JP2002532056A - ヒト輸送タンパク質相同体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト輸送タンパク質相同体（HTPH）並びにHTPHを同定及びコードするポリヌクレオチドを提供する。また、本発明は発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニスト、及びアンタゴニストを提供する。更に、本発明はHTPHの発現に関わる疾患の診断、治療、又は予防の方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 技術分野 本発明は、ヒト輸送タンパク質相同体の核酸配列およびアミノ酸配列、並びに
癌、生殖障害、及び銅代謝障害の診断・予防・治療におけるこれらの配列の利用
法に関するものである。

【０００２】 発明の背景 真核細胞は、脂質二重層膜で囲まれ、機能的に異なる膜結合コンパートメント
に細分される。膜は、サイトゾル、細胞外環境、及び各細胞内の細胞小器官の間
の本質的な相違を維持する。脂質膜が殆どの極性分子輸送に対して高度に不透過
性であるので、脂質膜を横切る、また細胞小器官の間における必須の栄養素、所
定の金属イオン、代謝性の廃棄物、細胞シグナル伝達分子、巨大分子、及びタン
パク質の輸送は、種々の輸送分子に媒介されなければならない。

【０００３】 また、膜を横切る輸送は、特定の種類の分子と結合する膜貫通タンパク質であ
って膜を横切り結合分子を輸送するために一連の立体配置的変化を受ける輸送体
、又はポンプに依存する。輸送は、受動的な濃度依存機構によって起こり得て、
或いはATPの加水分解もしくはイオン勾配のようなエネルギー源と関連し得る。
例としては、促通性の輸送体、イオン濃度によって駆動される2次的な活性共輸
送体および対向輸送体、並びにMHCクラスI分子に対する抗原性ペプチドのターゲ
ティング及び多剤耐性に関与する活性なATP結合カッセット輸送体が挙げられる
。輸送される基質は、栄養素及びイオンから多種多様な薬物、ペプチド、及びタ
ンパク質にわたる。

【０００４】 ATP-結合カセット（ABC）輸送体は、小さな親水性の分子を生体膜を横切り輸
送する膜タンパク質のスーパーファミリーのメンバーである。ABC輸送体は、2つ
の部分（即ち、複数の膜貫通セグメントを伴う膜貫通ドメイン及びヌクレオチド
結合ドメイン）を各々含む2つの相同的モノマーを有する。哺乳類のABC輸送体は
、例えば多剤耐性輸送体および嚢胞性線維症の膜貫通制御因子タンパク質のよう
な二量体の輸送体として、或いは、例えば抗体プロセッシングに関する輸送体（
即ち2量体化して完全な活性TAP輸送体を形成するTAP1及びTAP2タンパク質）のよ
うな単量体の輸送体として見出される。2つの単量体のABC輸送体は、ヒトのペル
オキシソーム膜（副腎白質萎縮症タンパク質(ALDP)及び70kDaのペルオキシソー
ムの膜タンパク質(PMP70)）において同定されている。副腎白質萎縮症遺伝子の
突然変異は、X-連鎖の副腎白質萎縮症、超長鎖脂肪酸のペルオキシソームのβ-
酸化の先天的エラーの原因となる。PMP70遺伝子の突然変異は、ツェルヴェーガ
ー症候群、ペルオキシソームバイオジェネシスの先天的障害の患者で発見されて
いる。多剤耐性（MDR）は、ABC輸送体ファミリーの別のメンバーであるP糖タン
パク質の過剰産生に起因する。MDRは、主としてP糖タンパク質による耐性菌から
の薬物放出の増加の結果である。P糖タンパク質は、ヌクレオチド結合に対する
コンセンサス配列に隣接する6つの疎水性セグメントを含む2つの相同的部分を有
する。疎水性のセグメントが膜チャネルを形成する一方で、ヌクレオチド結合部
位は薬物輸送のエネルギに関与し得る（Saurin.W.ら(1994) Mol. Microbiol.12:
993-1004; Shani. N.ら(1996)J.Biol.Chem.271:8725-8730; 並びにKoster,W.及
びBohm,B.(1992) Mol. & Gen.Genet. 232:399-407）。

【０００５】 鉄、亜鉛、銅、コバルト、マンガン、モリブデン、セレン、ニッケル、及びク
ロム等の多くの金属イオンは、多くの酵素の補助因子として重要である。例えば
、銅は、スーパーオキシドジスムターゼ、ferroxidase（セルロプラスミン）、
及びリシルオキシダーゼ等の酸化還元酵素における補助因子として機能すること
によって、ヘモグロビン合成、結合組織代謝、及び骨の発育に関与する。銅およ
び他の金属イオンは、ダイエット中に摂取されねばならず、それらは胃腸管の輸
送体によって吸収される。血漿タンパク質が、金属イオンを肝臓及び他の標的器
官に輸送し、そこで特定の輸送体が、必要に応じてそのイオンを細胞および細胞
小器官に移送する。金属イオン代謝における不均衡は、多くの病状に関連づけら
れている。特に、銅は、スーパーオキシドジスムターゼ、ferroxidase（セルロ
プラスミン）、及びリシルオキシダーゼ等の酸化還元酵素における補助因子とし
て機能することによって、ヘモグロビン合成、結合組織代謝、及び骨の発育に関
与する。銅の欠乏は、ウィルソン病、並びに、貧血、成長遅延、毛髪の不完全な
角質化及び色素沈着、低体温症、大動脈エラスチンにおける退行性変化、精神的
痴呆、及び骨格における壊血病様変化の誘因となり得る。過剰な銅は、肝炎、肝
硬変、振戦、精神的痴呆、溶血性貧血、及び腎機能障害を引起こし得る。メンケ
ス病(Menke's disease)は、銅代謝の劣性障害に関連し、そこでは、腸からの銅
の取込みは正常であるが、銅の組織分布が乱されている。特に、セルロプラスミ
ン及びリシルオキシダーゼを含む銅含有酵素の活性および含有量が低下する。メ
ンケス病の症状には、コラーゲン及びエラスチンの量の減少が含まれ、それによ
って動脈瘤、突発性心臓破裂、肺気腫、及び骨粗鬆症が引起こされる。通常は、
5年以内で死亡する（Isselbacher, K.J.ら(1994) Harrison's Principles of In
ternal Medicine, 13^th edition, McGraw-Hill, Inc. New York, NY., pp. 481-
10 482、Cotran, R.S.ら(1994) Robbins Patholoeic Basis of Disease, 5^th ed
ition, W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA, pp. 134-135, 863-864）。

【０００６】 殆どの哺乳動物の細胞のエネルギ必要量は、血液中を循環するグルコースの連
続的な供給によって満たされる。グルコースは、形質膜に存在する特異的なグル
コース輸送体分子によって細胞に入る。グルコース輸送体のファミリーには、哺
乳動物の組織の典型的な受動輸送体および細菌由来の活性なH⁺結合糖輸送体が含
まれる。これらの輸送体には、大きな親水性の細胞質領域によって離隔された6
つの推定上の膜貫通のαへリックスの2つのグループが特徴的に含まれる。配列
のN末端およびC末端領域は、細胞質であると予想される。ヒト赤血球グルコース
輸送体の生物物理学的研究により、膜貫通αへリックスが、膜を横切り延在する
基質結合間隙または親水性のチャネルの形成に関連することが示されている。基
質転位のメカニズムには、立体配置的変化による基質結合部位の各膜の表面に対
する交互の露出が含まれる（Pessin, J. E.及びBell G. I. (1992) Annu Rev Ph
ysiol 54:911-930）。

【０００７】 新規なヒト輸送タンパク質相同体及びそれらをコードするポリヌクレオチドの
開示は、癌、生殖障害、及び銅代謝障害の診断・治療・予防に役立つ新たな組成
物を提供して当業者の要求を満たすものである。

【０００８】 発明の概要 本発明は、まとめて「HTPH」、個別には「HTPH-1」、「HTPH-2」、及び「HTPH-3」と称
される実質的に精製されたポリペプチドである神経伝達関連タンパク質を特徴と
する。一実施態様において、本発明はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、及びSEQ ID N
O:3、並びにそれらの断片からなるグループより選択されたアミノ酸配列を含む
実質的に精製されたポリペプチドを提供する。

【０００９】 また、本発明はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、及びSEQ ID NO:3のアミノ酸配列
、並びにそれらの断片に対して少なくとも90%以上のアミノ酸同一性を有する実
質的に精製された変異体を提供する。更に本発明はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、
及びSEQ ID NO:3、並びにそれらの断片からなるグループより選択されたアミノ
酸配列を含むポリペプチドをコードする単離され精製されたポリヌクレオチドを
提供する。更に本発明にはSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、及びSEQ ID NO:3、並び
にそれらの断片からなるグループより選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも90%以上のポリヌクレオチ
ド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチドの変異配列が含ま
れる。

【００１０】 更に、本発明はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、及びSEQ ID NO:3、並びにそれら
の断片からなるグループより選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有する単離され精製されたポリ
ヌクレオチドだけでなく、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、及びSEQ ID NO:3、並び
にそれらの断片からなるグループより選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドと厳密な条件の下でハイブリダイズする単離さ
れ精製されたポリヌクレオチドを提供する。

【００１１】 更に、本発明はSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、及びSEQ ID NO:6、並びにそれら
の断片からなるグループより選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離され精
製されたポリヌクレオチドを提供する。更に本発明はSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5
、及びSEQ ID NO:6、並びにそれらの断片からなるグループより選択されたポリ
ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有する単離さ
れ精製されたポリヌクレオチドだけでなく、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、及びSE
Q ID NO:6、並びにそれらの断片からなるグループより選択されたポリヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドに対して少なくとも90%以上のポリヌクレオチ
ド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチドの変異配列を提供
する。

【００１２】 更に、本発明はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、及びSEQ ID NO:3、並びにそれら
の断片からなるグループより選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発現ベクターを提供する。別の
態様では、その発現ベクターは宿主細胞に包含される。

【００１３】 更に、本発明はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、及びSEQ ID NO:3、並びにそれら
の断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法
を提供し、その方法には、（ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で、
前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発現ベ
クターを含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）その宿主細胞の培地からポリペ
プチドを回収する過程とが含まれる。

【００１４】 更に、本発明はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、及びSEQ ID NO:3、並びにそれら
の断片からなるグループより選択されたのアミノ酸配列を有する実質的に精製さ
れたポリペプチドを適切な製薬用担体と共に含む医薬品成分を提供する。

【００１５】 更に、本発明には前記ポリペプチドの精製されたアゴニストおよび精製された
アンタゴニストだけでなく、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、及びSEQ ID NO:3、並
びにそれらの断片からなるグループより選択されたのアミノ酸配列を含むポリペ
プチドに結合する精製された抗体が含まれる。

【００１６】 更に、本発明は癌の治療又は予防の方法を提供し、その方法には、そのような
治療が必要な被験者に対してSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、及びSEQ ID NO:3、並
びにそれらの断片からなるグループより選択されたアミノ酸配列を有するポリペ
プチドのアンタゴニストを有効な量投与する過程が含まれる。

【００１７】 更に、本発明は生殖障害の治療又は予防の方法を提供し、その方法には、その
ような治療が必要な被験者に対してSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、及びSEQ ID NO:
3、並びにそれらの断片からなるグループより選択されたアミノ酸配列を有する
ポリペプチドのアンタゴニストを有効な量投与する過程が含まれる。

【００１８】 更に、本発明は銅代謝障害の治療又は予防の方法を提供し、その方法には、そ
のような治療が必要な被験者に対してSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、及びSEQ ID N
O:3、並びにそれらの断片からなるグループより選択されたアミノ酸配列を有す
る実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を有効な量投与する過程
が含まれる。

【００１９】 更に、本発明は所定の生物学的サンプルにおいてSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、
及びSEQ ID NO:3、並びにそれらの断片からなる一群より選択されたアミノ酸配
列を含むポリヌクレオチドの検出方法を提供し、その検出方法には、（ａ）生物
学的サンプルの少なくとも1つの核酸と、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、及びSEQ I
D NO:3、並びにそれらの断片からなるグループより選択されたアミノ酸配列を含
むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の相補配列とをハイブリダイ
ズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、（ｂ）前記ハイブ
リダイゼーション複合体を検出する過程であって、該ハイブリダイゼーション複
合体の存在が前記生物学的サンプルにおけるポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドの存在と相関性を有するような検出過程とが含まれる。一態様において
、その方法には、ハイブリダイゼーション過程の前にポリヌクレオチドを増幅す
る過程が更に含まれる。

【００２０】 発明を実施するための形態 本発明のタンパク質、核酸配列、及び方法について説明する前に、本発明は、
ここに開示した特定の方法論、プロトコル、細胞系、ベクター、及び試薬に限定
されるものではなく、その実施形態は変更可能であることを理解されたい。また
、ここで使用した専門用語は、特定の実施例のみを説明する目的で用いたもので
あり、特許請求の範囲のみで限定される本発明の範囲を限定することを意図した
ものではないことも理解されたい。

【００２１】 請求の範囲を含む本明細書において、単数形の「或る」及び「その（この）」
の表記は、文脈からそうでないことが明らかである場合以外は、複数の意味も含
むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」の表記には、複数のそ
のような宿主細胞が含まれ、この「抗体」の表記は、1またはそれ以上の抗体及
び当業者に周知のその等価物なども表している。

【００２２】 特別に定義されていない限り、本明細書における全ての専門用語及び特定の用
語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に一般に理解され
るものと同じ意味を有する。ここで説明したものと類似あるいは等価な方法や材
料を本発明の実施や試験において使用可能であるが、本明細書においては好適な
方法、装置、材料を説明する。本発明で言及した全ての文献は、文献で報告され
た本発明に関して用いられ得る株化細胞、ベクター、及び方法論を説明・開示す
るために引用したものである。本明細書のあらゆる開示内容は、本発明が従来発
明によるそのような開示に先行し得ないことを認めるものと解釈してはならない
。

【００２３】 定義 ここで用いる「HTPH」は、任意の種、詳細にはウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウ
マ、及び好ましくをヒトを含む特定の哺乳類の種から得られたものであって、天
然、合成、半合成か、或いは組換え体を起源として得られた実質的に精製された
HTPHのアミノ酸配列を指す。

【００２４】 用語「アゴニスト」は、HTPHと結合した場合にHTPHの効果を高めたり、その効果
の持続時間を延ばす分子を指す。アゴニストには、HTPHに結合してその作用を調
節するタンパク質、核酸、糖質、または任意の他の分子が含まれ得る。

【００２５】 ここで用いる「アレル変異配列」は、HTPHをコードする遺伝子の対立形である。
アレル変異配列は、核酸配列における少なくともひとつの突然変異に起因し、変
異したmRNA或いはポリペプチドが生ずるが、それらの構造又は機能は変化する場
合と変化しない場合がある。与えられた任意の自然の遺伝子または組換え型の遺
伝子には、アレル形がないもの、1つ存在するもの、或いは多数存在するものが
ある。一般にアレル変異配列が生じる通常の変異は、ヌクレオチドの自然な欠失
、付加、または置換に因るものである。これらのタイプの変化の各々は、単独ま
たは他の変化と組み合わされて、所定の配列において１またはそれ以上の回数で
生じ得る。

【００２６】 ここで用いるHTPHをコードする「変異(altered)」核酸配列には、結果として同
一のHTPHまたはHTPHの機能的特徴の少なくとも1つをともなうポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレオチドの欠失、挿入、または
置換をともなうそれらの配列が含まれる。この定義には、HTPHをコードするポリ
ヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な、
或いは検出困難な多型と、またHTPHをコードするポリヌクレオチド配列の正常の
染色体の位置とは別の所定の位置を有する、アレル変異配列に対する不適切な或
いは予期しないハイブリダイゼーションとが含まれる。コード化されたタンパク
質もまた「変異」したものであり得て、サイレント変化(silent change)を生ずる
アミノ酸残基の置換、欠失、または挿入を含み、結果的に機能的に等価HTPHとな
るものである。意図的なアミノ酸置換は、HTPHの生物学的または免疫学的活性が
保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および
／または両親媒性の性質についての類似性に基づき行なわれ得る。例えば、負に
荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正に荷電し
たアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ、同様な親水性値を有する非電
荷の極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシ
ン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラ
ニン、及びチロシンが含まれる。

【００２７】 ここで用いる「アミノ酸」または「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド
、ポリペプチド、又はタンパク質の配列、またはそれらの何れかの断片であり、
自然発生又は合成の分子を指す。HTPHの断片は、好ましくは約5〜約15個のアミ
ノ酸の長さを有し、HTPHの生物的活性又は免疫学的活性を保持しているものであ
る。この文脈において、「断片」、「免疫原性の断片」、または「抗原性の断片」は、
好ましくは約5〜15のアミノ酸の長さ（最も好ましくは14のアミノ酸の長さ）で
あってHTPHの生物学的活性または免疫学的活性を保持するHTPHの断片を指す。こ
こで「アミノ酸配列」は、自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列を指すものと
して挙げているが、「アミノ酸配列」や類似の用語は、列挙されたタンパク質分
子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列にアミノ酸配列を限定する意味で用
いられるわけではない。

【００２８】 ここで用いる「増幅」は、核酸配列の追加の複製物を生成することであり、通
常は当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて実施される（Die
ffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) PCR Primer. a Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY,pp.1-5参照）。

【００２９】 用語「アンタゴニスト」は、HTPHに結合した場合にHTPHの生物学的又は免疫学
的活性の効果の程度を低下させたり、効果の持続時間を短縮する分子を指す。ア
ンタゴニストには、タンパク質、核酸、糖質、或いはHTPHの作用を低下させる任
意の他の分子が含まれ得る。

【００３０】 用語「抗体」は、完全な分子、並びに抗原決定基と結合し得るFa、F(ab)₂、及
びFvフラグメントのようなそれらの断片も指す。HTPHポリペプチドに結合する抗
体は、無処置のポリペプチドを用いて、或いは免疫化する抗原として関与する小
型のペプチドを含むその断片を用いて調製することができる。動物（例えば、マ
ウス、ラット、またはウサギ）を免疫化するのに用いるポリペプチドまたはオリ
ゴペプチドは、RNAの翻訳または化学的に合成されたものから得られ、必要なら
ば担体タンパク質と結合可能である。ペプチドと化学的に結合する通常用いられ
る担体には、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリン、キーホールリンペット
ヘモシアニン（KLH）が含まれる。次に、この結合したペプチドを用いて動物を
免疫化する。

【００３１】 用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の断片（即ち、エピトープ
）を指す。タンパク質またはタンパク質の断片を用いてホストの動物を免疫化す
る場合、このタンパク質の多くの領域が、抗原決定基（タンパク質の所定の領域
または3次元構造）と特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。抗原決定基は
抗体への結合について元の抗原（即ち、免疫応答を誘発するために用いられる免
疫原）と競合し得る。

【００３２】 用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列の「センス」鎖と相補的な核酸配列を
含む任意の成分を指す。アンチセンス分子は、合成や転写を含む任意の方法で作
り出すことができる。この相補的ヌクレオチドは、一度細胞内に導入されると、
細胞によって作られた天然の配列と結合して2重鎖を形成し、転写や翻訳を妨げ
る。「マイナス（−）」なる表現がアンチセンス鎖を指し、「プラス（＋）」な
る表現がセンス鎖を指すことがある。

【００３３】 用語「生物学的に活性」は、自然発生の分子の構造的機能、調節機能、又は生
化学的機能を有するタンパク質を指す。同様に「免疫学的に活性」は、天然の、
組換え体の、又は合成のHTPH、若しくはその任意のオリゴペプチドの能力を指し
、適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗体に結合する。

【００３４】 用語「相補的」または「相補性」は、任意の塩類及び温度条件の下での塩基対
によるポリヌクレオチド同士の自然な結合である。例えば、配列「5'A-G-T3'」
は相補的配列「3'T-C-A5'」に結合する。2つの1本鎖分子間の相補性は、幾つか
の核酸のみが結合しているような「部分的」なものも、或いは1本鎖分子間に完
全な相補性が存在するような「完全」なものもある。核酸鎖同士の相補性の程度は
、核酸鎖同士のハイブリダイゼーションの効率及び強さに大きな影響を与える。
このことは、核酸鎖同士の結合によって左右される増幅反応や、ペプチド核酸（
PNA）分子の設計及び使用において特に重要である。

【００３５】 ここで用いる「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」または「所定のア
ミノ酸配列を含む組成物」とは、概して所定のポリヌクレオチド配列またはアミ
ノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥した製剤または水溶
液が含まれ得る。HTPHまたはHTPHの断片をコードするポリヌクレオチドを含む組
成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして利用できる。このプローブは凍
結乾燥した形態で保存することができ、糖質のような安定化剤と結合させること
ができる。ハイブリダイゼーションにおいて、このプローブは、塩（例えば、Na
Cl）、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)）及び他の物質（例
えば、デンハート液、乾燥ミルク、サケ精子DNA等）を含む水溶液に分散させる
ことができる。

【００３６】 用語「コンセンサス配列」は、再度配列決定して不要な塩基が分離された核酸
配列か、XL-PCR^TM(The Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT)を用いて5‘方向及び
／又は3’方向に伸長して再度配列決定した核酸配列か、或いはフラグメントの
組み合わせのためのコンピュータプログラム（例えば、GELVIEW^TM Fragment Ass
embly system, GCG, Madison WI）を用いて2種以上のインサイト社クローンの重
複した配列から組み合わせて作られた核酸配列である。いくつかの配列が伸長さ
れ、かつ組み合わされてコンセンサス配列が作られる。

【００３７】 用語「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」とは、ノーザン解析による
HTPHをコードする核酸配列と同一か又は関連する核酸の存在の検出が、サンプル
内のHTPHをコードする核酸の存在を示しており、従ってHTPHをコードするポリヌ
クレオチドからの転写産物の発現と相関性を有している、ということを表してい
る。

【００３８】 ここで用いる「欠失」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化
であり、結果的に１個またはそれ以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸残基が欠
けることである。

【００３９】 用語「誘導体」は、ポリペプチド配列、又はポリヌクレオチド配列の化学修飾
を指す。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、水素からアルキル基、
アシル基、又はアミノ基への置換が含まれる。ポリヌクレオチド誘導体は、自然
発生の分子の生物学的又は免疫学的機能を保持しているポリペプチドをコードす
る。誘導体ポリペプチドは、グリコシル化、ポリエチレングリコール化(pegylat
ion)、または元のポリペプチドの生物学的又は免疫学的機能を保持する別の任意
のプロセスで修飾されたものである。

【００４０】 用語「類似性」は、或る程度の相補性を意味する。部分的な類似性と、完全な
類似性の場合がある。用語「類似性」の代わりに「同一性」を用いることができる。
同一の配列が標的の核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する
部分的に相補的な配列は、「実質的に類似な」ことを指す。完全に相補的な配列
と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、緩やかな厳密性のもとで、ハ
イブリダイゼーションアッセイ（サザン法またはノーザン法、溶液ハイブリダイ
ゼーション等）を用いて検定可能である。実質的に類似な配列またはハイブリダ
イゼーションプローブは、緩やかな厳密性の下で完全に類似（同一）な配列との
結合について標的の配列と競合し、それを阻害する。このことは、緩やかな厳密
性の条件が、非特異的な結合を許容するようなものであるということを意味する
わけではなく、緩やかな厳密性の条件では2つの配列の相互の結合が特異的（即
ち選択的）相互作用であることが必要である。非特異的結合が存在しないことを
、部分的な程度の相補性（即ち約30%未満の類似性又は同一性）さえも有してい
ない第2の標的配列を用いることにより検査することができる。非特異的結合が
存在しない場合、概ね類似な配列またはプローブは第2の非相補的な標的配列と
ハイブリダイズしない。

【００４１】 用語「同一性のパーセント」又は「同一性の%」は、2以上のアミノ酸または核酸配
列の比較において見出された配列の類似性の百分率を指す。同一性のパーセント
は、例えばMegAlignプログラム（DNASTAR,Inc.,Madison WI）を用いることによ
って電子的に決定できる。MegAlignプログラムは、例えばclustal Method.（例
えば、Higgins,D.G.及びSharp,P.M.(1988)Gene 73:237-244参照）のような種々
の方法に従い、2以上の配列の間のアライメントを作成することができる。clust
alアルゴリズムは、全てのペアの間の距離を調べることによって配列をクラスタ
ーに分類する。クラスターはペアでアライメントされ、次にグループにおいてア
ライメントされる。2つのアミノ酸配列（例えば、配列A及び配列B）の間の類似
性のパーセンテージは、（配列Aと配列Bとの間で一致する残基の総数）／（配列
Aの長さ−配列Aにおけるギャップ残基(gap residues)の数−配列Bにおけるギャ
ップ残基の数）×100によって計算する。2つのアミノ酸の間の低い類似性または
非類似性のギャップは、類似性のパーセンテージの測定に含まれない。また、核
酸配列の間の同一性のパーセントは、例えばJotun Hein Methodのような当業者
に周知の他の方法により計算、即ちカウントできる（例えばHein, J.(1990) Met
hods Enzymol. 183:626-645参照）。更に配列間の同一性は、例えばハイブリダ
イゼーション条件を変更することによる当業者に周知の別の方法によって測定可
能である。

【００４２】 「ヒト人工染色体」（HACs）は6kb〜10MbのサイズのDNA配列を含んでおり、安定
した有糸分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の小染色体
である（Harrington, J.J.ら (1997) Nat Genet. 15:345-355参照）。

【００４３】 用語「ヒト化抗体」は、抗体が本来の結合能力をそのまま保持しながらヒト抗
体により近づくように、非抗体結合領域におけるアミノ酸配列配列を置換した抗
体分子を指す。

【００４４】 用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結
合する任意の過程を指す。

【００４５】 用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基の間の水素結合形成
の効力によって、2つの核酸配列で形成された複合体を指す。ハイブリダイゼー
ション複合体は、溶液中で形成されるか（例えば、C₀t又はR₀t解析）、或いは核
酸は溶液中に存在する一方の核酸と固体支持体（例えば、紙、メンブラン、フィ
ルタ、ピン、またはスライドガラス、ポリマー、または細胞やその核酸が固定さ
れる他の適切な基板）に固定されたもう一方の核酸との間で形成され得る。

【００４６】 ここで用いる「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子にみられる配列に対
して、1個または2個以上のヌクレオチド、アミノ酸残基が各々加わるような、ヌ
クレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。

【００４７】 「免疫応答」は、炎症、心的外傷、免疫異常症、又は伝染性もしくは遺伝性の疾
患に関連する容態を指す。これらの容態は、細胞および全身の防御系に作用する
種々の因子（例えばサイトカイン、ケモカイン、及び他のシグナル伝達分子）の
発現によって特徴づけられる。

【００４８】 用語「マイクロアレイ」とは、例えば紙、ナイロン、又は他のタイプのメンブ
ラン、フィルタ、チップ、スライドガラス、又は他の任意の適切な固体支持体の
ような基板上に配列された個々のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを配
列したものを指す。

【００４９】 マイクロアレイの文脈で使用する用語「エレメント」又は「アレイエレメント」は
、支持体（基板）の表面に配置されたハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを
指す。

【００５０】 用語「調節(modulate)」は、HTPHの活性の変化を指す。例えば、調節によって
、タンパク質活性の向上や低下、結合特性の変化、又はHTPHの生物学的、機能的
、免疫学的特性等の他の変化がもたらされる。

【００５１】 ここで用いる「核酸」または「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチ
ド、ポリヌクレオチド、又はそれらの任意の断片を指す。また、これらの用語は
、1本鎖または2本鎖の、センス鎖又はアンチセンス鎖のゲノム起源又は合成起源
のDNA若しくはRNAや、ペプチド核酸（PNA）や、任意のDNA様若しくはRNA様物質
も指す。用語「断片（フラグメント）」は、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、及びSE
Q ID NO:6を特別に同定する独特のポリヌクレオチド配列の領域を含む核酸配列
（例えば、同じゲノム内の任意の別の配列とは異なる）を指す。例えば、SEQ ID
NO:4、SEQ ID NO:5、及びSEQ ID NO:6の断片は、ハイブリダイゼーション及び
増幅技術に有用であり、また、関連するポリヌクレオチド配列からSEQ ID NO:4
、SEQ ID NO:5、及びSEQ ID NO:6を区別する類似性の測定にも有用である。SEQ
ID NO:4、SEQ ID NO:5、及びSEQ ID NO:6の断片は、少なくとも約ヌクレオチド1
5〜20個の長さである。SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、及びSEQ ID NO:6及びこの断
片に対応するSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、及びSEQ ID NO:6の領域の正確な長さ
は、断片の所期の目的に基づいた当業者に周知の一般的な技術の1つを用いてル
ーチン的に決定できる。或いは、断片が翻訳された際に、機能的特徴（例えば、
完全長のポリペプチドの抗原性等）および構造的特徴（例えば、完全長のポリペ
プチドのATP結合部位等）を保持したポリペプチドを形成し得る。

【００５２】 用語「操作可能に関連する」、即ち「操作可能に連結する」は、機能的に関係した
核酸配列を指す。プロモーターがコードされたポリペプチドの転写を制御する場
合、プロモーターはコード配列と操作可能に関連する、即ち操作可能に連結する
。操作可能に関連した、即ち操作可能に連結した核酸配列が、読み枠に存在ある
いは近接する際に、所定の遺伝因子（例えば、リプレッサー遺伝子）は、コード
されたポリペプチドには連続的に連結せずに、それでもポリペプチドの発現を制
御するオペレーター配列に結合する。

【００５３】 ここで用いる「オリゴヌクレオチド」は、PCR増幅又はハイブリダイゼーショ
ンアッセイ、またはマイクロアレイで用いることができる核酸配列であって、長
さが少なくとも約6ヌクレオチドから約60ヌクレオチド程度のもので、好適には1
5〜30ヌクレオチド、より好適には20〜25ヌクレオチドであるものを指す。ここ
で用いる「オリゴヌクレオチド」は、当技術分野において一般に定義されている用
語「アンプライマー」、「プライマー」、「オリゴマー」、及び「プローブ」と
概ね同義である。

【００５４】 ここで用いる「ペプチド核酸」（PNA）は、リジンを末端とするアミノ酸残基
のペプチドバックボーンに結合した5ヌクレオチド以上の長さのオリゴヌクレオ
チドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤(anti-gene agent)を指す。末端の
リジンがその組成に溶解性を賦与している。PNAは相補的な1本鎖DNAやRNAに優先
的に結合して転写物の伸長を止め、またPNAをポリエチレングリコール化して細
胞におけるPNAの寿命を延ばすことが可能である。（Nielsen, P.E.ら(1993) Ant
icancer Drug Des. 8:53-63）。

【００５５】 ここで用いる用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられる。HTPHをコ
ードする核酸、若しくはその断片、またHTPH自体を含む疑いのある生物学的サン
プルは、体液や、細胞から分離された染色体、細胞小器官、又は細胞膜からの抽
出物や、細胞や、（溶液中の、或いは固体支持体に結合した）ゲノムのDNA、RNA
、またはcDNAや、組織や、組織プリントその他を含み得る。

【００５６】 用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、抗体ならびにタンパク質
もしくはペプチド、抗体及びアンタゴニストの相互作用を指す。この相互作用は
、タンパク質の特定の構造（例えば、結合する分子が認識する抗原決定基、つま
りエピトープ）の存在に左右されることを意味している。例えば、抗体がエピト
ープ「A」に対して特異的である場合、標識された遊離した「A」及びその抗体を
含む反応において、エピトープA（つまり遊離し、標識されていないA）を含むポ
リヌクレオチドが存在することにより、抗体に結合した標識されたAの量が低下
する。

【００５７】 用語「厳密（ストリンジェント）な条件」は、ポリヌクレオチドと特許請求の
範囲に記載されたポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能な条件を
指す。厳密な条件は、塩濃度、有機溶剤（例えば、ホルムアミド）の濃度、温度
、及び当業者に周知の他の条件によって規定される。特に、塩の濃度を低下させ
ることや、ホルムアミドの濃度を上昇させることや、ハイブリダイゼーション温
度を上昇させることによって厳密性が増す。

【００５８】 用語「実質的に精製」は、天然の環境から取り除かれた核酸配列又はアミノ酸
配列であって、天然にはそれが結合して存在する他の構成成分から単離又は分離
されて、その構成要素が60%以上、好ましくは75%以上、最も好ましくは90%以上
除去された核酸配列又はアミノ酸配列である。

【００５９】 用語「置換」は、それぞれ1個または2個以上のヌクレオチド或いはアミノ酸を
、別のヌクレオチド或いはアミノ酸に各々置換することを指す。

【００６０】 用語「形質転換」の定義は、外来性のDNAが入り込みレシピエント細胞を変化
させるプロセスを意味する。形質転換は、当業者に周知の種々の方法を用いた天
然または人工の条件の下で起こり、また外来性の核酸配列を原核細胞または真核
細胞の宿主細胞に導入するための任意の既知の方法に基づき得る。形質転換の方
法は、形質転換される宿主細胞のタイプによって選択され、以下に限定はされな
いが、ウイルス感染、熱ショック、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、リ
ポフェクション、及び微粒子銃を用いる方法が含まれる。このような「形質転換
された」細胞には、挿入されたDNAを自律的に複製するプラスミドとして、また
は宿主の染色体の一部として複製が可能な安定的に形質転換された細胞が含まれ
、またそれは限られた時間で導入されたDNAやRNAを一過性に発現する細胞を指す
。

【００６１】 ここで用いるHTPHポリペプチドの「変異体」は、1又は2以上のアミノ酸残基が
変異したアミノ酸配列である。この変異体は「保存的」変化を含むものであり得
、この場合、例えばロイシンをイソロイシンで置き換えるように、置換されるア
ミノ酸が類似な構造的及び化学的特性を有する。稀にではあるが、例えばグリシ
ンがトリプトファンで置換されるように、変異体が「非保存的」に変化する場合
もある。類似した小さい変化には、アミノ酸の欠失または挿入、或いはその両方
が含まれる。例えばLASERGENEソフトウエアのような周知のコンピュータプログ
ラムを用いて、何れのアミノ酸残基が生物学的或いは免疫学的活性を損なわずに
置換、挿入、又は除去可能であるということを決定するガイダンスを提供するこ
とができる。

【００６２】 ポリヌクレオチド配列の文脈の中で用いられる「変異配列」とは、HTPHに関連
したポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義には、例えば「アレル」（前
述）、「スプライス」、「種」、「多形性」変異配列も含まれる。スプライス変
異配列は基準分子と有意な同一性を有し得るが、一般にmRNAプロセッシングの際
のエキソンの交互のスプライシングによってポリヌクレオチドの数が増減する。
対応するポリペプチドは、付加的な機能ドメインを有するか、或いはドメインを
含まない。種変異配列は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。生じ
たポリペプチドは、一般に互いに有意なアミノ酸同一性を有する。多形性変異配
列は、所定の個別の種の間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における変異
である。また、多形性変異配列には、ポリヌクレオチド配列の1つの塩基が変化
する「単一のヌクレオチド多形性」（SNP）が包含され得る。SNPの存在は、例え
ば、或る集団、病状、又は病状の性向を表し得る。

【００６３】 発明 本発明は、新規のヒト輸送タンパク質相同体（HTPH）、HTPHをコードするポリ
ヌクレオチド、並びに癌、生殖障害、及び銅代謝障害の診断、予防、又は治療の
ためのこれらの組成物の利用法の発見に基づくものである。表１の第1列および
第2列には、アミノ酸および核酸の配列番号（SEQ ID NO:）をそれぞれ示す。第3
列には、各HTPHをコードする核酸配列が初めて同定されたインサイト社クローン
ID、第4列には、クローンのcDNAライブラリーをそれぞれ示す。第5列には、第6
列の断片に対応する配列番号を示す。第6列には、断片を示し、例えば、ハイブ
リダイゼーション技術における断片として有用であり、各HTPHのコンセンサスヌ
クレオチド配列の一部であるインサイト社クローン（及びライブラリー）及びシ
ョットガン配列を示す。

【００６４】 表２は、本発明のポリペプチドの種々の特性を示すものであり、第1列には、
アミノ酸SEQ ID NO:、第2列には、各ポリペプチドのアミノ酸残基の数、第3列に
は、潜在的リン酸化部位、第4列には、潜在的グリコシル化部位、第5列には、（
適用可能な場合は）ポリペプチドに存在するサイン配列、第6列には、配列相同
性およびタンパク質モチーフを利用するポリペプチドを識別するために使用する
分析方法をそれぞれ示す。

【００６５】 表３には、ノーザン分析による各核酸配列の発現組織、この発現組織に関する
疾患および障害、並びに各cDNAがクローン化されたベクターを示す。

【００６６】 図１Ａ、１Ｂ、及び１Ｃは、HTPH-1及びABC輸送体（GI 2982567；SEQ ID NO:7
）の間の切り詰められたアライメントを示す。アライメントは、ABC輸送体の最
初の240個のアミノ酸を切り詰めている。特に、HTPH-1及びラットABC輸送体は、
90％の配列同一性を有し、ABC輸送体ファミリーサイン配列およびATP/GTP結合部
位モチーフA（P-ループ）を共有する。

【００６７】 図２は、HTPH-2及びE.coli由来の銅恒常性タンパク質CutC（GI 1736520；SEQ
ID NO:8）の間のアライメントを示す。特に、HTPH-2及びE.coli銅恒常性タンパ
ク質は、36％の配列同一性を有し、幾つかのリン酸化部位を共有する。

【００６８】 また、本発明はHTPHの変異体を含む。HTPH変異体は、HTPHアミノ酸配列に対し
て好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少
なくとも95%以上のアミノ酸配列の同一性を有し、またHTPHの機能的もしくは構
造的特徴の少なくとも1つを含む。

【００６９】 更に、本発明はHTPHをコードするポリヌクレオチドを包含する。特定の実施例
において、本発明はHTPHをコードするSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、及びSEQ ID N
O:6からなるグループより選択されたポリヌクレオチド配列を包含する。

【００７０】 更に、本発明はHTPHをコードするポリヌクレオチドの変異配列を含む。特に、
そのようなポリヌクレオチドの変異配列は、HTPHをコードするポリヌクレオチド
配列に対して少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少
なくとも95%以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する。本発明の特定の態
様には、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、及びSEQ ID NO:6からなるグループより選
択された配列を含むポリヌクレオチド配列の変異配列が含まれ、それはSEQ ID N
O:4、SEQ ID NO:5、及びSEQ ID NO:6からなるグループより選択された配列を含
むポリヌクレオチド配列に対して少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%
、最も好ましくは少なくとも95%以上のポリヌクレオチド配列の同一性を有する
。上記のポリヌクレオチドの変異配列は何れもHTPHの機能的または構造的特徴の
少なくとも1つを含むアミノ酸配列をコードすることが可能である。

【００７１】 遺伝暗号の縮重の結果、既知の遺伝子及び自然発生の遺伝子のポリヌクレオチ
ド配列に対する最小の類似性を有する幾つかのものを含め、多数のHTPHをコード
するポリヌクレオチド配列が作り出されることが、当業者には理解されるであろ
う。従って、本発明は、可能なコドン選択に基づく組合せの選択により作り出さ
れ得るポリヌクレオチド配列の可能な全ての変異を考慮している。これらの組合
せは自然発生のHTPHのヌクレオチド配列に対し適用されるような標準のトリプレ
ット遺伝暗号に従い作り出されるものであり、また全てのそのような変異はここ
に明確に開示されると考えられたい。

【００７２】 HTPHをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、適切に選択された厳
密性の条件下に於いて、自然発生のHTPHのヌクレオチド配列に対してハイブリダ
イズ可能であることが好ましいが、それは非自然発生のコドンを含める等の実質
的に異なるコドンの用法を有するHTPHをコードするヌクレオチド配列を作り出す
のに有利である。特定のコドンが宿主により利用される頻度に従い、真核生物又
は原核生物の宿主に於いてペプチドの発現が起こる割合を高めるようにコドンを
選択することができる。コードされるアミノ酸配列を変化させることなしにHTPH
及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変更する別の理由は、
自然発生の配列から作り出された転写物よりも長い半減期のようなより望ましい
特性を有するRNA転写物を作り出すためである。

【００７３】 また本発明は、HTPH及びその誘導体をコードするDNA配列、またはその断片を
専ら合成化学によって作り出すことを含む。作製の後に、合成配列を当業者によ
って周知の試薬を用いて任意の多数の利用可能な発現ベクター及び細胞系に挿入
することが可能である。更に、合成化学を利用してHTPHをコードする配列又はそ
れらの任意のフラグメントに突然変異を導入し得る。

【００７４】 また本発明に包含されるものには、種々の厳密な条件の下で、請求項に記載さ
れたポリヌクレオチド配列、また特にSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、及びSEQ ID N
O:6で示す配列に対してハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列が含まれる
（例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger(1987) Methods Enzymol. 152:399-407；
Kimmel, A.R.(1987) Methods Enzymol. 152:507-511参照）。例えば、厳密な塩
濃度は、通常は約750mM未満の塩化ナトリウム及び約75mM未満のクエン酸3ナトリ
ウムであり、好ましくは約500mM未満の塩化ナトリウム及び約50mM未満のクエン
酸3ナトリウムであり、最も好ましくは約250mM未満の塩化ナトリウム及び約25mM
未満のクエン酸3ナトリウムである。例えばホルムアミド等の有機溶剤の非存在
下では厳密性の低いハイブリダイゼーションとなり、一方で約35%以上のホルム
アミド、最も好ましくは約50%以上のホルムアミドの存在下において厳密性の高
いハイブリダイゼーションとなる。厳密な温度条件は、通常は約30℃以上であり
、より好ましくは約37℃以上であり、最も好ましくは約42℃以上である。例えば
、ハイブリダイゼーション時間、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）等の薬品濃度
、キャリアDNAの含有または排除等の変動する付加的なパラメーターは、当業者
には周知である。これらの必要とする種々の条件を組合わせることによって、様
々なレベルの厳密性が実現される。好適な実施例では、温度30℃、750mMの塩化
ナトリウム、75mMのクエン酸3ナトリウム、及び1%のSDSにおいてハイブリダイゼ
ーションが実施される。より好適な実施例では、温度37℃、500mMの塩化ナトリ
ウム、50mMのクエン酸3ナトリウム、1%のSDS、35%のホルムアミド、及び100μg/
mlの変性サケ精子DNA（ssDNA）においてハイブリダイゼーションが実施される。
最も好適な実施例では、温度42℃、250mMの塩化ナトリウム、25mMのクエン酸3ナ
トリウム、1%のSDS、50%のホルムアミド、及び200μg/mlのssDNAにおいてハイブ
リダイゼーションが実施される。これらの条件の有益な変更については、当業者
には容易に理解されるであろう。

【００７５】 ハイブリダイゼーションの後の洗浄過程においても厳密性は変更し得る。洗浄
の厳密な条件は、塩濃度および温度によって規定できる。前述のように、塩濃度
を低下させるか、或いは温度を上昇させることで洗浄の厳密性が増大し得る。例
えば、洗浄過程の厳密な塩濃度の条件は、好ましくは約30mM未満の塩化ナトリウ
ム及び約3mM未満のクエン酸3ナトリウムであり、最も好ましくは約15mＭ未満の
塩化ナトリウム及び約1.5mM未満のクエン酸3ナトリウムである。洗浄過程の厳密
な温度の条件は、通常は約25℃以上であり、より好ましくは約42℃以上であり、
最も好ましくは約68℃以上である。好適実施例では、洗浄過程は、温度25℃、30
mMの塩化ナトリウム、3mMのクエン酸3ナトリウム、及び0.1%SDSにおいて実施さ
れる。より好適な実施例では、洗浄過程は、温度42℃、15mMの塩化ナトリウム、
1.5mMのクエン酸3ナトリウム、及び0.1%SDSにおいて実施される。最も好適な実
施例では、洗浄過程は、温度68℃、15mMの塩化ナトリウム、1.5mMのクエン酸3ナ
トリウム、及び0.1%SDSにおいて実施される。これらの条件の更なる変更につい
ては、当業者には容易に理解されるであろう。

【００７６】 DNA塩基配列決定方法および分析は当業者に周知のものである。その方法は、D
NAポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、SEQUENASE酵素（Ameraham Pharmaci
a Biotech Ltd., Uppsala, Sweden）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer Corp.,
Norwalk, CT）、耐熱性T7ポリメラーゼ（Ameraham Pharmacia Biotech Ltd., Up
psala, Sweden）、或いはELONGASE^TM増幅システム（Life Technologies, Inc.,
Rockville, MD）に於いて発見されたようなプルーフリーディングエキソヌクレ
アーゼ及びポリメラーゼの組合せのような酵素を使用する。配列の準備は、例え
ばABI CATALYST 800（Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT）若しくはMICROLABョ 2 200（Hamilton Co., Reno NV）システムのような装置を熱サイクラー(thermal c yclers)と組合せることによって自動化することが好ましい。また、配列決定は
、ABI PRISM^TM373 or 377 systems（Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT）若しく
はMEGABACE^TM 1000 capillary electrophoresis system（Molecular Dynamics,
Inc., Sunnyvale CA）等によって自動化可能である。配列は、当業者に周知のコ
ンピュータプログラム及びアルゴリズムを用いて分析可能である（例えば、Ausu
bei, 前出, unit 7.7; Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechno logy , Wiley VCH, New York NYを参照）。

【００７７】 HTPHをコードする核酸配列は、部分的なヌクレオチド配列を用いて先行技術に
於いて周知の種々のPCR法をベースとした方法で伸長し、プロモータ及び調節エ
レメントのような上流の配列を検出することができる。例えば、用いられる方法
の1つである制限部位PCR法は、一般的なプライマー及びネスト化プライマーを用
いてクローニングベクター内のゲノムDNAから未知の配列を増幅する（例えば、S
arkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322を参照）。逆PCR法を用いる
別の方法では、多岐に伸長して環状化鋳型から未知の配列を増幅するプライマー
を用いる。この鋳型は、既知のゲノム遺伝子座及びその周辺の配列を含む制限酵
素断片に由来する。（Triglia, T.ら（1988）Nucleic Acids Res. 16:8186）。
第3の方法として、キャプチャーPCR法(capture PCR)には、ヒト及び酵母菌の人
工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片のPCR増幅が含まれる（例えば、Lag
erstrom, M.ら（1991）PCR Methods Applic 1:111-119を参照）。この方法では
、多数の制限酵素の消化及びライゲ−ションを用いて、PCRを行う前に未知の配
列の領域に組換え2本鎖配列を挿入することができる。また、未知の配列を回収
するのに用いられ得る他の方法が当業者に周知である（例えば、Parker, J.D.
ら (1991)Nucleic Acids Res. 19:3055-306を参照）。更に、PCR法、ネスト化プ
ライマー、PromoterFinder^TMライブラリー（Clonetech, Palo Alto, CA）を用い
て、ゲノムDNA内の歩行が可能である（Clontech, Palo Alto, CA）。この方法で
はライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン移行部の
発見に有用である。全てのPCR法をベースとした方法については、プライマーは
、OLIGO^TM 4.06 Primer Analysis software（National Biosciences Inc., Plym
outh, MN）のような市販のソフトウェア又は別の適切なプログラムを用いて、長
さが22〜30ヌクレオチド、GC含有率が約50%以上、また約68℃〜72℃の温度で鋳
型に対してアニーリングするよう設計され得る。

【００７８】 完全長cDNAをスクリーニングするとき、大きなcDNAを含むようにサイズ選択さ
れたライブラリーを用いることが好ましい。また、遺伝子の5’領域を配列を含
むことが多いランダムプライムド(random-primed)ライブラリーは、oligo d(T)
ライブラリーで完全な長さのcDNAを得られない場合に好適である。またゲノムラ
イブラリーは、5’非転写領域における配列の伸長のために役立ち得る。

【００７９】 配列決定やPCRの産物のヌクレオチド配列のサイズ分析または確認のために、
市販のキャピラリー電気泳動法システムを用いることができる。特に、キャピラ
リーシークエンシングでは、電気泳動分離のための流動性ポリマー、4つの異な
るヌクレオチドに特異的なレーザーで活性化される蛍光色素、及び放射された波
長の検出を行うCCDカメラを使用し得る。出力／光強度は適切なソフトウエア（
例えば、Genotyper^TM及びSequence Navigator^TM(Perkin Elmer Corp., Norwalk,
CT)）を用いて電気信号に変換され、サンプルのローディングからコンピュータ
解析及び電子データ表示までの全過程がコンピュータ制御され得る。キャピラリ
ー電気泳動法は、特定のサンプル内に限られた量だけしか存在しないこともある
DNAの小片の配列決定に特に好適である。

【００８０】 本発明の別の実施例では、HTPHをコードするポリヌクレオチド配列またはその
断片を組換えDNA分子に用いて、HTPH、その断片またはその機能的等価物の適切
な宿主細胞内における発現を指向することができる。遺伝暗号の固有の縮重によ
って、実質的に同一、即ち機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のDNA配
列が作り出され、HTPHの発現のために用いることができる。

【００８１】 限定はしないが遺伝子産物のクローニング、プロセシング及び／又は発現を改
変すること等の種々の理由により、HTPHをコードする配列を改変するために、本
発明のヌクレオチド配列を当業者に周知の方法を用いて操作可能である。ランダ
ムな断片化によるDNA混合や、遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのPCR再構
成を用いて、ヌクレオチド配列を操作できる。例えば、オリゴヌクレオチド媒介
の部位特異的変異誘発により、新しい制限部位を生成する突然変異の挿入、グリ
コシル化パターンの変更、コドン選好の変化、スプライシングバリアントの生成
等が可能である。

【００８２】 本発明の別の実施例では、当業者に周知の化学的手法を用いて、HTPHをコード
する配列の全体、或いはその一部を合成することができる（例えば、Caruthers.
M.H.ら(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.215-223；Horn,T.ら(1980)Nucl.Acids R
es.Symp.Ser.225-232参照）。或いは、化学的手法を用いて、HTPHそのもの又は
その断片を合成することができる。例えば、種々の固相技術を用いてペプチド合
成を行うことができる（例えば、Roberge, J.Y.ら(1995) Science 269:202-204
参照）。また、ABI 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer Corp., Norwalk,
CT）を用いて合成の自動化を行なうことができる。更に、HTPHのアミノ酸配列
もしくはその任意の部分を、直接の合成において改変することにより、並びに／
又は他のタンパク質もしくはその任意の部分に由来する配列と結合させることに
より、変異体ポリペプチドを生成可能である。

【００８３】 そのペプチドは、分離用の高速液体クロマトグラフィにより実質的に精製する
ことができる（例えば、Chiez, R.M.およびRegnier. F.Z. (1990) Methods Enzy
mol. 182:392-421参照）。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸解析或いは配
列決定法により確認することができる（Creighton,T.(1983) Proteins. Structu res avd Molecular Properties ,WH Freeman and Co.,New York,NY）。

【００８４】 生物学的に活性なHTPHを発現させるために、HTPHをコードするヌクレオチド配
列またはその誘導体を、適切な発現ベクター（即ち、適切な宿主に挿入されたコ
ーディング配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクター）に挿入す
る。これらのエレメントには、ベクター及びHTPHをコードするポリヌクレオチド
配列におけるエンハンサー、構成型及び発現誘導型のプロモーター、5’及び3’
の非翻訳領域等の調節配列が含まれる。このようなエレメントの長さ及び特異性
は変化し得る。特定の開始シグナルを利用して、HTPHをコードする配列のより効
果的な翻訳を行なうことが可能である。このようなシグナルには、ATG開始コド
ンや例えばコザック配列等の隣接する配列が含まれる。HTPHをコードする配列、
その開始コドン、及び上流の調節配列が、適切な発現ベクターに挿入された場合
は、付加的な転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは不用となり得る。しかしな
がら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、読み枠の中の
ATG開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが発現ベクターよって与えられ
なければならない。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、天然及び合成の
種々のものからなり得る。用いられる特定の宿主細胞株に適当なエンハンサーを
含むことにより、発現の効率を高めることが可能である（例えば、Scharf, D.
ら (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162.を参照）。

【００８５】 HTPHをコードする配列および適切な転写や翻訳の調節領域を含む発現ベクター
を作製するために、当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には、in v itro 組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝的組換え技術が含まれる（例え
ば、Sambrook, J.ら(1989)Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spr
ing Harbor Press, Plainview, NY, ch.4,8,及び16-17；Ausubel,F.M.ら(1995,
and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, John W
iley & Sons, New York, NY, ch.9,13,及び16参照）。

【００８６】 HTPHをコードする配列を包含し、発現するために、種々の発現ベクター／宿主
系が利用できる。これらには、以下に限定しないが、組換え型のバクテリオファ
ージ、プラスミド或いはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌のような
微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌や、ウイルス発現ベクター
（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター
（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）またはタバコモザイクウイル
ス（TMV））或いは細菌の発現ベクター（例えば、TiまたはpBR322プラスミド）
で形質転換した植物細胞系や、或いは動物細胞系が含まれる。本発明は、利用さ
れる宿主細胞によって限定されるものではない。

【００８７】 細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターを、HTPHをコード
するポリヌクレオチド配列の使用の目的に応じて選択できる。例えば、HTPHをコ
ードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、及
び増殖は、Bluescript

【００８８】 HTPHの生成に酵母の発現系を利用できる。酵母菌Saccharomyces cerevisiae又
はPichia pastorisにおいて、α因子、アルコールオキシダーゼ、及びPGHなどの
構成型又は誘導型のプロモーターを含む多種のベクターを使用可能である。更に
、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌若しくは細胞内保持の何れ
かを導き、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来性の配列を組込みを可能
とする（例えば、上記のAusubel, 前出; 及び Grantら(1987) Methods Enzymol.
153:516-54；Scorer, C.A.ら(1994) Bio/Technology 12:181-184を参照）。

【００８９】 植物系もHTPHの発現に使用できる。HTPHをコードする配列の転写は、ウイルス
性のプロモータ（例えば、CaMVの35S及び19Sプロモーター単独、又はTMV由来の
オメガリーダー配列との組合わせ）で促進され得る（Takamatsu, N.ら(1987) EM
BO J. 6:307-311）。これらの作製物は、直接のDNA形質転換または病原体媒介の
形質移入によって、植物細胞中に導入可能である。（例えば、Hobbs, S.又はMur
ry, L.E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992) McGraw
Hill, New York; pp.191-196を参照）。

【００９０】 哺乳類の細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用することがで
きる。発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合、HTPHをコードする
配列が、後発のプロモータ及び三連のリーダー配列からなるアデノウイルス転写
／翻訳複合体の中に結合され得る。ウイルスのゲノムの非必須E1又はE3領域にお
ける挿入により、宿主細胞においてHTPHを発現する感染性のウイルスが得られる
（例えば、Logan, J.及びShenk, T.(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-365
9を参照）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーのような転写エン
ハンサーを、哺乳類の宿主細胞内の発現を増大させるために用いることができる
。また、タンパク質の高レベルの発現のために、SV40またはEBVをベースとした
ベクターを用いることができる。

【００９１】 また、ヒト人工染色体（HAC）を用いることにより、プラスミドに含まれ発現
され得るものに比べてより大きなDNAの断片を供給することもできる。治療を目
的とし、6kb〜10MbのHACを構築して従来のデリバリー方法（リポソーム、ポリカ
チオンのアミノポリマー、又は小胞）を介して供給することができる。

【００９２】 哺乳類系の組換え型タンパク質の産生を長期間にわたり確保するためには、細
胞株におけるHTPHの安定した発現が好ましい。例えば、発現ベクターを用いてHT
PHをコードする配列を細胞株に形質転換することが可能であり、その発現ベクタ
ーには、ウイルス起源の複製及び／若しくは内在性の発現エレメント並びに同一
或いは個別のベクターの上の選択マーカー遺伝子が含まれる。ベクターの導入の
後、選択培地に切り替える前に濃縮培地内で細胞を1〜2日間増殖させる。選択可
能なマーカーの目的は、選択的な媒介物に対して耐性を与えることであり、また
その存在によって導入された配列をうまく発現する細胞の増殖および回収が可能
とすることである。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞の
型に適した組織培養技術を用いて増殖することができる。

【００９３】 形質転換された細胞株を回収するために任意の数の選択系を用いることができ
る。これらには、以下に限定しないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ
及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれ、それぞれは、
tk⁻及びapr⁻細胞において用いられる（例えば、Wigler,M.ら(1977)Cell 11:22
3-32；Lowy,I.ら(1980)Cell 22:817-23参照）。また代謝拮抗剤、抗生剤或いは
除草剤への耐性を選択の基礎として用いることが可能で、例えばdhfrはメトトレ
キセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシドネオマイシン及びG-418に
対する耐性を与え、als或いはpatはクロルスルフロン(chlorsulfuron)、ホスフ
ィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(phosphinotricin acetyltransferase
)に対する耐性を与える（例えば、Wigler, M.ら(1980) Proc. Natl. Acad. Sci.
77:3567-70；Colberre-Garapin, F. ら(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14；Murry
, 前出を参照）。さらに選択可能な遺伝子として、例えば、代謝産物に対する細
胞の必要性を変更するtrpB及びhisDが文献に記載されている（例えば、Hartman,
S.C.及びR.C. Mulligan(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-8051参照）。
例えば、アントシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP）（Clontech, Palo Alto,
CA）、β-グルクロニダーゼ及びその基質GUS、ルシフェラーゼ及びその基質ルシ
フェリン等の可視マーカーを利用できる。これらのマーカーは形質転換体を同定
するだけでなく、特定のベクター系による一過性の或いは安定的なタンパク質発
現の量を定量するために広く用いられる（例えば、Rhodes, C.A.ら(1995)Method
s Mol. Biol.55:121-131参照）。

【００９４】 マーカー遺伝子発現の存在／非存在によって目的の遺伝子の存在も示唆される
が、その遺伝子の存在及び発現の確認を必要とすることもある。例えばHTPHをコ
ードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、HTPHをコードする配列
を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子の機能が存在しないことにより同
定できる。或いは、単一のプロモータの制御下において、HTPHをコードする配列
とマーカー遺伝子を直列に配置することができる。選択または誘導に応じた標識
遺伝子の発現は、通常直列に配置された配列の発現も同様に示す。

【００９５】 一般に、当業者に周知の様々な方法により、HTPHをコードする核酸配列を含み
HTPHを発現する宿主細胞を同定できる。このような方法には、以下に限定しない
が、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーション、PCR増幅、並びに核酸と
タンパク質配列を検出及び／若しくは定量するための技術に基づく膜、溶液、若
しくはチップを含むタンパク質バイオアッセイ又はイムノアッセイが含まれる。

【００９６】 特異的なポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体のいずれかを用いる
HTPHの発現を検出・測定するための免疫学的手法は、当業者に周知のものである
。そのような技術の例には、酵素結合免疫検定法（ELISA）、ラジオイムノアッ
セイ（RIAs）及び蛍光細胞分析分離（FACS）が含まれる。HTPH上において2つの
非干渉エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位のモノ
クローナルベースのイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay
）が好ましいが、競合的結合実験も用いられうる。これらアッセイおよび他のア
ッセイは、当業者によって開示されている（例えば、Hampton, R.ら(1990);Sero logical Methods, a Laboratory Manual , APS Press,St Paul,MN Section IV；C
oligan, J. E.ら(1997 and periodic supplements) Current Protocols in Immu nology , Greene Pub. Associates and Wiley-lnterscience, New York, NY; 及
びMaddox, D.E.ら(1983); J. Exp. Med. 158:1211-1216を参照）。

【００９７】 多様なラベル及び結合技術が当業者には周知であり、そして種々の核酸及びア
ミノ酸のアッセイにおいて用いることができる。HTPHをコードするポリヌクレオ
チドに関係する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプロ
ーブやPCRプローブを作製するための手段には、オリゴ標識(oligolabeling)、ニ
ックトランスレーション法、末端標識(end-labeling)、或いは標識ヌクレオチド
を用いるPCR増幅などが含まれる。或いは、HTPHをコードする配列、又はその任
意の断片を、mRNAプローブの作製のためのベクターにクローン化できる。そのよ
うなベクターは当業者に周知で、また市販されており、これを用いて、例えばT7
、T3或いはSP6のような適切なRNAポリメラーゼ及び標識したヌクレオチドを加え
ることによってin vitroでRNAプローブを合成することができる。これらの方法
は、種々の市販のキット（Pharmacia & Upjohn(Kalamazoo, MI)、Promega (Madi
son WI、及びU.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH提供）を用いて実施する
ことができる。検出を容易にするために用いる適切なレポーター分子、即ち標識
には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤或いは色素生産剤や、基質、コフ
ァクター、インヒビター、磁性粒子等が含まれる。

【００９８】 細胞培養からのタンパク質の回収および発現に適した条件下において、HTPHを
コードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を培養することができる
。形質転換された細胞により産生されるタンパク質は、用いられる配列及び／ま
たはベクターに応じて分泌されるか、又は細胞内に保持され得る。当業者に理解
されるように、HTPHをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核
生物か真核生物の細胞膜を通してHTPH分泌を指向するシグナル配列を含むように
設計することができる。

【００９９】 更に、宿主細胞株は、挿入した配列の発現の調節能力または発現したタンパク
質を所望の形にプロセシングする能力によって選択される。このようなポリペプ
チドの修飾には、以下に限定するものではないが、アセチル化、カルボキシル化
、グリコシル化、リン酸化、脂質化(lipidation)、及びアシル化が含まれる。タ
ンパク質の「prepro」形を切断する翻訳後プロセシングを用いて、タンパク質の
標的、折り畳み及び／又は活性を特定することができる。翻訳後の活性のための
特定の特徴的な機構及び細胞装置を有する種々の宿主細胞（例えば、CHO、HeLa
、MDCK、MEK293、WI38）は、American Type Culture Collection（ATCC, Bethe
sda, MD）より入手可能であり、外来性のタンパク質の正しい修飾及びプロセシ
ングを確実にするために選択され得る。

【０１００】 本発明の別の実施例では、HTPHをコードする天然の核酸、改変された核酸、又
は組換えの核酸配列を、前述の任意の宿主系の融合タンパク質の翻訳となる異種
配列に結合させ得る。例えば、市販の抗体によって識別できる異種部分を含むキ
メラHTPHタンパク質が、HTPHの活性のインヒビターに対するペプチドライブラリ
のスクリーニングを促進し得る。また、市販の親和性の基質を用いて、異種タン
パク質及びペプチド部分が、融合タンパク質の精製を促進し得る。このような部
分には、以下に限定されるものではないが、グルタチオンSトランスフェラーゼ
（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモ
ジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）が含
まれる。GST、MBP、Trx、CBP、及び6-Hisによって、固定されたグルタチオン、
マルトース、フェニルアルシン酸化物、カルモジュリン、及び金属キレート樹脂
の各々で同族の融合タンパク質の精製が可能となる。FLAG、c-mc、及び赤血球凝
集素（HA）によって、これらのエピトープ標識を特異的に識別する市販のモノク
ロナール抗体及びポリクロナール抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性の
精製が可能である。また、HTPHをコードする配列と異種タンパク質配列との間に
位置するタンパク質切断部位を融合タンパク質が含むように、融合タンパク質が
操作されて、精製の後にHTPHが異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発
現及び精製方法については、Ausubel, F. M.らの (1995 and periodic suppleme
nts) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York
, NY, ch 10に記載されている。また、融合タンパク質の発現及び精製の促進の
ために、種々の市販のキットを用いることができる。

【０１０１】 本発明の更に別の実施例では、TNT^TMウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ
胚芽抽出系（Promega, Madison, WI）を用いてin vitroで放射能標識したHTPHの
合成を行なうことができる。これらの系は、T7、T3、又はSP6プロモーターと操
作可能に結合したタンパク質をコードする配列の転写と翻訳を結びつける。転写
は放射能標識されたアミノ酸前駆体（好ましくは³⁵S-メチオニン）の存在の下で
起こる。

【０１０２】 組換え体の生成だけでなく、固相技術を用いた直接のペプチド合成によって、
HTPHの断片を作り出すことができる（例えば、Creighton, 前出 pp.55-60を参照
）。タンパク質合成は手作業または自動で行なうことができる。自動化された合
成は、例えば、Applied Biosystem 431Aペプチドシンセサイザ（The Perkin Elm
er Corp., Norwalk, CT）を用いて行うことができる。HTPHの種々の断片を個別
に合成して、次に結合させて完全長分子を作り出すことも可能である。

【０１０３】 治療 HTPH-1及びラットのABC輸送体（GI 2982567）の間には、（例えば、配列およ
びモチーフの前後関係において）化学的および構造的類似性が存在する。更に、
タンパク質の配列分析（PFAM及びBLOCKS）によって、HTPH-1をABC輸送体として
同定する。HTPH-1は、癌性のライブラリー及び生殖組織由来のライブラリーにお
いて発現される。従って、HTPH-1は、癌および生殖障害において所定の役割を果
たしていると考えられる。HTPH-2及びE.coliの銅恒常性タンパク質CutC（GI 173
6520）の間には、（例えば、配列およびモチーフの前後関係において）化学的お
よび構造的類似性が存在する。更に、HTPH-2は、癌性のライブラリー及び生殖組
織由来のライブラリーにおいて発現される。従って、HTPH-2は、癌、生殖障害、
及び銅代謝障害において所定の役割を果たしていると考えられる。タンパク質配
列分析によって、HTPH-3をLac Yファミリーのプロトン／糖共輸送体（BL00896）
として同定する。更に、HTPH-3は、癌性のライブラリー及び生殖組織由来のライ
ブラリーにおいて発現される。従って、HTPH-2は、癌および生殖障害において所
定の役割を果たしていると考えられる。

【０１０４】 従って、一実施例においては、銅代謝障害の治療または予防のためにHTPH又は
その断片若しくは誘導体を被験者に投与することができる。そのような疾患には
、以下に限定しないが、メンケス病、ウィルソン病、IX型エーラース‐ダンロス
症候群等が含まれる。

【０１０５】 別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む銅代謝障害の治療ま
たは予防のために、HTPH、又はその断片もしくは誘導体を発現可能なベクターを
被験者に投与してもよい。

【０１０６】 また別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む銅代謝障害の治
療または予防のために、適切な医薬用担体と共に実質的に精製されたHTPHを含む
医薬品組成物を被験者に投与してもよい。

【０１０７】 更に別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む銅代謝障害の治
療または予防のために、HTPHの活性を調節するアゴニストを被験者に投与しても
よい。

【０１０８】 別の実施例においては、癌の治療または予防のためにHTPHのアンタゴニストを
被験者に投与することができる。そのような癌には、以下に限定しないが、腺癌
、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫や、特に、副腎、膀胱、
骨、骨髄、脳、乳房、頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉
、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲
状腺、及び子宮の癌等が含まれる。一実施態様では、HTPHと特異的に結合する抗
体をアンタゴニストとして直接用いるか、或いはHTPHを発現する細胞や組織に薬
剤をもたらす送達機構またはターゲティングとして間接的に用いることができる
。

【０１０９】 別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む癌の治療または予防
のために、HTPHをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを
被験者に投与してもよい。

【０１１０】 別の実施例においては、生殖障害の治療または予防のためにHTPHのアンタゴニ
ストを被験者に投与することができる。そのような疾患には、以下に限定しない
が、プロラクチン産生異常や、卵管異常、排卵異常、及び子宮内膜症を含む不妊
症や、発情周期の混乱、月経周期の混乱、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺激症候
群、子宮内膜や卵巣の腫瘍、子宮筋腫、自己免疫異常、異所的妊娠、及び奇形発
生や、乳房の癌、乳房線維嚢胞病、及び溢乳や、精子形成の混乱、異常性精子生
理、精巣の癌、前立腺の癌、良性の前立腺肥大症、前立腺炎、ペイロニー病(Pey
ronie's disease)、男性の乳房および女性化乳房の癌等が含まれる。一実施態様
では、HTPHと特異的に結合する抗体をアンタゴニストとして直接用いるか、或い
はHTPHを発現する細胞や組織に薬剤をもたらす送達機構またはターゲティングと
して間接的に用いることができる。

【０１１１】 別の実施例においては、限定はしないが上述のものを含む生殖障害の治療また
は予防のために、HTPHをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベク
ターを被験者に投与してもよい。

【０１１２】 他の実施例においては、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ
スト、相補的配列またはベクターの何れかを、他の適切な治療薬と組合せて投与
することもできる。当業者は従来の製薬の原理に基づいて併用療法で使用するた
めの適切な薬剤を選択することができるであろう。治療薬を組み合わせることに
より、上述の種々の反応の治療又は予防に効果を与えるように相乗剤的に機能し
得る。この方法を用いることにより、より少ない各薬剤の投与量で治療効果を上
げることができ、従って副作用の可能性を低下させることができる。これは、HT
PH-1の活性を調節する薬剤に関して特に重要である。 HTPH-1は、P糖タンパク質、MDR（多剤耐性タンパク質）を含むABC輸送体ファ
ミリーのメンバーである。これらのタンパク質は、標的細胞の外側の薬物（例え
ば、抗生物質）の輸送を媒介し、従って標的細胞における薬物の抗力を低下させ
る。よって、標的細胞から薬物を除去するのを阻害する薬剤は、薬物の効力を著
しく促進し、またそれ自体が併用療法において特に重要である。

【０１１３】 HTPHのアンタゴニストは、当業者に周知の方法を用いて製造することができる
。詳細には、精製されたHTPHを用いて抗体を作り出したり、或いはHTPHに特異的
に結合するものを同定するために、薬剤のライブラリーをスクリーニングするこ
とができる。HTPHの抗体は、当業者によく知られた方法を用いて産生することが
できる。このような抗体には、以下に限定されないが、ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fabフラグメント、及びFab発現ライ
ブラリーにより作られたフラグメントが含まれる。中和抗体（即ち、二量体形成
を阻害するもの）は治療の用途に特に好適である。

【０１１４】 抗体を産生するために、HTPHか、免疫学的特性を有するその任意の断片或いは
そのオリゴペプチドを注射することによって、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、
ヒト等を含む種々の宿主を免疫化することができる。ラット及びマウスは、モノ
クロナール抗体生成を含むダウンストリーム適用のための宿主として好ましい。
宿主の種に応じて、免疫学的反応を増強するために種々のアジュバントを用いる
ことができる。そのようなアジュバントには、以下に限定しないが、フロイント
のアジュバント、アルミニウムの水酸化物ようなミネラルゲル、リゾレシチンの
ような界面活性剤、プルロニックポリオール(pluronic polyols)、ポリアニオン
、ペプチド、オイルエマルジョン、KLH及びジニトロフェノールが含まれる。ヒ
トで使用するアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びCoryn ebacterium parvum が特に好ましい（抗体の産生および分析の方法のレビューは
、例えば、Harlow, E. 及びLane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照）。

【０１１５】 HTPHの抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、またはそ
の断片は、好ましくは少なくとも5個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも14
個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。またこれらのオリゴペプチド、ペ
プチド、または断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一で、小形
の自然発生の分子の全アミノ酸配列を含んでいることが好ましい。HTPHアミノ酸
の短い伸展部が、KLHのような別のタンパク質の伸展部と融合し、キメラ分子の
抗体が産生され得る。

【０１１６】 HTPHのモノクローナル抗体は、培養における持続的な細胞株によって抗体分子
を産生させる任意の技術を用いて調製できる。このような技術には、以下に限定
しないが、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、及びEBV-ハイ
ブリドーマ技術が含まれる（例えば、Kohler, G.ら(1975) Nature 256:495-497
；Kozbor, D. ら(1985) Immunol. Methods 81 :31-42；Cote, R.J. ら(1983) Pr
oc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030；Cole, S.P. ら(1984) Mol. Cell Biol. 6
2:109-120参照）。

【０１１７】 さらに、適切な抗原特異性および生物活性を備えた分子を得るために、ヒト抗
体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングする技術のような「キメラ抗体
」の産生のために開発された技術を用いることができる（例えば、Morrison,S.L
.ら(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855;Neuberger, M.S. ら(1984)Nat
ure 312:604-608;Takeda, S. ら(1985)Nature 314:452-454参照）。或いは、当
業者に周知の方法を用いて単鎖の抗体の生成のための技術を適用して、HTPHに特
異的な単鎖抗体を産生することができる。関連する特異性を有するがイディオタ
イプ組成が異なる抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリー
からの鎖混合(chain shuffling)によって産生することができる（例えば、Burto
n D.R.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:10134-10137参照）。

【０１１８】 抗体は、免疫グロブリンライブラリーまたは高度に特異的な結合試薬のパネル
をスクリーニングすることにより、或いはリンパ球集団でのin vivoの産生を誘
導することにより産生することができる（例えば、Orlandi,R.ら(1989), Proc.
Natl. Acad. Sci. 86:3833-3837；Winter, G.ら(1991) Nature 349:293-299参照
）。

【０１１９】 またHTPHに対する特異的な結合部位を含む抗体フラグメントも作り出すことが
できる。例えばこのような断片には、以下に限定はしないが、抗体分子のペプシ
ン消化により生成することができるF(ab')₂フラグメントや、F(ab')₂フラグメン
トのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるFabフラグメン
トが含まれる。或いは、所望の特異性を備えたモノクローナルFabフラグメント
を迅速かつ容易に同定可能なように、Fab発現ライブラリーを構成し得る（例え
ば、Huse,W.D.ら(1989) Science 246:1275-1281参照）。

【０１２０】 種々のイムノアッセイを、所望の特異性および最小の交差反応性を有する抗体
を同定するためのスクリーニングに用いることができる。確立された特異性を有
するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の何れかを用いる競合的結合
アッセイ或いは免疫放射線測定法の多数のプロトコルが、当技術分野で周知であ
る。このようなイムノアッセイには、一般にHTPHとその特異的な抗体との間の複
合体の形成の測定が含まれる。2つの非干渉HTPHエピトープに対して反応するモ
ノクローナル抗体を用いる2部位のモノクローナル抗体ベースのイムノアッセイ
（two sites monoclonal based immunoassay）が好適であるが、競合的結合アッ
セイも用いられ得る（Maddox, 前出）。

【０１２１】 ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析等の種々の方法を用いて、HTP
H抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態
におけるOP抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で割ったもの
として定義される。多数のHTPHエピトープに対して親和性が不均一なポリクロナ
ール抗体試薬に対して測定されたKaは、HTPH抗体の平均親和性または結合活性を
表す。特定のHTPHエピトープに単一特異的なモノクロナール抗体試薬に対して測
定されたKaは、親和性の真の測定値を表す。Kaの値が10⁹〜10¹²L/molの高い親和
性の抗体試薬は、HTPH抗体複合体が厳密な操作に耐えなければならないイムノア
ッセイに用いるのが好ましい。Kaの値が10⁶〜10⁷L/molの低い親和性の抗体試薬
は、最終的にHTPHが活性化状態で抗体から解離する必要がある免疫精製(immunop
urification)及び類似の処理に用いるのが好ましい。（Catty, D. (1988) Antib odies, Volume I: A Practical Approach . IRL Press, Washington, DC; Liddel
l, J. E.及びCryer, A. (1991) A Practical Guide to Monocional Antibodies,
John Wiley & Sons, New York NY）。

【０１２２】 ポリクロナール抗体試薬のタイター及び結合活性を更に評価して、ある一定の
ダウンストリーム適用に対するこのような試薬の品質及び適合性を判定する。例
えば、少なくとも1〜2mg/mlの特異的な抗体、好ましくは5〜10mg/mlの特異的な
抗体を含むポリクロナール抗体試薬は、HTPH抗体複合体の沈殿を必要とする方法
に使用することが好ましい。種々の適用における抗体の特異性、タイター、及び
結合活性に対する処理、並びに抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能であ
る （例えば、Catty, 前出、及びColiganら, 前出を参照）。

【０１２３】 本発明の別の実施例では、HTPHをコードするポリヌクレオチド、またはその任
意の断片や相補配列を、治療を目的として用いることができる。一態様では、mR
NAの転写を阻害することが望ましい状況において、HTPHをコードするポリヌクレ
オチドに対する相補配列を用いることができる。詳細には、HTPHをコードするポ
リヌクレオチドに相補的な配列で細胞を形質転換することができる。従って、HT
PHの活性を調節する、或いは遺伝子の機能を調節するために、相補的な分子また
は断片を用いることができる。現在このような技術は周知であり、センス又はア
ンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはより大きな断片を、HTPHをコードする配
列のコード領域や調節領域に従って様々な位置から設計可能である。

【０１２４】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクシニアウイルスに由来
する、或いは種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的の器官、
組織、即ち細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられ得る。当業者に
周知の方法を用いて、HTPHをコードするポリヌクレオチドに相補的な核酸配列を
発現するためのベクターを産生することができる（例えば、Sambrook, 前出、及
びAusubel, 前出 参照）。

【０１２５】 HTPHをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を高レベルで発現する発現
ベクターで細胞または組織を形質転換させることによって、HTPHをコードする遺
伝子を作り出すことができる。このような作製物は、翻訳不能なセンス配列或い
はアンチセンス配列を細胞に導入するために用いることができる。DNAへ組み込
みが存在しない場合でも、このようなベクターは、それらが内在性のヌクレアー
ゼにより無能となるまで、RNA分子を転写し続け得る。一過性の発現は、非複製
ベクターでも1ヶ月以上、適切な複製エレメントがベクター系の一部である場合
にはさらに長い期間持続し得る。

【０１２６】 前述のように、HTPHをコードする遺伝子の制御、5’、又は調節領域に対する
相補配列、つまりアンチセンス分子（DNA、RNAまたはPNA）を設計することによ
って、遺伝子発現を変更することができる。転写開始点（例えば、開始部位から
+10〜-10の位置）に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、三重らせ
ん体の塩基対形成方法論を用いて、阻害を達成することができる。ポリメラーゼ
、転写制御因子、或いは調節分子の結合のために二重らせんが十分にほどける能
力を阻害するので、三重らせん対合は有用である（例えば、Gee, J.E.ら(1994)I
n: Huber, B.E.及びB.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futur
a Publishing Co.,Mt.Kisco,NY,pp.163-177参照）。転写物のリボソームへの結
合を阻止することによりmRNAの転写を阻害するために、相補的配列、即ちアンチ
センス分子を設計し得る。

【０１２７】 リボザイム、つまり酵素RNA分子を用いてRNAの特異的切断を触媒することがで
きる。リボザイム作用機構は、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列の特異
的ハイブリダイゼーションに関与し、その後のヌクレオチド鎖切断が行なわれる
。例えば、操作されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、HTPHをコード
する配列のヌクレオチド鎖切断を特異的かつ効果的に触媒し得る。

【０１２８】 任意の潜在的なRNA標的物内の特異的なリボザイム切断部位は、最初、後続す
る配列GUA、GUU並びにGUCを含むリボザイム切断部位に対する標的分子を走査す
ることによって同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領
域に対応する15〜20個のリボヌクレオチドの間の短いRNA配列は、そのオリゴヌ
クレオチドを動作不能(inoperable)とする2次の構造的特徴について評価するこ
とができる。また候補の標的の適合性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイ(ribon
uclease protection assay)を用い、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリ
ダイゼーションに対する接触性(accessibility)の検査により評価することがで
きる。

【０１２９】 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子を合成するのための
当技術分野で周知の方法により作り出すことができる。これらには、固相ホスホ
ラミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドの化学的合成のための技術が含
まれる。或いは、RNA分子は、HTPHをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo
の転写により作り出すことができる。このようなDNA配列は、T7或いはSP6のよう
な適切なRNAポリメラーゼプロモーターを伴う多様なベクターに取り込むことが
できる。或いは、構成的または誘導的に相補的なRNAを合成するこれらのcDNA作
製物は、株化細胞、細胞または組織内に導入することができる。

【０１３０】 細胞内の安定性を高め、また半減期を長くするために、RNA分子は修飾するこ
とができる。可能な修飾としては、以下に限定しないが、その分子の5′末端及
び／又は3’末端でのフランキング配列の付加や、分子のバックボーン内におけ
るホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネート或いは2′O-メチルを
使用を含む。この概念はPNA生成において固有のものであり、内在性エンドヌク
レアーゼにより容易に認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及
びウリジンの、アセチル−、メチル−、チオ−、及び類似の修飾形態だけでなく
、イノシン、クエオシン(queosine)、及びワイブトシン(wybutosine)のような従
来よりあまり用いられない塩基を含めることにより、これら全ての分子に拡張可
能である。

【０１３１】 細胞或いは組織内にベクターを導入するための多くの方法が利用可能で、同様
にin vivo、in vitro、及びex vivoでの使用にも適している。ex vivoでの治療
法のに対し、ベクターを患者から採取された幹細胞に導入し、自己移植して同じ
患者に戻すためにクローンとして増殖させることができる。トランスフェクショ
ンによるデリバリー、或いはリポソーム注入またはポリカチオンアミノポリマー
によるデリバリーは、当技術分野でよく知られた方法を用いて実施することがで
きる（例えば、Goldman, C.K.ら(1997) Nature Biotechnology 15:462-466参照
）。

【０１３２】 前述の治療法は何れも、例えばイヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及
び最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む治療が必要な任意の対象に適用する
ことができる。

【０１３３】 本発明の更なる実施例では、前述の任意の治療効果のために、医薬成分を薬剤
上受け入れられる担体とともに投与する。このような医薬成分は、HTPH、HTPHの
抗体、HTPHの模倣体、アゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターからなる
ものでありうる。この成分は、単体或いは例えば安定化する配合ような1以上の
他の薬剤とともに、任意の無菌の生体適合性の医薬用担体に投与され、その担体
には、以下に限定しないが、生理食塩水、バッファー食塩水、ブドウ糖或いは水
が含まれる。このような組成物は、単体或いは他の薬剤、ドラッグやホルモンと
結合した形で患者に投与されうる。

【０１３４】 本発明で用いられる医薬品組成物の投与経路には、以下に限定されないが、経
口投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄内投与、くも膜下腔内投与、
脳室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経腸投与、局所的
投与、舌下投与、或いは直腸投与が含まれ得る。

【０１３５】 有効成分に加えて、これらの医薬成分は、有効成分を医薬上使用できる製剤に
するための処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含む、適切な医薬上認め
られる担体を含みうる。更に、製剤或いは投与に関する技術の詳細は、Remingto ns Pharmaceutical Sciences （Maack Publishing Co., Easton, PA）の最新版に
記載されている。

【０１３６】 経口投与のための医薬品組成物は、当技術分野でよく知られる医薬上認められ
る担体を用いて、経口投与に適当な投与量に配合される。このような担体により
、医薬品組成物を患者に摂取させるための錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液
体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液等に調剤できる。

【０１３７】 経口投与用の医薬製剤は、有効成分と固形の賦形剤とを配合して、（所望によ
り、粉砕した後に）得られた顆粒の混合物を処理して錠剤或いは糖衣剤コア(dra
gee core)を作ることによって得られる。必要ならば、適切な添加物が加えるこ
とができる。適切な賦形剤には、ラクトース、スクロース、マンニトール或いは
ソルビトールを含む砂糖のような糖質またはタンパク質賦形剤や、トウモロコシ
、コムギ、コメ、ジャガイモ等からのデンプンや、メチルセルロース、ヒドロキ
シプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムの
ようなセルロースや、アラビアゴム或いはトラガカントゴムのようなゴムや、並
びにゼラチン或いはコラーゲンのようなタンパク質が含まれる。必要ならば、架
橋したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はアルギン酸ナトリウムの
ようなその塩のような崩壊剤または可溶化剤を加えてもよい。

【０１３８】 糖衣丸コアは、濃縮糖液のような適切な剤皮と共に用いられるが、それらには
アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤(carbopol ge
l)、ポリエチレングリコール及び／又はチタンの二酸化物、ラッカー溶液及び適
切な有機溶剤或いは溶剤の混合物等が含まれる。錠剤の識別のため、或いは有効
成分の量（即ち投与量）を特徴づけるために、染料或いは色素を錠剤或いは糖衣
錠皮に加えることができる。

【０１３９】 経口投与できる製剤には、ゼラチンからなるプッシュフィット(push-fit)カプ
セル、ゼラチンからなる軟性のシールされたカプセル及びグリセロール或いはソ
ルビトールのような錠皮が含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトース
或いはデンプンのような賦形剤または結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネ
シウムのような潤滑剤、及び所望により安定剤と混合された有効成分を含みうる
。軟性カプセルにおいて、有効成分は、安定剤とともに或いは安定剤なしに、脂
肪性の油、液体、または液状ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解
或いは懸濁される。

【０１４０】 非経口投与に適した医薬製剤は、水溶液中で、好適にはハンク溶液、リンゲル
溶液或いは生理緩衝食塩水のような生理学的に適合するバッファーの中で配合す
ることができる。水性の注射懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウ
ム、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁液の粘性を高める物質を含み
うる。更に、有効成分の懸濁液は、適切な油性注入懸濁液として調製してもよい
。適切な親油性の溶媒或いは賦形剤には、胡麻油のような脂肪性の油や、オレイ
ン酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのような合成脂肪酸エステルが含
まれる。また非脂質ポリカチオンアミノポリマーが、送達のために用いられる。
所望により、懸濁液は化合物の溶解度を増加させて濃縮度の高い溶液の調製を可
能にする適切な安定剤または薬剤を含んでもよい。

【０１４１】 局所または経鼻投与用には、浸透する特定の障壁に対して適切な浸透剤が調合
に用いられる。このような浸透剤は、当技術分野において周知のものである。

【０１４２】 本発明の医薬組成物は周知の方法、例えば通常の混合処理、溶解処理、顆粒化
処理、糖衣形成処理、湿式粉砕処理(levigating)、乳化処理、カプセル化処理、
エントラップ処理(entrapping)或いは凍結乾燥処理により製造される。 この医薬組成物は塩類として提供されることもあり、以下に限定しないが、塩
酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む多くの酸とともに
形成することができる。塩は水性或いはプロトニック溶剤において、対応する遊
離塩基形態よりも溶解性が高くなる傾向がある。別のケースでは、好適な製剤と
しては、使用前に緩衝剤配合したpH4.5〜5.5の範囲にある1mM〜50mMのヒスチジ
ン、0.1%〜2%のショ糖、2%〜7%のマンニトールの何れか、或いは全てを含む凍結
乾燥粉末でもよい。

【０１４３】 医薬組成物は調製された後に適切な容器内に入れられて、指示された状態の治
療のためにラベル付けできる。HTPHの投与の場合では、このようなラベルには、
投与量、投与頻度、投与方法が表示される。

【０１４４】 本発明において使用するのに適する医薬品組成物は、所望の目的を達成するた
めに有効成分を効果的な量だけ含む成分を含んでいる。有効量の決定は、当業者
の能力の範囲内で十分行うことができる。

【０１４５】 任意の化合物の場合、治療に有効な量は、最初は例えばマウス、ウサギ、イヌ
、ブタのような動物モデルまたは腫瘍性細胞の何れかの細胞培養のアッセイにお
いて見積もることができる。また、適切な濃度範囲および投与経路を決定するた
めに動物モデルを用いることができる。次にこのような情報を利用して、ヒトに
おける投与量や投与経路を決定することができる。

【０１４６】 治療的に有効な量とは、例えば、症状や状態を回復させるHTPHまたはその断片
、HTPHの抗体、HTPHのアゴニスト、HTPHのアンタゴニスト、又はHTPHのインヒビ
ターの有効成分の量を指す。治療的な効力および毒性は、細胞培養或いは実験動
物における標準的な製薬方法により、例えばED₅₀(母集団の50%における治療的な
有効投与量)またはLD₅₀(母集団の50%の致死投与量)統計量を計算することによっ
て決定することができる。毒性に対する治療効果の用量比が治療指数であり、ED ₅₀ / LD₅₀の比として表すことができる。医薬品組成物は大きな治療指数を示すこ
とが好ましい。細胞培養のアッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトの
使用のための投与量の範囲をまとめるのに用いることができる。そのような成分
の投与量は、毒性が少ないか或いは全く毒性がなく、ED₅₀を含む循環する濃度の
範囲内にあることが好ましい。使用する剤形、患者の感受性並びに投与経路に応
じて、投与量はこの範囲内で変化する。

【０１４７】 正確な用量は、治療が必要な被験者に関連する要因を考慮して医師が決定する
。投与及び投薬量は、十分なレベルの有効成分を与える、即ち所定の効果を維持
するために調節される。考慮すべき要因としては、疾病状態の重症度、全般的な
被験者の健康、年齢、体重、性別や、食餌、投与の時間及び頻度や、併用する薬
剤、反応感受性、および治療への反応が含まれる。長時間作用性の医薬品組成物
は、半減期及び特定の製剤のクリアランス率に応じて3〜4日毎に、1週間毎に、或
いは2週間に1度投与してもよい。

【０１４８】 通常の投与量は0.1〜100,000μgの範囲であり、最大約1gの総投与量まで、投
与経路に応じて変化する。特定の投与量或いは送達の方法のガイダンスは文献に
おいて提供され、通常当技術分野の医師に利用可能である。当業者は、ヌクレオ
チドに対しては、タンパク質やインヒビター用の製剤とは異なる製剤を採用する
ことができる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の
細胞、状態、位置等に対して特異的でありうる。

【０１４９】 診断 別の実施例においては、HTPHに特異的に結合する抗体を、HTPHの発現によって
特徴づけられる状態や疾病の診断や、HTPH又はHTPHのアゴニスト、アンタゴニス
ト、インヒビターで治療を受けている患者のモニタリングのためのアッセイに用
いることができる。診断目的に対して有用な抗体は、前述の治療のためのものと
同様の方法で作製することができる。HTPHの診断のアッセイには、ヒトの体液、
細胞或いは組織の抽出物においてHTPHを検出するために抗体および標識を用いる
方法が含まれる。抗体は修飾しても、修飾なしでも用いることができ、また共有
結合或いは非共有結合かのいずれかによりリポーター分子と結合させて標識する
ことができる。当業者に周知の多様なリポーター分子が用いられ、そのうちの幾
つかについては前述の通りである。

【０１５０】 ELISA、RIA及びFACSを含む、HTPHを測定するための種々のプロトコルが当技術
分野では周知であり、またこれによりHTPH発現の変化や異常性のレベルを診断す
るための基礎が得られる。HTPHの発現の正常値、即ち標準値は、複合体形成に適
した条件下で、哺乳類、好ましくはヒトの正常な被験者から得られる体液或いは
細胞抽出物とHTPHの抗体を結合させることによって確立できる。標準の複合体形
成量は、種々の方法、好ましくは測光手段を用いて定量化できる。被験者の生検
組織からの対照サンプル及び患部サンプルにおいて発現されたHTPHの量を、標準
値と比較する。標準値と被験者の値との偏差によって疾病診断のためのパラメー
タを確立する。

【０１５１】 本発明の別の実施例において、HTPHをコードするポリヌクレオチドを、診断の
目的で用いることができる。用いられるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオ
チド配列、相補的RNA及びDNA分子、及びPNAが含まれる。このポリヌクレオチド
は、HTPHの発現が疾病と関連するであろう生検組織における遺伝子発現の検出や
定量のために用いられる。診断アッセイは、HTPHが存在、非存在、過剰発現の何
れの状態かを識別したり、治療の処置の際にHTPHレベルの調節をモニタリングす
るために用いることができる。

【０１５２】 一態様では、HTPHまたは密接に関連分子をコードする、ゲノム配列を含むポリ
ヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブとのハイブリダイゼーションを用い
て、HTPHをコードする核酸配列を同定することができる。そのプローブの特異性
、つまりそのプローブが非常に高度に特異的な領域（例えば、5’調節領域）に
由来するか、或いはより特異性の度合いの低い領域（例えば、保存されたモチー
フ）の何れに由来するかによって、またハイブリダイゼーション或いは増幅の（
最大の、高い、中程度の、或いは低い）厳密性によって、そのプローブがHTPHを
コードする自然発生の配列のみを同定するか、或いはアレルや関連する配列も同
定するかが決定される。

【０１５３】 プローブは関連する配列を検出するためにも用いることができ、また好ましく
はHTPHをコードする任意の配列に対して少なくとも50%の配列同一性を有するべ
きである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、DNA若しくはRNAか、ま
たSEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、又はSEQ ID NO:6の配列に由来するものか、或い
はHTPH遺伝子のイントロン、エンハンサー、及びプロモータを含むゲノムの配列
に由来するものでもよい。

【０１５４】 HTPHをコードするDNAのための特異的なハイブリダイゼーションプローブを作
製するための手段には、mRNAプローブを作り出すためにHTPH又はHTPH誘導体をコ
ードするポリヌクレオチド配列をベクターにクローンニングする方法がある。こ
のようなベクターは当業者に周知で、また市販されており、適切なRNAポリメラ
ーゼや適切な標識されたヌクレオチドを付加することにより、in vitroでRNAプ
ローブを合成するために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブ
は種々のリポータグループにより標識され、例えば、その標識は、³²Pや³⁵Sのよ
うな放射性核種によるものや、アビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結
合するアルカリホスファターゼのような酵素による標識等である。

【０１５５】 HTPHをコードするポリヌクレオチド配列を、HTPHの発現に関連する疾患の診断
のために用いることができる。そのような疾患の例としては、以下に限定はしな
いが、メンケス病、ウィルソン病、IX型エーラース‐ダンロス症候群等の銅代謝
疾患、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌腫や、
特に、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎
臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾
臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌等の癌、並びに、プロラクチン産生異常
や、卵管異常、排卵異常、及び子宮内膜症を含む不妊症や、発情周期の混乱、月
経周期の混乱、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣過刺激症候群、子宮内膜や卵巣の腫瘍
、子宮筋腫、自己免疫異常、異所的妊娠、及び奇形発生や、乳房の癌、乳房線維
嚢胞病、及び溢乳や、精子形成の混乱、異常性精子生理、精巣の癌、前立腺の癌
、良性の前立腺肥大症、前立腺炎、ペイロニー病(Peyronie's disease)、男性の
乳房および女性化乳房の癌等の生殖障害が挙げられる。HTPHをコードするポリヌ
クレオチド配列を、患者の生検組織や体液を利用するサザンブロット法またはノ
ーザン分析、ドットブロット法或いは他の膜をベースとした技術や、PCR技術や
、ディップスティック試験法(dipstick)、ピン、マルチフォーマットELISA様ア
ッセイまたはマイクロアレイにおいて用いて、HTPH発現の変化を検出することが
できる。このような定性的または定量的試験法は当業者に周知のものである。

【０１５６】 特定の態様では、特に上述のような関連疾患の存在を検出するアッセイにおい
て、HTPHをコードするヌクレオチド配列は有用であり得る。HTPHをコードするヌ
クレオチド配列を標準的な方法で標識し、またハイブリダイゼーション複合体の
形成に適した条件下で、患者からの体液や組織サンプルに加えることができる。
適当なインキュベーション期間の後、そのサンプルを洗浄し、シグナルを定量し
て標準値と比較する。患者のサンプルにおけるシグナルの量が、対照サンプルに
比べて有意に変化している場合、サンプルのなかのHTPHをコードするヌクレオチ
ド配列のレベルの変化は、関連する疾患の存在を示している。また、このような
アッセイを用いて、動物実験、臨床試験、または個々の患者の治療のモニタリン
グにおける特定の治療学的な処置法の有効性を評価することもできる。

【０１５７】 HTPHの発現に関連する疾病の診断のための基礎を提供するために、正常な、即
ち標準の発現のプロフィールを確立する。これは、ハイブリダイゼーション或い
は増幅に適した条件下で、動物またはヒト何れかの正常な被験者から採取された
体液或いは細胞抽出物をHTPHをコードする配列又はその断片と結合させることに
より達成される。標準のハイブリダイゼーションは、正常な被験者から得られる
値と、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを用いる実験から得られ
る値とを比較することにより定量することができる。このように正常なサンプル
から得られた標準値は、疾病の徴候がある患者のサンプルから得られる値と比較
することができる。標準値からの偏差を用いて疾病の存在を証明する。

【０１５８】 一旦疾患の存在が確認されて治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼ
ーションアッセイが定期的に繰り返され、患者の発現のレベルが正常な患者で観
察されるレベルに近づき始めたか否かを評価できる。連続的なアッセイから得ら
れる結果を用いて、数日から数ヶ月にわたる治療の効果を示すことができる。

【０１５９】 癌に関しては、個体からの生検組織における比較的多量の転写物（不十分に発
現もしくは過剰に発現されたもの）の存在が、疾病の発生の素因を示し、つまり
実際の臨床的症状が現れる前に疾病を検出するための手段となり得る。このタイ
プのより決定的な診断により、健康の専門家が予防的処置を講じたり、より早期
に積極的な治療を行なうことが可能となり、故に癌の発生や更なる進行を予防す
ることができる。

【０１６０】 HTPHをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの更なる診断のため
の使用法には、PCR法の利用が含まれる。これらのオリゴマーは化学的に合成さ
れるか、酵素を用いて作製されるか、或いはin vitroで作製されてもよい。オリ
ゴマーは、好ましくはHTPHをコードするポリヌクレオチドの断片、またはHTPHを
コードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、特定の
遺伝子或いは状態を同定するための最適化された条件の下で用いられる。また密
接に関連するDNAまたはRNA配列の検出及び／又は定量のために、オリゴマーは緩
やかな厳密性の条件で用いることができる。

【０１６１】 またHTPH発現を定量するために用いられる方法には、放射標識或いはビオチン
化したヌクレオチドの利用、対照核酸の同時増幅(coamplification)の利用、及
び標準の検量線で補間する実験結果の利用が含まれる（例えば、Melby, P.C.ら(
1993) J. Immunol. Methods, 159:235-244；Duplaa, C. ら(1993) Anal. Bioche
m. 229-236参照）。多数のサンプルの定量の速度は、目的のオリゴマーが種々の
希釈溶液中に存在し、分光光度法または比色定量応答により迅速に定量するELIS
A形式のアッセイを実施することによって加速することができる。

【０１６２】 別の実施例においては、ここに開示した任意のポリヌクレオチド配列に由来す
るオリゴヌクレオチド又はより長い断片を、マイクロアレイにおける標的として
用いることができる。マイクロアレイを用いて、同時に多くの遺伝子の発現レベ
ルをモニタし、また遺伝子の変異配列、変異及び多形性を同定することができる
。この情報は、遺伝子機能の決定、疾病の遺伝的基礎の理解、疾病の診断、並び
に治療薬の開発およびその活性のモニタリングにおいて有用である。

【０１６３】 マイクロアレイが準備され、それを用いて当業者に周知の方法で分析してもよ
い（例えば、Brennan, T.M.ら(1995) U.S. Patent NO. 5,474,796; Schena, M.
ら(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweilerら(1995) P
CT application WO95/251116; Shalom D.ら (1995) PCT application WO95/355
05: Heller. R.A. ら(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 並びにHel
ler. M.J.ら(1997) U.S. Patent No.5,605,662を参照）。

【０１６４】 本発明の別の実施例においては、HTPHをコードする核酸配列を用いて、自然発
生のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを
作り出すことができる。この配列は、特定の染色体、染色体の特定の部分、又は
人工染色体作製物にマッピングすることができ、その人工染色体作製物には、例
えば、ヒト人工染色体（HACs）、酵母菌人工染色体（YACs）、細菌人工染色体（
BACs）、細菌性P1作製物又は1本鎖染色体cDNAライブラリーがある（例えば、Har
rington. J.J.ら(1997) Nat Genet. 15:345-355; Price, C.M. (1993) Blood Re
v. 7:I27-134; 並びにTrask. B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154を参照）。

【０１６５】 蛍光性in situハイブリダイゼーション（FISH）は、他の物理的な染色体マッ
ピング技術や遺伝地図データと関連し得る（例えば、Heinz-Ulrichら(1995)in M
eyers, 前出, pp.965-968を参照）。遺伝地図データの例は、種々の科学誌、ま
たはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）に見られる。物理的な染色
体地図上のHTPHをコードする配列の位置および特定の疾病、もしくは特定の疾病
の素因との関連性が、疾患に関係するDNAの領域の範囲を定めるのに役立つ。本
発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者とキャリア、また発症した個体との間
の遺伝子配列の違いを検出することができる。

【０１６６】 遺伝地図を拡大するために、染色体作製物のin situハイブリダイゼーション
及び確立された染色体マーカーを用いる連鎖解析のような物理的マッピング技術
を用いることができる。多くの場合、特定のヒト染色体の数やアームが未知であ
っても、マウスのような別の哺乳類の染色体上の遺伝子配置によって関連するマ
ーカーが明らかになる。物理的マッピングによって、新たな配列を染色体のアー
ム、或いはその一部へ割当てることができる。これにより、位置クローニングま
たは別の遺伝子発見技術を用いて、疾病遺伝子を検索する研究者に価値ある情報
を提供できる。ひとたび疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域（例えば、11q2
2-23に対する毛細血管拡張性運動失調 ）への遺伝連鎖による不完全な位置ぎめ
がなされると、その領域にマッピングされる任意の配列は、さらなる研究のため
の関連する遺伝子または調節遺伝子を表し得る（例えば、Gatti, R.A.ら（1988
）Nature 336:577-580参照）。また、本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常
者の染色体の位置と、キャリア、又は発症した個体の、転座、逆位等によって生
じた染色体の位置との違いを検出することもできる。

【０１６７】 本発明の別の実施例においては、HTPHや、その触媒作用性または免疫原性断片
、又はそれらのオリゴペプチドを、種々の薬剤スクリーニング技術における化合
物のライブラリーのスクリーニングのために用いることができる。そのようなス
クリーニングにおいて用いられる断片は、溶液中で遊離しているか、固体支持体
へ付着しているか、細胞表面へ付着しているか、或いは細胞内に位置しているも
のであり得る。HTPHと試験する薬剤との結合複合体の形成を測定することができ
る。

【０１６８】 別の薬物スクリーニング技術によって、目的のタンパク質に対する適切な結合
親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングが提供される（例えば、
Geysenら(1984) PCT出願WO84/03564参照）。この方法においては、多くの異なる
小形の試験化合物がプラスチックピン或いは別の表面のような固体基板において
合成される。試験化合物をHTPH又はその断片と反応させ、そして洗浄する。次に
、当技術分野で周知の方法で結合HTPHを検出する。また、前述の薬剤スクリーニ
ング技術において使用するために、精製されたHTPHをプレート上に直接コーティ
ングすることもできる。或いは、非中和性抗体を用いて、ペプチドを捕捉して固
体支持体上に固定することができる。

【０１６９】 別の実施例においては、HTPHの結合のためにHTPHと結合可能な中和抗体が試験
化合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイを用いることがで
きる。この方法において、抗体を用いて、1以上の抗原決定基をHTPHと共有する
任意のペプチドの存在を検出することができる。

【０１７０】 さらに別の実施例においては、その新技術が、以下に限らないが、トリプレッ
ト遺伝暗号及び特異的な塩基対相互作用のようなものを含め現在周知のヌクレオ
チド配列の特性に基づくものであれば、HTPHをコードするヌクレオチド配列を、
未だ開発されていない分子生物学的技術に用いることができる。

【０１７１】 当業者は、更なる説明がなくても前述の説明によって本発明を十分に利用でき
るであろう。従って、以下に記す特定の実施例は、単なる例示であって本発明を
限定するものではない。

【０１７２】 先に記載したもの及び以下に記載した全ての特許出願、特許、刊行物、並びに
米国仮出願第09/113,427号については、ここで言及することにより本明細書の一
部とする。

【０１７３】

【実施例】

１ cDNAライブラリーの作製 RNAはCLONTECH Laboratories社（Palo Alto, CA）から購入したものか、表４
に示した組織から単離したもである。幾つかの組織を均質化してグアニジニウム
イソチオシアネート溶液に溶解し、一方では別の組織を均質化してフェノールに
溶解するか、或いはTRIZOL^TM（Life Technologies, Inc., Rockville, MD）、グ
アニジニウムイソチオシアネート及びフェノールの単相溶液等の適切な変性剤の
混合液に溶解した。結果として得られた溶解産物をCsClクッションでの遠心分離
またはクロロホルムで抽出した。イソプロパノール或いは酢酸ナトリウムの何れ
かとエタノールで、或いは別の通常の方法でこの溶解物からRNAを沈殿させた。

【０１７４】 RNAのフェノール抽出および沈殿を必要な回数繰り返してRNAの純度を高めた。
場合によっては、RNAをDNA分解酵素で処理した。殆どのライブラリーでは、olig
o d(T)結合常磁性粒子（Promega Corp., Madison, WI）、OLIGOTEX^TMラテックス
粒子（QIAGEN, Inc., Valencia, CA）、又はOLIGOTEX^TM mRNA精製キット（QIAGE
N Inc., Valencia, CA）を用いてpoly(A+) RNAを単離した。或いは、例えばPOLY
(A)PURE^TM mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）等の別のRNA単離キットを用い
てRNAを組織溶解産物から直接単離した。

【０１７５】 場合によっては、Stratagene社（La Jolla, CA）にRNAを提供してそれに対応
するcDNAライブラリーを作製した。そうでない場合は、UNIZAP^TMベクターシステ
ム（Stratagene Inc., La Jolla, CA）又はSUPERSCRIPT^TM プラスミドシステム
（Life Technologies Inc., Rockville, MD）を用いて当業者に周知の推奨され
た方法もしくは類似の方法でcDNAを合成してcDNAライブラリーを作製した。（例
えば、Ausubel, 1997,前出, units 5.1-6.6を参照)。oligo d(T)又はランダムプ
ライマーを用いて逆転写を開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを2本
鎖cDNAに結合させてから、適切な（複数の）制限酵素でcDNAを消化した。殆どの
ライブラリでは、SEPHACRYLョ S1000、 SEPHAROSEョ CL2B、若しくはSEPHAROSEョ C L4Bカラムクロマトグラフィー（Amersham Pharmacia Biotech Ltd., Uppsala, S weden）、又は分離用のアガロースゲル電気泳動法によってcDNAの大きさ（300〜
1000bp）を選択した。適切なプラスミド（例えば、pBLUESCRIPTョ (Stratagene I nc., La Jolla, CA)、pSPORT1^TM (Life Technologies Inc., Rockville, MD)、 又はplNCY(Incyte Pharmaceuticals Inc., Palo Alto CA)等）のポリリンカーの
適合性制限酵素部位にcDNAを結合させた。組換えプラスミドを、例えば、XL1-Bl
ue、XL1-BlueMRF、若しくはSOLR ^TMストレーン（Stratagene, Inc., La Jolla,
CA）、又はDH5α、DH10B、若しくはElectroMAX DH10B （Life Technologies Inc
., Rockville, MD）等のコンピテントE.coli細胞に形質転換した。

【０１７６】 ２ cDNAクローンの単離 UNIZAP ^TMベクターシステム（Stratagene, Inc., La Jolla, CA）又は細胞溶
解を利用して、in vivoでの切除によって宿主細胞からプラスミドを回収した。M
agic若しくはWIZARDョ Minipreps DNA精製システム（Promega Corp., Madison, W I）、AGTC ョMiniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、及びQ IAGEN社のQIAWELL ョ8 Plasmid、QIAWELLョ 8 Plus Plasmid、QIAWELL 8 Ultra Pl asmid 精製システム（QIAGEN Inc., Valencia, CA）、R.E.A.L.^TM Prep 96プラ
スミドキット（QIAGEN Inc., Valencia, CA）のうちの少なくとも1つを用いてプ
ラスミドを精製した。沈殿の後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或
いは凍結乾燥しないで4℃で保管した。

【０１７７】 或いは、高スループットフォーマットの直接結合PCR法によって宿主細胞溶解
産物からプラスミドDNAを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Blochem. 216:1-1
4）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程を単一反応混合液で実施した。サ
ンプルを処理して384-ウエルプレートで保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度
をPICOGREENョ色素（Molecular Probes, Inc., Eugene, OR）及びFluoroskan II
蛍光スキャナー（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光定量的に測
定した。

【０１７８】 ３ 配列決定および分析 配列決定のためのcDNAは、Peltier PTC-2000 thermal cyclers（MJ Research,
Inc., Watertown, MA とABI PRISM^TM CATALYST 800 （Perkin-Elmer Applied B
iosystems, Foster City, CA）若しくはMICROLAB 2200（Hamilton Co., Reno, N
V）sequencing preparation systemとを共に用いて準備した。cDNAは、ABI PRIS
M^TM373若しくは377 配列決定システム並びにABIプロトコル、塩基対呼び出しソ
フトウェア、及びキット（Perkin-Elmer Applied Biosystems）を用いて配列決
定した。或いは、ABIキットの代りにAmersham Pharmacia Biotech社の溶液およ
び色素を用いた。或る態様においては、標準的な方法（Ausubel, 前出）を用い
て読み枠を識別した。DNA配列の幾つかを選択して、本実施例の５に記載した方
法で伸長した。

【０１７９】 cDNA、伸長物、及びショットガン配列決定から得られたポリヌクレオチド配列
は、当業者に周知のアルゴリズムを利用するソフトウェアプログラムを組合せて
用いて構築および分析した。表５には、利用したソフトウェアプログラム、対応
するアルゴリズム、引用文献、及び適用可能なカットオフパラメータをまとめた
。表５の第3列に示した引用文献については、ここで言及することにより本明細
書の一部とする。また、配列アライメントは、MACDNASIS PROソフトウェア（Hit
achi Software Engineering Co., Ltd. San Bruno, CA）及びLASERGENEソフトウ
ェアのマルチシーケンスアライメントプログラム（DNASTAR Inc., Madison WI）
を用いて分析および作成した。

【０１８０】 ポリヌクレオチド配列の確証は、BLAST、動的計画法、及びジヌクレオチド最
近接分析に基づいたプログラム及びアルゴリズムを用いて、ベクター、リンカー
、及びポリA尾部の配列を取除き、多義性の塩基対をマスクすることによって実
施した。次に、配列をBLAST、FASTA、及びBLIMPSに基づいたプログラムを用いて
GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳類、脊椎動物、及び真核生物のデータベース
やBLOCKSデータベース等の公共のデータベースでから選択した配列に対して問合
わせて注釈を得た。Phred、Phrap、及びConsedに基づいたプログラムを用いて配
列を完全長のポリヌクレオチドに構築し、GeneMark、BLAST、及びFASTAに基づい
たプログラムを用いて読取り枠に対してスクリーニングした。次に完全長のポリ
ヌクレオチド配列を翻訳して対応する完全長のアミノ酸配列を引き出し、続いて
その完全長のポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をGenBankデータベース
（前述）、SwissProt、BLOCKS、PRINTS、PFAM 、及びPrositeなどのデータベー
スに問い合わせることによって分析した。

【０１８１】 ４ ノーザン分析 ノーザン分析は、転写物の存在を検出するために用いられる実験用技術であり
、特定の細胞種或いは組織に由来するmRNAが結合している基板と標識されたヌク
レオチドプローブとのハイブリダイゼーション過程を含む（Sambrook、前出, ch
.7）。

【０１８２】 電子的ノーザン分析は、BLASTを用いて実施し、LIFESEQョデータベース（Incyt e Phamnaceuticals）若しくはGenBankのようなヌクレオチドデータベースにおい
て同一又は関連する配列を検索する。コンピュータ検索の感度を変更して、一致
の特異性を設定する。 検索の基準は、以下で定義される積スコア(product score)である。 （配列同一性%×最大BLASTスコア%）／100 積スコアは、2つの配列間の類似性および配列一致の長さの両方を考慮に入れる
。例えば、積スコア40の場合、その一致は1〜2%誤差の範囲内の正確さであり、積
スコア70の場合は正確な一致となる。一致が、検査される配列の非保存部分また
は5’配列に偏っている場合には、低いスコアが関連する配列に結びつくが、関
連する分子は15〜40の積スコアを示す。

【０１８３】 電子的なノーザン分析は、器官／組織および疾病のカテゴリーへのcDNAライブ
ラリーの分類に関わる。器官／組織のカテゴリーは、心血管、皮膚、発生、内分
泌、胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖、及び泌尿器であり、疾患のカテゴ
リーは、癌、炎症／外傷、胎性、神経性、及び貯留(pooled)である。配列を発現
した各カテゴリーの中のライブラリーをカウントして全体の中の割合を算出する
。電子的ノーザン分析の結果は、表３における器官／組織および疾病の分類にお
ける配列の百分率の分布で報告される。

【０１８４】 ５ HTPHをコードするポリヌクレオチドの伸長 完全長の核酸配列（SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、及びSEQ ID NO:6）をこれら
の断片に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、表１の第5列に示した
構成要素断片の伸長によって生成した。各核酸配列に対して、一方のプライマー
はアンチセンスポリヌクレオチドの伸長を開始するために合成し、他方のプライ
マーはセンスポリヌクレオチドの伸長を開始するために合成した。プライマーを
用いることにより、既知の配列を「外側に」伸長することを容易にし、対象の領
域に対する新たな未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成した。初期
のプライマーを、OLIGO^TM4.06 (National Biosciences,Plymouth,MN)或いは他の
適切なプログラムを用いて、約22〜30個のヌクレオチドからなる長さであって50
%以上のGC含有物を有し、且つ約68〜72℃の温度で標的配列にアニーリングする
ようにcDNAから設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー2量体を生
ずるようなヌクレオチドの如何なる伸長も回避した。

【０１８５】 選択されたヒトcDNAライブラリー（GIBCO BRL）を用いてその配列を伸長した
。2以上の伸長が必要であるか、もしくは望ましい場合には、さらに別のプライ
マーの組を設計して既知領域をさらに伸長させる。

【０１８６】 XL-PCR^TM キット（The Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT）の取扱説明書に従
って、酵素及び反応混合物を完全に混合することで高い適合度の増幅が得られた
。PCRはPTC-200 thermal cycler（MJ Reserch, Inc., Watertown, MA）を用いて
実施され、以下のパラメータで、40pmolの各プライマーおよびキットの他の全て
の成分は推奨された濃度で開始した。 ステップ1 94℃で1分間（初期変性） ステップ2 65℃で1分間 ステップ3 68℃で6分間 ステップ4 94℃で15秒間 ステップ5 65℃で1分間 ステップ6 68℃で7分間 ステップ7 ステップ4〜6をさらに15サイクル繰返す ステップ8 94℃で15秒間 ステップ9 65℃で1分間 ステップ10 68℃で7分15秒間 ステップ11 ステップ8〜10を12サイクル繰返す ステップ12 72℃で8分間 ステップ13 4℃（保持する） 反応混合物の5〜10μlのアリコットを低濃度（約0.6〜0.8%）アガロースミニ
ゲル上で電気泳動法により分析し、どの反応物が配列の伸長に成功したかを判定
した。最も大きな生成物を含むと考えられるバンドをゲルから切出し、QIA Quic
k^TM （QIAGEN Inc.）を用いて精製し、クレノウ酵素を用いてオーバーハングを
切除して、再連結及びクローニングを容易にした。

【０１８７】 エタノール沈殿の後、その生成物を13μlの連結緩衝液中に再溶解し、1μlのT
4-DNAリガーゼ（15単位）及び1μlのT4ポリヌクレオチドキナーゼを加えて、そ
の混合物を室温で2〜3時間、或いは16℃で一晩インキュベートした。コンピテン
トE.coli細胞（40μlの適切な培養液中の）を3μlの連結混合物を用いて形質転
換し、80μlのSOC培養液で培養した（例えば、Sambrook、前出,Appendix A, p.2
参照）。37℃で1時間インキュベートした後、E.coli混合物を、カルベニシリン
（2x carb）を含むLuria Bertani (LB)-agar（例えば、Sambrook、前出, Append
ix A, p.1参照）上で平板培養(plated)した。翌日、いくつかのコロニーを各プ
レートから無作為に選択して、適切な市販の滅菌96穴マイクロタイタープレート
の個々のウエル内に置かれた150μlの液体LB/2x carb培地で培養した。その翌日
、終夜培養した各5μlの培養物を非滅菌の96穴プレートに移し、水で1:10に希釈
した後、各サンプルから5μlをPCRアレイに移した。

【０１８８】 PCR増幅の場合、ベクタープライマー、伸長反応のために用いられる1つ或いは
両方の遺伝子特異性プライマー、及び4単位のrTth DNAポリメラーゼを含む18μl
の濃縮PCR反応混合物（3.3x）が各ウエルに加えられた。増幅は、以下の条件で
実施した。 ステップ1 94℃で60秒間 ステップ2 94℃で20秒間 ステップ3 55℃で30秒間 ステップ4 72℃で90秒間 ステップ5 ステップ2〜4をさらに29サイクル繰返す ステップ6 72℃で180秒間 ステップ7 4℃（保持する） PCR反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動さ
せた。PCR生成物の大きさを元の部分的なcDNAと比較し、適切なクローンを選択
し、プラスミドに結合させて配列決定した。

【０１８９】 同様に、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、及びSEQ ID NO:6のヌクレオチド配列を
使用し、上記手順、5’伸長用に設計されたオリゴヌクレオチド、及び適切なゲ
ノムライブラリを用いて5’調節配列が得られる。

【０１９０】 ６ 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、及びSEQ ID NO:6から得られたハイブリダイゼー
ションプローブを用いて、cDNA、ゲノムDNA、又はmRNAをスクリーニングする。
約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大
きなヌクレオチド断片にも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、OLIG
O^TM 4.06ソフトウェア（National Biosciences）のような当技術分野のソフトウ
エアを用いて設計し、50pmolの各オリゴマー、250μCiの[γ-³²P]アデノシン3リ
ン酸 （Amersham, Chicago, IL）、及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont N
EN^ョ, Boston MA）を結びつけることにより標識する。標識されたオリゴヌクレオ チドを、Sephadex^TM G-25超微細分子サイズ排除デキストランビーズカラム（Pha
rmacia & Upjohn, Kalamazoo, MI）を用いて実質的に精製する。毎分10⁷カウン
トの標識されたプローブを含むアリコットを、以下のエンドヌクレアーゼ、Ase
I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1、又はPvu II（DuPont NEN, Boston, MA）の中
の1つで消化されたヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション
解析に用いる。

【０１９１】 各消化物からのDNAを、0.7%アガロースゲルに上で分画して、ナイロン膜（NyH
TPHlus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーション
は40℃で16時間実施する。非特異的シグナルを除去するために、0.1xクエン酸ナ
トリウム食塩水及び0.5%ドデシル硫酸ナトリウムまでの徐々に厳密性を増す条件
下で、ブロットを室温にて連続的に洗浄する。XOMAT AR^TMフィルム （Kodak, Ro
chester, NY）を数時間ブロットに露光した後、ハイブリダイゼーションパター
ンを視覚的に比較する。

【０１９２】 ７ マイクロアレイ 化学的結合プロシージャ及びインクジェット装置を用いることにより、基板の
表面上でアレイエレメントを合成することができる。（例えば、Baldeschweiler
, 前出 参照）。また、ドットブロット又はスロットブロット法に類似の所定の
アレイを用いて、熱、UV、化学的もしくは機械的結合プロシージャを利用して、
基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。標準的なアレイは、手製
で或いは手近な方法及び機械を用いて製作でき、また任意の適切な数のエレメン
トを含む。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしていないプローブを取
除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターンを判定する。マイクロアレ
イ上のエレメントとハイブリダイズする各プローブの相補性の度合及び相対的な
存在量は、スキャナーで読取られた画像を解析することにより評価する。

【０１９３】 完全長cDNA、発現された配列タグ（ESTs）、又はそれらの断片は、マイクロア
レイのエレメントを含み得る。ハイブリダイゼーションに適した断片は、当業者
に周知のLASERGENE^TMのようなソフトウェアを用いて選択可能である。本発明の
ヌクレオチド配列の1つに対応する完全長cDNA、EST、若しくはそれらの断片を、
又は本発明に関連するcDNAライブラリーから無作為に選択されたものを、例えば
スライドガラスのような適切な基板に配置する。そのcDNAを、例えばUV架橋の後
に熱的および化学的に処置し、さらに乾燥することによって、スライドガラスに
固定する（例えば、Schena, M.ら (1995) Science 270:467-470; 並びにShalon,
D.ら(1996) Genome Res. 6:639-645参照）。蛍光プローブを作製し、基板上の
エレメントとのハイブリダイゼーションに用いる。基板は前述の方法によって解
析する。

【０１９４】 ８ 相補的ポリヌクレオチド HTPHをコードする配列に相補的な配列、或いはその任意の一部を、自然発生HT
PHの発現を検出し、低下させる、即ち抑制するために用いる。約15〜約30塩基対
を含むオリゴヌクレオチドの使用について記載するが、より小さな、或いはより
大きな配列フラグメントの場合でも本質的に同じ方法が用いられる。OLIGO^TM4.0
6ソフトウェア及びHTPHのコーディング配列を用いて適切なオリゴヌクレオチド
を設計する。転写を抑制するために、相補オリゴヌクレオチドを最も独特な5’
配列から設計してコーディング配列へのプロモーターの結合を防止するために用
いる。翻訳を抑制するために、相補的なオリゴヌクレオチドを設計してHTPHをコ
ードする転写物へのリボソームの結合を防ぐ。

【０１９５】 ９ HTPHの発現 HTPHの発現及び精製は、細菌またはウイルスに基づく発現系を用いて実施され
る。細菌におけるHTPHの発現の場合、抗菌性の耐性遺伝子とcDNAの転写レベルを
高める誘導性のプロモーターとを含む適切なベクターにcDNAをサブクローニング
する。このようなプロモーターの例としては、以下に限定しないが、lacオペレ
ーター調節エレメントに関連するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及
びtrp-lac(tac)ハイブリッドプロモーターが挙げられる。組換えベクターを、BL
21(DE3)などの適切な細菌性の宿主に形質転換する。抗生物質耐性菌が、イソプ
ロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（IPTG）での誘発によりHTPHを発現する。
真核生物の細胞におけるHTPHの発現は、昆虫または哺乳動物の細胞株に、一般に
バキュロウイスルスとして知られているAutographica californica核多角体ウイ
ルス（AcMNPV）を感染させることによって行う。バキュロウイルスの非必須ポリ
ヘドリン遺伝子を、相同的組換え又は転移プラスミド中間体を含む細菌媒介の遺
伝子転移の何れかによって、HTPHをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染
力は維持され、強力なポリヘドリンプロモータによって高レベルのcDNAの転写が
行われる。多くの場合、組換え型バキュロウイルスは、Spodoptera frugiperda
（Sf9）昆虫細胞の感染に用いられるが、場合によっては、ヒト肝細胞の感染に
も用いられる。後者の感染には、バキュロウイルスに対する更なる遺伝的変更が
必要となる。（例えば、Engelhard. E. K.ら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 91:3224-3227; Sandig, V.ら(1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945.を参照）
。

【０１９６】 殆どの発現系において、HTPHは、例えばグルタチオンSトランスフェラーゼ（G
ST）、またはFLAG若しくは6-His等のペプチドエピトープ標識で融合タンパク質
として合成され、粗製の細胞溶解産物からの組換え型融合タンパク質の親和性ベ
ースの精製を迅速に1段階で行うことができる。Schistosoma japonicumからの26
キロダルトンの酵素のGSTによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持した条
件の下で固定化されたグルタチオにおける融合タンパク質の精製が可能となる。
（Pharmacia, Piscataway, NJ）。精製の後に、特定の操作部位においてHTPHか
らGST部分をタンパク分解的に切断可能である。8個のアミノ酸のペプチドである
FLAGにより、市販のモノクロナール及びポリクロナール抗FLAG抗体を用いて免疫
親和性の精製が可能となる（Eastman Kodak, Rochester, NY）。6個の連続した
ヒスチジン残基のストレッチである6-Hisによって、金属キレート樹脂（QIAGEN
Inc, Chatsworth, CA）における精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製
の方法については、Ausubel. F. M. らの（1995年、更に定期的に増補された） Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York, NY,
ch 10, 16に記載されている。これらの方法によって得られた精製されたHTPHを
、以下のアッセイで直接用いることができる。

【０１９７】 １０ HTPH活性の実証 HTPH輸送活性は、X.laevis卵母細胞における初期のものから遅発のエンドソー
ムのコンパートメントへの輸送の測定に用いるリガンド混合アッセイの使用によ
って実証可能である。卵巣を成体の雌のX.laevisの解剖によって得て、卵母細胞
を単離した。卵母細胞を2mg/mlのアビジンと共に18℃で5時間電気パルスを送り(
pulsed)、洗浄し、その後16時間インキュベートし、遅発のコンパートメントへ
のアビジンの輸送を可能とした。次に、卵母細胞を1mg/mlのビオチン-西洋わさ
びペルオキシダーゼ（HRP）と共に18℃で30分間インキュベートし、初期のエン
ドサイトーシスのコンパートメントを標識した。HTPHの量を変更して卵母細胞に
注入し、卵母細胞を18℃でインキュベートした。卵母細胞をHTPH注入後の幾つか
の時点で回収し、洗浄し、0.3％のTriton X-100、0.2％の塩化メチルベンゼトニ
ウム、及び400μg/mlのBSA-ビオチンをスカベンジャーとして含む100μlのリン
酸緩衝食塩水に溶解した。最終的に、溶解産物を微量遠心管において30秒間遠心
分離し、アビジン-ビオチン複合体を、抗-アビジン抗体被覆プレートを用いて4
℃で終夜インキュベートすることによって免疫沈降させた。非結合タンパク質を
除去するために、プレートを少なくとも5回洗浄した。初期のエンドソームから
遅発のコンパートメントへの輸送は、免疫沈降したHRPの量を測定することによ
って数量化する（HTPHによって増加した輸送は、調節卵母細胞との比較によって
数量化される）。

【０１９８】 １１ 機能的アッセイ HTPHの機能は、哺乳類細胞培養系における生理学的に高められたレベルでのHT
PHをコードする配列の発現によってアッセイする。高レベルでcDNAを発現する強
力なプロモーターを含む哺乳類の発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。
選り抜きのベクターには、pCMV SPORT^TM （Life Technologies, Gaithersburg,
MD）及びpCR^TM 3.1 （Invitrogen, Carlsbad, CA）が含まれ、その各々にはサイ
トメガロウイルスプロモーターが含まれる。5〜10μgの組換えベクターを、リポ
ソーム製剤或いは電気穿孔法によって、好ましくは内皮若しくは造血由来のヒト
細胞株に一過性に形質移入する。また、標識タンパク質をコードする配列を含む
1〜2μgの付加的なプラスミドを同時形質移入する。標識タンパク質の発現によ
り、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とを区別することができ、
また組換えベクターからのcDNAの発現を確実に予測できる。選り抜きの標識タン
パク質には、緑色蛍光タンパク質（GFP）（Clontech, Palo Alto, CA）、CD64、
又はCD64-GFP融合タンパク質が含まれる。自動化されたレーザー光学に基づいた
技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFP又はCD64-GFPを発現する
形質移入された細胞を同定し、またアポトーシスの状態等の特性を評価する。FC
Mによって、先行する或いは同時の細胞死の現象を診断する蛍光分子の取込みを
検出及び定量化する。これらの現象には、プロピジウムヨウ化物でのDNAの染色
によって測定される核DNA内容物の変化、ブロモデオキシウリジンの取込み量の
低下によって測定されるDNA合成の下方制御、特異的抗体との反応性によって測
定される細胞表面および細胞内のタンパンク質の発現の変化、並びにフルオレセ
イン結合アネキシンVタンパク質の細胞表面への結合によって測定される形質膜
組成の変化が含まれる。フローサイトメトリーの方法については、Ormerod, M.
G.の (1994) Flow Cytometry, Oxford, New York, NYに記載されている。

【０１９９】 遺伝子発現におけるHTPHの影響は、HTPHをコードする配列並びにCD64若しくは
CD64-GFPの何れかが形質移入された高度に精製された細胞集合を用いて評価する
ことができる。CD64及びCD64-GFPは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免
疫グロブリンG（IgG）の保存された領域と結合する。形質転換された細胞を、ヒ
トIgG若しくはCD64の抗体の何れかで被覆された磁気ビーズを用いて、形質転換
されていない細胞から分離することができる（DYNAL, Lake Success, NY）。mRN
Aは、当業者に周知の方法で細胞から精製することができる。HTPH及び目的とす
る他の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で
解析することが可能である。

【０２００】 １２ HTPH特異的抗体の産生 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE）（例えば、Harrington, M.G. (19
90) Methods Enzymol. 182:488-495参照）、或いは他の精製技術を使用して実質
的に精製されたHTPHを用いて、標準的なプロトコルに従ってウサギを免疫化して
抗体を生成する。

【０２０１】 或いは、HTPHのアミノ酸配列をLASERGENE^TM software （DNASTAR Inc.）を用
いて解析して免疫原性の高い領域を判定し、対応するオリゴポリペプチドを合成
し、これを用いて当業者に知られた方法により抗体を産生させる。C-末端付近ま
たは親水性領域内のエピトープのような適切なエピトープの選択方法の詳細につ
いては当業者の文献に記載されている（例えば、Ausubelら 前出, ch.11参照）
。

【０２０２】 通常、15残基の長さのオリゴペプチドを、fmoc法の化学作用を利用するApplied
Biosystems Peptide Synthesizer Model 431Aを用いて合成し、MBS（N-maleimi
dobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester）を用いた反応によりKLH(Sigma, St.Lo
uis, MO)に結合させて免疫抗原性を増強させる（例えば、Ausubel前出 参照）。
ウサギをフロイント完全アジュバントにおけるオリゴペプチド-KLH複合体で免疫
化する。その結果生じる抗血清は、例えば、プラスチックにペプチドを結合させ
、1%BSAでブロッキングし、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射性ヨ
ウ素標識したヤギ抗ウサギIgGと反応させることにより、抗ペプチド活性に対し
て検査される。

【０２０３】 １３ 特異的抗体を用いる自然発生HTPHの精製 HTPHに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより、
自然発生或いは組換えHTPHを実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは
、HTPH抗体を、CnBr-活性化セファロース（Pharmacia＆Upjohn）のような活性化
されたクロマトグラフィー用樹脂に共有結合させることにより作製する。結合の
後、製造者の取扱説明書に従って樹脂をブロック及び洗浄する。

【０２０４】 HTPHを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、HTPHを優先的に吸着
させる条件下（例えば、界面活性剤の存在下における高イオン強度のバッファー
）でそのカラムを洗浄する。抗体／HTPH結合を分裂させる条件下（例えば、pH2
〜3のバッファー、又は尿素もしくはチオシアン酸塩イオンのような高濃度のカ
オトロープ(chaotrope)）でカラムを溶出させ、HTPHを回収する。

【０２０５】 １４ HTPHと相互作用する分子の同定 HTPH若しくは生物学的に活性なそれらの断片を¹²⁵I Bolton-Hunter試薬で標識
する（例えば、Bolsonら(1973) Biochem. J. 133:529を参照）。マルチウェルプ
レートのウェル内に予め配置した候補分子を、標識したHTPHと共にインキュベー
トし、洗浄し、標識したHTPH複合体を含む全てのウェルをアッセイする。種々の
HTPH濃度で得られたデータを用いて、HTPHと候補分子との会合、親和性、及び数
についての値を計算する。

【０２０６】 上記の刊行物および特許出願の全ては、ここで言及することにより本明細書の
一部とする。当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本明細書に
記載した方法及びシステムの種々の改変を行うことができるであろう。本発明を
特定の好適実施例に関して説明してきたが、請求する発明がそのような特定の実
施例に過度に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、記載した本
発明の実施のための方法の種々の改変は、分子生物学或いは関連する分野の当業
者には明らかであり、請求の範囲内に含まれることを意図するものである。

【０２０７】 表の簡単な説明 表１の第1列には、ポリペプチド配列識別番号SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、及
びSEQ ID NO:3を示す。第2列には、HTPHをコードするコンセンサス配列のヌクレ
オチド配列識別番号SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、及びSEQ ID NO:6を示す。第3列
には、各HTPHをコードするコンセンサス配列が初めて同定されたインサイト社ク
ローン番号を示す。第4列には、クローンが単離された組織ライブラリーを示す
。第5列には、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、及びSEQ ID NO:6のコンセンサス配列
を引出すのに用いられた重複及び／又は伸長された核酸配列を示す。

【０２０８】 表２の第1列には、ポリペプチド配列番号（SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、及びS
EQ ID NO:3）を示す。第2列には、各ポリペプチドのアミノ酸残基の数を示す。
第3列には、各ポリペプチドにおける潜在的リン酸化部位、第4列には、潜在的グ
リコシル化部位をそれぞれ示す。第5列には、各ポリペプチドに存在する有意な
タンパク質ファミリーのサインもしくはリガンド／基質結合モチーフを示す。第
6列には、タンパク質の識別を示す。第7列には、ポリペプチドを同定するために
用いるアルゴリズムもしくは分析方法を示す。

【０２０９】 表３の第1列には、ヌクレオチド配列番号（SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、及びS
EQ ID NO:6）を示す。第2列には、HTPHの発現組織および各ポリヌクレオチドを
発現する全組織中の割合を示す。第3列には、疾病の種類および各ポリヌクレオ
チドを発現する全疾患組織の中の割合を示す。第4列には、各cDNAライブラリー
のサブクローニングに用いるベクターを示す。

【０２１０】 表４の第1列には、ヌクレオチド配列番号（SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、及びS
EQ ID NO:6）を示す。第2列には、対応するインサイト社クローン番号を示す。
第3列には、クローンが得られた組織ライブラリーの説明を示す。

【０２１１】 表５には、HTPHの分析に用いたプログラム、アルゴリズム、データベース、及
び限定的スコアをまとめた。表５の第1列には、ツール、プログラム、若しくは
アルゴリズム、第2列には、データベース、第3列には、簡単な説明、並びに第4
列には、2つの配列間の一致の度合を決定する適切なスコア（より大きな値にお
いて、より相同性が高い）を示す。

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 LASERGENETMソフトウエアのマルチシーケンスアライメントプログラム（DNAST
AR Inc, Madison WI）を使用して作成したHTPH-1（インサイト社クローン番号；
SEQ ID NO:1）及びラットABC輸送体（GI 2982567；SEQ ID NO:7）のアミノ酸配
列アライメントを示す図である。

【図１Ｂ】 LASERGENETMソフトウエアのマルチシーケンスアライメントプログラム（DNAST
AR Inc, Madison WI）を使用して作成したHTPH-1（インサイト社クローン番号；
SEQ ID NO:1）及びラットABC輸送体（GI 2982567；SEQ ID NO:7）のアミノ酸配
列アライメントを示す図である。

【図１Ｃ】 LASERGENETMソフトウエアのマルチシーケンスアライメントプログラム（DNAST
AR Inc, Madison WI）を使用して作成したHTPH-1（インサイト社クローン番号；
SEQ ID NO:1）及びラットABC輸送体（GI 2982567；SEQ ID NO:7）のアミノ酸配
列アライメントを示す図である。

【図２】 LASERGENETMソフトウエアのマルチシーケンスアライメントプログラム（DNAST
AR Inc, Madison WI）を使用して作成したHTPH-2（インサイト社クローン番号；
SEQ ID NO:2）及びE.coli恒常性タンパク質（GI 1736520；SEQ ID NO:8）のアミ
ノ酸配列アライメントを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 15/00 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 3/00 35/00 ４Ｃ０８５ 15/00 43/00 ４Ｃ０８６ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｈ０４５ 43/00 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 33/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ユエ、ヘンリー アメリカ合衆国カリフォルニア州94087・ サニーベイル・ルイスアベニュー 826 (72)発明者 レディ、ルーパ・エム アメリカ合衆国カリフォルニア州94086・ サニーベイル・ウェストマッキンレードラ イブ 1233 (72)発明者 ゴルゴン、ジーナ・エイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94303・ パロアルト・＃６・サンアントニオロード 777 (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・＃30・デールアベニュ ー 1240 (72)発明者 アジムザイ、ヤルダ アメリカ合衆国カリフォルニア州94587・ ユニオンシティ・ファモソプラザ 213 (72)発明者 パターソン、チャンドラ アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・レランドアベニュー 2189 (72)発明者 ボーグン、マライア・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・サンティアゴロード 14244 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA34 AA35 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB02 4B024 AA01 AA11 AA12 BA41 BA80 CA04 CA09 EA04 GA11 GA16 HA03 HA12 4B063 QA01 QA05 QA19 QQ03 QQ08 QQ20 QQ42 QQ52 QR31 QR56 QR62 QS25 QS34 4B064 AG01 AG27 CA01 CA19 CC24 DA01 4B065 AA01X AA77X AA80X AA87X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA17 BA01 BA02 BA22 NA14 ZA812 ZB262 ZC212 4C085 AA13 AA14 DD62 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA81 ZB26 ZC21 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 EA20 EA27 EA28 FA72 FA73 FA74 HA06

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、及びSEQ ID NO:3、並びにそ
   れらの断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含む実質的に精製された
   ポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１の配列に対して少なくとも90%以上のアミノ酸配
   列の同一性を有する実質的に精製された変異体。
3. 【請求項３】 請求項１のポリペプチドをコードする単離され精製された
   ポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 請求項３のポリヌクレオチドに対して少なくとも90%以上
   のポリヌクレオチド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド
   の変異配列。
5. 【請求項５】 厳密な条件の下で請求項３のポリヌクレオチドとハイブリ
   ダイズする単離され精製されたポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項３のポリヌクレオチド配列に対して相補的な配列を
   有する単離され精製されたポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、及びSEQ ID NO:6、並びにそ
   れらの断片からなる一群より選択されたポリヌクレオチド酸配列を含む単離され
   精製されたポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 請求項７のポリヌクレオチドに対して少なくとも90%以上
   のポリヌクレオチド配列の同一性を有する単離され精製されたポリヌクレオチド
   変異配列。
9. 【請求項９】 請求項７のポリヌクレオチドに対して相補的な配列を有す
   る単離され精製されたポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 請求項３のポリヌクレオチドの少なくとも断片を含む発
    現ベクター。
11. 【請求項１１】 請求項１０の発現ベクターを含む宿主細胞。
12. 【請求項１２】 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、及びSEQ ID NO:3、並びに
    それらの断片からなる一群より選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドの製
    造方法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で、請求項１１の宿主細胞を
    培養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと
    を特徴とする製造方法。
13. 【請求項１３】 適切な医薬用担体と共に請求項１のポリペプチドを含む
    医薬品組成物。
14. 【請求項１４】 請求項１のポリペプチドに特異的に結合する精製された
    抗体。
15. 【請求項１５】 請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。
16. 【請求項１６】 請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。
17. 【請求項１７】 癌の治療または予防の方法であって、そのような治療が
    必要な患者に対して、有効な量の請求項１６のアンタゴニストを投与する過程を
    含む方法。
18. 【請求項１８】 生殖障害の治療または予防の方法であって、そのような
    治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１６のアンタゴニストを投与する
    過程を含む方法。
19. 【請求項１９】 銅代謝障害の治療または予防の方法であって、そのよう
    な治療が必要な患者に対して、有効な量の請求項１３の医薬品組成物を投与する
    過程を含む方法。
20. 【請求項２０】 所定の生物学的サンプルにおいてSEQ ID NO:1、SEQ ID
    NO:2、及びSEQ ID NO:3、並びにそれらの断片からなる一群より選択されたアミ
    ノ酸配列を含むポリヌクレオチドの検出方法であって、 （ａ）請求項６のポリヌクレオチドを前記生物学的サンプルの少なくとも1つ
    の核酸とハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程
    と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、該ハイブ
    リダイゼーション複合体の存在が前記生物学的サンプルにおける前記ポリペプチ
    ドをコードするポリヌクレオチドの存在と相関性を有するような検出過程とを含
    むことを特徴とする検出方法。
21. 【請求項２１】 ハイブリダイゼーション過程の前に、前記ポリヌクレオ
    チドを増幅する過程を更に含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。