０⁷Ｌ／ｍｏｌの低親和
性抗体試薬は、ＨＴＲＭが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免
疫精製（immunopurification）及び類似の処理に用いるのが好ましい。(Catty,
D. (1988) Antibodies, Volume l' A Practical Approach. IRL Press, Washing
ton, DC; Liddell, J. E. and Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoci
onal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY)。

【０１２１】 ポリクロナール抗体試薬のタイター及び結合活性を更に評価して、あるダウン
ストリーム適用に対するこのような試薬の品質及び適性を調べる。例えば、少な
くとも１〜２ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍｌの特異
的な抗体を含むポリクロナール抗体試薬の使用は、ＨＴＲＭ抗体複合体を沈殿さ
せなければならない処理に向いている。様々な適用例における抗体の特異性及び
タイター、結合活性、抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である。(例
えば、Catty, 前出, 及びColigan 他、前出を参照)。

【０１２２】 本発明の別の実施例では、ＨＴＲＭをコードするポリヌクレオチド、または任
意の断片またはその相補配列が、治療目的で使用することができる。ある実施形
態では、ＨＴＲＭをコードするポリヌクレオチドの相補配列がｍＲＮＡの転写を
阻止するのに好適である場合、これを使用することができる。特に細胞は、ＨＴ
ＲＭをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列で形質転換することもできる
。したがって、相補的分子または断片は、ＨＴＲＭの活性の調節、または遺伝子
機能の調節のために使用することができる。このような技術は当分野では周知で
あり、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは大きな断片が、ＨＴ
ＲＭをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位
置から設計可能である。

【０１２３】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス又はワクシニア、又は様々な細菌
性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的の器官、組
織又は細胞集団に運ぶこともできる。当業者に周知の方法を用いてＨＴＲＭをコ
ードポリヌクレオチドと相補的な核酸配列を発現するベクターを作製することが
できる(例えば、前出のSambrook 他、及び前出のAusubel 他によるものを参照)
。

【０１２４】 ＨＴＲＭをコードする遺伝子は、ＨＴＲＭをコードするポリヌクレオチド又は
その断片を高いレベルで発現する発現ベクターで、細胞又は組織を形質転換する
ことによって止めることができる。このような作製物を用いて翻訳できないセン
ス又はアンチセンス配列を細胞の中に導入することができる。ＤＮＡの中に組み
入れられない場合でも、このようなベクターは内在性のヌクレアーゼによって機
能が損なわれるまでｍＲＮＡ分子を転写し続ける。非複製ベクターでも一過性の
発現を一ヶ月以上に亘って続け、好適な複製エレメントがベクター系の一部であ
る場合はさらに長く持続し得る。

【０１２５】 上記した通り、遺伝子の発現は、ＨＴＲＭをコードする遺伝子の制御５’また
は調節領域に対する相補的な配列またはアンチセンス分子（ＤＮＡ或いはＲＮＡ
、ＰＮＡ）を設計することによって調節することができる。転写開始部位、即ち
開始部位から−１０と＋１０との間の領域に由来するオリゴヌクレオチドが好適
である場合と同様に、「三重らせん」と塩基対合法を用いて阻止することができ
る。三重らせん構造は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、または調節分子
の結合のために十分に広がるのを阻止するため有益である。三重式ＤＮＡを用い
る最近の治療の進歩は文献に記載されている（例えば、Gee, J.E. 等. (1994) I
n: Huber, B.E. 及び B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Fut
ura Publishing Co., Mt. Kisco, NYを参照）。相補的な配列またはアンチセン
ス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってｍＲＮ
Ａの翻訳を阻止するように設計できる。

【０１２６】 酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために
用いることができる。リボザイム作用の機構には、相補的な標的ＲＮＡへのリボ
ザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれ、ヌクレオチド鎖切断
が続く。例えば、ＨＴＲＭをコードする配列のヌクレオチド鎖切断を、特異的且
つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。

【０１２７】 任意の潜在的ＲＮＡ標的の中の特異的なリボザイム切断部位が、後続の配列Ｇ
ＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位に対して、標的分子をスキ
ャニングすることによって初めに同定される。一度同定されると、切断部位を含
む標的遺伝子の領域に対応する１５個から２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮ
Ａ配列を、オリゴヌクレオチドの機能を不全にする二次的な構造の特徴について
評価することが可能である。候補標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセ
イを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易性
をテストすることによって評価することが可能である。

【０１２８】 本発明の相補的なリボ核酸分子及びリボザイムは、当分野で周知の方法を用い
て、核酸分子の合成のために作製することができる。これらの方法には、固相ホ
スホラミダイト化合物などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含ま
れる。別法では、ＲＮＡ分子がin vitro及びin vivoでＨＴＲＭをコードするＤ
ＮＡ配列の転写によって生成され得る、このようなＤＮＡ配列はＴ７またはＳＰ
６等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて、種々のベクターの中に組
み入れることが可能である。別法では、相補的なＲＮＡを構成的または誘導的に
合成するこれらのｃＤＮＡ作製物は、細胞株、細胞、または組織の中に導入する
ことができる。

【０１２９】 ＲＮＡ分子を修飾することによって、細胞内の安定性を高め、半減期を長くす
ることができる。可能な修飾には、分子の５’及び／または３’端部でのフラン
キング配列の追加、または分子のバックボーン内でのホスホジエステラーゼ結合
よりむしろホスホロチオネート又は２’Ｏメチルの使用が含まれる、がこれらに
限定されるものではない。ＰＮＡの生成に固有のこの概念は、内在性のエンドヌ
クレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミ
ン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾形態だけで
なく、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（wybutosine）
などの従来のものでない塩基を含めるこによって、これらの分子の全体に拡大す
ることができる。

【０１３０】 ベクターを細胞又は組織に導入する多数の方法が利用でき、in vivo、in vitr o 、及びex vivoでの使用に等しく適している。ex vivoでの治療の場合、患者か
ら採取された肝細胞の中にベクターを導入して、自家移植で同じ患者に戻すため
にクローニング増殖される。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリ
カチオンアミノポリマーによる運搬は、当分野で周知の方法を用いて実行するこ
とができる（例えば、Goldman, C.K. 他. (1997) Nature Biotechnology 15:462
-66:を参照）。

【０１３１】 上記したいかなる治療方法も、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル
、及び最も好ましいヒトなどの哺乳動物を含む、治療が必要な全ての被験者に適
用できる。

【０１３２】 本発明の別の実施例は、上記した全ての治療効果のために、医学上認められる
担体と共に医薬品或いは無菌組成物の投与に関連する。このような医薬品組成物
は、ＨＴＲＭ、ＨＴＲＭに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、又
はＨＴＲＭのインヒビターなどからなる。この組成物は、単体で、或いは安定剤
などの１種類以上の別の薬剤と共に、無菌の生体適合性医薬品担体に投与するこ
とができる。このような医薬品担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、
及び水などが含まれるがこれらに限定されるものではない。この組成物は、単独
或いは薬物又はホルモンなどの別の薬剤と共に投与することができる。

【０１３３】 本発明に用いられる医薬品組成物は、任意の数の経路を用いて投与することも
できる。この経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、もく膜下腔内
、心室内、経皮性、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、異所性、舌下、または直腸が
含まれるがこれらに限定されるものではない。

【０１３４】 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物には、活性化合物を医薬的に使
用可能な薬剤にするのを容易にする、医薬品添加物及び補助剤を含む好適な薬学
的に認められる担体が含まれ得る。製剤及び投与についての詳しい技術について
は、最新版のRemington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., E
aston, PA)に記載されている。

【０１３５】 経口投与用の医薬品組成物が、経口投与に好適な投与量において当分野で周知
の薬学的に許容される担体を用いて、製剤することができる。このような担体に
より、医薬品組成物が患者が摂取するために、錠剤、丸薬、糖衣剤、カプセル、
液体、ゲル状、シロップ剤、泥状物、懸濁液として製剤される。

【０１３６】 経口用に用いられる医薬品は、活性化合物と固体の薬品添加物とを混合し、得
られた顆粒の混合物を処理して、（所望に応じてすりつぶした後）タブレット或
いは糖衣錠コア（dragee cores）にする。好適な医薬品添加物とは、ラクトース
、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖類、トウモロコシ、小
麦、米、ジャガイモ、又はその他の植物からのでんぷん、メチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウ
ムなどのセルロース、アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、ゼラチン
及びコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物又はタンパク質賦形剤である。
必要に応じて、例えば、架橋結合したポリビニルピロリドン、かんてん、アルギ
ン酸、またはその塩であるアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤が
加えられる。

【０１３７】 糖衣錠コアは、濃縮糖溶剤などの好適なコーティングと共に用いられる。この
ような濃縮糖溶剤には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボ
ポルゲル（carbopol gel）、ポリエチレングリコール、及び／または二酸化チタ
ン、ラッカー溶剤、及び好適な有機溶媒または混合溶剤などが含まれ得る。染料
または色素が、製品の識別又は活性化合物の量、即ち薬用量を示すため、錠剤ま
たは糖衣錠に加えられる。

【０１３８】 経口用に用いられる医薬品製剤には、ゼラチンから作られたプッシュ−フィッ
ト型のカプセル、グリセロールまたはソルビトールなどのコーティングとゼラチ
ンからなる封入されたカプセルが含まれる。プッシュ−フィット型のカプセルに
は、ラクトース又はスターチなどの賦形剤や結合材、タルク又はステアリン酸マ
グネシウムなどの潤滑剤、所望に応じて安定剤と混合された活性処方成分が含ま
れる。ソフトカプセルでは、活性化合物が、安定剤と共に或いは安定剤なしで、
脂肪油、溶液、またはポリエチレングリコール溶液などの好適な溶液に溶解或い
は懸濁され得る。

【０１３９】 非経口投与用に好適な医薬品剤が、水溶液で製剤されるが、ハンクス液、リン
ガー液、生理緩衝食塩水などの生理学的に適合性のある緩衝剤が好ましい。水性
懸濁注射液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデ
キストランなどの懸濁液の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性化合物の懸
濁液は、好適な油性注入懸濁液として製剤され得る。好適な親水性溶液または媒
体には、ごま油などの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド又はリボソー
ムなどの合成脂肪酸が含まれる。非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、運搬目
的で使用される。随意選択により、懸濁液は高濃度の溶液が可能となるよう化合
物の溶解性を高める好適な安定剤または薬剤を含み得る。

【０１４０】 局部または鼻腔投与のため、特定の障壁に浸透する好適な浸透剤が製剤に用い
られる。このような浸透剤は当業者には周知である。

【０１４１】 本発明の医薬品組成物は、当分野で周知の方法、例えば従来の混合、溶解、顆
粒化、糖衣化、溶離（levigating）、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥
処理を用いて製造され得る。

【０１４２】 医薬品組成物は塩類として製剤され、限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等の多くの酸と共に形成可能である。塩分は対
応する遊離塩基系よりも、水溶剤または他のプロトン溶剤に溶けやすい。別の場
合の好ましい薬剤の形態には、１から５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スク
ロース、及び２〜７％マンニトールの幾つか或いは全てを含み、ｐＨの範囲が４
．５〜５．５であり、使用前に緩衝剤と結合する凍結乾燥粉末を用いることがで
きる。

【０１４３】 医薬品組成物が調合された後、それらは適当な箱に詰められ、指定した症状の
薬としてラベルが貼られる。ＨＴＲＭの投与のため、このようなラベルには、量
、頻度、及び投与の方法が含まれるであろう。

【０１４４】 本発明に用いる好適な医薬品組成物には、目的を達成するため、効果的な量の
活性処方成分を含む組成物が含まれる。当業者は、自分の能力で十分に効果的な
服用量を決めることができる。

【０１４５】 どのような組成物であっても、治療に効果的な薬用量は、初めは、例えば腫瘍
細胞の腫瘍細胞アッセイで、或いは動物モデルのどちらかで推定することができ
る。通常、動物モデルには、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタなどが用いられる
。動物モデルはまた、好適な濃縮範囲及び投与の経路を決めるのに用いることが
できる。このような治療をもとに、ヒトへの有益な薬用量及び投与経路を決定す
ることができる。

【０１４６】 医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる、たとえばＨＴＲＭ又は
その断片、ＨＴＲＭの抗体、ＨＴＲＭのアゴニストまたはアンタゴニスト、イン
ヒビターなどの活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、たとえば
、ＥＤ₅₀（服用に対して集団の５０％に医薬的効果がある。）またはＬＤ₅₀（服
用に対して集団の５０％に致命的である）統計を計算するなど、細胞培養または
動物実験における標準的な薬剤手法によって決定することができる。治療効果と
毒性効果との薬用量比は治療指数であり、ＬＤ₅₀／ＥＤ₅₀の比率で示すことがで
きる。高い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物
実験から得られたデータが、ヒトへの適用のために、薬用量の範囲を調剤するの
に用いられる。このような組成物が含まれる薬用量は、毒性を殆ど或いは全く含
まず、ＥＤ₅₀を含む血中濃度の範囲であることが望ましい。薬用量は、用いられ
る投与形態及び患者の感受性、投与の経路にによって、この範囲内で様々である
。

【０１４７】 正確な薬用量は、治療が必要な患者に関する要素を考慮して、実務者によって
決められるであろう。薬用量及び投与は、効果的なレベルの活性成分を与えるた
め或いは所望の効果を維持するために調節される。薬用量の要素として考慮され
るものには、疾患の重症度、患者の一般的な健康状態、年齢、体重、及び患者の
性別、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、及び治療に対する応答
が含まれる。作用器官が長い医薬品組成物は、三日か四日に一度、一週間に一度
、二週間に一度、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって左右され、投
与され得る。

【０１４８】 通常の薬用量は投与の経路によって異なるが、約０．１〜１００，０００μｇ
までの最大約１グラムまでである。特定の薬用量及び運搬の方法に関するガイダ
ンスは文献に記載されており、一般に当分野の実務者はそれを利用することがで
きる。当業者は、タンパク質またはインヒビターとは異なったヌクレオチドの製
剤を利用するであろう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの運搬は、
特定の細胞、状態、位置などに対して特異的であろう。

【０１４９】 診断 別の実施例では、特異的にＨＴＲＭと結合する抗体が、ＨＴＲＭの発現によっ
て特徴づけられる疾患の診断、或いはＨＴＲＭやＨＴＲＭのアゴニストまたはア
ンタゴニスト、インヒビターで治療を受ける患者を監視するためのアッセイに用
いられる。診断に有益な抗体は、治療のところで記載した方法と同じ方法で製剤
される。ＨＴＲＭの診断アッセイには、抗体及び標識を用いてヒトの体液或いは
細胞や組織から採取されたものにおけるＨＴＲＭを検出する方法が含まれる。こ
れらの抗体は、修飾をして或いはしないで使用され、レポーター分子の共有結合
か非共有結合によって標識化され得る。当分野で周知の幅広いレポーター分子が
用いられるが、その内の幾つかは既に記述した。

【０１５０】 ＨＴＲＭを測定するためのＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ，及びＦＡＣＳを含む種々のプ
ロトコルは、当分野では周知であり、変わった或いは異常なレベルのＨＴＲＭの
発現を診断する元となるものを提供する。正常或いは標準的なＨＴＲＭの発現の
値は、複合体の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、好ましくはヒトである
被験者から採取した体液または細胞とＨＴＲＭに対する抗体とを結合させること
によって決定する。標準的な複合体形成の量は種々の方法で定量され得るが、測
光法（photometric）が好ましい。被験者のＨＴＲＭの発現の量、制御及び疾患
、生検組織からのサンプルが標準値と比較される。標準値と被験者との間の偏差
が、疾患を診断するパラメーターとなる。

【０１５１】 別の実施例によれば、ＨＴＲＭをコードするポリヌクレオチドを診断のために
用いることもできる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配
列、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡが含まれる。ポリヌクレオチド
を用いて、疾患と相関し得るＨＴＲＭを発現する生検組織における遺伝子の発現
を検出及び定量する。この診断アッセイを用いて、ＨＴＲＭの不在、存在、及び
過度の発現を調べ、治療中のＨＴＲＭレベルの制御を監視する。

【０１５２】 ある実施形態では、ＨＴＲＭまたは近縁の分子をコードする遺伝子配列を含む
ポリヌクレオチド配列を検出可能なＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーシ
ョンによって、ＨＴＲＭをコードする核酸配列を同定することが可能である。例
えば５'調節領域である高度に特異的な領域か、例えば保存されたモチーフであ
るやや特異性の低い領域から作られているかのプローブの特異性と、ハイブリダ
イゼーション或いは増幅の厳密性（最大、高い、中間、または低い）は、プロー
ブがＨＴＲＭをコードする自然界の配列のみを同定するかどうか、或いはアレル
や関連配列コードする自然界の配列のみを同定するかどうかによって決まるであ
ろう。

【０１５３】 プローブはまた、関連する配列の検出に利用され、ＨＴＲＭをコードする任意
の配列からのヌクレオチドを５０％以上含むのが望ましい。目的の本発明のハイ
ブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡあるいはＲＮＡが可能であり、SEQ ID N
O:66-130の配列、或いはＨＴＲＭ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イント
ロンを含むゲノム配列に由来し得る。

【０１５４】 ＨＴＲＭをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプロー
ブの作製方法には、ＨＴＲＭ及びＨＴＲＭ誘導体をコードするポリヌクレオチド
配列をｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある
。このようなベクターは市販されており、当業者には周知であり、好適なＲＮＡ
ポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vit ro でＲＮＡプローブを合成するために用いられる。ハイブリダイゼーションプロ
ーブは、例えば３２Ｐ或いは３５Ｓなどの放射性核種、或いはアビジン／ビオチ
ン（biotin）結合系によってプローブに結合されたアルカリホスファターゼなど
の酵素標識等の種々のレポーターの集団によって標識され得る。

【０１５５】 ＨＴＲＭをコードするポリヌクレオチドを用いてＨＴＲＭの発現に関連する疾
患の診断に用いることが可能である。このような疾患の例には、細胞増殖異常症
があり、その中には日光性角化症及び動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包
炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症
、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症があり、また、癌も含まれ、その中には
腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には副
腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝
臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精
巣、胸腺、子宮の癌などがあり、また、免疫異常症も含まれ、その中には後天性
免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギ
ー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己
免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クロ
ーン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、偶発性リンパ球減少症
、赤芽球症、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、
痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発
性硬化症、重症筋無力症、心筋又は心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、
多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェ−グレン
症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血
小板減少症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環
と、ウィルス感染症及び細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、
蠕虫の感染症、外傷が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＨＴＲＭ
をコードするポリヌクレオチド配列は、サザーンブロット法やノーザンブロット
法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、ディップスティック（dipstick）、
ピン（pin）、ＥＬＩＳＡアッセイ、及び患者から採取した体液或いは組織を利
用して変異ＨＴＲＭの発現の検出に用いられるマイクロアレイに使用することが
可能である。このような質的或いは量的方法は、当分野では周知である。

【０１５６】 特定の形態において、ＨＴＲＭをコードするヌクレオチド配列は、関連する疾
患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて有用であろう。ＨＴＲＭをコ
ードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーシ
ョン複合体の形成に好適な条件の下、患者から採取した体液或いは組織のサンプ
ルに加えることができるであろう。好適な培養期間の後、サンプルを洗浄し、シ
グナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、制御サ
ンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のＨＴＲＭをコードする
ヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。こ
のようなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験、或いは個人の患者の治療を監
視における、特定の治療効果を推定することが可能である。

【０１５７】 ＨＴＲＭの発現に関連する疾患の診断の元となるものを提供するために、正常
あるいは標準的な発現の概要が確立される。この確立は、ハイブリダイゼーショ
ン或いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から抽
出された体液或いは細胞と、ＨＴＲＭをコードする配列或いはその断片とを結合
させることにより達成され得る。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被
験者から得た値と周知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる
実験からの値とを比較することによって定量可能である。正常なサンプルから得
た標準的な値を、疾患の症状を示す被験者から得た値と比較可能である。標準値
と被験者の値との偏差を用いて疾患の存在を確定する。

【０１５８】 疾患の存在が確定され治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイを通常ベースで繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患
者に示される値に近づき始めたかどうかを推定することが可能である。繰り返し
行ったアッセイの結果を、数日から数ヶ月の期間の治療の効果を見るのに用いる
ことができる。

【０１５９】 癌において、個体からの生体組織における比較的多量の転写物は、疾患の発生
の素因を示し、また実際に臨床的症状が出る前に疾患を検出する方法を提供する
ことが可能である。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法或
いは積極的な治療法を早くから利用して、癌の発生または進行を防ぐことが可能
となる。

【０１６０】 ＨＴＲＭをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断
への利用には、ＰＣＲの利用が含まれ得る。このようなオリゴマーは、化学的な
合成、酵素を用いた生成、或いはin vitroで生成され得る。オリゴマーは、好ま
しくはＨＴＲＭをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはＨＴＲＭをコード
するポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件の
下、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、や
や緩い厳密性条件の下、近縁のＤＮＡ或いはＲＮＡ配列の検出及び／または定量
のため用いることが可能である。

【０１６１】 ＨＴＲＭの発現を定量するために用いられ得る方法には、ヌクレオチドの放射
標識或いはビオチン標識、調節核酸の相互増幅（coamplification）、及び標準
的な曲線に結果が加えられたものが含まれる（例えば、Melby, P.C.等(1993) J.
Immunol. Methods, 159:235-44；Duplaa, C.等(1993) Anal. Biochem. 229-236
を参照）。多数のサンプルの定量の速度が、目的のオリゴマーが種々の希釈液に
含まれ、分光光度法或いは非色応答により迅速に定量するＥＬＩＳＡ型のアッセ
イを用いることによって加速された。

【０１６２】 別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリ
ゴヌクレオチドまたはそれより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多くの遺伝子の発現レベルを監
視し、遺伝子の変異、突然変異及び多形性を識別する。この情報は、遺伝子機能
の決定、疾患の遺伝的根拠の解釈、疾患の診断、及び治療薬剤の活性の監視及び
開発に有用である。

【０１６３】 当分野で公知の方法でマイクロアレイを準備して使用し、分析する。(例えば
、Brennan, T.M. 他 (1995) 米国特許第5,474,796号;Schena, M. 他 (1996) Pro
c. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweiler 他(1995) PCT出願番号W
O95/251116; Shalon, D.他 (1995) PCT出願番号WO95/35505; Heller, R.A. 他(1
997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 及び Heller, M.J. 他 (1997) 米
国特許第5,605,662号を参照) 本発明の別の実施例ではまた、ＨＴＲＭをコードする核酸配列を用いて、自然
発生のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブ
を生成することが可能である。この配列は、以下のものに対してマッピングされ
る。特定の染色体、染色体の特定領域または人工生成の染色体、例えば、ヒト人
工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、
細菌Ｐ１生成物或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリである。（例えば、Price,
C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134, 及びTrask, B.J. (1991) Trends Genet.
7:149-154を参照） In sit蛍光ハイブリダイゼーション（FISH）は、他の物理的染色体マッピング
技術及び遺伝マップデータと相関するであろう（例えば、Heinz-Ulrich, 他によ
る(1995) in Meyers, 前出, pp. 965-968.を参照）。遺伝子マップデータの例は
、種々の科学誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のサイ
トで見付けることができる。物理的な染色体マップ上のＨＴＲＭをコードする遺
伝子の位置と特定の疾患との相関性、或いは特定の疾患に対する素因が、このよ
うな疾患と関係するＤＮＡの領域を決定するのに役立つ。本発明のヌクレオチド
配列を用いて、正常者と、保有者、及び感染した者との遺伝子配列における違い
を検出することもある。

【０１６４】 染色体標本のIn sitハイブリダイゼーション、及び確定した染色体マーカーを
用いた結合分析などの物理的マッピング技術を用いて、遺伝子マップを拡張する
こともできる。マウスなどの別の哺乳動物の染色体上での遺伝子の配置により、
たとえ特定のヒト染色体の数或いはアームが分かっていなくても、関連するマー
カーが明らかになることが多い。新規の配列を、物理的なマッピングによって、
染色体アームに割り付けることもできる。このことは、位置クローニング或いは
別の遺伝子発見技術を用いて遺伝的疾患の研究をしている研究者にとって、価値
ある情報である。疾患或いは症候群の位置が、例えば血管拡張性失調症の11q22-
23などの特定の遺伝子領域に遺伝子結合によって大まかに決定されると、その領
域に対するどの配列マッピングも、さらなる調査のための関連する遺伝子或いは
調節遺伝子を表す（例えば、Gatti, R.A.他による（1988）Nature 336:577-580
を参照）。また、目的の本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、
即ち感染者の間の、転位置、反転などによる染色体位置の違いを検出することも
ある。

【０１６５】 本発明の別の実施例では、ＨＴＲＭ、その触媒作用断片或いは免疫原断片また
はそのオリゴペプチドを、種々の任意の薬剤スクリーニング技術における化合物
のライブラリのスクリーニングに用いることができる。このようなスクリーニン
グに用いる断片は、溶液に遊離、固体支持物に固定、細胞の表面上に保持、或い
は細胞内に存在する。ＨＴＲＭとテストされる薬剤との複合体を結合することに
よる形成は計測されることもある。

【０１６６】 薬剤スクリーニングに用いる別の方法は、目的のタンパク質に対して、好適な
結合親和性を有する化合物のスクリーニング処理能力を高めるために用いられる
（例えば、Geysen,他による(1984) PCT出願番号 WO84/03564を参照）。この方法
では、相当な数の異なる小さな試験用化合物が、プラスチックピン或いは他の基
板の上に合成される。試験用化合物は、ＨＴＲＭ、或いはその断片と反応してか
ら洗浄される。次ぎに、結合されたＨＴＲＭが、当分野で周知の方法で検出され
る。精製されたＨＴＲＭはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用い
られるプレート上で直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いて
、ペプチドを捕らえ、固体支持物に固定することもできる。

【０１６７】 別の実施例では、ＨＴＲＭと結合可能な中和抗体がＨＴＲＭと結合するため試
験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることが
できる。この方法では、抗体が、ＨＴＲＭと１つ以上の抗原決定因子を共有する
どのペプチドの存在も検出する。

【０１６８】 別の実施例では、発展途上の分子生物学技術にＨＴＲＭをコードするヌクレオ
チド配列を用いて、限定はされないが、現在知られているトリプレット暗号及び
特異的な塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する新しい技術を
提供することができる。

【０１６９】 当分野の技術者であれば、更なる説明がなくても前述の説明だけで十分に本発
明を利用できるであろう。したがって、以下に記載する特定の実施例は、例示目
的であって本発明を限定するものではない。

【０１７０】 前出及び以下に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、及び米国仮出願第６
０／０８４、２５４号（１９９８年５月５日出願）、第６０／０９５、８２７号
（１９９８年８月７日出願）、第６０／１０２、７４５号（１９９８年１０月２
日出願）の全ての記載を引用して本明細書の一部とする。

【０１７１】

【実施例】

ｃＤＮＡライブラリの作製 ＲＮＡにはClontech社から購入したものと、表４に列記した組織から単離した
ものとがある。ある組織をホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート
溶液に溶解した。一方で別の組織をホモジナイズしてフェノールに溶解するか、
或いはTRIZOL (Life Technologies)、グアニジニウムイソチオシアネート及びフ
ェノールの単相溶液などの好適な変性剤の混合液に溶解した。この溶解物を塩化
セシウムにおいて遠心分離またはクロロホルムで抽出した。イソプロパノール或
いは酢酸ナトリウムのどちらかとエタノール、或いは別の方法でこの溶解物から
ＲＮＡを沈殿させた。

【０１７２】 ＲＮＡの純度を高めるためにＲＮＡのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な
回数繰り返した。場合によっては、ＤＮＡ分解酵素でＲＮＡを処理する。殆どの
ライブラリでは、オリゴd(T)連結常磁性粒子(Promega)またはOLIGOTEXラテック
ス粒子(QIAGEN. Valencia CA)、OLIGOTEX mRNA精製キット(QIAGEN)を用いてポリ
（Ａ＋）ＲＮＡを単離した。別法では、POLY(A)PURE mRNA精製キット(Arabion,
Austin TX)などの別のＲＮＡ単離キットを用いて組織溶解物から直接単離した。

【０１７３】 ある場合には、Stratagene社にＲＮＡを提供しStratagene社が対応するｃＤＮ
Ａライブラリを作製した。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム(Stratag
ene)またはSUPERSCRIPT プラスミドシステム(Life Technologies)を用いて当分
野で公知の推奨方法または類似の方法でｃＤＮＡを合成してｃＤＮＡライブラリ
を作製した。(例えば、Ausubel, 1997,前出,ユニット5.1-6.6を参照)。逆転写は
、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオ
チドアダプターを二本鎖ｃＤＮＡに結合させてから、好適な１つの制限酵素或い
は複数の制限酵素でｃＤＮＡを消化した。殆どのライブラリでは、SEPHACRYL S
1000または SEPHAROSE CL2B、SEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー(Amersh
am Pharmacia Biotech)、アガロースゲル電気泳動法によってｃＤＮＡの大きさ
（300〜1000bp）を選択した。PBLUESCRIPTプラスミド(Stratagene)またはpSPORT
1プラスミド(Life Technologies)、plNCY (Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto
CA)などの好適なプラスミドのポリリンカーの適合性制限酵素部位にｃＤＮＡを
結合させた。この組換えプラスミドを、Stratagene社のXL1-Blue, XL1-BIueMRF
、SOLR、またはLife Technologies社のDH5αまたはDH 10B、ElectroMAX DH 10B
を含むコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。

【０１７４】 ２ ｃＤＮＡクローンの単離 UNIZAPベクターシステム(Stratagene)或いは細胞溶解を利用して、in vivo切
除によって宿主細胞からプラスミドを回収した。MagicまたはWIZARD Minipreps
DNA精製システム(Promega)、及びAGTC Miniprep精製キット(Edge Biosystems, G
aithersburg MD)、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus Plasmid、QI
AWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、REAL Prep 96プラスミドキットの内の少
なくとも１つを用いてプラスミドを精製した。沈殿させた後、０．１ｍｌの蒸留
水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。

【０１７５】 別法では、高スループットの直接結合ＰＣＲ法によって宿主細胞溶解物からプ
ラスミドＤＮＡを増幅した。(Rao, V.B. (1994) Anal. Blochem. 216:1-14)。宿
主細胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で行った。サンプルを処
理してから３８４−ウエルプレートに移して保管し、増幅したプラスミドＤＮＡ
の濃度をPICOGREEN色素(Molecular Probes, Eugene OR)及びFluoroskan II蛍光
スキャナー(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)を用いて蛍光定量的に測定した
。

【０１７６】 ３ シークエンシング及び分析 シークエンシングのためのｃＤＮＡの準備には、ABI CATALYST 800 (Perkin-E
lmer)またはHYDRAマイクロディスペンサー(Robbins Scientific)、MICROLAB 220
0 システム(Hamilton)をPTC-200 thermal cyclers (MJ Research)と共に用いた
。ｃＤＮＡのシークエンシングには、ABI PRISM 373または377シークエンシング
システム(Perkin-Elmer)及び標準ABIプロトコル、塩基対呼び出しソフトウェア
、キットを用いた。別法では、ｃＤＮＡのシークエンシングには、MEGABACE 100
0 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamics)を用いた。更なる別法で
は、ｃＤＮＡの増幅及びシークエンシングにABI PRISM BIGDYE Terminator cycl
e sequencing ready reactionキット(Perkin-Elmer)を用いた。また、更なる別
法では、ｃＤＮＡのシークエンシングにAmersham Pharmacia Biotech社の溶液と
色素を用いた。ESTの読み枠は、標準的な方法(reviewed in Ausubel, 1997, sup
ra, unit 7.7)を用いて決定した。ｃＤＮＡ配列の幾つかを選択して、本実施例
の５に記載した方法で延長した。

【０１７７】 ｃＤＮＡ及び延長、ショットガンシークエンシングから得たポリヌクレオチド
配列の構築及び分析は、当分野の技術者に既知のアルゴリズムを利用したソフト
ウェアを組合せて行った。表５は、利用したソフトウェアのプログラム名、プロ
グラムの説明、引用文献、閾値パラメーターの要約である。表５の第１の列は用
いたツール及びプログラム、アルゴリズムであり、第２の列はそれらの簡単な説
明であり、第３の列は引用することで本明細書の一部とした引用文献であり、第
４の列は２つの配列の一致度の評価に用いたスコア及び確率値、他のパラメータ
である（確率値が高ければ高いほど相同性が高くなる）。配列の分析には、MACD
NASIS PROソフトウェア(Hitachi Software Engineering, S. San Francisco CA)
及びLASERGENEソフトウェア (DNASTAR)を用いた。

【０１７８】 また、ｃＤＮＡのGenBankの配列との比較には、Applied Biosystems社によっ
て開発されてINHERIT^TM 670配列分析システムに組込まれた検索アルゴリズムを
用いた。このアルゴリズムでは、Pattern Specification Language (TRW Inc, L
os Angeles, CA)を用いて相同領域を決定した。配列の比較には、ウインドウサ
イズ及びウインドウオフセット、誤差許容値の３つのパラメーターを用いた。こ
れらの３つのパラメーターの組み合せを用いて、問合わせの配列と相同な領域を
含む配列をＤＮＡデータベースで検索し、好適な配列を初期値で評点する。次に
、これらの相同領域をドットマトリクス相同プロットで調べて、相同領域と偶然
の一致とを区別する。Smith-Watermanアライメントを用いて、相同性の結果を示
す。

【０１７９】 ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、ＤＮＡ配列相同性分析で用いたもの
と類似の方法でINHERIT- 670配列分析システムを用いて確認する。Pattern Spec
ification Language及びウインドウパラメーターを用いて、初期値で評点された
相同領域を含む配列をタンパク質データベースで検索した。ドットマトリクス相
同プロットを調べて、相同領域と偶然の一致とを区別する。

【０１８０】 ポリヌクレオチド配列の確証は、BLAST及び動的計画法、ジヌクレオチド最近
接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター及びリンカー
、ポリＡ配列を取り除き、あいまいな塩基対をマスクすることで行った。次に、
BLAST及びFASTA、BLIMPSに基づいたプログラムを用いて、公共のデータベースで
あるGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳類、脊椎動物、真核生物のデータベー
スやBLOCKSデータベースなどから選択した配列に対してこれらの配列を問合わせ
て注釈を得た。Phred及びPhrap、Consedに基づいたプログラムを用いて完全長の
ポリヌクレオチド配列の中にこれらの配列を構築して、BLAST及びFASTA、BLIMPS
に基づいたプログラムでオープンリーディングフレームのためにスクリーンした
。完全長のポリヌクレオチド配列を翻訳して対応する完全長のアミノ酸配列を引
き出し、GenBankデータベース(上記)及びSwissProt、BLOCKS、PRINTS、PFAM、Pr
ositeなどのデータベースに対して問い合わせてこれらの完全長の配列を分析し
た。

【０１８１】 完全長のポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の構築及び分析に用いる上記
のプログラムは、SEQ ID NO:110−130からのポリヌクレオチド配列の断片の同定
にも使用できる。約２０から４０００までのヌクレオチドの断片はハイブリダイ
ゼーション及び増幅に有用であり、上記の発明で説明した。

【０１８２】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験用技
術であり、特定の細胞種或いは組織からのＲＮＡが結合されている膜への標識さ
れたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを伴う(例えば、Sambrook,上記
, 7章; 及び Ausubel. F.M. 他、上記, 4章及び16章を参照)。

【０１８３】 ＢＬＡＳＴに用いる類似のコンピュータ技術を用いて、GenBank或いはLIFESEQ
データベース（インサイト社）のようなヌクレオチドデータベース内の同一或い
は関連する分子を検索する。この分析は多くの膜系ハイブリダイゼーションより
非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を変更して、任意の特定の一
致が、厳密な一致或いは相同的一致の何れかとして分類されるかを確定すること
ができる。検索の基準は、 （％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００ として定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列
一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコア４０の場合、その一致は１〜２
％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。類似分子は通
常、１５〜４０の範囲の積スコアを示す分子を選択することにより同定されるが
、それより低いスコアでも関連した分子が同定される場合もある。

【０１８４】 ノーザン分析の結果は、ＨＴＲＭをコードする転写物が発生したライブラリの
分布割合として報告される。分析には、器官／組織及び疾患によるｃＤＮＡライ
ブラリの分類も含まれる。器官／組織のカテゴリーには、心血管、皮膚、発生、
内分泌、胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖、泌尿が含まれる。疾患のカテ
ゴリーには、癌、炎症／外傷、胎児、神経、貯留(pooled)が含まれる。それぞれ
のカテゴリーについて、目的の配列を発現するライブラリの数を数えて、それを
全ての範囲のライブラリの数で割った。各組織に特異的に発現する割合（パーセ
ント）と各疾患で発現する割合を表３に示した。

【０１８５】 ５ ＨＴＲＭをコードするポリヌクレオチドの延長 SEQ ID NO:66−130の完全長の核酸配列は、完全長分子の好適な断片から設計
したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてその完全長分子の好適な断片を延長
して作製した。一方のプライマーは既知の断片の５'の延長を開始するために合
成し、他方のプライマーは既知の断片の３'の延長を開始するために合成した。
開始プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（National Biosciences
）或いは他の適切なプログラムを用いて、約２２個から約３０個のヌクレオチド
の長さで約５０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列
にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量
体が生じないようにヌクレオチドを延長した。

【０１８６】 選択されたヒトｃＤＮＡライブラリーを用いてこの配列を延長した。２段階以
上の延長が必要な場合、若しくは望ましい場合は、追加或いはネスト化プライマ
ーの組を設計する。

【０１８７】 当分野で既知の方法を利用したＰＣＲ法で高い忠実度で増幅した。ＰＣＲはPT
C-200 thermal cycler (MJ Research, Inc.)用いて９６ウェルブロックプレート
で行った。反応混合液は、鋳型ＤＮＡ及び２００ｎｍｏｌの各プライマー、Mg^2- と(NH₄)₂SO₄とβ−メルカプトエタノールを含む緩衝液、Taq DNAポリメラーゼ(A
mersham Pharmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリ
メラーゼ(Stratagene)を含む。プライマーの組、PCI AとPCI Bに対して以下のパ
ラメーターで増幅を行った。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ６０℃で１分間 ステップ４ ６８℃で２分間 ステップ５ ステップ２及び３、４を２０回繰り返す ステップ６ ６８℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管 別法では、プライマーの組、T7とSK+に対して以下のパラメータで増幅を行った
。 ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ５７℃で１分間 ステップ４ ６８℃で２分間 ステップ５ ステップ２及び３、４を２０回繰り返す ステップ６ ６８℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管。

【０１８８】 各ウェルのＤＮＡ濃度は、１X TE及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物
に溶解した１００μｌのPICOGREEN定量試薬(0.25% (v/v) PICOGREEN; Molecular
Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Coming Costar, Acton MA)
の各ウェルに分配してＤＮＡが試薬と結合できるようにして測定する。このプレ
ートをFluoroskan II (Labsystems Oy, Helsinki, Finland)でスキャンして、サ
ンプルの蛍光を計測してＤＮＡの濃度を定量化する。反応混合物の５〜１０μｌ
のアリコットを１％のアガロースミニゲル上での電気泳動によって解析し、何れ
の反応物が配列を延長することに成功したかを決定する。

【０１８９】 延長したヌクレオチドを脱塩及び濃縮してから３８４ウェルのプレートに移し
、CviJIコレラウィルスエンドヌクレアーゼ(Molecular Biology Research, Madi
son WI)で消化し、pUC 18ベクター(Amersham Pharmacia Biotech)に再連結する
前に音波処理またはせん断を行った。ショットガンシークエンシングのために、
消化したヌクレオチドを低濃度（０．６〜０．８％）のアガロースゲル上に分離
して断片を切断し、寒天をAgar ACE (Promega)で消化した。T4リガーゼ(New Eng
land Biolabs, Beverly MA)を用いて延長したクローンをpUC 18ベクター(Amersh
am Pharmacia Biotech)に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)で制限部
位の延び出しを処理してコンピテント大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した
細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB
/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートに３７℃で一晩培養した。

【０１９０】 細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でＤＮＡをＰＣＲ増幅した。
ステップ１ ９４℃で３分間 ステップ２ ９４℃で１５秒 ステップ３ ６０℃で１分間 ステップ４ ７２℃で２分間 ステップ５ ステップ２及び３、４を２９回繰り返す ステップ６ ７２℃で５分間 ステップ７ ４℃で保管。 上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でＤＮＡを定量化した。ＤＮ
Ａ回収率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを２０％の
ジメチルサルホサイド（dimethysulphoxide）( 1:2, v/v)で希釈し、DYENAMIC D
IRECTキット(Amersham Pharmacia Biotech)またはABI PRISM BIGDYE Terminator
cycle sequencing ready reactionキット(Perkin-Elmer)を用いてシークエンシ
ングした。

【０１９１】 同様に、SEQ ID NO:66−130のヌクレオチド配列を用いて、上述の手順で及び
この延長のために設計したオリゴヌクレオチド、好適な遺伝子ライブラリで５′
調節配列を得た。

【０１９２】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 SEQ ID NO:66−130から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用い
て、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩
基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、より大きなｃＤＮ
Ａフラグメントの場合でも基本的に同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、
OLIGO4.06ソフトウェア（National Bioscience）のような最新式のソフトウェア
を用いてデザインし、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０μＣｉの[γ‐³²
Ｐ]アデノシン三リン酸（Amersham, Chicago, IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（DuPont NEN、Boston MA）とを組み合わせて用いることにより標識する
。標識されたオリゴヌクレオチドを、Sephadex^TM G-25超精細排除デキストラン
ビードカラム（Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, MI）を用いて実質的に精製す
る。毎分１０⁷カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、次のエンド
ヌクレアーゼ、AseI，Bgl II，EcoRI，Pst I，Xba1或いはPvuII（DuPont NEN）
の１つを用いて切断したヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ベースのハイブリダイゼ
ーション解析において用いる。

【０１９３】 各切断物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画して、ナイロン製
メンブラン（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に転写する。ハ
イブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り
除くため、ブロットを、段階的に厳密性が増す条件で最大０．１ｘクエン酸ナト
リウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまで順次室温にて洗浄する。
XOMAT AR^TMフィルム（Kodak, Rochester, NY）を、フィルムに写すためにブロッ
トに数時間露光した後、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。

【０１９４】 ７ マイクロアレイ 化学結合方法及びインクジェット装置を用いて、基板の表面上でアレイ要素を
合成することが可能である（例えば、上記Baldeschweilerを参照）。ドットブロ
ット法またはスロットブロット法に類似したアレイを利用し、要素を熱、ＵＶ、
機械的または化学的結合方法を用いて基板の表面に配置し結合させる。典型的な
アレイは、手作業または利用可能な方法や機械を用いて作製することができ、任
意の適正な数の要素を含み得る。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズ
していないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターン
を決定する。スキャンした画像を分析して、マイクロアレイ上で要素にハイブリ
ダイズする各プローブの相補性の程度及び相対的な量／発現レベルを調べること
が可能である。

【０１９５】 完全長のｃＤＮＡ、発現配列タグ（ＥＳＴ：Expressed Sequence Tags）、或
いはそれらの断片が、マイクロアレイの要素を含み得る。ハイブリダイゼーショ
ンに好適な断片を、LASERGENE^TMなどの当分野で公知のソフトウェアを用いて選
択することが可能である。本発明の核酸配列の１つに対応する完全長のｃＤＮＡ
、ＥＳＴ、或いはそれらの断片、或いは本発明に関連するｃＤＮＡライブラリか
ら任意に選択されたｃＤＮＡを、ガラススライドなどの好適な基質に整列する。
ｃＤＮＡは、例えばＵＶ交差結合（UV cross-linking）を利用してスライドに固
定してから、熱処理及び化学処理を施し、最後に乾燥させる(例えば、 Schena,
M. 他. (1995) Science 270:467-470; 及び Shalon,D. 他. (1996) Genome Res.
6:639-645を参照)。蛍光プローブを準備して、基質上の要素にハイブリダイゼ
ーションするために用いる。上記した方法によってこの基質を分析する。

【０１９６】 ８ 相補的ポリヌクレオチド ＨＴＲＭをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、自
然発生のＨＴＲＭの発現の低下即ち阻害するために用いられる。約１５〜約３０
個の塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、より小さな或いは
より大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Olig
o4.06ソフトウェア及びＨＴＲＭのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌ
クレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５′配列から相補
的なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配
列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオ
チドを設計して、リボソームがＨＴＲＭをコードする転写物に結合するのを阻害
する。

【０１９７】 ９ ＨＴＲＭの発現 ＨＴＲＭの発現及び精製は、細菌またはウイルスを基にした発現系を用いて行
うことができる。細菌でＨＴＲＭが発現するために、抗生物質耐性及びｃＤＮＡ
の転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにｃＤＮＡを
サブクローニングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節エ
レメントに関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びtrp-la
c(tac)ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではな
い。組換えベクターを、BL21(DE3)などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生
物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘
発されるとＨＬＯＲを発現する。真核細胞でのＨＴＲＭの発現は、昆虫細胞株ま
たは哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているAutographi ca californica 核多面性ウイルス(AcMNPV)を感染させて行う。バキュロウイルス
の非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う
細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、ＨＴＲＭをコードするｃＤＮ
Ａと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強いポリヘドリンプロモータによ
って高いレベルのｃＤＮＡの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多く
の場合はSpodoptera frugiperda (Sf9)昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝
細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルス
の更なる遺伝的変更が必要になる。(例えば、Engelhard. E. K.他 (1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther.
7:1937-1945.を参照)。

【０１９８】 殆どの発現系では、ＨＴＲＭが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(G
ST)、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タンパ
ク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベー
スの精製が素早く１回で行うことができる。Schistosoma japonicumからの２６
キロダルトンの酵素であるＧＳＴによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持
した状態で固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる。(Pha
rmacia, Piscataway, N J)。精製の後、ＧＳＴ部分を特定の操作部位でＨＬＯＲ
からタンパク分解的に切断できる。アミノ酸８個のペプチドであるＦＬＡＧで、
市販のモノクロナール及びポリクロナール抗FLAG抗体(Eastman Kodak)を用いた
免疫親和性の精製が可能となる。６個のヒスチジン残基が連続して伸展した6-Hi
sによって、金属キレート樹脂(QIAGEN)で精製が可能となる。タンパク質の発現
及び精製の方法は、Ausubel (1995,前出, ch 10, 16)に記載されている。これら
の方法で精製したＨＬＯＲを直接用いて以下のアッセイを行うことができる。

【０１９９】 １０ ＨＴＲＭ活性の実証 ＨＴＲＭの活性は、Liu, H.Y他(1997; EMBO J. 16:5289-5298.)に記載された
ように、レポーター遺伝子の転写を刺激する能力によって測定される。このアッ
セイには、大腸菌βガラクトシダーゼ酵素(LacZ)をコードする配列と融合したLe
xA DNA転写調節エレメント(LexA_op)からなる大きな特徴をもつレポーター遺伝子
作成物であるLexAop-LacZを使用する。融合遺伝子の作製及び発現、細胞への導
入の方法、またβガラクトシダーゼ酵素活性の測定方法は、当分野の技術者には
よく知られている。ＨＴＲＭをコードする配列を、LexA転写因子からのＤＮＡ結
合ドメイン及びHTRMからなる融合タンパク質LexA-HTRMの合成を誘導するプラス
ミドにクローニングする。LexA-HTRM融合タンパク質をコードするプラスミドを
、LexAop-LacZレポーター遺伝子を含むプラスミドと共に酵母細胞に導入する。L
exA-HTRM形質移入細胞と関連するβガラクトシダーゼ酵素の活性の程度は、ＨＴ
ＲＭ遺伝子産物によって刺激された転写物の量に比例する。

【０２００】 １１ 機能的アッセイ ＨＴＲＭの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベル
でのＨＴＲＭをコードする配列の発現によって評価する。ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ
を高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブク
ローニングする。このようなベクターには、pCMV SPORT^TM (Life Technologies.
Gaithersburg. MD)及びpCR^TM 3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)が含まれ、どち
らもサイトメガロウイルスプロモーターを含んでいる。５〜１０μｇの組換えベ
クターを、好ましくは内皮由来か造血由来のヒト細胞株にリポソーム製剤或いは
電気穿孔法によって一過性に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする
配列を含む１〜２μｇのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発
現により、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とを区別できる。ま
た、標識タンパク質の発現によって、ｃＤＮＡの組換えベクターからの発現を正
確に予想できる。このような標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質(GFP) (C
lontech, Palo Alto, CA)、及びCD64またはCD64-GFP融合タンパク質が含まれる
。レーザー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法(FCM)を用いて、G
FPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、アポトーシスの状態
などの特性を評価する。また、ＦＣＭで、先行した或いは同時の細胞死の現象を
診断する蛍光分子の取り込みを検出して計量する。これらの現象には、プロピジ
ウムヨウ化物でのＤＮＡの染色によって計測される核ＤＮＡ内容物の変化と、ブ
ロモデオキシウリジンの取り込み量の低下によって計測されるＤＮＡ合成の下方
調節と、特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内のタン
パンク質の発現の変化と、蛍光複合アネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合
によって計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細胞計測法は、Orme
rod, M. G.による (1994) Flow Cytometry ( Oxford, New York, NY.)に記載さ
れている。

【０２０１】 遺伝子発現におけるＨＴＲＭの影響は、ＨＴＲＭをコードする配列とCD64また
はCD64-GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価
することができる。CD64またはCD64-GFPは形質転換された細胞表面で発現し、ヒ
ト免疫グロブリンG(IgG)の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形
質転換されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された
磁気ビードを用いて分離することができる。(DYNAL. Lake Success. NYを参照)
。ｍＲＮＡは、当分野で公知の方法で細胞から精製することができる。ＨＴＲＭ
及び目的の他の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現は、ノーザン分析やマイクロ
アレイ技術で分析することができる。

【０２０２】 １２ ＨＴＲＭに特異的な抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE) (例えば、Harrington,M.G. (1990) Methods Enzymol. 182:488-495を参照)または他の精製技術を用いて実質的に精
製されたＨＴＲＭを、標準的なプロトコルによりウサギを免疫化し、抗体を作り
出すために用いる。

【０２０３】 別法では、ＨＴＲＭアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（DNASTA
R）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを
合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を産生させる。Ｃ末端付近の、
或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択につい
ては、当分野で周知である(例えば、前出のAusubel他による11章を参照)。

【０２０４】 通常、約１５残基の長さのオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペプチド
シンセサイザModel 431Aを用いてｆｍｏｃ法のケミストリにより合成し、Ｎ−マ
レイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用い
た反応によりＫＬＨ（Sigma, St. Louis, MO）に結合させて、免疫原生を高める
(例えば、前出のAusubel 他による文献を参照)。フロイントの完全アジュバント
においてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた
抗血清の抗ペプチド活性を検査するには、例えばペプチドをプラスチックに結合
し、１％ＢＳＡを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに
放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。

【０２０５】 １３ 特異的抗体を用いる自然発生ＨＴＲＭの精製 自然発生ＨＴＲＭ或いは組換えＨＴＲＭを、ＨＴＲＭに特異的な抗体を用いる
イムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィ
ニティーカラムは、CNBr-活性化SEPHAROSE（Pharmacia & Upjohn）のような活性
化クロマトグラフィー用レジンとＨＴＲＭ抗体とを共有結合させることにより構
築する。結合の後、そのレジンを製造者の使用説明書に従って、ブロックし洗浄
する。

【０２０６】 ＨＴＲＭを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムをＨ
ＴＲＭを優先的に吸着できる条件下で（例えば、界面活性剤の存在下において高
イオン強度のバッファーで）洗浄する。このカラムを、抗体とＨＴＲＭとの結合
を切るような条件下で（例えば、ｐＨ２−３のバッファー、或いは高濃度の尿素
またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）溶出させ、ＨＴ
ＲＭを回収する。

【０２０７】 １４ ＨＴＲＭと相互作用する分子の同定 ＨＴＲＭ又は生物学的に活性なその断片を、¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬（例
えば、Bolton他 (1973) Biochem. J. 133:529を参照）で標識する。マルチウェ
ルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＨＴＲＭと共にインキ
ュベートし、洗浄して、標識したＨＴＲＭ複合体を有する全てのウェルをアッセ
イする。様々なＨＴＲＭ濃度で得られたデータを用いて、候補の分子とＨＴＲＭ
との結合、親和性、数について数値を計算する。

【０２０８】 当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法
及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。特定の好適実施例に基
づいて本発明を説明したが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に
制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学或いは関連す
る分野の専門家には明らかな本明細書に記載の本発明の実施のための方法の様々
な改変は、特許請求の範囲に含まれることが意図されている。

【０２０９】 表の簡単な説明 表１は、ＨＴＲＭをコードする完全長の配列を作り出すために用いた、ヌクレ
オチド配列及びポリペプチド配列のＩＤ番号及びクローンＩＤ、ｃＤＮＡライブ
ラリ、ｃＤＮＡ断片を示す。

【０２１０】 表２は、ＨＴＲＭの同定に用いた潜在モチーフ及び相同配列、方法、アルゴリ
ズムを含む各ポリペプチド配列の特徴を示す。

【０２１１】 表３は、ノーザン分析によって決定された各核酸配列の組織特異的発現パター
ンと、これらの組織に関連した疾患や異常、症状と、各ＤＮＡがクローンされた
ベクターとを示す。

【０２１２】 表４は、ＨＴＲＭをコードするインサイトｃＤＮＡクローンが単離されたｃＤ
ＮＡライブラリを作製するために用いられた組織を示す。

【０２１３】 表５は、ＨＴＲＭを分析するために用いたプログラム及びその説明、引用文献
、パラメーター閾値を示す。

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【表１０】

【表１１】

【表１２】

【表１３】

【表１４】

【表１５】

【表１６】

【表１７】

【表１８】

【表１９】

【表２０】

【表２１】

【表２２】

【表２３】

【表２４】

【表２５】

【表２６】

【表２７】

【表２８】

【表２９】

【表３０】

【表３１】

【表３２】

【表３３】

【表３４】

【表３５】

【表３６】

【表３７】

【表３８】

【表３９】

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１２月１５日（２０００．１２．１５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７３】 本発明はまた、ＨＴＲＭをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む
。詳細には、このようなポリヌクレオチド配列の変異配列は、好ましくはＨＴＲ
Ｍをコードするポリヌクレオチド配列と７０％以上の配列同一性、更に好ましく
は８５％以上の配列同一性、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を有する
。また本発明の特定の実施態様では、SEQ ID NO:66−130からなる一群から選択
された核酸配列と少なくとも約７０％の配列同一性、好ましくは約８５％以上の
配列同一性、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有するSEQ ID NO: 66
−130からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列
を含む。上記の各ポリヌクレオチド変異配列のすべてが、ＨＴＲＭの機能的或い
は構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 16/18 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ６０／１０２，７４５ (32)優先日 平成10年10月２日(1998．10．2) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 バンドマン、オルガ アメリカ合衆国カリフォルニア州94043・ マウンテンビュー・アンナアベニュー 366 (72)発明者 ラル、プリーティ アメリカ合衆国カリフォルニア州95054・ サンタクララ・ラスドライブ 2382 (72)発明者 ユエ、ヘンリー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・ルイスアベニュー 826 (72)発明者 レディ、ルーパ アメリカ合衆国カリフォルニア州94086・ サニーベイル・ウェストマッキンレードラ イブ 1233 (72)発明者 タング、ワイ・トム アメリカ合衆国カリフォルニア州95118・ サンノゼ・ランウィックコート 4230 (72)発明者 ガースティン、エドワード・エイチ アメリカ合衆国カリフォルニア州94122・ サンフランシスコ・サーティエイスアベニ ュー 1408 (72)発明者 パターソン、チャンドラ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・＃１・シャーウッドウェイ 490 (72)発明者 ボーグン、マライア・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・サンティアゴロード 14244 (72)発明者 アジムザイ、ヤルダ アメリカ合衆国カリフォルニア州94547・ ヘイワード・ロックスプリングスドライブ 2045 (72)発明者 リュ、デュング・アイナ・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州95136・ サンノゼ・パークベルモントプレイス 55 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA04 DA02 EA02 GA11 GA18 HA04 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ42 QQ53 QR56 QR84 QS15 QS25 QS34 QX01 QX07 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA01 DA05 DA13 DA14 4B065 AA90X AA93Y AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA17 BA01 BA02 CA18 ZA892 ZB022 ZB112 ZB212 ZB352 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 DA86 EA22 EA28 EA50 EA51 FA72 FA74 GA26

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 SEQ ID NO:1−65及びその断片からなる一群から選択され
   たアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一
   性を有する実質的に精製された変異体。
3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離され精製された
   ポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチドと７０％以上のポリヌクレオ
   チド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
5. 【請求項５】 厳密な条件の下で請求項３のポリヌクレオチドとハイブリ
   ダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単離
   され精製されたポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 ポリヌクレオチドを検出する方法であって、 （ａ）請求項６のポリヌクレオチドをサンプルの少なくとも１つの核酸とハイ
   ブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記ハイ
   ブリダイゼーション複合体の存在が、前記サンプルのポリヌクレオチドが存在す
   ることと相関性を有する、該過程とを含むことを特徴とする検出方法。
8. 【請求項８】 ハイブリダイゼーションの前にポリヌクレオチドを増幅す
   る過程を更に含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 SEQ ID NO:1−65及びその断片からなる一群から選択され
   たポリヌクレオチド配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 請求項９のポリヌクレオチドと７０％以上のポリヌクレ
    オチド配列同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド変異配列。
11. 【請求項１１】 請求項９のポリヌクレオチドと相補的な配列を有する単
    離され精製されたポリヌクレオチド。
12. 【請求項１２】 少なくとも１つの請求項３のポリヌクレオチドの断片を
    含む発現ベクター。
13. 【請求項１３】 請求項１２の発現ベクターを含む宿主細胞。
14. 【請求項１４】 ポリペプチドの製造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件の下で、請求項１３の宿主細胞を
    培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
    を特徴とする製造方法。
15. 【請求項１５】 好適な医薬用担体と共に請求項１のポリペプチドを含む
    医薬品組成物。
16. 【請求項１６】 請求項１のポリペプチドと特異的に結合する精製された
    抗体。
17. 【請求項１７】 請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
18. 【請求項１８】 請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
19. 【請求項１９】 ＨＴＲＭの発現または活性の低下に関連する疾患の治療
    または予防が必要な患者に、請求項１５の医薬品組成物を効果的な量投与する過
    程を含む、ＨＴＲＭの発現または活性の低下に関連する疾患を治療または予防す
    る方法。
20. 【請求項２０】 ＨＴＲＭの発現または活性の増加に関連する疾患の治療
    または予防が必要な患者に、請求項１８のアンタゴニストを効果的な量投与する
    過程を含む、ＨＴＲＭの発現または活性の増加に関連する疾患を治療または予防
    する方法。