JP2007506433A - ビタミンｋエポキシド還元酵素遺伝子内の一塩基多型とワルファリン用量とを相関させるための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

本発明は、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有するヒト被験者を同定する方法であって、前記被験者においてＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出するステップであって、前記一塩基多型がワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられ、それによりワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップを含む方法を提供する。

Description

［優先権についての陳述］
本発明は、米国特許法第１１９条ｅ項に基づいて、その内容全体が参照して本明細書に組み込まれる、２００３年９月２３日に提出された米国仮特許出願第６０／５０５，５２７号の利益を主張する。

［政府の支援］
本発明は、一部には、米国立衛生研究所からの補助金第５Ｐ０１ ＨＬ０６３５０−４２号および第５−Ｒ０１ ＨＬ４８３１８の支援を受けて実施された。米国政府は、本発明に所定の権利を有する。

［発明の分野］
本発明は、単離核酸、該単離核酸を含有する宿主細胞、およびその使用方法、ならびにビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）遺伝子内の一塩基多型（ＳＮＰ）の同定およびそれらとワルファリンに対する感受性との相関に向けられる方法および組成物に関する。

極めて多数のタンパク質が機能するには、複数のグルタミン酸残基がγ−カルボキシグルタミン酸へ修飾されることが必要である。これらの中で最もよく知られているのは、ビタミンＫ依存性（ＶＫＤ）凝固タンパク質、第ＩＸ因子（クリスマス因子）、第ＶＩＩ因子、およびプロトロンビンである。マトリックスＧｌａタンパク質の遺伝子のノックアウトはマウスの動脈の石灰化を生じさせるという観察（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）「Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｔｅｒｉｅｓ ａｎｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｉｎ ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ ＧＬＡ ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｎａｔｕｒｅ ３８６：７８−８１）は、凝固以外の機能を備えるタンパク質にとってのビタミンＫサイクルの重要性を強調している。さらに、機能が知られていないＧａｓ６およびその他のＧｌａタンパク質は神経組織内で発現し、子宮内でのワルファリン曝露は精神遅延および顔面奇形を生じさせる。これは、Ｇｌａ修飾を行う酵素であるＶＫＤカルボキシラーゼの発現が、初期胚形成期中には神経系での高発現を伴う組織特異的方法で時間的に調節されるという観察と一致している。カルボキシル化に付随して、反応の補基質である還元ビタミンＫは、ビタミンＫエポキシドへ転換させられる。ヒトの食品に含まれるビタミンＫの量は限られるので、ビタミンＫエポキシドは、その欠乏を防止するためにビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）によってビタミンＫへ再転換されなければならない。最も広範囲に使用されている抗凝固薬であるワルファリンはＶＫＯＲを標的としており、ビタミンＫの再生を妨害する。その結果、還元ビタミンＫの濃度が減少し、これによりγ−グルタミルカルボキシラーゼによるカルボキシル化の速度を減少させ、低カルボキシル化ビタミンＫ依存性タンパク質を産生させる。

ワルファリンは、米合衆国だけでも毎年１００万人を上回る患者に処方されており、そしてオランダでは、人口のおよそ２％が長期ワルファリン療法を受けていると報告されている。抗凝固の治療レベルに必要とされるワルファリンの用量は患者によって大きく異なるので、ワルファリンの利用には重大な副作用のリスクが付随する。例えば、ワルファリン療法の開始後には患者の１〜２％において重大な出血症状が発生し、患者の０．１〜０．７％において死亡が発生した、と報告されている。これらの危険性にもかかわらず、ワルファリンの使用は誘発性出血症状１例につき２０例の発作を防止できると推定されており、おそらく誘発性出血に対するおそれがあるために十分には活用されていない。

本発明は、被験者における一塩基多型をワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させるための方法および組成物を提供し、それによって被験者にとってリスクが減少した治療用量および維持用量をより正確かつ迅速に決定することを可能にすることによって、当分野における以前の短所を克服する。

本発明は、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有するヒト被験者を同定する方法であって、前記被験者においてＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出するステップであって、前記一塩基多型がワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられ、それによりワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップを含む方法を提供する。

さらに、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有するヒト被験者を同定する方法であって、ａ）ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在をワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させるステップと、及びｂ）前記被験者においてステップ（ａ）の前記一塩基多型を検出するステップであって、それによりワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、を含む方法が提供される。

また別の実施形態では、本発明は、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられたＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型を同定する方法であって、
ａ）ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、
ｂ）前記被験者におけるＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出するステップと、および
ｃ）ステップ（ｂ）の前記一塩基多型の存在を前記被験者におけるワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させるステップであって、それによりワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられたＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型を同定するステップと、を含む方法を提供する。

さらに、本発明は、被験者のＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型をワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させる方法であって、ａ）ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、ｂ）ステップ（ａ）の被験者の前記ＶＫＯＲ遺伝子のヌクレオチド配列を決定するステップと、ｃ）ステップ（ｂ）のヌクレオチド配列を前記ＶＫＯＲ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列と比較するステップと、ｄ）ステップ（ｂ）のヌクレオチド配列内の一塩基多型を検出するステップと、およびｅ）ステップ（ｄ）の一塩基多型をステップ（ａ）の被験者におけるワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させるステップと、を含む方法を提供する。

本発明のまた別の態様は、ビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）、特に哺乳動物（例、ヒト、ヒツジ、ウシ、サルなど）ＶＫＯＲをコードする単離核酸である。例には、（ａ）例えば配列番号８もしくは配列番号９に記載のヌクレオチド配列を有する単離核酸などの、本明細書に開示した核酸と、（ｂ）上記の（ａ）の単離核酸もしくはその補体へ（例えば、ストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする、および／または上記の（ａ）の核酸との実質的な配列同一性を有する（例えば、上記の（ａ）の核酸と８０、８５、９０、９５もしくは９９％同一性である）、およびＶＫＯＲをコードする核酸と、ならびに（ｃ）遺伝コードの縮重のため上記の（ａ）もしくは（ｂ）の核酸と異なるが、上記の（ａ）もしくは（ｂ）の核酸によってコードされるＶＫＯＲをコードする核酸と、が含まれる。

本明細書で使用する用語「ストリンジェント」は、ハイブリダイゼーション方法の必需品を規定するために当分野において一般に理解されているハイブリダイゼーション条件に関する。ストリンジェンシー条件は、それらの用語は当分野において一般に知られており、当業者には明確に認識されているので、低、高、中であってよい。本明細書に提供するようなヌクレオチド配列へ同種ヌクレオチド配列がハイブリダイズするのを許容する高ストリンジェンシー条件は、当分野において周知である。１つの例として、そのような配列の本明細書に開示した核酸分子へのハイブリダイゼーションは、約６０％相同性の配列のハイブリダイゼーションを可能にするために、４２℃での２５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液および５％硫酸デキストラン中で実施することができ、その後には４２℃での２５％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳの洗浄条件を用いる。また別の例は、約４５℃での６×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件、続いて５０〜６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件を含む。ストリンジェントな条件の別の例は、標準ハイブリダイゼーションアッセイを用いて６０〜７０℃での０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳの洗浄ストリンジェンシーによって表される（その内容が全体として参照して本明細書に組み込まれる、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ｅｔ ａｌ．，ＥＤＳ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ １９８９）を参照されたい）。様々な実施形態において、ストリンジェントな条件は、例えば、高度にストリンジェントな（すなわち、高ストリンジェンシー）条件（例えば、６５℃での０．５Ｍ ＮａＨＰ０₄、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ中でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション）および／または中程度にストリンジェントな（すなわち中ストリンジェンシー）条件（例えば、４２℃の０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中での洗浄）を含むことができる。

本発明の追加の態様は、異種プロモーターと連結している本明細書に記載のビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする核酸を含む組換え核酸である。

本発明のまた別の態様は、上述の組換え核酸を含有して、発現する細胞である。適切な細胞には、植物、動物、哺乳動物、昆虫、酵母および細菌細胞が含まれる。

本発明のまた別の態様は、本明細書に記載のＶＫＯＲをコードする単離核酸へハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。

本発明のまた別の態様は、本明細書に記載の核酸によってコードされる単離かつ精製されたＶＫＯＲ（例、均質に精製されたＶＫＯＲ）である。例えば、本発明のＶＫＯＲは配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含んでよい。

本発明のまた別の態様は、ビタミンＫ依存性タンパク質を作製する方法であって、ビタミンＫの存在下でビタミンＫ依存性タンパク質をコードする核酸を発現してビタミンＫ依存性タンパク質を産生する宿主細胞を培養するステップと、および次に前記ビタミンＫ依存性タンパク質を前記培養から採取するステップと、を含み、前記宿主細胞がビタミンＫ依存性カルボキシラーゼをコードする異種核酸を含有して、発現し、そして前記宿主細胞がさらにビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）をコードする異種核酸を含有して、発現し、本明細書に記載のＶＫＯＲを産生する方法である。

本明細書で使用する「１つの」または「その」は１つまたは２つ以上を意味することがある。例えば、「１つの」細胞は、単一の細胞または複数の細胞を意味することがある。

以下では、本発明をより詳細に説明する。この説明は、本発明を実行できる全ての様々な方法、あるいは本発明に付け加えることのできる全ての特徴についての詳細な目録であることは意図していない。例えば、１つの実施形態に関して例示する特徴は、他の実施形態に組み込むことができ、そして特定の実施形態に関して例示する特徴は、その実施形態から削除することもできる。さらに、本開示に照らせば、当業者には、本明細書に提案した様々な実施形態への数多くの変形および追加は本発明から逸脱せずに明白であろう。そこで、以下の明細書は、本発明の一部の特定の実施形態を例示することを意図しており、全ての順列、組み合わせおよび変形を排他的に規定することは意図していない。

本明細書に添付の「配列リスト」は、本明細書に完全に記載されているかのように本明細書の一部を形成する。

本発明は、本開示に基づいて、そしてそれらの開示が本明細書に完全に記載されているかのようにその全体が参照して本明細書に組み込まれるＳｔａｆｆｏｒｄ ａｎｄ Ｗｕへの米国特許第５，２６８，２７５号およびＳｔａｆｆｏｒｄ ａｎｄ Ｃｈａｎｇへの米国特許第６，５３１，２９８号に記載されているものを含むがそれらに限定されない、当分野において既知の方法、構成成分、および特徴を利用して実施されてよい。

本明細書で使用する「核酸」は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（例、化学的に合成された）ＤＮＡならびにＲＮＡおよびＤＮＡのキメラを含むＲＮＡおよびＤＮＡの両方を包含している。核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。一本鎖の場合は、核酸はセンス鎖またはアンチセンス鎖であってよい。核酸は、オリゴヌクレオチドアナログもしくは誘導体（例、イノシンもしくはホスホロチオエートヌクレオチド）を用いて合成されてよい。そのようなオリゴヌクレオチドは、例えば変化した塩基対合能力またはヌクレアーゼに対する増加した耐性を有する核酸を調製するために使用できる。

「単離核酸」は、それが由来する有機体の天然型ゲノム内ではそれと隣接している（一本は５’末端上そして一本は３’末端上）コーディング配列のどちらとも隣接していないＤＮＡまたはＲＮＡである。そこで、１つの実施形態では、単離核酸は、前記コーディング配列に隣接する５’非コーディング（例、プロモーター）配列の一部および全部を含む。このためこの用語は、例えば、ベクター内、自己複製プラスミドもしくはウイルス内、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ内に組み込まれる、または他の配列とは独立して個別分子（例、ＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生するｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡフラグメント）として存在する組換えＤＮＡを含む。これは、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡもさらに含む。

用語「単離（した）」は、実質的に細胞性物質、ウイルス性物質、もしくは培養培地（組換えＤＮＡ技術によって生成した場合）、または化学的前駆物質もしくは他の化学薬品（化学合成した場合）を含んでいない核酸もしくはポリペプチドを意味することがある。さらに、「単離核酸フラグメント」は、フラグメントとして自然には発生しない、そして自然状態では見いだされないであろう核酸フラグメントである。

用語「オリゴヌクレオチド」は、例えばＰＣＲ増幅におけるプライマーとして、またはハイブリダイゼーションアッセイもしくはマイクロアレイにおけるプローブとして使用できる、少なくとも約６ヌクレオチドから約１００ヌクレオチド、例えば約１５から３０ヌクレオチド、もしくは約１５から３０ヌクレオチドの核酸配列を意味する。オリゴヌクレオチドは、天然もしくは合成、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくは修飾主鎖などであってよい。

特定のヌクレオチド配列が標準ヌクレオチド配列との特定の同一性（％）を有すると言われる場合は、同一性（％）は標準ヌクレオチド配列に比較されている。例えば、１００塩基長である標準ヌクレオチド配列と５０％、７５％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列は、前記標準ヌクレオチド配列の５０、７５、８５、９０、９５もしくは９９ヌクレオチド配列と完全に同一である５０、７５、８５、９０、９５もしくは９９塩基を有することがある。ヌクレオチド配列は、さらにその全長にわたり標準ヌクレオチド配列と５０％、７５％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一である１００塩基長ヌクレオチド配列であることもある。当然ながら、同一基準を同様に満たすであろう他のヌクレオチド配列も存在する。

ＶＫＯＲヌクレオチド配列と「実質的に同一」である核酸配列は、配列番号８もしくは９のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一である。核酸を比較するために、標準核酸配列の長さは、一般に少なくとも４０ヌクレオチド、例えば少なくとも６０ヌクレオチド以上であろう。配列同一性は、配列解析ソフトウエア（例えば、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター（１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ、５３７０５ ウィスコンシン州マディソン）遺伝学コンピュータグループの配列解析ソフトウエアパッケージ）を用いて測定できる。

当分野において既知のように、核酸もしくはアミノ酸が既知の配列との配列同一性もしくは類似性を有するかどうかを同定するために多数の様々なプログラムを使用することができる。配列同一性もしくは類似性は、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２，４８２（１９８１）の局所的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３（１９７０）の配列同一性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４（１９８８）の類似性方法についての検索、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ（ウィスコンシン州マディソン）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、好ましくはデフォルト設定を用いてＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２，３８７−３９５（１９８４）によって記載されたＢｅｓｔ Ｆｉｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅプログラムまたは検査を含むがそれらに限定されない当分野において既知の標準技術を用いて決定することができる。

有用なアルゴリズムの例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、進歩的なペアワイズアライメントを用いて１群の関連する配列から複数の配列アライメントを作製する。ＰＩＬＥＵＰはさらに、アライメントを作製するために使用されるクラスタリング関係を示している系統樹をプロットできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５，３５１−３６０（１９８７）の革新的なアライメント方法の単純化を使用する；この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＆ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５，１５１−１５３（１９８９）によって記載された方法に類似している。

有用なアルゴリズムのまた別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０，（１９９０）およびＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，５８７３−５７８７（１９９３）に記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６，４６０−４８０（１９９６）から入手されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、好ましくはデフォルト値へ設定されている数個の検索パラメータを使用する。これらのパラメータは動的数値であり、特定配列の構成およびそれに対して当該配列が検索されている特定データベースの構成に依存してプログラム自体によって確立される；しかし、数値は感受性を増加させるために調整することができる。追加の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２によって報告されたようなｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴである。

配列類似性を決定するためには、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムもまた使用できる。このアルゴリズムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ７３：２３７；Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ ８：１５５−６５；およびＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１によって記載されている。

さらに、本明細書に開示した核酸より多いもしくは少ないヌクレオチドを含有する配列については、１つの実施形態では、配列同一性（％）は、ヌクレオチド塩基の総数に関連付けて同一ヌクレオチドの数に基づいて決定されることは理解されている。そこで、例えば本明細書に詳細に開示した配列より短い配列の配列同一性は、１つの実施形態では、短い配列におけるヌクレオチド塩基の数を用いて決定されるであろう。同一性（％）の計算においては、相対荷重は、例えば挿入、欠失、置換などの様々な配列変化の発現には割り当てられない。

本発明のＶＫＯＲポリペプチドには、組換えポリペプチド、合成ペプチドおよび天然ポリペプチドが含まれるが、それらに限定されない。本発明は、さらにまたその中で天然型アミノ酸配列が変化もしくは欠失しているＶＫＯＲポリペプチドの形態をコードする核酸配列を包含している。好ましい核酸は、正常な生理的条件下で可溶性であるポリペプチドをコードする。さらに本発明には、ＶＫＯＲの全部もしくは一部分が非関連性ポリペプチド（例、マーカーポリペプチドもしくは融合パートナー）へ融合して融合タンパク質を作製する融合タンパク質をコードする核酸が含まれる。例えば、ポリペプチドは細菌で発現されたポリペプチドの精製を促進するためのヘキサヒスチジンタグへ、または真核細胞中で発現したポリペプチドの精製を促進するためのヘマグルチニンタグへ、またはアフィニティクロマトグラフィーもしくは免役沈降法によるポリペプチドの精製を促進するためのＨＰＣ４タグへ融合させることができる。本発明は、第１部分および第２部分を含む単離ポリペプチド（およびこれらのポリペプチドをコードする核酸）もさらに含み、第１部分は、例えばＶＫＯＲポリペプチドの全部もしくは一部分を含み、そして第２部分は、例えば検出可能なマーカーを含む。

融合パートナーは、例えば、分泌を促進するポリペプチド、例えば分泌配列であってよい。そのような融合ポリペプチドは、一般的にプレタンパク質と呼ばれる。分泌配列は、細胞によって切断されて成熟タンパク質を形成することができる。さらに、不活性プレタンパク質を産生するためにポリペプチド配列へ融合されたＶＫＯＲをコードする核酸が含まれる。プレタンパク質は、不活性化配列の除去によってタンパク質の活性形へ変換することができる。

本発明は、さらに例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（本明細書に規定したとおり）下で配列番号１〜６、８もしくは９のヌクレオチド配列の全部もしくは一部分またはそれらの補体へハイブリダイズする核酸も含む。特定の実施形態では、ハイブリダイズしている核酸のハイブリダイズしている部分は、一般的に長さが少なくとも１５（例えば、２０、３０、もしくは５０）ヌクレオチドである。ハイブリダイズしている核酸のハイブリダイズしている部分は、ＶＫＯＲポリペプチドをコードする核酸の一部分もしくは全部の配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは１００％同一である。本明細書に記載のタイプのハイブリダイズしている核酸は、例えばクローニングプローブ、プライマー（例、ＰＣＲプライマー）、または診断用プローブとして使用できる。本発明には、例えば本明細書に記載の、そして当分野において既知のような活性アッセイにおいて決定されるように、ＶＫＯＲの機能を阻害する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および／またはアンチセンスＲＮＡもまた含まれる。

また別の実施形態では、本発明は、本発明の核酸を含有する細胞、例えば形質転換細胞を特徴とする。「形質転換細胞」は、ＶＫＯＲポリペプチド、および／またはアンチセンス核酸もしくはｓｉＲＮＡの全部もしくは一部をコードする核酸が組換え核酸技術によってその中に（もしくはその祖先の中に）導入されている細胞である。例えば細菌、酵母、昆虫、マウス、ラット、ヒト、植物などの原核および真核細胞の両方が含まれる。

本発明は、例えば発現ベクターのような、発現を可能にする転写および／または翻訳調節エレメントへ機能的に連結している本発明の核酸を含有する核酸構築物（例えば、ベクターおよびプラスミド）もさらにまた特徴とする。「機能的に連結した」は、前記調節エレメントが選択された核酸の転写および／または翻訳を調節できるように、例えばＶＫＯＲポリペプチドをコードするＤＮＡ分子のような選択された核酸が、配列の転写および／または翻訳を指令する１つ以上の調節エレメント、例えばプロモーターに隣接して配置されていることを意味する。

本発明は、プライマーもしくはプローブとして使用できる、本発明の核酸のフラグメントもしくはオリゴヌクレオチドをさらに提供する。そこで、一部の実施形態では、本発明のフラグメントもしくはオリゴヌクレオチドは、配列番号８もしくは配列番号９に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、２５００もしくは３０００連続ヌクレオチドであるヌクレオチド配列である。本発明のオリゴヌクレオチドの例を本明細書に含まれた配列リストに提供する。そのようなフラグメントもしくはオリゴヌクレオチドは、例えば増幅（例、ＰＣＲ）アッセイにおけるプライマーとして使用する場合は、制限酵素切断部位を含める、および／または組み込むために、検出可能に標識もしくは修飾することができる。

本発明は、例えば配列番号１０のアミノ酸配列またはその生物活性フラグメントもしくはペプチドを含む、本質的にそれからなる、および／またはそれからなるポリペプチドなどの精製もしくは単離ＶＫＯＲポリペプチドをさらに特徴とする。そのようなフラグメントもしくはペプチドは、典型的には配列番号１０のアミノ酸配列の少なくとも約１０アミノ酸（例えば、配列番号１０のアミノ酸配列の１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５、８５、９５、１００、１２５、もしくは１５０アミノ酸）であり、（例えば、配列番号１０に記載のような）ＶＫＯＲタンパク質のアミノ酸配列の連続アミノ酸のペプチドもしくはフラグメントであってよい。本発明のフラグメントもしくはペプチドの生物活性は、本明細書に提供した、そしてＶＫＯＲ活性を同定するために当分野において既知のような方法にしたがって決定できる。本発明のＶＫＯＲタンパク質のフラグメントおよびペプチドは、抗体を産生するための抗原としてさらに活性を有する可能性がある。本発明のフラグメントもしくはペプチド上のエピトープの同定は、周知のプロトコルによって実施され、当業者の通常の技術の範囲内に含まれる。

本明細書で使用する「タンパク質」および「ポリペプチド」はどちらも、長さまたは翻訳後修飾（例、グリコシル化、リン酸化もしくはＮ−ミリスチル化）とは無関係に、アミノ酸の鎖を意味する。そこで用語「ＶＫＯＲポリペプチド」には全長天然型ＶＫＯＲタンパク質、ならびに全長天然型ＶＫＯＲタンパク質に、または天然型もしくは合成ＶＫＯＲポリペプチドの一部分に一致する組換えにより、もしくは合成により産生したポリペプチドが各々含まれる。

「精製」もしくは「単離」化合物もしくはポリペプチドは、当該の化合物の重量で少なくとも６０％の組成物、例えば天然型微生物もしくはウイルスの他の構成成分の少なくとも一部、例えば細胞もしくはウイルス構造成分またはそのポリペプチドと一般に結び付いて見いだされる他のポリペプチドもしくは核酸から分離されている、もしくはそれらを実質的に含有していないＶＫＯＲポリペプチドもしくは抗体である。本明細書で使用する「単離」ポリペプチドは、少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％（ｗ／ｗ）以上純粋である。好ましくは、前記調製物は当該の化合物の重量で少なくとも７５％（例、少なくとも９０％もしくは９９％）である。純度は、適切な標準方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、またはＨＰＬＣ分析によって測定できる。

好ましいＶＫＯＲポリペプチドには、天然型ＶＫＯＲポリペプチドの全部もしくは一部分と実質的に同一である配列が含まれる。本明細書に記載のＶＫＯＲポリペプチド配列と「実質的に同一」であるポリペプチドは、配列番号１０のＶＫＯＲポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％もしくは８５％（例、９０％、９５％もしくは９９％）同一であるアミノ酸配列を有する。比較のために、標準ＶＫＯＲポリペプチドの長さは、一般に少なくとも１６アミノ酸、例えば少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５もしくは１００アミノ酸であろう。

標準配列と１００％未満同一であるポリペプチド配列の場合は、非同一である位置は、必ずではないが、好ましくは標準配列に対して保存的置換である。保存的置換には、典型的には以下の基：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびトレオニン；リシンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン内の置換が含まれるが、それらに限定されない。

特定のポリペプチドが規定長さの標準ポリペプチドとの特定の同一性（％）を有すると言われる場合は、同一性（％）は標準ポリペプチドに比較されている。そこで例えば、１００アミノ酸長である標準ポリペプチドに対して５０％、７５％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一であるポリペプチドは、前記標準ポリペプチドの５０、７５、８５、９０、９５もしくは９９アミノ酸長部分と完全に同一である５０、７５、８５、９０、９５もしくは９９アミノ酸ポリペプチドであってよい。それは、その全長にわたり標準ポリペプチドと５０％、７５％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一である１００アミノ酸長ポリペプチドであってもよい。当然ながら、他のポリペプチドもまた同一基準を満たすであろう。

本発明は、本発明のＶＫＯＲポリペプチドもしくはそのフラグメントへ特異的に結合する精製もしくは単離抗体もさらに特徴とする。「特異的に結合する」とは、抗体が特定の抗原、例えばＶＫＯＲポリペプチド、またはＶＫＯＲポリペプチドのフラグメントもしくはペプチド上のエピトープを認識して結合するが、しかしサンプル中の他の分子を実質的に認識して結合することがないことを意味する。１つの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体であり、そして他の実施形態では、抗体はポリクローナル抗体である。キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、抗体フラグメントなどを含むモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方の生成法は、当分野において周知である。

また別の態様では、本発明はサンプル中のＶＫＯＲポリペプチドを検出する方法を特徴とする。本方法は、抗体とＶＫＯＲとの複合体の形成を可能にする条件下で、サンプルをＶＫＯＲポリペプチドもしくはそのフラグメントに特異的に結合する抗体と接触させるステップと、もしあれば複合体の産生を、前記サンプル中のＶＫＯＲポリペプチドもしくはそのフラグメントの検出として検出するステップと、を含む。そのようなイムノアッセイは、当分野において周知であり、免疫沈降アッセイ、免疫ブロットアッセイ、免疫標識アッセイ、ＥＬＩＳＡなどが含まれる。

本発明は、サンプル中のＶＫＯＲポリペプチドをコードする核酸を検出する方法であって、ハイブリダイゼーション複合体が形成できる条件下で、前記サンプルをＶＫＯＲポリペプチドもしくはそのフラグメントをコードする本発明の核酸と、またはＶＫＯＲもしくはそのフラグメントをコードする核酸の補体と接触させるステップと、それによりサンプル中のＶＫＯＲをコードする核酸を検出するためにハイブリダイゼーション複合体の形成を検出するステップと、を含む方法をさらに提供する。そのようなハイブリダイゼーションアッセイは当分野において周知であり、プローブ検出アッセイおよび核酸増幅アッセイが含まれる。

本発明には、ＶＫＯＲ遺伝子（すなわち、その機能的ホモログ）に関連する遺伝子を入手する方法もまた包含される。そのような方法は、ＶＫＯＲの全部もしくは一部分をコードする単離核酸、またはそのホモログを含む検出可能に標識されたプローブを入手もしくは生成するステップと、標識されたプローブを用いて核酸フラグメントライブラリーを、前記ライブラリー内の核酸フラグメントへのプローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより核酸重複部位を形成させる条件下でスクリーニングするステップと、もしあれば標識された重複部位を単離するステップと、およびＶＫＯＲ遺伝子に関連する遺伝子を入手するためにいずれかの標識された重複部位内の核酸フラグメントから全長遺伝子配列を調製するステップと、を含む。

本発明のまた別の態様は、ビタミンＫ依存性タンパク質を作製する方法であって、ビタミンＫの存在下でビタミンＫ依存性タンパク質をコードする核酸を発現してビタミンＫ依存性タンパク質を産生する宿主細胞を培養するステップと、および次に前記ビタミンＫ依存性タンパク質を前記培養から採取するステップと、を含み、前記宿主細胞がビタミンＫ依存性カルボキシラーゼをコードする異種核酸を含有して、発現し、そして前記宿主細胞がさらにビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）をコードする異種核酸を含有して、発現し、本明細書に記載のＶＫＯＲを産生する方法である。ＶＫＯＲをコードする核酸の発現およびＶＫＯＲの産生は、細胞がＶＫＯＲの非存在下で産生されるであろうレベルより高レベルのビタミンＫ依存性タンパク質を産生することを誘発するであろう。

そこで一部の実施形態では、本発明は、ビタミンＫ依存性タンパク質を生成する方法であって、
ａ）細胞内にビタミンＫ依存性タンパク質をコードする核酸を、それにより前記核酸が発現して前記ビタミンＫ依存性タンパク質がビタミンＫの存在下で産生する条件下で導入するステップであって、前記細胞がビタミンＫ依存性カルボキシラーゼをコードする異種核酸を含み、そしてビタミンＫエポキシド還元酵素をコードする異種核酸をさらに含むステップと、および
ｂ）前記細胞から前記ビタミンＫ依存性タンパク質を任意に採取するステップと、を含む方法をさらに提供する。生成できるビタミンＫ依存性タンパク質は、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳおよびプロトロンビンをあらゆる組み合わせで含むが、それらに限定されない、現在知られている、もしくは本質的に後になって同定されるあらゆるビタミンＫ依存性タンパク質であってよい。本明細書に記載の核酸を用いて形質転換させることのできる全ての宿主細胞は、本明細書に記載のように使用できるが、一部の実施形態では、非ヒトもしくは非哺乳動物宿主細胞さえ使用できる。本明細書に記載のビタミンＫ依存性カルボキシラーゼをコードする核酸およびビタミンＫ依存性タンパク質をコードする核酸は当分野において周知であり、それらを発現させるための細胞内への導入は、日常的プロトコルにしたがって実施されるであろう。

本発明のある実施形態は、抗凝固療法のための被験者のワルファリンの治療用量は、前記被験者の前記ＶＫＯＲ遺伝子内の１つ以上の一塩基多型の存在と相関させることができるという、本発明者らの発見に基づいている。そこで本発明は、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有するヒト被験者を同定する方法であって、前記被験者においてＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出するステップであって、前記一塩基多型がワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられ、それによりワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップを含む方法をさらに提供する。

ワルファリンに対する増加した感受性と相関させられたＳＮＰの例は、配列番号８のゲノム配列ならびにこの配列の前後のおよそ１０００ヌクレオチドを含む標準配列である、配列番号１１のヌクレオチド配列のヌクレオチド２５８１（配列番号１２）（ＶＫＯＲ遺伝子のイントロン２において；参照して本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ８０５０８９４）でのＧ→Ｃの変化である。この配列は、ゲノム位置「ヒト染色体１６ｐ１１．２」を有する、またはヒト染色体１６：３１００９７００−３１０１３８００としてＮＣＢＩデータベース内の物理的地図において位置を決定することができる。

ワルファリンに対する減少した感受性と相関させられたＳＮＰの例は、配列番号１１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３２９４（配列番号１３）（ＶＫＯＲ遺伝子のイントロン２において；参照して本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ２３５９６１２）でのＴ→Ｃの変化および配列番号１１のヌクレオチド配列のヌクレオチド４７６９（配列番号１４）（ＶＫＯＲ遺伝子の３’ＵＴＲにおいて；参照して本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｒｅｆＳＮＰ ＩＤ：ｒｓ７２９４）でのＧ→Ａの変化である。

本明細書で使用されるように、「ワルファリンに対する増加した感受性」を有する被験者は、前記被験者のためのワルファリンの適合する治療用量もしくは維持用量が正常被験者のために適合するであろうワルファリンの治療用量もしくは維持用量より少ない被験者、すなわちＶＫＯＲ遺伝子内にワルファリンに対する増加した感受性の表現型を付与するＳＮＰを有していなかった被験者である。これとは逆に、本明細書で使用するように、「ワルファリンに対する減少した感受性」を有する被験者は、前記被験者のためのワルファリンの適合する治療用量もしくは維持用量が正常被験者のために適合するであろうワルファリンの治療用量もしくは維持用量より多い被験者、すなわちＶＫＯＲ遺伝子内にワルファリンに対する減少した感受性の表現型を付与するＳＮＰを有していなかった被験者である。正常被験者に対するワルファリンの典型的な治療用量の例は１週間当たり３５ｍｇであるが、この量は変動する可能性がある（例えば、Ａｉｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｌａｎｃｅｔ ３５３：７１７−７１９には１週間当たり３．５から４２０ｍｇの用量範囲が記載されている）。ワルファリンの典型的な治療用量は、本明細書に記載の方法にしたがって所定の試験について決定でき、これを使用するとこの用量を上回る、もしくは下回るワルファリン治療用量を備える被験者を同定し、それによってワルファリンに対する減少もしくは増加した感受性を有する被験者を同定することができる。

さらに本明細書では、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有するヒト被験者を同定する方法であって、ａ）ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在をワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させるステップと；およびｂ）前記被験者においてステップ（ａ）の前記一塩基多型を検出するステップであって、それによりワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、を含む方法が提供される。

さらに、本発明は、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられたＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型を同定する方法であって、ａ）ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、ｂ）前記被験者におけるＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出するステップと、およびｃ）ステップ（ｂ）の前記一塩基多型の存在を前記被験者におけるワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させるステップであって、それによりワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられたＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型を同定するステップと、を含む方法を提供する。

さらに、本明細書では、被験者のＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型をワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させる方法であって、ａ）ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、ｂ）ステップ（ａ）の被験者における前記ＶＫＯＲ遺伝子のヌクレオチド配列を決定するステップと、ｃ）ステップ（ｂ）のヌクレオチド配列を前記ＶＫＯＲ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列と比較するステップと、ｄ）ステップ（ｂ）のヌクレオチド配列内の一塩基多型を検出するステップと、およびｅ）ステップ（ｄ）の一塩基多型をステップ（ａ）の被験者におけるワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させるステップと、を含む方法も提供する。

被験者は、周知のプロトコルにしたがった抗凝固療法のためのワルファリンの治療用量もしくは維持用量を確立するステップと、その被験者のための治療用量もしくは維持用量を、それからワルファリンの平均もしくは中間治療用量もしくは維持用量が計算される１集団の正常被験者（例えば、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられるＶＫＯＲ遺伝子内のＳＮＰが欠如している被験者）の抗凝固療法のためのワルファリンの治療用量もしくは維持用量と比較するステップによって、ワルファリンに対する増加または減少した感受性を有するかを画定される。ワルファリンの平均治療用量もしくは維持用量を下回るワルファリンの治療用量もしくは維持用量（例えば、野生型ＶＫＯＲ遺伝子を有する、すなわちワルファリン感受性に関連付けられた一塩基多型が欠如している被験者にとって治療的である、もしくは維持レベルを提供するワルファリンの用量）を有する被験者は、ワルファリンに対する増加した感受性を有すると同定された患者である。ワルファリンの平均治療用量もしくは維持用量を上回るワルファリンの治療用量もしくは維持用量を有する被験者は、ワルファリンに対する減少した感受性を有すると同定された被験者である。野生型ＶＫＯＲ遺伝子を備える被験者のためのワルファリンの平均治療用量もしくは維持用量は、当業者によって容易に決定されるであろう。

被験者のＶＫＯＲ遺伝子のヌクレオチド配列は、当分野において標準の、そして本明細書に提供した実施例に記載のような方法にしたがって決定される。例えば、ゲノムＤＮＡは被験者の細胞から抽出され、ＶＫＯＲ遺伝子は既知のプロトコルにしたがって特定されてシーケンシングされる。ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型は、被験者の配列と当分野において既知の野生型配列（本明細書に配列番号１１として示した標準配列）との比較によって同定される。

ＶＫＯＲ遺伝子内のＳＮＰは、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有する、すなわち前記平均用量を上回る、もしくは下回るワルファリンの維持用量もしくは治療用量を有すると同定された被験者のＶＫＯＲ遺伝子内の１つのＳＮＰもしくは複数のＳＮＰの存在を同定するステップと、周知の統計分析方法にしたがって、１つ以上のＳＮＰとワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性との相関の統計分析を実施するステップと、によってワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられる。１つ以上のＳＮＰ（遺伝子型）と増加もしくは減少したワルファリン感受性（表現型）との統計的関連（例、有意な関連）を同定する分析は、被験者における１つ以上のＳＮＰの存在とその被験者におけるワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性との相関関係を確立する。

被験者のＶＫＯＲ遺伝子内の１つ以上のＳＮＰの存在を含む要素の組み合わせは、その被験者におけるワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させることができることは企図されている。そのような要素には、シトクロムｐ４５０ ２Ｃ９多型、人種、年齢、性別、喫煙歴および肝疾患が含まれるが、それらに限定されない。

そこでまた別の実施形態では、本発明は、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有するヒト被験者を同定する方法であって、ＶＫＯＲ遺伝子の１つ以上の一塩基多型、１つ以上のシトクロムｐ４５０ ２Ｃ９多型、人種、年齢、性別、喫煙歴、肝疾患およびこれらの要素の２つ以上の組み合わせからなる群から選択された、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられた要素の組み合わせの存在を同定するステップであって、前記要素の組み合わせがワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられ、それによりワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップを含む方法を提供する。

さらに、本明細書では、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有するヒト被験者を同定する方法であって、ａ）要素の組み合わせの存在をワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させるステップであって、前記要素が、ＶＫＯＲ遺伝子の１つ以上の一塩基多型、１つ以上のシトクロムｐ４５０ ２Ｃ９多型、人種、年齢、性別、喫煙歴、肝疾患およびこれらの要素の２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるステップと；およびｂ）前記被験者においてステップ（ａ）の要素の組み合わせを検出するステップであって、それによりワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、を含む方法が提供される。

さらに、本発明は、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられた要素の組み合わせを同定する方法であって、前記要素が、ＶＫＯＲ遺伝子の１つ以上の一塩基多型、１つ以上のシトクロムｐ４５０ ２Ｃ９多型、人種、年齢、性別、喫煙歴、肝疾患およびこれらの要素の２つ以上の組み合わせからなる群から選択され、ａ）ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、ｂ）前記被験者における前記要素の組み合わせの存在を検出するステップと、およびｃ）ステップ（ｂ）の要素の組み合わせの存在を前記被験者におけるワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させるステップであって、それによりワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられた要素の組み合わせを同定するステップと、を含む方法を提供する。

本明細書では、さらにまた要素の組み合わせを相関させる方法であって、前記要素が、ＶＫＯＲ遺伝子の１つ以上の一塩基多型、１つ以上のシトクロムｐ４５０ ２Ｃ９多型、人種、年齢、性別、喫煙歴、肝疾患およびこれらの要素の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される方法であって、ａ）ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、ｂ）前記被験者における前記要素の組み合わせの存在を同定するステップと、およびｃ）ステップ（ｂ）の要素の組み合わせをステップ（ａ）の被験者におけるワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させるステップと、を含む方法もまた提供される。

本明細書に記載の要素の組み合わせは、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性を有すると同定された被験者における要素の組み合わせの存在を同定するステップと、および周知の統計分析方法にしたがって、要素の組み合わせとワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性との関連についての統計分析を実施するステップとによって、ワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性と相関させられる。要素の組み合わせと（増加もしくは減少した）ワルファリン感受性表現型との統計的関連（例、有意な関連）を同定する分析は、被験者における要素の組み合わせの存在とその被験者におけるワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性との相関関係を確立する。

本明細書では、ＶＫＯＲをコードし、本明細書に記載の１つ以上のＳＮＰを含む核酸がさらに提供される。そこで、本発明は、本質的に配列番号１２、１３、１４、１５および１６に規定したヌクレオチド配列を含む、本質的にそれらからなる、および／またはそれらからなる核酸をさらに提供する。前記核酸はベクター内に存在していてもよく、該ベクターは細胞内に存在していてよい。さらに、配列番号１２、１３、１４、１５および１６に規定したヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされたタンパク質、ならびに配列番号１２、１３、１４、１５および１６に規定したヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされたタンパク質へ特異的に結合する抗体が含まれる。以下の実施例では、本発明をより詳細に記載するが、当業者には多数の修飾および変形が明白であろうから、前記実施例は単に例示することが企図されている。

ＶＫＯＲ遺伝子内の１つ以上のＳＮＰとワルファリンに対する増加もしくは減少した感受性との相関関係
ＶＫＯＲ遺伝子の最も主要なアイソフォームは約４ｋｂ長であり、３つのエクソンを有し、そして１８．４ｋＤａの質量を備える１６３アミノ酸の酵素をコードする。本試験では、ＳＮＰ（各々、４６．９％、４６．８％および４６．３％のヘテロ接合性率）として同定された３つの突然変異ｖｋ２５８１（Ｇ＞Ｃ）、ｖｋ３２９４（Ｔ＞Ｃ）およびｖｋ４７６９（Ｇ＞Ａ）を、被験者におけるそれらの存在と治療効果のある反応を達成するために必要とされるワルファリンの維持用量との相関関係について試験した。

１．被験者の選択
被験者は、外来ケアセンター内のＵＮＣ凝固クリニックから入手した。研修を積んだ遺伝カウンセラーによってインフォームドコンセントを入手した。英語を流暢に話せない被験者は、通訳がおらず、同意を得るための要件が満たされないために除外した。本試験適格者となるために、被験者は少なくとも６ヶ月間にわたりワルファリンを摂取しており、年齢が１８歳以上であり、外来ケアクリニックでのＵＮＣ凝固クリニックによってフォローアップされた。

２．全血からのゲノムＤＮＡの抽出
ゲノムＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製品番号５１１０４）を用いて被験者の全血から抽出した。ＤＮＡ濃度は１０ｎｇ／μＬへ調整した。

３．ゲノムＤＮＡサンプルのシーケンシング
およそ１０ｎｇのＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイのために使用した。ＶＫＯＲ遺伝子を増幅させるために使用したプライマーは次のとおりであった：５’−ＵＴＲおよびエクソン１領域のためのエクソン１−５’ＣＣＡＡＴＣＧＣＣＧＡＧＴＣＡＧＡＧＧ（配列番号２９）およびエクソン１−３’ＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＡＧＣＡＣＴＧＴＣＴ（配列番号３０）；エクソン２領域のためのエクソン２−５’ＡＧＧＧＧＡＧＧＡＴＡＧＧＧＴＣＡＧＴＧ（配列番号３１）およびエクソン２−３’ＣＣＴＧＴＴＡＧＴＴＡＣＣＴＣＣＣＣＡＣＡ（配列番号３２）；ならびにエクソン３および３’−ＵＴＲ領域のためのエクソン３−５’ＡＴＡＣＧＴＧＣＧＴＡＡＧＣＣＡＣＣＡＣ（配列番号３３）およびエクソン３−３’ＡＣＣＣＡＧＡＴＡＴＧＣＣＣＣＣＴＴＡＧ（配列番号３４）。ＶＫＯＲ遺伝子内のＳＮＰを検出するためには、自動ハイスループットキャピラリー電気泳動ＤＮＡシーケンシングを使用した。

４．リアルタイムＰＣＲを用いた既知のＳＮＰの検出
ＳＮＰ遺伝子型特定のためのアッセイ試薬は、Ａｓｓａｙ−ｂｙ−Ｄｅｓｉｇｎ（商標）ｓｅｒｖｉｃｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、製品番号４３３２０７２）から入手した。プライマーおよびプローブ（ＦＡＭ（商標）およびＶＩＣ（商標）色素標識）は、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエアを用いて設計し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製合成装置内で合成した。各ＳＮＰのためのプライマー対はＳＮＰ部位の上流／下流位置に配置され、ＰＣＲ反応において１００ｂｐ長未満のＤＮＡフラグメントを生成できる。ＦＡＭ（商標）およびＶＩＣ（商標）色素標識プローブは、１５〜１６ｎｔの長さを備えるＳＮＰ部位をカバーするように設計した。各ＶＫＯＲ ＳＮＰのためのプライマーおよびプローブ配列は表２に示した。

ＰＣＲ反応では、２×ＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，Ｎｏ ＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、製品番号４３２４０１８）を使用した。４０サイクルのリアルタイムＰＣＲは、Ｏｐｔｉｃｏｎ ＩＩ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）機内で実施した。９５℃で１０分間予熱され、次に９２℃で１５秒間、６０℃で１分間加熱され、そしてその後にプレートが読み取られた。結果は、ＦＡＭおよびＶＩＣ色素のシグナル値にしたがって読み取った。

５．統計的分析
様々な遺伝子型間の平均用量の差は、ＳＡＳバージョン８．０（ＳＡＳ社、ノースカロライナ州カリー）を用いた分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって比較した。０．０５未満の両側ｐ値を有意と見なした。ＳＮＰ群間の平均治療用量についての分布および残余についての試験は、分散の均質性の前提を満たすために対数変換が不可欠であることを示していた。

６．ＳＮＰとワルファリン用量との相関関係
直接ゲノムＤＮＡシーケンシングおよびＳＮＰリアルタイムＰＣＲ検出によって、ＶＫＯＲ遺伝子内で５つのＳＮＰが同定された：１つは５’−ＵＴＲ内、２つはイントロンＩＩ内、１つはコーディング領域内および１つは３’−ＵＴＲ内（表１）。

これらのＳＮＰの中で、ｖｋ５６３およびｖｋ４５０１ ＳＮＰ対立遺伝子を有していたのは本試験の被験者５８例中１例（さらに３’−ＵＴＲ ＳＮＰ対立遺伝子も有し、三重ヘテロ接合型）だけであり、その他のＳＮＰは１７〜２５例のヘテロ接合型患者において同定された。

最初に各マーカーを個別に分析した。図１Ａは、ｖｋ２５８１野生型対立遺伝子を備える患者についての平均ワルファリン用量が１週間当たり５０．１９±３．２０ｍｇであったが（ｎ＝２６）、他方この多型についてヘテロ接合型およびホモ接合型である場合の用量が、各々１週間当たり３５．１９±３．７３（ｎ＝１７）および３１．１４±６．２ｍｇ（ｎ＝１５）であったことを示している。図１Ｂは、ｖｋ３２９４野生型対立遺伝子を備える患者についての平均ワルファリン用量は１週間当たり２５．２９±３．０５ｍｇであったが（ｎ＝１１）、他方ヘテロ接合型およびホモ接合型対立遺伝子を有する患者は、各々１週間当たり４１．６±８４．９２（ｎ＝２５）および４７．７３±２．７５ｍｇ（ｎ＝２２）であったことを示している。図１Ｃは、ｖｋ４７６９ＳＮＰ野生型を備える患者についての平均ワルファリン用量が１週間当たり３５．３５±４．０１ｍｇであったが（ｎ＝２７）、他方ヘテロ接合型およびホモ接合型対立遺伝子を備える患者は、各々１週間当たり４４．４８±４．８０（ｎ＝１９）および４７．５６±３．８６ｍｇ（ｎ＝１２）を必要としたことを示している。さらに、Ｐ４５０ ２Ｃ９＊３は、以前に報告されたように（Ｊｏｆｆｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）「Ｗａｒｆａｒｉｎ ｄｏｓｉｎｇ ａｎｄ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ２Ｃ９ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ９１：１１２３−１１２８）、ワルファリン用量へ有意な作用を有することも観察された（図１Ｄ）。Ｐ４５０ ２Ｃ９＊１（野生型）を備える患者についての平均ワルファリン用量が１週間当たり４３．８２±２．７５ｍｇ（ｎ＝５０）であったが、他方この対立遺伝子に対してヘテロ接合型の患者は１週間当たり２２．４±４．３４ｍｇ（ｎ＝８）を必要とした。

７．統計的分析
Ｌｏｇ_e（ワルファリン平均用量）（ＬｎＤｏｓｅ）とＶＫＯＲ遺伝子内のＳＮＰとの関連を分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって試験した。最初にＳＡＳを使用して、ＶＫＯＲ ＳＮＰ以外の用量に影響を及ぼす可能性がある要素を同定するために、一連の要素（人種、性別、喫煙歴、肝疾患、シトクロムＰ４５０ ２Ｙ９遺伝子でのＳＮＰなど）を試験する繰返し手順を実施した。Ｐ４５０ ２Ｃ９＊３はワルファリンの平均用量と統計的有意に関連していた；そこで、これが詳細な分析のための共変成分であると結論した。この分析は、共変量を含めたときに、３つのＶＫＯＲのＳＮＰが依然として１週間当たりのワルファリン用量と統計的有意に関連していることを示した（ｖｋ２５８１、Ｐ＜０．０００１；ｖｋ３２９４，Ｐ＜０．０００１；およびｖｋ４７６９、Ｐ＝０．００４４）。

ＶＫＯＲの３つのＳＮＰがワルファリン用量と独立して関連しているかどうかを詳細に試験するために、ＶＫＯＲ遺伝子内の２つのＳＮＰを他のＳＮＰに対する共変量として含めた分析を繰り返した。３つのＶＫＯＲ ＳＮＰは相互に２ｋｂの距離内に位置していたので、密接に連結していると予想される。検査から、少なくとも白色人種については、１つのハプロタイプ（Ａ＝ｖｋ２５８１である場合はグアニンおよびａ＝ｖｋ２５８１である場合はシトシン；Ｂ＝ｖｋ３２９４ではチアミンおよびｂ＝ｖｋ３９２４ではシトシン；Ｃ＝ｖｋ４７６９ではグアニンおよびｃ＝ｖｋ４７６９ではアデニン）はＡＡｂｂｃｃであり、他方はａａＢＢＣＣであることが明白であった。患者における個々のＳＮＰの分布は、他のＳＮＰと統計的有意に相関していることが見いだされた（Ｒ＝０．６３〜０．８７、ｐ＜０．００１）。実際に、ハロタイプＡＡｂｂｃｃを備える被験者（ｎ＝７）は、ハロタイプａａＢＢＣＣを備える患者のワルファリン用量（２５．２９±３．０５；ｐ＜０．００１）に比較して有意に高いワルファリン用量（ワルファリン用量＝４８．９８±３．９３）を必要とした。

ｓｉＲＮＡの設計および合成
ｓｉＲＮＡは、最新バージョンの合理的設計アルゴリズム（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）「Ｒａｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ」Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２：３２６−３３０）を用いて選択した。１３の遺伝子各々について、最高スコアを備える４つのｓｉＲＮＡ重複部位を選択し、Ｈｕｍａｎ ＥＳＴデータベースを用いてＢＬＡＳＴ検索を実施した。不正確なサイレンシング作用の可能性を最小限に抑えるために、非関連配列に対して４つ以上のミスマッチを備える配列標的だけを選択した（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｏｆｆ − ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＲＮＡｉ」Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１：６３５−７）。全部の重複部位は２’−ＡＣＥ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ（２０００）「Ａｄｖａｎｃｅｄ ５’−ｓｉｌｙｌ−２’−ｏｒｔｈｏｅｓｔｅｒ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ＲＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ３１７：３−１８）の変法を用いてＵＵオーバーハングを備える２１−ｍｅｒとしてＤｈａｒｍａｃｏｎ（コロラド州ラファイエット）において合成し、ＡＳストランドは、最高活性を保証するために化学的にリン酸化した（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｉＲＮＡｓ ｇｕｉｄｅ ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ｉｎ ＲＮＡｉ」Ｃｅｌｌ １１０：５６３−７４）。

ｓｉＲＮＡトランスフェクション
トランスフェクションは、小さな変更を加えただけで、本質的には以前に記載されたとおりであった（Ｈａｒｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００１）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ」Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１４：４５５７−６５）。

ＶＫＯＲ活性のアッセイ
ｓｉＲＮＡトランスフェクトＡ５４９細胞をトリプシン処理し、低温ＰＢＳを用いて２回洗浄した。各ＶＫＯＲアッセイのために１．５×１０⁷ｃｅｌｌｓを採取した。２００μＬのバッファーＤ（２５０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄−ＮａＨ₂ＰＯ₄、５００ｍＭ ＫＣｌ、２０％グリセロールおよび０．７５％ ＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．４）を細胞ペレットに添加し、次に細胞溶解液の超音波処理を実施した。溶解させたマイクロソームをアッセイするために、ミクロソームを（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ａｐｐｅａｒｓ ｔｏ ｂｅ ｔｈｅ ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２８５８４−９１）に記載されたとおりに２×１０⁹ｃｅｌｌｓから調製した；各アッセイのために１０〜５０μＬの溶解マイクロソームを使用した。ビタミンＫエポキシドを図の説明文に記載の濃度へ添加し、ＤＴＴを４ｍＭへ添加して反応を開始させた。反応混合液を３０℃で３０分間にわたり黄灯下でインキュベートし、５００μＬの０．０５Ｍ ＡｇＮＯ₃：イソプロパノール（５：９）を添加することにより反応を停止させた。５００μＬのヘキサンを添加し、混合液を１分間にわたり強力にボルテックスミキサーにかけることによりビタミンＫおよびＫＯを抽出した。５分間の遠心後、上層の有機層を５ｍＬの褐色バイアルへ移し、Ｎ₂を用いて乾燥させた。１５０μＬのＨＰＬＣバッファー、アセトニトリル：イソプロパノール：水（１００：７：２）を添加してビタミンＫおよびＫＯを溶解させ、サンプルをＡＣ−１８カラム（Ｖｙｄａｃ社、製品番号２１８ＴＰ５４）上でのＨＰＬＣによって分析した。

ＲＴ−ｑＰＣＲ（逆転写酵素定量的ＰＣＲ）
１×１０⁶ｃｅｌｌｓをＰＢＳで２回洗浄し、製造業者（インビトロジェン社）のプロトコルにしたがってＴｒｉｚｏｌ試薬を用いて全ＲＮＡを単離した。ＲＱ１ ＤＮａｓｅｌ（プロメガ社）によって１μｇのＲＮＡを消化し、熱不活化した。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（インビトロジェン社）を用いて第１ストランドｃＤＮＡを作製した。ｃＤＮＡをＤｙＮＡｍｏ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲプレミックス（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ社）と混合し、Ｏｐｔｉｃｏｎ ＩＩ ＰＣＲサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。次のプライマーを使用した：
１３１２４７６９−５’（Ｆ）：（ＴＣＣＡＡＣＡＧＣＡＴＡＴＴＣＧＧＴＴＧＣ、配列番号１）；
１３１２４７６９−３（Ｒ）’：（ＴＴＣＴＴＧＧＡＣＣＴＴＣＣＧＧＡＡＡＣＴ、配列番号２）；
ＧＡＰＤＨ−Ｆ：（ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ、配列番号３）；
ＧＡＰＤＨ−Ｒ：（ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ、配列番号４）；
Ｌａｍｉｎ−ＲＴ−Ｆ：（ＣＴＡＧＧＴＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＡ、配列番号５）および
Ｌａｍｉｎ−ＲＴ−Ｒ：（ＣＴＧＴＴＣＣＴＣＴＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＣ、配列番号６）。

Ｓｆ９昆虫細胞系におけるＶＫＯＲの過剰発現
ｍＧＣ１１２７６コーディング領域についてのｃＤＮＡは、（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５：１８２９１−６）に記載されたように、そのアミノ末端でＨＰＣ４タグ（ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫ、配列番号７）を用いてｐＶＬ１３９２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）内へクローニングし、Ｓｆ９細胞内で発現させた。

遺伝子の選択
ＶＫＯＲ遺伝子についての検索はマーカーＤ１６Ｓ３１３１とＤ１６Ｓ４１９の間のヒト染色体１６番に集中した。この領域は、遺伝地図上の５０ｃＭ〜６５ｃＭでの染色体１６番および物理的地図上の２６〜４６．３Ｍｂに一致する。この領域内の１９０の予測されるコーディング配列をＮＣＢＩ非冗長性タンパク質データベースのＢＬＡＳＴＸ検索によって分析した。それらのヒト遺伝子および既知の機能を備える関連種からのオルソログは除外した。ＶＫＯＲは膜貫通タンパク質であると思われるので（Ｃａｒｌｉｓｌｅ ＆ Ｓｕｔｔｉｅ（１９８０）「Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ：ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９：１１６１−７）、残りの遺伝子をＮＣＢＩデータベース内のｃＤＮＡ配列にしたがって翻訳させ、プログラムＴＭＨＭＭおよびＴＭＡＰ（Ｂｉｏｌｏｇｙ ＷｏｒｋＢｅｎｃｈ社、 Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ社）を用いて分析して膜貫通ドメインを備えるものを予測した。その後の分析のために内在性膜たんぱく質をコードすると予測された１３の遺伝子を選択した。

ＶＫＯＲ活性についての細胞系のスクリーニング
この方法は、多量のＶＫＯＲ活性を発現する細胞系を同定し、ｓｉＲＮＡを使用して全１３の候補遺伝子を系統的にノックダウンさせるためのものであった。２１〜２３ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡであるｓｉＲＮＡは、細胞培養中で特異的ＲＮＡ分解を引き起こすことが証明されている（Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００２）「Ｒａｐｔｏｒ，ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｒｔｎｅｒ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ（ＴＯＲ），ｍｅｄｉａｔｅｓ ＴＯＲ ａｃｔｉｏｎ」Ｃｅｌｌ １１０：１７７−８９；Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ ＆ Ｋｏｓｉｋ（２００２）「ＲＮＡｉ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｎｅｕｒｏｎｓ」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１１９２６−９；Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｖｅｌ ｐ５３ Ｔａｒｇｅｔ Ｇｅｎｅ Ｓｎｋ／Ｐｌｋ２ Ｌｅａｄｓ ｔｏ Ｍｉｔｏｔｉｃ Ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｅ ｉｎ Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（Ｔａｘｏｌ）−Ｅｘｐｏｓｅｄ Ｃｅｌｌｓ」Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２３：５５５６−７１）。しかし、哺乳動物細胞における大規模スクリーニングのためのｓｉＲＮＡの適用は、特異的哺乳動物細胞ｍＲＮＡに対する機能的標的を同定するのが困難であるために、以前には報告されていない（Ｈｏｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ｓｉｍｉｌａｒ ｂｅｈａｖｉｏｕｒ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ａｎｄ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｓｉＲＮＡｓ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｔｈｅｙ ａｃｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｃｏｍｍｏｎ ＲＮＡｉ ｐａｔｈｗａｙ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：２４０１−７）。ｓｉＲＮＡ設計のための合理的な選択アルゴリズムの開発（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．）は、特異的ｓｉＲＮＡを開発できる可能性を増加させる；さらに、４つの合理的に選択されたｓｉＲＮＡをプールすることによって成功の確率を増加させることができる。以前には同定されていない遺伝子について検索するためにｓｉＲＮＡを使用することは、ＶＫＯＲ活性が活性のために２つ以上の遺伝子の産物を必要とする場合でさえ、アッセイが酵素活性の消失を決定するために、スクリーニングは依然として有効であるという長所を有する。

１５の細胞系をスクリーニングし、容易な測定のために十分なワルファリン感受性ＶＫＯＲ活性を示すヒト肺癌細胞系Ａ５４９を同定した。ほとんどＶＫＯＲ活性を発現しない第２のヒト結腸直腸腺癌腫細胞系であるＨＴ２９を標準として使用した。

Ａ５４９細胞におけるＶＫＯＲ活性のｓｉＲＮＡによる阻害
ｓｉＲＮＡの１３のプール各々を３回ずつＡ５４９細胞内へトランスフェクトし、７２時間後にＶＫＯＲ活性についてアッセイした。遺伝子ｇｉ：１３１２４７６９に対して特異的な１つのｓｉＲＮＡプールは、８回の個別アッセイにおいてＶＫＯＲ活性を６４％〜７０％へ減少させた（図２）。

７２時間後にＶＫＯＲ活性がその初期活性の約３５％までしか阻害されなかったことについて考えられる１つの理由は、哺乳動物タンパク質の半減期が大きく変動する（数分間から数日間まで）（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６）「Ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｃａｌｐａｉｎ ｉｓｏｚｙｍｅｓ ａｒｅ ｌｏｎｇｌｉｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｃａｌｐａｉｎ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：１８８２５−３０；Ｂｏｈｌｅｙ（１９９６）「Ｓｕｒｆａｃｅ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ３７７：４２５−３５；Ｄｉｃｅ ＆ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ（１９７５）「Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ａｎｄ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７２：３８９３−７）、そしてｍＲＮＡ翻訳は阻害されるが、酵素活性は阻害されないことにある。このため、細胞を１１日間を通して保有し、それらのＶＫＯＲ活性を追跡した。図３は、ｇｉ：１３１２４７６９ ｍＲＮＡについてのｍＲＮＡのレベルが正常値の約２０％へ急速に減少し、他方この期間中にＶＫＯＲ活性が持続的に減少したことを示している。活性におけるこの減少は、ＶＫＤカルボキシラーゼ活性のレベルおよびＬａｍｉｎ Ａ／Ｃ ｍＲＮＡが一定のままであったので、ｓｉＲＮＡの一般的作用もしくは細胞死の結果ではない。さらに、ｇｉ：１３２１２４７６９ ｍＲＮＡのレベルは、高いＶＫＯＲ活性を示すＡ５４９細胞内より低いＶＫＯＲ活性を有するＨＴ−２９細胞内の４分の１である。これらのデータは、ｇｉ：１３１２４７６９がＶＫＯＲ遺伝子に一致することを示している。

ＶＫＯＲをコードする遺伝子の同定
本明細書でＶＫＯＲをコードすると同定された遺伝子ＩＭＡＧＥ ３４５５２００（ｇｉ：１３１２４７６９、配列番号８）は、ヒト染色体１６ｐ１１．２、マウス染色体７Ｆ３、およびラット染色体１：１８０．８Ｍｂに位置する。ＮＣＢＩデータベース内には７種のスプライシングパターンを表す３３８個のｃＤＮＡクローンが存在する（ＮＣＢＩ ＡｃｅＶｉｅｗプログラム）。これらは２から４個のエクソンの全部もしくは一部から構成される。これらの中で最も重要なアイソフォームであるｍＧＣ１１２７６は３個のエクソンを有し、肺および肝細胞中において高レベルで発現する。この３つのエクソン転写産物（配列番号９）は、１８．２ｋＤａの質量を備える１６３アミノ酸からなる予測タンパク質（配列番号１０）をコードする。これは、予測のために使用されたプログラムに依存して、１から３つの膜貫通ドメインを備える推定Ｎ−ミリスチル化小胞体タンパク質である。これは、酵素活性がチオール試薬に依存するという観察所見に一致して、７つのシステイン残基を有する（Ｔｈｉｊｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）「Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ ｌｉｐｏａｍｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ ｅｐｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２９７：２７７−８０）。７つのシステイン中５つは、ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、Ｘｅｎｏｐｕｓ（アフリカツメガエル）およびＡｎｏｐｈｅｌｅｓ（ハマダラカ）の間で保存されている。

前記ＶＫＯＲ遺伝子が同定されていたことを確証するために、酵素の最も重要な形態（３つのエクソン）をＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ヨトウガ）、Ｓｆ９細胞内で発現させた。Ｓｆ９細胞は測定可能なＶＫＯＲ活性を有していないが、ｍＧＣ１１２７６ ｃＤＮＡを用いてトランスフェクトさせるとワルファリン感受性活性を示す（図４）。ＶＫＯＲ活性は、それらのアミノもしくはカルボキシル末端のいずれかでエピトープタグを備える構築物から観察される。このタグは、ＶＫＯＲの精製に関与するであろう。

ＶＫＯＲはワルファリン感受性を示すはずであり、したがってＶＫＯＲを発現するＳｆ９細胞からミクロソームを作製し、ワルファリン感受性について試験した。ＶＫＯＲ活性はワルファリン感受性である（図５）。

要約すると、本発明は知られていない遺伝子を同定するために哺乳動物細胞中のｓｉＲＮＡを使用する最初の例を提供する。ＶＫＯＲ遺伝子の同一性は、昆虫細胞中での発現によって確証された。ＶＫＯＲ遺伝子は数個のアイソフォームをコードする。各アイソフォームの活性および発現パターンを特徴付けることが重要であろう。世界中で数百万人が抗凝固を阻害するためにワルファリンを利用している。このため、より安全、より効果的な抗凝固薬のより正確な用量設定または設計をもたらすことができるので、ＶＫＯＲを詳細に特徴付けることが重要である。

上記は本発明の例示であり、それを限定するものと見なすべきではない。本発明は、本明細書に含まれるべき請求項の同等物とともに、添付の請求項によって限定される。

本明細書で言及した全ての出版物、特許出願、特許、特許公報およびその他の参考文献は、その中で参考文献が提示されている文章および／または段落にとって重要な教示のために参照して全体に組み込まれる。

ＳＮＰであるｖｋ２５８１、ｖｋ３２９４およびｖｋ４７６９に対する野生型、ヘテロ接合型およびホモ接合型被験者におけるワルファリン用量の比較、ならびにＰ４５０ ２Ｙ９に対する野生型およびヘテロ接合型被験者におけるワルファリン用量の比較を示した図である。 １３個のｓｉＲＮＡプールの各々について、Ａ５４９細胞を含有する３個のＴ７フラスコをトランスフェクトし、７２時間後にＶＫＯＲ活性を決定した。ＶＫＯＲアッセイには２５μＭのビタミンＫエポキシドを使用した。遺伝子ｇｉ：１３１２４７６９に対して特異的な１つのｓｉＲＮＡプールは、８回の繰返し実験においてＶＫＯＲ活性を６４％〜７０％減少させた。 Ａ５４９細胞中でのｇｉ：１３１２４７６９に対して特異的なｓｉＲＮＡプールによるＶＫＯＲ活性の阻害の時間経過を示した図である。この期間中にＶＫＯＲ活性は持続的に減少したが、そのｍＲＮＡのレベルは正常値の約２０％へ急速に減少した。このアッセイには２５μＭのビタミンＫエポキシドを使用した。ｓｉＲＮＡはＶＫＤカルボキシラーゼの活性またはＬａｍｉｎ Ａ／Ｃ ｍＲＮＡのレベルに影響を及ぼさなかった。 ＶＫＯＲ活性は、ｍＧＣ＿１１２７６がＳｆ９昆虫細胞内で発現した時点に検出された。このアッセイでは、約１×１０⁶ｃｅｌｌｓを使用した。反応は、バッファーＤ中で３０分間にわたり３０℃で３２μＭ ＫＯを用いて実施した。ブランクのＳｆ９細胞が陰性コントロールとして、そしてＡ５４９細胞が標準として機能した。 ワルファリンによるＶＫＯＲの阻害。反応は、バッファーＤ中で１５分間にわたり３０℃で、ＶＫＯＲ＿Ｓｆ９細胞、６０μＭ ＫＯから作製された１．６ｍｇのミクロソームタンパク質、および様々な濃度のワルファリンを用いて実施した。

Claims (16)

1. ワルファリンに対する増加した感受性を有するヒト被験者を同定する方法であって、前記被験者においてＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出するステップであって、前記一塩基多型がワルファリンに対する増加した感受性と相関させられ、それによりワルファリンに対する増加した感受性を有する前記被験者を同定するステップを含む方法。
2. 前記ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型が、配列番号１１のヌクレオチド配列のヌクレオチド２５８１でのＧ→Ｃ変換である、請求項１に記載の方法。
3. ワルファリンに対する増加した感受性を有するヒト被験者を同定する方法であって、
   ａ）前記ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在をワルファリンに対する増加した感受性と相関させるステップと、および
   ｂ）前記被験者においてステップ（ａ）の前記一塩基多型を検出するステップであって、それによりワルファリンに対する増加した感受性を有する被験者を同定するステップと、を含む方法。
4. ワルファリンに対する増加した感受性と相関させられた前記ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を同定する方法であって、
   ａ）ワルファリンに対する増加した感受性を有する被験者を同定するステップと、
   ｂ）前記被験者における前記ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出するステップと、および
   ｃ）ステップ（ｂ）の前記一塩基多型の存在を前記被験者におけるワルファリンに対する増加した感受性と相関させるステップであって、それによりワルファリンに対する増加した感受性と相関させられたＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型を同定するステップと、を含む方法。
5. 被験者のＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在をワルファリンに対する増加した感受性と相関させる方法であって、
   ａ）ワルファリンに対する増加した感受性を有する被験者を同定するステップと、
   ｂ）ステップ（ａ）の被験者の前記ＶＫＯＲ遺伝子のヌクレオチド配列を決定するステップと、
   ｃ）ステップ（ｂ）のヌクレオチド配列を前記ＶＫＯＲ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列と比較するステップと、
   ｄ）ステップ（ｂ）のヌクレオチド配列内の一塩基多型を検出するステップと、および
   ｅ）ステップ（ｄ）の一塩基多型をステップ（ａ）の被験者におけるワルファリンに対する増加した感受性と相関させるステップと、を含む方法。
6. ワルファリンに対する減少した感受性を有するヒト被験者を同定する方法であって、前記被験者においてＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出するステップであって、前記一塩基多型がワルファリンに対する減少した感受性と相関させられ、それによりワルファリンに対する減少した感受性を有する被験者を同定するステップを含む方法。
7. 前記ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型が、配列番号１１のヌクレオチド配列のヌクレオチド３２９４でのＴ→Ｃ変換である、請求項６に記載の方法。
8. 前記ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型が、配列番号１１のヌクレオチド配列のヌクレオチド４７６９でのＧ→Ａ変換である、請求項６に記載の方法。
9. ワルファリンに対する減少した感受性を有するヒト被験者を同定する方法であって、
   ａ）前記ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在をワルファリンに対する減少した感受性と相関させるステップと、および
   ｂ）前記被験者においてステップ（ａ）の前記一塩基多型を検出するステップであって、それによりワルファリンに対する減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、を含む方法。
10. ワルファリンに対する減少した感受性と相関させられた前記ＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を同定する方法であって、
    ａ）ワルファリンに対する減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、
    ｂ）前記被験者におけるＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型の存在を検出するステップと、および
    ｃ）ステップ（ｂ）の前記一塩基多型の存在を前記被験者におけるワルファリンに対する減少した感受性と相関させるステップであって、それによりワルファリンに対する減少した感受性と相関させられたＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型を同定するステップと、を含む方法。
11. 被験者のＶＫＯＲ遺伝子内の一塩基多型をワルファリンに対する減少した感受性と相関させる方法であって、
    ａ）ワルファリンに対する減少した感受性を有する被験者を同定するステップと、
    ｂ）ステップ（ａ）の被験者の前記ＶＫＯＲ遺伝子のヌクレオチド配列を決定するステップと、
    ｃ）ステップ（ｂ）のヌクレオチド配列を前記ＶＫＯＲ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列と比較するステップと、
    ｄ）ステップ（ｂ）のヌクレオチド配列内の一塩基多型を検出するステップと、および
    ｅ）ステップ（ｄ）の一塩基多型をステップ（ａ）の被験者におけるワルファリンに対する減少した感受性と相関させるステップと、を含む方法。
12. ビタミンＫ依存性タンパク質を作製する方法において
    ａ）ビタミンＫの存在下でビタミンＫ依存性タンパク質をコードする核酸を発現し、そしてビタミンＫ依存性タンパク質を産生する宿主細胞を培養するステップと、および
    ｂ）前記培養から前記ビタミンＫ依存性タンパク質を採取するステップであって、前記宿主細胞がビタミンＫ依存性カルボキシラーゼをコードするヘテロ接合型核酸を含有して、発現するステップと、を含み、
    前記宿主細胞として、ビタミンＫエポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）をコードするヘテロ接合型核酸をさらに含有して、発現する宿主細胞を使用することを含む、改善を含む方法。
13. 前記ビタミンＫ依存性タンパク質が、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、およびプロトロンビンからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記宿主細胞が植物細胞である、請求項１２に記載の方法。
15. 前記宿主細胞が昆虫細胞である、請求項１２に記載の方法。
16. 前記ビタミンＫ依存性カルボキシラーゼがウシビタミンＫ依存性カルボキシラーゼである、請求項１２に記載の方法。
    

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