JPH05508551A

JPH05508551A - ガンマーカルボキシラーゼおよび使用の方法

Info

Publication number: JPH05508551A
Application number: JP91513740A
Authority: JP
Inventors: バークナー　カスリーン　エル．
Original assignee: ザイモジェネティクス，インコーポレイティド
Priority date: 1990-07-23
Filing date: 1991-07-22
Publication date: 1993-12-02
Also published as: WO1992001795A1; AU8427091A; IE912600A1; CA2087970A1; EP0540650A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１６、前記細胞はビタミンに依存性タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列を発現するようにさらにトランスフエフシランまたは形質転換されている、請求項１３に記載の培養された細胞。１７、工程：ガンマ−カルボキシラーゼをエンコードする第１ＤＮＡ配列およびビタミンに依存性タンパク質をエンコードする第２　ＤＮＡ配列を発現するようにトランスフェクシヨンまたは形質転換された細胞を培養し、そして前記第２　ＤＮＡ配列によりエンコードされたビタミンに依存性タンパク質を単離する、からなる、ビタミンに依存性タンパク質を生産する方法。１Ｂ、前記第１　ＤＮＡ配列は表１２のヌクレオチド１９〜ヌクレオチド３８のヌクレオチド配列（配列ＩＤ　Ｎｏ、１８）を含んでなる、請求項１７に記載の方法。１９、前記ガンマ−カルボキシラーゼは表９のペプチド１、ペプチド２、ペプチド３、ペプチド４、ペプチド５、ペプチド６またはペプチド７のアミノ酸配列（配列ＩＤ　Ｎｏ、３．　４．　５．　６．１９．２０および２１）を含んでなる、請求項１７に記載の方法。２０、前記細胞は培養された真核生物細胞である、請求項１７に記載の方法。２１、前記細胞は培養された哺乳動物の細胞である、請求項１７に記載の方法。２２、前記細胞を０．１〜１０μｇ／■１のビタミンにの存在下に培養する、請求項１７に記載の方法。２３、前記ガンマ−カルボキシラーゼはヒト、ウシおよびラットのガンマ−カルボキシラーゼから成る群より選択される、請求項１７に記載の方法。２４、前記ガンマ−カルボキシラーゼが肝臓ガンマ−カルボキシラーゼである、請求項１７に記載の方法。技術分野本発明は、一般に、単離されたタンパク質およびタンパク質をつくる方法に関する。さらに詳しくは、本発明は単離されたガンマ−カルボキシラーゼ、ガンマ− カルボキシラーゼをエンコードするＤＮＡ配列、およびガンマ−カルボキシル化されたタンパク質の生産において１）ＮＡ配列を使用する方法に関する。発明の背景ガンマ−カルボキシグルタミン酸（’ｇｌａ　Ｊと略す）は、ある種のカルシウム結合性タンパク質の中に見いだされるアミノ酸である。これらのタンパク質は次のものを包含する：因子ＶＩＩ　、因子ＩＸ、因子Ｘ、プロトロンビン、タンパク質Ｃおよびタンパク質Ｓ、凝固系の化合物である血漿タンパク質：また、血漿の中に見いだされるタンパクｆｚ；肺の界面活性層に関連するタンパク質（Ｒａｎｎｅｌｓら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｔ、　ＵＳＡ、　８４．５９５２−５９５６）　；および骨のタンパク質のオステオカルシン（また、骨のｇｌａ−タンパク質として知られている）およびマトリックスのｇｌａ−タンパク質。このアミノ酸を含有するタンパク質は、「ビタミンに依存性タンパク質」、ｒｇｌａタンパク質」または「ガンマ−カルボキシル化されたタンパク質ｊといろいろ呼ばれる。血漿のビタミンに依存性タンパク質は、それらの生物学的活性についてカルシウムおよび膜のリン脂質へのｇｌａ仲介結合に依存する。ｇｌａを含有するタンパク質は、高度のアミノ末端のアミノ酸配列の相同性を示す。ガンマ−カルボキシグルタミン酸は、コファクターとしてビタミンにのハイドロキノン（にＨｚ）を必要とする反応において、特定のグルタミン酸残基の翻訳後の修飾により形成される。カルボキシル化反応は、ＫＨｚのビタミンにエポキシド（ＫＯ）への酸化を必要とするが、カルボキシル化およびＫＯの形成は厳格にはカップリングされない、この反応はグルタミン酸のＴ−炭素からの水素イオンの除去、引き続（Ｃ０８の付加により進行すると信じられる。　Ｋ）Ｉ！はりダクダーゼの作用により再生される。ガンマ−カルボキシラーゼはＶｅｒｖｅｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、　２６６　：　６２５−６３６．１９９０）による最近の概観の主題である。近年、ある数のビタミンに依存性タンパク質が遺伝子操作により生産されてきている。しかしながら、活性タンパク質の生産レベルは、発生期のタンパク質の中のグルタミン酸残基を適切にカルボキシル化する宿主細胞の能力により制限される。従来、原核生物または下等真核生物（例えば、菌類）の宿主細胞の中で生物学的活性なビタミンに依存性タンパク質を生物学的に生産することは可能ではなく、より高等の真核生物（例えば、哺乳動物）の細胞系に顧ることが必要であり、これらの細胞系は一般に培養することがいっそう困難でありかつ経費がかかる。そうであってさえ、生物学的活性のビタミンに依存性タンパク質の生産レベルは、遺伝子操作された哺乳動物の細胞系を使用して生産された他のタンパク質のレベルと比較して、非常に低い０例えば、Ｗａｇｅｎら（米国特許第４．７８４．９５０号）は、子供のハムスターの腎細胞系の中の２００ｎｇ／■Ｉまでの組み換えヒト因子Ｖｌｌの発現を報□告したｓ　Ｋａｕｆｍａｎｎら（Ｊ、　Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅ＠、。％は：　９６２２−９６２８）は、ｃａａ細胞系を使用して１００μｇ／霧ｌの因子Ｘを生産したが、この物質のわずかに１％が生物学的に活性であった；そしてｗａｌｌら（Ｇｅｎｅ、　８１　：　１３９−１４９．１９８９）は、増幅後２５μｇ／ａ＋１までのタンパク質Ｃを生産した。対照的に、他のタンパク質ば典型的には生物学的に活性な形態で１００〜２００　ｕ　ｇ　／ｍｌのレベルで生産される。さらに研究において、培養された哺乳動物細胞によるビタミンに依存性タンパク質の分泌は、ビタミンＫが培地から省略される場合、２０倍まで減少し、そして因子■χおよびタンパク質Ｃは、それらのプロペプチドが欠失される場合、分泌が劣ることが示された。 −緒に、これらの実験結果が示唆するように、ビタミンに依存性タンパク質はこれらのタンパク質の効率よい生産に要求され、そして細胞系が効率よくカルボキシル化することができないことは、発現のレベルを限定することがある。さらに、これらのデータが示すように、不適切にプロセシングされた（すなわち、カルボキシル化されないか、あるいはカルボキシル化されつつある）ビタミンに依存性タンパク質は効率よ（分泌されず、そして宿主細胞の中で不安定であることがある。ガンマ−カルボキシラーゼを単離しようとする従来の試みは、有泪なレベルの精製を生じてきていない、　Ｃａｎｆｉｅｌｄら（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。影μ仇ｕ−，２０２：　５１５−５２４．１９８０）は、ラントの肝臓のミクロソームの調製物の中のカルボキシラーゼ活性の１００〜１５０倍の濃縮を報告した。　Ｇｉｒａｒｄｏｔ　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ−、、２５７：　１５００Ｂ−１５０１１，１９８２）は、ラットの肝臓のミクロソームからのカルボキシラーゼ−基質の複合体の４００倍の精製を報告した。Ｖａｎ　Ｈａａｒｌｅｍら（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２４５　：２５１−２５５．１９８７）は、ウシの大動脈からカルボキシラーゼ活性について濃縮された粗製のミクロソームの分画を調製した。この調製物は、また、ビタミンにリダクターゼ活性を示した。　）ｌｕｂｂａｒｄら（Ｐｒｏｃ。Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ、　８６　：　６８９３−６８９７．１９８９）は、ウシの肝臓からの７７ｋＤａカルボキシラーゼの精製を報告した。後に、このタンパク質はＢｉＰ　（また、ＧＲＰ７Ｂとして知られている）であると決定された　（Ｆｕｒｉｅ、１９９０　Ｇｏｒｄｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ＋　Ｈｅ５ｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　；　Ｗａｌｓｈ、１９９０　Ｇｏｒｄｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ｈｅ５ｏｓｔａｓｉｓａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）＊ガンマーカルボキシラーゼの特性決定を許すこの酵素の精製された調製物が、この分野において、なお必要とされている。単離された酵素を使用して、ビタミンに依存性タンパク質のｉｎ　ｖｉｔｒｏのカルボキシル化を指令することができる。カルボキシラーゼをエンコードするＤＮＡ分子は、下等の真核生物および原核生物の中の生物学的に活性なビタミンに依存性タンパク質の生産において使用することができる。さらに、この酵素をエンコードするＤＮＡ分子は遺伝子操作の方法において使用して、培養された哺乳動物細胞系の中のビタミンに依存性タンパク質の生産を増加することができる９発明は、このような酵素の調製物およびＤＮＡ分子、ならびに酵素調製物またはＤＮＡ分子を使用するビタミンに依存性タンパク質を生産する方法を提供する。さらに、本発明は他の関係する利点を提供する。発明の要約１つの面において、本発明は、肝臓のミクロソームに比較して少なくとも２０．０００倍に濃縮されたガンマ−カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質組成物を提供する。１つの実施態様において、タンパク質はウシ、ヒトおよびラットのガンマ−カルボキシラーゼから成る群より選択される。他の実施Ｂ様において、タンパク質は肝臓のガンマ−カルボキシラーゼである。なお他の実施態様において、タンパク質組成物のガンマ−カルボキシラーゼの活性は肝臓のミクロソームに比較して１００．０００倍に濃縮されている。他の面において、タンパク質が固体の支持体に固定されている、前述のタンパク質組成物が提供される。これらの組成物は、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでビタミンに依存性タンパク質をカルボキシル化するとき有用である。なお他の実施態様において、本発明は、ウシ、ヒトおよびラットのガンマ−カルボキシラーゼを包含する、ガンマ−カルボキシラーゼをエンコードするＤＮＡ分子を提供する。１つの実施態様において、ガンマ−カルボキシラーゼは肝臓のガンマ−カルボキシラーゼである。他の実施態様において、ＤＮＡ分子はｅＤＮＡ分子である。本発明の関係する面は、ガンマ−カルボキシラーゼをエンコードするＤＮＡ配列を発現するようにトランスフェクションまたは形質転換された培養された細胞を提供する。ある種の実施態様内で、培養された細胞は真核生物の細胞、例えば、酵母菌細胞または哺乳動物細胞である。他の実施態様において、培養された細胞はビタミンに依存性タンパク質、例えば、因子ｖｒｒ　、因子ＩＸ、因子Ｘ、プロトロンビン、タンパク質Ｃ１活性化されたタンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、タンパク質Ｚ１オステオカルシン、マトリックスのｇｌａ−タンパク質または肺の界面活性剤に関連するタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列を発現するように、さらに、トランスフェクションまたは形質転換される。他の実施態様内で、ビタミンに依存性タンパク質はヒトタンパク質である。培養された細胞は、ビタミンに依存性タンパク質を生産する方法において、細胞を培養し、そしてビタミンに依存性タンパク質を単離することによって使用できる。これらの方法において、細胞は０６１〜１０μｇ／＋ｓｌのビタミンにの存在下に培養することができる。他の面において、本発明は、（ａ）ガンマ−カルボキシラーゼをエンコードする第１　ＤＮＡ配列およびビタミンに依存性タンパク質をエンコードする第２　ＤＮＡ配列をヒト以外の動物の生殖系列の中に導入し、（ｂ）動物を成長させ、そして（Ｃ）第２　ＤＮＡ配列によりエンコードされたビタミンに依存性タンパク質を動物から単離する、工程からなる、ビタミンに依存性タンパク質を生産する方法を提供する。１つの実施！ａ欅において、ビタミンに依存性タンパク質は、因子ＶＩＩ　、因子ＩＸ、因子Ｘ、プロトロンビン、タンパク質Ｃ５活性化されたタンパクｆＣ、タンパク質Ｓ、タンパク質Ｚ１オステオカルシン、マトリックスのｇｌａ−タンパク質または肺の界面活性剤に関連するタンパク質から成る群より選択される。他の実施Ｕ欅において、ビタミンに依存性タンパク質はヒトのタンパク質である。本発明の関係する面は、ガンマ−カルボキシラーゼをエンコードするクローニングされたＤＮＡ分子が導入されたヒト以外の動物を提供し、ここでＤＮＡ分子は動物の中で発現される。動物は、さらに、ビタミンに依存性タンパク質をエンコードする第２　ＤＮＡ分子が導入されており、ここで第２　ＤＮＡ分子はまた発現される。１つの実施態様において、ビタミンに依存性タンパク質は、因子ＶＩＩ　、因子ＩＸ、因子Ｘ、プロトロンビン、タンパク質Ｃ１活性化されたタンパク質Ｃ１タンパク質Ｓ、タンパク質Ｚ１オステオカルシン、マトリックスのｇｌａ−タンパク質または肺の界面活性剤に関連するタンパク質から成る群より選択される。他の実施態様において、ビタミンに依存性タンパク質はヒトのタンパク質である。本発明のこれらおよび他の面は、添付の詳細な説明および図面を参照すると、明らかとなるであろう。図面の簡単な説明第１図は、ガンマ−カルボキシラーゼの精製手順からの分画のポリアクリルアミドゲルを示す０分子量マーカー（２００，９３，６８オヨび４３ｋＤ　）が示されている。第２図は、リーダー欠失■χ−ｐＤ５の構成を例示する。使用する記号は０−１．アデノウィルス５０−１の地図単位の配列、Ｅ、ＳＶ４０エンハンサ−：ＭＬＰ、アデノウィルス２の主要な後期のプロモーター；Ｌｌ−３、アデノウィルス２の３部分リーダー；５’、５’スプライス部位；３’、３’スプライス部位；　ＦＩＸ、因子ＸのｃＤＮＡ　；およびｐＡ、　ＳＶ４０の早期のポリアデニル化シグナル。第３図は、精製したウシのガンマ−カルボキシラーゼ（レーン１〜３）の３つの試料を示す、レーン４、分子量マーカー（２０５゜１１７、１０６．８０および５０ｋＤ）　ｉレーン５、示すような分子量マーカ第４図は、ウシのガンマ−カルボキシラーゼに対する抗血清でブロービングした、精製されたウシのガンマ− カルボキシラーゼのウェスタンプロットの結果を示す０分子量マーカーの位置が示されている。第５図は、抗体の親和クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーおよびレンチルレクチンクロマトグラフィーを使用して、Ｇ３およびＤ３０から精製されたポリアクリルアミドゲルのポリアクリルアミドゲルを示す、レーン１、分子量マーカー（２００，９３゜６８、４３および２６ｋＤ）　ｉ　レーア２．　Ｄ３０（２）ミクロ’／　−４；　レ−：／３゜０３ミクロソーム；レーン４、マーカー。発明の詳細な説明本発明を記載する前に、以後使用するある種の用語を定義することは有用であろう。トランスフェクシヨン　たはＩ　；精製されたＤＮＡの導入により受容体細胞または微生物の遺伝子型を安定にかつ遺伝的に変更する方法、これは、典型的には、受容有機体の表現型の変化により検出される。用語「形質転換」は、一般に、微生物に通眉されるが、「トランスフェクション」は多細胞の有機体から誘導された細胞においてこの方法記載するために使用される。細胞の場合において、培養れた細胞は単細胞、組織または組織の一部分として有機体から単離された細胞である。前述したように、特定のグルタミン酸残基のカルボキシル化はある種のタンパク質の生物学的活性のために必要である０本発明は、ガンマ−カルボキシラーゼ活性について高度に濃縮されたタンパク質組成物、ならびにガンマ−カルボキシラーゼをエンコードするＤＮＡ分子を提供する。これらの組成物および分子はビタミンに依存性タンパク質をつくる方法において有用である。本発明の範囲内において、ガンマ−カルボキシラーゼはラットおよびウシの肝臓から、および組み換え因子ＩＸを生産する培養されたヒト細胞系から調製されたミクロソームから単離された。ガンマ−カルボキシラーゼは、また、このタンパク質を生産することが知られている他の組織または細胞から単離することができる。単離されたカルボキシラーゼはビタミンに依存性タンパク質のｆｎ　ｖｉｔｒｏのカルボキシル化において使用することができる。カルボキシラーゼは、また、それをエンコードするゲノムおよびｃＤＮ＾のクローンの単離のために有用な道具を提供する。これらのクローンを使用して、培養された真核生物または原核生物の細胞をトランスフェクションまたは形質転換して、ビタミンに依存性血液凝固タンパク質およびビタミンに依存性骨タンパク質を包含する、ビタミンに依存性タンパク質の高いレベルの生産に適当な宿主細胞を生産する。ガンマ−カルボキシラーゼの好ましい源は、肝臓のミクロソーム、例えば、舊歯類（例えば、ラットまたはマウス）、ウシまたはヒトの肝臓から調製されたミクロソームであるが、他の種の肝臓のミクロソームをまた使用することができる０種々の哺乳動物の種から誘導された宿主細胞の中の生物学的に活性な、組み換えヒトビタミンに依存性タンパク質の生産（Ｈａｇｅｎら、米国特許第４，７８４．９５０号二Ｐｏ５ｔｅｒら、米国特許第４．９５９．３１８号）が証明するように、ガンマ−カルボキシラーゼは種の系統を通じて活性であり、こうして１つの哺乳動物の種から誘導されたガンマ−カルボキシラーゼは第２の哺乳動物の種からのタンパク質のカルボキシル化において有用であろうが、シンジェネイックカルボキシラーゼは好ましいことがある。Ａ　他の適当な源は、活性なビタミンに依存性タンパク質タンパク質を生産することができることが知られている細胞系、例えば、形質転換されたヒト腎細胞２９３細胞系（ＡＴＣＣから受け入れ番号ＣＲＬ１５７３で入手可能である）を包含する。当業者は理解されるように、原理的には、はとんど任意の組織または細胞の型はガンマ−カルボキシラーゼの候補の源である。ガンマ−カルボキシラーゼ活性は検査したほとんどの組織において検出されてきており、そしてカルボキシラーゼ活性は、候補の組織または細胞において、ここに記載するように、カルボキシル化反応において放射線標識されたＣＯｔをタンパク質の中に組み込むその組織または細胞系の能力を測定することによって、検出することができる。典型的には、ミクロソームを１〜２ｇの組織から調製し、そしてカルボキシル化反応においてＮａｐ”Ｇｏｓとインキエベーシッンする。この反応はビタミンにのハイドロキノンの存在または不存在下で実施し、そして反応生成物をゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより分析する。ビタミンＫを含む反応に対して特異的な１または２以上の標識したタンパク質の存たは組織から調製する。１つの適当な方法は、Ｓｗａｎｓｏｎおよび５ｕｔｔｉｅ（…匹画紅■■、　２１　：　６０１１−６０１８．１９８２）　、その開示をここに引用によって加える、に記載されている方法である。簡単に述べると、細胞または組織をスクロースおよびプロテアーゼ阻害因子を含有するわずかに酸性ないしわずかに塩基性の緩衝液の中で均質化する。ミクロソームは超遠心によりこの調製物から収穫する。ミクロソームの調製は、また、Ｒｅｎｎｅｌｓ　ら（前掲）および５ｏｕｔｅら（Ｔｈｒｏｍｂ。Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、　５７　：　７７−８１．１９８７）に開示されている。次いで、タンパク質の調製物をミクロソームから調製する。適当な抽出物は、膜を組織ホモジナイザーの中で摩砕し、洗浄剤の中で可溶化し、不溶性膜物質を除去し、そして溶液の（Ｎｌ！、）、５０４濃度を飽和の約６０％に１１節することによって調製することができる。沈澱したタンパク質を遠心により回収する。本発明の範囲内で、いくつかの異なる方法を使用して、ミクロソームの抽出物を分画し、そしてガンマ−カルボキシラーゼを精製した。これらの方法のあるものは、ビタミンに依存性タンパク質、例えば、因子ＩＸ、プロトロンビンまたはタンパク質Ｃに結合するガンマ−カルボキシラーゼの能力を利用する。好ましい実施態様において、ビタミンに依存性タンパク質のプロペプチドの親和クロマトグラフィーにより、ビタミンに処置した動物からのミクロソームの抽出物から、ガンマ−カルボキシラーゼを用して、ガンマ−カルボキシラーゼを同定する。ビタミンに依存性タンパク質のプロペプチドは、既知のアミノ酸配列のデータに基づいて合成することができる０例えば、次の開示を参照のこと：　Ｋｕｒａｃｉに、プロペプチドを適当な固体の支持体、例えば、誘導化されたアガロースゲル（例えば、臭化シアン活性化されたアガロースゲルまたは活性化されたチオールアガロースゲル）に共有結合する。好ましいこのような支持体は、活性化されたチオールセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂ”　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　；ニージャーシイ州ピスカタエイ、は一般に供給者により提供される。活性化されたチオールの支持体を使用するとき、カップリングされたプロペプチドおよびガンマ−カルボキシラーゼは還元剤、例えば、ジチオスレイトールで溶離する。別法において、完全なプロペプチド（例えば、前因子ＩＸまたは前プロトロンビン）を支持体に取り付け、そして結合したガンマ−カルボキシラーゼをビタミンに依存性タンパク質の単離されたプロペプチドを使用して溶離する。クロマトグラフィーはバッチ処理において、あるいはカラム上で実施することができる。典型的には、この工程はガンマ−カルボキシラーゼ活性の約５００倍の濃縮を提供する。別の実施ＪＩｌ様は抗体の親和クロマトグラフィーを利用する。ビタミンに依存性タンパク質に対する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を固体の支持体（例えば、活性化されたチオールセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）またはＣＮＢｒ活性化セファローズ（Ｓｅｐｂａｒｏｓｅ）　）にカップリングさせる。ビタミンに依存性タンパク質に対して抗体は、例えば、若株らＵ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ　、　謁：　１１０９７−１１１０５．１９８６）、　Ｋａｕｆｍａｎら（前掲）およびＢｕｃｂｙら（Ｎａｔｕｒｅ、　■：　２７１−２７３．１９８５）に開示されている。１つの実施！！欅において、前述の方法に類似する方法でワルファリン処置した動物から調製された、ミクロソーム抽出物を、固定化された抗体に適用するやガンマ−カルボキシラーゼを抗体から、ビタミンに依存性タンパク質の性質を使用するか、あるいはカルボキシル化反応混合物の中で抗体 −酵素複合体をインキユベーシヨンすることによってＲＩＡする。別法において、カルシウム依存性抗体を使用し、そしてカルシウム濃度を変更することによってガンマ−カルボキシラーゼを溶離する。ガンマ−カルボキシラーゼを含有する溶離液を回収する。抗体の親和クロマトグラフィーを、また、使用してガンマ−カルボキシラーゼを同定する。培養された細胞をトランスフェクションして、そのプロペプチドを欠如するビタミンに依存性タンパク質を発現させる。これらの細胞の抽出物を固定化された抗体に暴露する。結合したタンパク質を溶離し、そして電気泳動にかける。タンパク質のパターンを、対応する自然ビタミンに依存性タンパク質（すなわち、プロペプチドを含む）を発現するようにトランスフェクションされた細胞からつくった平行の調製物と比較する。ガンマ−カルボキシラーゼは、自然タンパク質を発現する細胞からの調製物の中に特異的に見いだされる。それ以上の精製は、イオン交換クロマトグラフィーおよび／またはレクチン親和クロマトグラフィーを使用して達成される。イオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換またはカチオン交換の媒質を使用して実施することができる。ウシのガンマ−カルボキシラーゼはカチオン交換媒質に結合するこが発見されたが、ヒトおよびラットのガンマ−カルボキシラーゼはアニオン交換媒質に結合することが発見された。適当なアニオン交換媒質は、誘導化された、架橋したアガロースまたはデキストラン、例えば、ＤＥＡＢおよびＱＡＥ誘導体を包含する。とくに好ましいアニオン交換媒質は、ＤＥＡＥセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　ＣＬ−６Ｂ”またはＱ−セファローズ　（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ”）（Ｐｈａｒ＋ｍａｃｉａから入手可能である）を包含する。適当なカチオン交換媒質は、カルボキシメチルおよびスルホプロピル誘導化樹脂を包含する。適当なレクチンはマンノース特異的レクチンを包含し、レンチルレクチンはとくに好ましい、追加の精製は、他の特異性をもつレクチンを使用して、汚染する糖タンパク質を除去することによって実施することができる。レクチンは普通の方法（例えば、ＣＮＢｒ活性化）に従い支持体のマトリックスにカップリングするか、あるいはレクチンのマトリックスは商業的供給業者から入手することができる。典型的なアニオン交換クロマトグラフィーの工程において、部分的に精製されたカルボキシラーゼ調製物を、リン脂質および非イオン性洗浄剤を含有する、中性ないしわずかに塩基性の緩衝液の中で透析する。好ましい緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌのホスファチジルコリンＶＥ型、５０μｇ／園ｌのホスファチジルセリン、５０μｇ／ｍｌのホスファチジルエタノールアミンおよび０．１％の３−（（３− クロロアミドプロピル）ジメチルアンモニオクー１−プロパンスルホネー）　［ＣＨＡＰＳ）を含有する、２０ｍＭのトリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）　ｐＨ８，５または２０＋ｓＭのビス−トリス（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）　ｐＨ６，８を包含する。次いで、透析した溶液をアニオン交換媒質と一緒にし、約１６時間インキエベーシジンし、そして塩（例えば、０．２Ｍ　〜１．ＯＭのＮａＣ１）、好ましくは約０．５Ｍの）ＪａＣＩを含有する同一緩衝液で溶離する。カルボキシラーゼを含有する溶離液を回収する。ガンマ−カルボキシラーゼはコア糖タンパク質を含有し、それがマンノース特異的レクチンに結合できるようにすることが本発明者により発見された。しかしながら、ガンマ−カルボキシラーゼはより複雑な炭水化物の付加を欠如する。これらの観察に基づいて、異なる特異性のレクチンをガンマ−カルボキシラーゼの精製において使用することができる。レクチン親和クロマトグラフィーは、典型的には、リン酸塩緩衝液の中で洗浄した、誘導化されたアガロース支持体に結合したレンチルレクチンを使用して実施する。部分的に精製されたカルボキシラーゼ調製物（例えば、プロペプチドの親和クロマトグラフィーまたはプロペプチドの活性および引き続くアニオン交換クロマトグラフィーにより精製された）を、洗浄したレクチン樹脂と一緒にする。この混合物を少なくとも約１６時間インキュベーションさせることが好ましい０次いで樹脂を洗浄して結合しない物質を除去し、そして結合したカルボキシラーゼを適当な糖、例えば、マンノースまたはα −メチルマンノシドで溶離する。この点における濃縮の典型的なレベルは、初期のミクロソーム調製物の約２０、０００　ｘである。：ａ縮のレベルは、第２レクチンを使用して汚染する糖タンパク質を除去することによって、約ｉｏｏ、ｏｏｏに増加することができる。好ましいレクチンは、次のものを包含する：５Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕ　１ｎｏｓａ　ＰＡ−ルクチンおよびリムルス、ヱー去にＬム２ヨ（Ｌｉｓ＋ｕｌｕｓ匹旦妨憇旦）レクチンを包含し、これらはガンマ−カルボキシラーゼに結合しない、これらおよび他のレクチンは商業的供給業者（例えば、Ｓｉｇ−ａ　Ｃｈｅｓ＋１ｃａｌ　Ｃｏ、、ミゾリー州セントルイス）から入手可能である。レクチンは、一般に前述したような普通の化学的方法を使用して固体の支持体に結合される。部分的に精製されたガンマ−カルボキシラーゼの調製物のカチオン交換クロマトグラフィーは、リン脂質および非イオン性洗浄剤を含有する、中性ないしわずかに酸性の緩衝液を使用して実施する。別の精製のプロトコルは、順次に、プロペプチドまたは抗体の親和クロマトグラフィー、レクチン親和クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを使用する。精製を通じて、冷い（例えば、４℃）ガンマ−カルボキシラーゼを包含するすべての操作をに１の洗浄剤／リン脂質の比で実施することが好ましい。ガンマ−カルボキシラーゼの精製は、下にいっそう詳細に記載するカルボキシル化アッセイを使用して細胞の生物学的活性を測定することによってモニターする。タンパク質の試料を非変性のポリアクリルアミドゲルでホスファチジルコリンおよびＣＨＡＰＳの存在下に電気泳動にかけ、そしてタンパク質のバンドをゲルから切断し、そしてカルボキシル化アッセイにおいて活性について試験する。試料の合計のタンパク質の濃度を、日常の手順、例えば、ビシコニン酸（例えば、ＢＣＡ”タンパク質アッセイ試薬、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、イリノイ州ロックフォードから入手可能である）を利用する方法に従うか、あるいはゲルの走査によりモニターする。前述の方法を使用して、プロトロンビンのプロペプチドに特異的に結合するタンパク質を同定した０本発明の１つの面の範囲内で、レンチルレクチンの親和クロマトグラフィーのそれ以上の精製を使用して、約９０〜１５０ｋＤａの分子量を有するタンパク質を変性性ゲル上で同定した。ガンマ−カルボキシラーゼをこれらの候補のタンパク質から、例えば、アミノ酸配列の分析により同定する。ピコモル量のタンパク質を、本質的にＡｅｂｅｒｓｏｌｄら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。婁迫、　８４　：　６９７０−６９７４．１９８７）（その開示をここに引用によって加える）に記載されているように配列決定する。ペプチドの断片をタンパク質の電気泳動により発生させ、そしてニトロセルロースに移し、次いでタンパク質分解の消化により発生させる。生ずる酵素の切断断片をｎｐｔｃにより分離し、そして自動化気相配列決定装置で配列決定する。アミノ酸配列を既知の、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ”データーベース（ｌＪ、ｓ、　Ｄａｐａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅ）またはタンパク質配列のデーターベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ）の中に含有されている配列を比較する。別法において、ガンマ−カルボキシラーゼは、候補のタンパク質のアミノ酸配列に相当するペプチドを調製し、ペプチドに対する抗体を調製し、そして抗体を使用して生物学的活性の免疫沈澱によりガンマ−カルボキシラーゼを同定することによって同定される。前述したように精製されたガンマ−カルボキシラーゼを使用して、普通の手順に従い、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を発生させることができる。これらの抗体は、タンパク質の大規模の親和精製に有用である。次いで、単離されたタンパク質から得られる情報を使用して、ガンマ−カルボキシラーゼをエンコードするＤＮＡ分子をクローニングする。標準クローニング法を使用する。大部分の組織はガンマ−カルボキシラーゼを生産すると信じられるが、クローニングのためには、実質的な量のビタミンに依存性タンパク質を生産することが知られているか、あるいはガンマ−カルボキシラーゼを含有することが知られている組織、例えば、肝臓、腎臓、精巣、心臓、骨または肺から誘導されたライブラリーを使用することが好ましい、肝臓の組織はとくに好ましい源である。例えば、ガンマ−カルボキシラーゼをエンコードするＤＮＡ分子は、タンパク質のアミノ酸配列から設計されたオリゴヌクレオチドのプローブを使用して単離することができる。低いレベルの同義性を有するアミノ酸配列を使用することが好ましい、既知の手順に従い、これらのプローブを使用して、ゲノムまたはｃＤＮＡのライブラリーをスクリーニングする。一般に、ｃＤＮＡライブラリーを使用することが好ましい。別法において、アミノ酸配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドのプライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応のクローニング法において使用する（Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３．１９５号およびＭｕｌｌｉｓら、米国特許第４．６８３，２０２号、それらの開示をここに引用によって加える、に開示されている）。プライマーは、一般に、断片の引き続くクローニングを促進するために５′末端に制限部位および予測するＤＮＡ配列に相当する、約１４〜３０、好ましくは約１８〜２０ヌクレオチドを含んでなる。高度に同義性をもつ配列のために、より短いプライマー（例えば、ＤＮＡ配列に相当する約１４ヌクレオチドからなるもの）は好ましい、プライマーの合成は、４倍の同義性の位置におけるイノシンを置換することによって簡素化される。高い同義性のプライマーを使用して作業するとき、初期のＰＣ！？反応は一般に低いストリンジエンシー（低いアニーリング温度）で実施されるであろう、この場合において、ＰＣＲ手順をわずかに高いストリンジエンシーで反復してバックグラウンド（非特異的配列）を減少することは有利である。ＰＣＲの反応生成物はゲル電気泳動により分離し、そして問題の断片について予測された大きさのバンドを配列決定してそれらの同一性を確証する。　ＰＣＲで発生したクローンをプローブとして使用して、ｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリーをスクリーニングするか、あるいはＦｒｏｈｍａｎ　ら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５　：　８９９Ｂ −９００２，１９８８）のＰＡＧＥ（ｃＤＮＡ末端のゑ、速増幅）手順により長いクローンを発生させる。ＰＡＣＥは、ＰＣＲで発生したプライマー、ＰＣＲで発生したプライマーと、混合したオリゴヌクレオチドのプライマーまたはオリゴ（ｄＴ）との組み合わせ、あるいはヌクレオチドのレベルで低い同義性を有するアミノ酸配列から設計された混合したオリゴヌクレオチドのプライマーとの組み合わせを使用して実施することができる。ＰＣＲ法は、次の文献に開示されている：　（ｎｎｆｓら編、ＰＣＲのプロトコル：　法および・へのガイド　ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｆｊｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ知旦ｄ　、　Ａｃａｄｅ＋ｉｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、、サンディエゴ、１９９０゜５ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９゜第３の別法において、精製されたガンマ −カルボキシラーゼまたはガンマ−カルボキシラーゼの断片に対してレイズされた抗体を使用して、発現のライブラリー、例えば、λｇｌＩ　ベクター（ＡＴＣＣ３７１９４）の中で調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。クローニングした配列の同一性は、発現のクローニング系、例えば、ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｔ、　ＵＳＡ＋　８０　：　１１９４−１１９８、１９８３）の７ｇｌｌ系において確証することができる。標準の免疫化のプロトコルを使用して、抗体（好ましくはモノクローナル抗体）をガンマ−カルボキシラーゼの配列から合成されたペプチドに対して調製する。これらの抗体を使用して発現ライブラリーをスクリーニングする。リンパ球および永久分裂能を付与した細胞を融合し、そして生ずるハイブリドーマからモノクローナル抗体を発生する方法は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ　（Ｎａｔｕｒｅ、　２５６　：　４９５−４９７．１９７５　；Ｅｕｒ、　Ｊ、　ｆｍｕｎｏｌ、　、　６　：　５１１−５１９．１９７６）により開示されている。あるいは、抗体を使用してより多い量のカルボキシラーゼを精製し、そして精製されたタンパク質を使用してポリクローナル抗血清を発生し、引き続いてこれを使用してライブラリーをスクリーニングする。本発明は、原核生物（例えば、バクテリア）、下等真核生物（例えば、菌類）およびより高い真核生物（例えば、哺乳動物）の細胞を包含する、広範な種類の培養した宿主細胞の中でビタミンに依存性タンパク質の生産を可能とする。これらの細胞の型を形質転換またはトランスフェクションして外因性ＤＮＡ配列を発現する方法はこの分野において知られており、そして、例えば、次の文献に開示されている：叛意ら（米国特許第４，７０４．３６２号）　、Ｇｏｅｄｄｅｌ　ら（米国特許第４．７６６．０７５号）　、Ｈｉｎｎｅｎら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ。７５４　：　１９２９−１９３３．１９７８）　、ＭｕｒｒａＶら（米国特許第４．８０１，５４２号）、Ｕｐｓｈａｌｌ　ら（米国特許第４．９３５．３４９号）　、Ｈａｇｅｎら（米国特許第４．７８４．９５０号）およびＡｘｏｌら（米国特許第４，３９９．２１６号）、これらの開示をここに引用によって加える。ガンマ−カルボキシラーゼをエンコードするＤＮＡ分子を、培養された細胞の中で発現させて、ガンマ−カルボキシレートのタンパク質の能力を提供または増大する。こうして、クローニングされたガンマ−カルボキシラーゼの配列を発現する細胞は、因子ＶＩＩ　、因子ＩＸ、因子Ｘ、プロトロンビン、タンパク質Ｃ１活性化されたタンパク質Ｃ１タンパク質Ｓ１タンパク質Ｚ、オステオカルシン、マトリックスのｇｌａ−タンパク質または肺の界面活性剤ならびにタンパク質を包含する、ビタミンに依存性タンパク質をつ（るとき、とくに有用である。血漿のビタミンに依存性タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列およびこれらのＤＮＡ配列の発現は１．二の分野において知られている。例えば、次の文献の開示を参照のこと：Ｋｕｒａｃｈｉ　ら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。Ａｃ　ｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ、　７９　：　６４６１−６４６４．１９８２）　、Ｆｏｓｔｅｒら（欧州特許公開ＥＰ第２６６、１９０号：米国特許第４．９５９．３１８号）　、Ｂａｎｇら（米国特許第４，７７５．６２４号）　、ｌｌａｇｅｎら（前掲）　、Ｄｓｇａｎら（Ｂｉｏｅｈｅｍｉｓｔｒ　。 ’１４　：　２０Ｂ？−２０９７，１９８３）　、　Ｌｅｙｔｕｓら（Ｂｉｏｅｈｅｍｉｓ±ｇ、　皿：　５０９８−５１０２、１９８６）およびＨｙｄｒｏら（欧州特許公開ＥＰ第２５５，７７１号）、これらの開示をここに引用によって加える。ラットのマトリックスのｇｌａ−タンパク質をエンコードするｃＤＮＡは、Ｐｒ１ｃｅら（Ｐｒｏｅ　Ｎａｔｌ。匙−回、　Ｓｃｉ、　［ＩＳＡ、　８４　：　８．’３３５−８３３９．１９８７）（この開示をここに引用によって加える）に開示されている。ラントの骨のｇｌａ−タンパク質をエンコードするｃＤＮＡは、Ｐａｎおよびｐｒｉｃｅ　（Ｐｒｏｅ、　Ｎ　ｔｌ、　Ａｃａｄ。録厄」錘、録：　６１０９−６１１３．１９８５）（この開示を、：こに引用によって加える）に開示されている。本発明の範囲内で、細胞をトランスフェクションまたは形質転換して、ガンマ− カルボキシラーゼをエンコードするＤＮＡ配列およびビタミンに依存性タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列を発現させる。　ＤＮＡ配列を宿主細胞の別々の発現ベクター上に、あるいは同一の発現ベクター上に導入する。次いで、導入された配列を発現する細胞を選択する。選択を促進するために、１または２以上の選択可能なマーカーを１または２以上の発現ベクター上に準備する。まずクローニングしたガンマ−カルボキシラーゼ配列を発現する細胞を獲得し、次いでこれらの細胞をトランスフェクションまたは形質転換してビタミンに依存性タンパク質を発現させることが好ましい。トランスフェクションおよび形質転換において使用する発現ベクターは、発現すべきＤＮＡ配列が転写プロモーターおよびターミネータ−配列に操作的に連鎖された、発現ユニットを包含する０発現ベクターは、さらに、要素、例えば、エンハンサ−、ポリアデニル化シグナル、スプライス部位、選択可能なマーカー、および複製の１または２以上の複製起点を含むことができる。これらの要素の選択および発現ベクターの構成は、通常の技術水準の範囲内である。宿主細胞の好ましい群は、培養された哺乳動物細胞、例えば、２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ　６１）、　ＢＨに（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６３２およびＣＲＬ　１０３１４）およびＣＨＯ（ＡＴＣＣＣＣＬ　６１）の細胞系である。好ましい実施態様の範囲内で、ガンマ−カルボキシラーゼのための発現ユニットおよび選択可能なマーカー、例えば、ネオマイシンおよびヒグロマイシンの耐性を含有するベクターで、培養された哺乳動物細胞系をトランスフェクシヨンする。選択可能なマーカーは、また、別のベクター上に設けることができる。トランスフェクション体を抗生物質の耐性に基づいて選択する。次いで、耐性細胞を、ガンマ−カルボキシラーゼの生産の増加について、例えば、トランスフェクションされたおよびトランスフェクションされない細胞の抽出物を測定することによってスクリーニングする。ガンマ−カルボキシラーゼを生産する細胞を、ビタミンに依存性タンパク質のための発現ユニットおよび第２の選択可能なマーカーを含有する第２の発現ベクターでトランスフェクションする。第２の選択可能なマーカーは、増幅可能なマーカー、例えば、ジヒドロフオレートリダクターゼをエンコードする遺伝子であることが好ましい、増幅可能な選択可能なマーカーの使用は外因性ＤＮＡの増幅を可能とし、ビタミンに依存性タンパク質の発現の増大に導く０分泌されたビタミンに依存性タンパク質、例えば、凝固タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列は、一般に、分泌シグナルを包含する。細胞内のタンパク質、例えば、骨およびマトリックスのｇｌａ−タンパク質について、分泌シグナル配列を省略することができる。別の実施Ｈ様において、ガンマ−カルボキシラーゼおよびビタミンに依存性タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列を、同一発現ベクター上に単一のプロモーターのコントロール下に配室して、多シストロン性メツセンジャーを生産する。］・ラランスフエフシラされた細胞を選択可能なマーカーに基づいて選択し、そして前述したように、あるいはｇｌａ−依存性抗体を使用してガンマーカルボギシラーゼタンパク質の量を測定する（若株ら、前掲）ことによって、ガンマ−カルボキシラーゼ活性についてスクリーニングする。培養されだ哺乳動物細胞の中で使用するために好ましいプロモーターは、次のものを包含する：　ＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ影且ｒ、、　１　：　８５４−８６４．１９８１）、アデノウィルス２の主要な後期のプロモーター（Ｋａｕｆｓａｎおよび５ｈａｒｐ、　Ｍｏ１．　Ｃｅｌ　Ｂｉｏｌ、＋　２　：　１３０４４３１９゜１９８２）およびマウスのメタロチオネイン−ｒ遺伝子のプロモーター（ＰａＪｍｉｔｓｒら、米国特許第４，５７９，８２１号）。種々の原核生物及び真核生物の宿主細胞を培養するための借地はこの分野において知られている。これらの借地は、一般に、炭素源、窒素源、ビタミン類（ビタミンＫを包含する）およびミネラル、ならびに成長因子および特定の宿主細胞が必要とする他の栄養を含有するであろう、多くの場合において、借地は、さらに、１または２以上の外因性ＤＮＡ配列の安定性を保証するために選択的因子を含有するであろう。培養された哺乳動物細胞の場合において、要求される成長因子および他の栄養の多くは、血清、例えば、胎児ウシ血清として提供されるが、種々の血清不含信地の配合物はこの分野において知られている。好ましい実施態様の範囲内で、ガンマ−カルボキシラーゼをエンコードするＤＮＡ配列を発現するようにトランスフェクションされた培養された哺乳動物細胞を、０．１〜１０μ ｇ／ｍｌのビタミンＫ、好ましくは約５μｇ／■ｌのビタミンＫを含有する培地の中で培養する。ガンマ−カルボキシラーゼは、また、ヒト以外のトランスジェニック動物、とくにトランスジェニック温血動物において発現させることができる。マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびブタを包含する、トランスジェニック動物を生産する方法はこの分野において知られており、そして、例えば、次の文献に開示されている：３４３−３４５．１９８５）および米国特許第４，７３６．８６６号、これらの開示をここに引用によって加える。簡単に述べると、発現すべきＤＮＡ配列ならびに適当に位置する発現コントロール配列を包含する、発現ユニットを、受精卵の前核の中に導入する。　ＤＮＡの導入はマイクロインジェクションにより普通に実施する。注入されたＤＮＡの組み込みは、組織の試料、典型的にはテイルの組織の試料からＤＮＡのプロット分析により検出される。導入されたＩＩＮＡを動物の生殖系列の中に組み込み、こうしてそれが動物の子孫に伝わるようにすることが好ましい、ガンマ−カルボキシラーゼおよびビタミンに依存性タンパク質の系統的発現は一般に好ましいが、宿主動物に対してｔｅ　ｔＫを示すタンパク質は調節されたおよび／または組織特異的方法で最もよく発現される。組織特異的発現は組織特異的プロモーター、例えば、インスリン遺伝子のプロモーターを使用して達成される。誘発可能なプロモーター、例えば、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター（Ｐａｌｍｔｔｅｒら、１９８３、前掲）の使用は、トランス遺伝子（ｔａｎｓｇｅｎｅ　）の調節された発現を可能とする。このようにして、動物はガンマ−カルボキシラーゼおよびビタミンに依存性タンパク質についてトランスジェニックとされる。動物を成長させ、そしてビタミンに依存性タンパク質を動物の細胞または体液（ｇ４えば、乳、血液または尿）から単離する。前述したように精製するか、あるいは遺伝子操作法（例えば、細胞の培養またはトランスジェニック動物）により調製されたガンマ−カルボキシラーゼは、また、ｉｎ　ｖｉｔｒｏＯカルボキシル化系において有用である。１つのこのような系は、Ｖｅｒ■ｅｅｒら（国際特許出願公開第Ｗ０８？１０４７１９号）により開示されている。Ｎ単に述べると、精製された酵素を固体の支持体（例えば、誘導化されたデキストランまたはアガロースのビーズ）に固定し、そしてカルボキシル化されないか、あるいはカルボキシル化されつつあるビタミンに依存性タンパク質は支持体の上を通る。この反応はビタミンにのハイドロキノンの存在下に実施する。このような系は原核生物または下等の真核生物の細胞の中で生産されるビタミンに依存性タンパク質の活性化にとくに有用である。タンパク質がプロペプチドを欠如する場合、外因性プロペプチドを反応混合物に添加してカルボキシル化を誘導する（　Ｋｎｏｂｌｏｃｈおよび５ｕｔｔｉｅ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、＋　２６２　：　１９８７）　ｅフ。ロベブチドを含有するタンパク質を、カルボキシル化後、タンパク質分解に処理してプロペプチドを除去する。次の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を限定しない。実施例ビタミンにはシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、ミゾリー州セントルイス）から入手し、そして５ａｄｏ＠ｓｋｉら（Ｊ、　Ｂｆｏｌ、　Ｃｈｅ−、、２５１：　２７７０−２７７６、１９７６）の方法により還元した。ＰＳＮ抗生物質の混合物はギブコ（ＧＩＢＣＯ）ＢＲＬライフ・テクノロジー・インコーボレーテシド（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｆｅｓ、　Ｉｎｃ、＞　（マリイランド州ガイサーバーク）から入手した。リン脂質およびレクチンはシグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手した。ガンマ−カルボキシラーゼは、放射線標識したＣ（ｈを合成ペプチドの基質ＮＢｏｃ−Ｌ−ｇｌｕ−Ｌ−ｇｌｕ−Ｌ−］、］ｅｕ−メチルエステルＥＥＬ）　（ＢａｃｈｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ペンシルベニア州フイラフヱルフイア、から入手した）の中への組み込みを、本質的にＶｅｒｍｅｅｒ（前掲）の方法を使用して、測定することによってアッセイした９反応混合物は、９５０μｌの３．８Ｍの（ＮＨ４）ｚＳＯ４，１５０μＩの１％のＣＨＡＰＳ、　１５０μｌの１０ｍｇ／■ＩのホスファチジルコリンＩＩＩ型、１％のＮａコレート、７５μＩの０．２Ｍのジチオスレイトール、７５０μｌの１ｍＭのＥＥＬおよび１５０μ ｌのＮａＨ”　ＣＯｓ　（５０ｍＣｉ　／　ｍ５ｏ１）を含有した。この混合物の１２８ａｌを１００μｍの被験試料＋５μｇ／ｍｌのビタミンにハイドロキノンと組み合わせた。対照反応はビタミンＫを欠如した。この反応は暗所で室温において１時間進行させた０反応を１曽ｌの１０％のトリクロロ酢酸の添加により停止させ、氷上に３０分間配置し、そして４℃において１５分間遠心した。生ずる上澄み液の１■ｌを５分間沸騰させ、そして１０１１Ｉのシンチラント（ＢｉｏＳａｆｅ　ＩＬ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｒｐ、　、イリノイ州プロスペクト、から入手した）と−緒にし、そして計数した。標識の組み込みをビタミンＫを欠如する対照の反応と比較した。２９３　ｍ胞を次のようにして代謝的に標識した。２９３の細胞を１２５１ｍ１１のプレートの中に１０％のコンフルエンシーに接種し、そして１％のＧ４１８＋　１％のＰＳＩＩＩ　（ＧＩＢＣＯＢＲＬ、マリイランド州ガイサーバーグ）＋１０％の透析した胎児ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｒｉｅｓ、　Ｉｎｃｏ、ユタ州ロウガン）を補充したダルベツコ変更イーグル培地（ＨａｚｅｔｌｔｏｎＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、　Ｌｅｘａｎａ、　ＫＡ）の中に２日間６０〜７０％のコンフルエンシーに成長させた。培地を２９３の細胞培養物の１＆ｌｌから吸引により取り出し、そして細胞を３７°Ｃに前取て加温したＰＢＳ　（Ｓｉｇｍａ、ミゾリー州セントルイス〕で洗浄した。ＰＢＳを除去し、そして２０ｕＣｉ／ｌａｒのＮｅｇ−０７２Ｅｘｐｒｅ′ｓＳ”Ｓ　（ｓＳＳ）タンパク質標識混合物（ＮＥＮ　Ｒｅ５ｅａｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ、プラウエア州つィルミントン）を含有する２５１の前取て加温したパルス培地（１００■ｌのダルベツコ変更イーグル培地−ｃｙｓ／−ａｂｅｔ（Ｈａｚｅｌｔｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ）　ｒ　１■ｌの１００５Ｍのピルビン酸ナトリウム［Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　％カリフォルニア州すンタアナ］、Ｌｍｌの２０（］＋ｇＭのＬ−グルタミン（Ｈａｚｅｌｔｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、１■ｌの１００ＸＰＳＮ。１０ｍ１の透析した胎児ウシ血清）を各プレートに添加した。細胞を３７°Ｃにおいてインキュベーションし、そして培地を２日間１０〜１２時間毎に交換した。第１組の培養物を処理した後第１日に、残りの二重反復実験の培養物を前述したように標識し、そして１日間１０−１２時間毎に培地を毎にして３７℃において成長させた。標識した後、各培養物からの培地を取り出し、そして氷上に貯蔵する。プレートを２．５■ｌの１×ベルセン（Ｖｅｒｓｅｎｅ）（ＧＩＢＣＯＢＦＩＬ）で洗浄し、そしてベルセンの洗浄液を使用済みの培地と一緒にした。ベルセンの洗浄後、追加の２．５−１の１×ベルセンを各プレートに添加し、そしてプレートを室温において１０〜１５分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を収穫し、そして使用済みの培地に添加した。実施■上ヒトプロトロンビンのプロペプチドに相当するペプチドおよびヒ）　ＧＭ−ＣＳＦ受容体の一部分（表１）を、アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４３１Ａ型ペプチド合成装置（ＡＰｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＋　Ｉｎｃ、、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用して合成した。、表」− プロープロトロンビン（配列ｔｏ　Ｎｏ、１）ＣＧＧＨＶＦＬＡＰＱＱＡＲＳＬＬＱＲＶＲＲＣ３Ｆ　（配列■ｏ　Ｎｏ、２）ＣＧＧＫＤＫＬＮＤＮＨＥＶＥＤＥＹ３８−ｇのブロープロトロンビン（ｐｒｏ−ＰＴ）ペプチド（配列１０　Ｎｏ、１）または４４ｍｇのＣＳＦペプチド（配列１０　Ｎｏ、２）を、それぞれ、７ ■ｌまたは６■ｌの０．１Ｍの酢酸アンモニウムｐｆ１４．５中に溶解した。溶液の各々を、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）および０．１Ｍの酢酸アンモニウムｐＨ４，５の中で順次に洗浄した１０ｍ１　（約２．５ｇ）の活性化チオールセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂ”　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　＝ｓ−ジャーシイ州ピスカタエイ）と−緒にした。混合物を室温においてロッカー上に一夜配置した０次いで、混合物を焼結ガラスの漏斗で濾過し、そして溶離液をカップリング効率の決定のために取って置（（Ｗａｒｅら、Ｊ、　Ｒｉｏｔ。Ｃｈｅｗ、、　２Ｅ組：　１１４０１−１１４０６．１９８９）樹脂の各々を２５０ｍ１の０．１Ｍの酢酸アンモニウムｐＨ４，５ですすいだ、すすいだ樹脂を、４ｍＭのβ−メルカフトエタノールを含有する１０ｍ１の０．１Ｍの酢酸アンモニウムｐＨ４，５と一緒にし、室温において２０分間揺り動かし、そして再び濾過した６次いで樹脂を２５０１１の０．１Ｍの酢酸アンモニウムｐＨ４，５ですすぎ、次いで２００■ｌのＰＢＳですすぎ、そして使用するまで４℃において貯蔵した。使用直前に、樹脂を濾過により回収した。ラットの肝臓ミクロソームを、本質的にＳｗａｎｓｏｎおよび５ｕｔｔｉｅ（前掲）に記載されているように調製しくほぼ８００＋＋＋ｇ）　、０．２５Ｍのスクロース、０．５ＭのＭＣＩ、　０．２％のトリトンＸ−１００を含有する４０ ■ｌの０．２５ＭのイミダゾールｐＨ７，２の中に懸濁させた。膜を組織のホモジナイザー（Ｄｕｒａ　Ｇｒｉｎｄ　５ｔａｉｎｌｅｓｓ　５ｔｅｅｌ　Ｄｏｕｎｃｅ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｇｒｉｎｄｅｒ。１１ｈｅａｔｏｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニュージャーシイ州ミリビレ）の８ストローりで摩砕し、そしてこの溶液を氷上に３０分間配置した。冷却した溶液をｉｓｏ、ｏｏｏｘ　ｇで４℃において１時間遠心し、そして上澄み液を回収した。上澄み液（４０ｍｌの体積）に、６０ｍ　ｌの飽和（ＮＨ４）ア３０４をほぼ３０分かけて添加し、そしてこの混合物を４℃においてさらに２０分間撹拌した。この溶液を１２，０ＯＯＸ　ｇで４℃において２０分間遠心したゆ（Ｎｏ４）ｉｓｏ４の沈澱物を４■Ｉの緩衝液Ａ　（１ｍｇ／ａｉ１のホスファチジルコリンＶＨ型、５０μｇ／ｍｌのホスファチジルセリン、５０μＨ／ｍｌのホスファチジルエタノールアミン、０．１％の１−（（３−クロロアミドプロピル）ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホネーＦ・（ＣＨＡＰＳ）　、　０．１５ＭのＮａＣ１，１５％のグリセロールを含有する？Ｏｄのリン酸ナトリウムｐ）１７．４）に約１５ａ＋１の最終体積に再懸濁させた。生ずる溶液を４℃において０．５リツトルの緩衝液Ａに対して５時間透析し、次いで緩衝液を０．５リットルの新鮮な緩衝液Ａで置換し、そして透析を４°Ｃにおいて一夜続けた。透析物の最終の体積はほぼ２０ｍ　ｌであった。透析したミクロソームの抽出物を２０置１の前原て洗浄した活性化されたチオールセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂと一緒にし、そしてこの混合物を４℃において３．５時間揺り動かした０次いで、この混合物をカラムの中に注ぎ、そして溶離液を回収した。このカラムを追加の緩衝液Ａで、溶離液の粘度の減少により決定してタンパク質の大部分が溶離されるまで、溶離した。溶離液の分画を一緒にしく合計の体積−３ｋｌ）、この調製物の２／３を１０１のｐｒｏ −ＰＴセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）と−緒にした。ミクロソームの調製物の残りの１／３を５■ＩのＣ３Ｆセフアローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）と−緒にし、この混合物を４°Ｃにおいて一夜揺り動かし、次いで４℃において２．０００Ｍｇで遠心したゆすすぎ手順を４回反復し、そして樹脂を５０ｍＭのジチオスレイトールに調節した５■Ｉ　（Ｃ５Ｆ）または１０＋ｓｌ　（ｐｒｏ−ＰＴ）　ＩＮ衝液Ａの中に再懸濁させ、そして４“Ｃにおいて２４時間ロッカー上に配置した。調製物を再び４°Ｃにおいて２．０００Ｍｇで５分間遠心し、そして上澄み液を回収し、そしてガンマ−カルボキシラーゼ活性およびタンパク質含量（ＢＣＡにより）について測定した０表２に示す結果が示すように、Ｃ３Ｆ樹脂に結合した活性のＩＯ倍程度に多い活性がｐｒｏ−ＰＴに結合した。Ｉ立置　１盪　叉Ｚバ又！星エ　豆戊旦輩Ｌミクロソーム懸濁液　４０謬１　２０ｍｇ／　ｓｌ　４　Ｘ　１０”ミクロソーム上澄み液　４０ｍ１　１５ｍｇ／ｍｌ　３Ｘ１０＠透析したミクｔｌｌｌソーム抽出物　２抛１　１９ｍｇ／ｍｌ　２　Ｘ　１０”樹脂前の溶離液　２０ｍ１　１１鍾ｇ／諷１　２ｘｌＯ”Ｃ５Ｆ樹脂　５■Ｉ　Ｎ、Ｄ、　ｌＸｌ０”ｐｒｏ−ＰＴ樹脂　１０ｍ１　Ｎ、Ｄ、　２　ＸＩＯ’Ｃ３Ｆ溶離液　５曽Ｉ　Ｎ、Ｄ。　３Ｘ１０’ｐｒｏ−ＰＴ溶離液　１０ｓ＋Ｉ　Ｎ、Ｄ、　６　ＸＩＯ’Ｎ、Ｄ−決定せずｐｒｏ−ＰＴおよびＣ３Ｆ樹脂からの溶離液を８％の５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけた。第１図は等しい体積のｐｒｏ−ＰＴ溶離液（レーン１）およびＣ３Ｆ溶離液（レーン２）を示すゲルの写真である。ス１１１１はぼ８００■ｇのラットの肝臓をミクロソーム（実施例１に記載するように調製した）を、０．２５Ｍのスクロース、０．２５ＭのＭＣＩ、　０．２％のトリトンＸ−１００を含有する４０ｍ１の０．０２５ＭのイミダゾールｐＨ１，２の中に懸濁させた。膜を組織のホモジナイザーの１０ストロークで摩砕し、そしてこの溶液を氷上に３０分間配置した。冷却した溶液ゐ４°Ｃにおいて１５０，０ＯＯＸ　ｇで１時間遠心し、そして上澄み液を回収した。この懸濁液に、６５ｍ１の飽和（ＮＨａ）ｔｓＯａをほぼ３０分かけて添加し、そしてこの混合物を４° Ｃにおいて３０分間撹拌した。この溶液を１２．０００Ｍｇで４°Ｃにおいて２０分間遠心した。（ＮＨ４）　２５０４の沈澱物を緩衝液Ａの中に約２０ｍ　ｌの最終体積に再懸濁させた。生ずる溶液を４℃において０．５リツトルの緩衝液Ａに対して５時間透析し、次いで緩衝液を０．５リツトルの新鮮な緩衝液Ａで置換し、そして透析を４℃において一夜続けた。透析物の最終の体積はほぼ２０−１であった。１０１の活性化されたチオールセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂを等しい体積の緩衝液Ａの中で洗浄し、そしてこの混合物を４℃において３時間揺り動かした１次いで、この混合物を２．０００Ｍｇで４℃において５分間遠心し、樹脂を回収し、そして洗浄産生物を４回反復した。洗浄した樹脂を透析したミクロソームの調製物を一緒にし、そしてロッカー上に３時間放置した０次いで調製物を２．０００Ｍｇで４　”Ｃにおいて５分間遠心し、そして上澄み液を回収した。次いで、上澄み液を前述したように合成プロトロンビンのプロペプチドにカンブリングした活性化されたチオールセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）と−緒にした。この混合物をロッカー上に４℃において一夜配置し、次いで２．０００Ｍｇで４°Ｃにおいて５分間遠心した。樹脂を回収し、０．５ＭのＮａＣ１に調節した５１の緩衝液Ａですすぎ、そして遠心した。すすぎ手順をさらに３回反復し、そして洗浄した樹脂を５０ｍＭのジチオスレイトールに調節した５＊１の緩衝液Ａと混合し、そしてロッカー上に４ ℃において１時間配置した。ＷＲ製物を再び２，０００Ｍｇで４℃において５分間遠心し、そして初期のミクロソーム調製物の約２００倍に精製されたガンマ− カルボキシラーゼを含有する上澄み液を回収した。精製はガンマ−カルボキシラーゼ活性についてアッセイすることによってモニターした。初期のミクロソーム懸濁液の中の４×１０・ｃｐｓのうちで、２×１０６ＣｐＩｌがｐｒｏ−ＰＴ溶離液の中に回収された。部分的に精製されたカルボキシラーゼをさらにレンチルレクチンクロマトグラフィーにより精製した。３■Ｉのレンチルレクチンセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂ　（Ｐｈａｙｖａｃｉａ）を４回の交換（各々１０ｍ１）のＰＢＳで洗浄した。洗浄した樹脂を５１のｐｒｏ−ＰＴ溶離液と一緒にし、そしてロッカー上に４°Ｃにおいて一夜配置した。樹脂を前述したように０．５ＭのＮａＣ１に調節した緩衝液Ａの中で６回（各々１０ｍ１）洗浄し、そして上澄み液を回収した。樹脂を０．５ＭのＮａＣ１，０，５％のＣＨＡＰＳおよび５鰺ｇ／■ １のホスファチジルコリンに調節し、そして０．５Ｍのマンノースを含有する５＋ｅｌの緩衝液Ａと一緒にし、そしてこの混合物をロッカー上に４℃において一夜配置した。樹脂を前述したように遠心により沈澱させ、そして上澄み液を回収した０分画をガンマ−カルボキシラーゼ活性についてアッセイした（表３）。２つの上澄み液の分画をポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけた。第１図はレンチルレクチンの貫流（レーン３）およびレンチルレクチンの溶離液（レーン４）を示す０等しい量のカルボキシラーゼ活性がレーンｌ　（ｐｒｏ−ＰＴ溶離液）および４に負荷された。レーンを比較すると、ｐｒｏ−ＰＴおよびレンチルレクチンの調製物（レーン４）に対して特異的なほぼ９０ｋＤおよび１５０ｋＤのバンドが明らかにされた。この点において、ガンマ−カルボキシラーゼ活性は初期のミクロソーム調製物の１０．０００〜２０，０００倍に濃縮された。ｌ主ｊｋｌＬ　ｕ　会ｌｊｂμＬｐｒｏ−ＰＴの溶離液　５＊ｌ　２．５ｘｌＯ’Ｌンｆ）ｋレクｆンｔｌＪＤ　３＊ｌ　１．２Ｘ１０”レンチルレクチンの貫流　５＊ｌ　３Ｘ１０’マンノース溶離液　５＊ｌ　３Ｘ１０’プロトロンビンの精製から部分的に精製された物質を、また、アニオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製することができた。精製の条件の試験において、５■ｌのプロペプチド樹脂溶離液を２回の交換の０．１％のＣＨＡＰＳ　（Ｓｉｇｍａ）　、１ｓ＋ｇ／ｍｌのホスファチジルコリンＶＥ型、５０μｇ／ｍｌのホスファチジルエタノールアミンおよび５０Ｍｇ／園ｌのホスファチジルセリンを含有する２０−Ｍのトリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、ミソ゛り一州セントＪレイス）　ｐｔ１８．５に対して透析した１次いで、１＊ｌの透析した溶液を、同一のトリシン結合の中で平衡化した（Ｌ５１１１のＤＥＡＥセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）または０．２Ｍ、０．５Ｍまたは０．８ＭのＮａＣｌを含有するトリシン結合と一緒にした。混合物をロッカー上に４℃において一夜配置し、次いで２，０００Ｘｇで４　’Ｃにおいて５分間遠心した。上澄み液を回収し、そしてカルボキシラーゼ活性について測定した０次いで、樹脂を１ ■ｌのトリシン緩衝液または適当な濃度のＮａＣ１を含有するトリシン緩衝液の中で４回すすぎ、そして２．ＯＯＯＸｇで４℃において５分間遠心した。各樹脂試料を回収し、そしてガンマ−カルボキシラーゼ活性について測定した。結果を表４に示す。ｌ土跋料　金肚坐印り樹脂　ＯＭ　ＮａＣ１２ＸＩＯ’ ０．２Ｍ　ＮａＣ１Ｉ　ＸＩＯ’ ０．５Ｍ　ＮａＣ１００，８Ｍ　ＮａＣ１０上澄み液　ＯＭ　ＮａＣ１２ＸＩＯ’ ０．２Ｍ　ＮａＣ１８ＸＩＯ’ ０．５Ｍ　ＮａＣ１２ＸＩＯ’ ０．８Ｍ　ＮａＣ１２ＸＩＯ’ 平行の組の実験において、ｐｒｏ−ＰＴ工程からの物質を２回の交換の０．１％のＣＨＡＰＳ、　１　ｍｇ／　ｍｌのホスファチジルコリンＶＥ型、５０Ｍｇ／ −１のホスファチジルエタノールアミンおよび５０Ｍｇ／■ｌのホスファチジルセリンを含有する２０ｍＭのビス−トリス（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）（Ｓｉｇｍａ）　ｐＨ６，８に対して透析した。４００μｌの透析した溶液を、同一ビス−トリス緩衝液の中で平衡化した０、５＊ｌのＳＰセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ”　）（Ｐｈａｒｓａｃｉａ）またはＣＭセファデフクス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ” 　）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と−緒にし、そして混合物を４℃において一夜揺り動かした。ガンマ−カルボキシラーゼ活性の本質的にすべては溶離液の中に見いだされた。１施班盈ワルファリン処置したラットから調製した８０−ｇの肝臓のミクロソームを組織のホモジナイザーの８ストロ一つて摩砕し、そして氷上に１５分間配置した０次いでミクロソーム調製物を、０．０２５ＭのイミダゾールｐＨ７，２，０，２５Ｍのスクロースの中で４回（１０ｍｌ）洗浄した４℃１ｇのマウス抗プロインスリンモノクローナル抗体がカップリングした、５＊ｌのＣＮＢｒ活性化セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）と−緒にした。この混合物を４℃において３時間揺り動かし、次いで２．０００Ｘ　ｇでｍｌのイミダゾール−スクロース緩衝液で洗浄し、遠心し、溶Ｍ液をした１０１０ｍ１（３のＣＮＢｒ活性化セファローズ（５ｅｐｈａｒｏｓｅ）と−緒に−ルｐＨ７，２，０，５ＭのＭＣＩで洗浄した。洗浄液を回収し、モして溶離液と一緒にした。脂を３■１の０．５ＭのＮａＣ１を含有する緩衝液Ａの中で３回洗浄した。て初期の活性の約３０％が最終の溶離液の中に回収されたことを示した。実ＪＬ［Ｌ圭ルを０．２％のトリトンＸ−１００を含有する４＊ｌのＳＩ　（０，２５Ｍのスクロース、０．０２５ＭのイミダゾールｐＨ７，２）の中に懸濁させた。ミクロソームを組織のホモジナイザーの１０ストロークで摩砕し、プールし、添加し、そして混合物を４°Ｃにおいてさらに３０分間攪拌した。沈澱物を遠心および液体の分画の除去により収穫した。沈澱物を５＊ｌの緩衝液Ａ’　（ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジこの混合物をカラムの中に注ぎ、そして貫流を集めた。１＊ｌをアッセイのために取り出した。１０１１１Ｏ貫流を５＊ｌのＣＳＦセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　（実施例１）洗浄し、０．５ＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのジチオスレイトールを含有する緩衝液Ａ′の中で５〜２４時間の間４℃において揺り動かした。この混合物を遠心し、そして上澄み液を保持した。精製手順の間に取り出された試料を、ガンマ−カルボキシラーゼ活性および合計のタンパク質金１　（ＢＣＡによる）について測定した。結果を表５に示す。 ”ｆｊＪ一体積　タンパク質　活性　比活性分画　和１）　ｊヱ　兵バＺ１１　μμリラ１ＬＴＸ上澄み液　５０　４０　５ｘｌＯ’　１０’ＴＸ？Ａ濁液　４５　４１　４ｘｌＯ”　１０’（ＮＨａ）ｔｓＯａ　ｐｐｔ（透析した）　４０　３０　４Ｘ１０’　１０’ＡＴＳ懸濁液　４０　２３　３ｘｌＯ”　１０’ｐｒｏＰＴ　ＷｔＭ液　１０　〜０．１　１　ｘｌＯ’　〜１０’Ｃ５Ｆ溶離液　５　〜０．１　ＮＤ　−ＮＤ−決定せずｐｒｏＰＴおよびＣＳＦの溶離液の各々の５Ｉｌｌを、緩衝液Ａ′の中で平衡化した５１のレンチルレクチンセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂと一緒にした。この混合物を４°Ｃにおいて一夜揺り動かし、そして０．５ＭのＮａＣｌに調節した１０厳１の緩衝液Ａ′で６回洗浄した。洗浄した樹脂の各々を０．５ＭのＮａＣ１，０，５Ｍのマンノース、０．５％のＣＨＡＰＳおよび５ｍｇ／ｍｌのボスファチジルコリンＶＥ型に調節した５■■の緩衝液Ａ′と混合した。混合物を４　”Ｃにおいて一夜揺り動かし、そして２．０ＯＯＸｇで５分間回転した。上澄み液をガンマ−カルボキシラーゼのアッセイおよびゲル電気泳動のために取った。裏立桝旦プロペプチド（アミノ酸−１８〜−１）を欠如する因子［Ｘの分子を発現するようにトランスフェクションした２９３の細胞系から、ガンマ−カルボキシラーゼを精製した。プロペプチド欠失ヒト因子ＩＸのタンパク質のための発現ベクターを、第２図に示すようにして構成した。ヒト因子ｌＸｅＤＮＡインサートを含有するｐｌＪｃｌｌＢをＨｃｏＲＶおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化し、そしてベクターおよび５′因子ＩＸ配列からなる３、３ｋｂの断片を回収した。同一のベラスミドをまたＨａｅＩＩＩおよびＨｉｎｄｌｌＩで消化し、そして因子ＩＸｃＤＮＡの３′部分からなる１、３ｋｂの断片を回収した。２つの断片をオリゴヌクレオチドＺＣ２５７５（５’　ＡＣＡＴＴＣＡＧＣＡＣＴ　ＧＡＧ　ＴＡＧ　ＡＴ　３　’　；配列ＩＯＮｏ、　７　）およびＺＣ２５７６（５’ＡＴＣＴＡＣＴＣＡ　ＧＴＧ　ＣＴＧ　ＡＡＴ　ＧＴ　３　’　；配列１０　Ｎｏ、　８　）との結合により接合した。このＤＮＡをε、ｃｏｌ　ｉ菌株Ｈ１０１の中に形質転換した。陽性のコロニーをアンピシリン耐性により選択した。１２１の陽性のコロニーをＮ７’レー１−　Ｌ、そＬＴ”Ｐ標識シタＺＣ２５７５（配列ＩＤ　Ｎｏ、　７　）でスクリーニングした。１２の陽性のコロニーを選択し、そしてＨａｅｌＩＩ＋ＥｃｏＲＩ、　ＨａｅｌＩＩ　、およびＥｃｏＲＶ　＋Ｐｖｕｌ！で消化することによってスクリーニングした。２つの陽性のコロニーを制限分析の基準で選択し、そしてＲａｍＨ’Ｉで消化してプロペプチド欠失インサートを単離した。インサートをＲａｍＨＩ消化したｐＤ５　（Ｆｏｓｔｅｒら、米国特許第４，９５９．３１８号に開示されている、その開示をここに引用によって加える）、すなわち、アデノウィルス５の複製起点（０−１地図単位）　、ＳＶ４０エンハンサ−、アデノウィルス２の主要な後期のプロモーターおよび３部分のリーダー、１組のスプライスシグナル、ＳＶ４０の後期のポリアデニル化シグナル、および独特なりａｇ旧クローニング部位からなる哺乳動物細胞の発現ベクター、に結合した。生ずるプラスミドをＢａｗｘＨＩで消化し、そして因子ＩＸのインガートを配列決定した。陽性のプラスミドのクローンをリーダー欠失ＩＸ−ｐＤ５と表示した。プロペプチド欠失因子ＩＸの発現ベクターを、ネオマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミド（ｐＤ５ｎｅｏ）を使用するリン酸カルシウム法により、２９３の細胞系の中の同時トランスフェクションした。トランスフェクシヨンした細胞を、ＩＸＰｓＮ混合物（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）および１０％の透析した胎児仔ウシ血清（ＦＣＳ）を補充したＤＭＥＭの中で培養した。不規則的に選択したコロニーを、酵素結合免疫収着アッセイ（Ｅｌ、ｌ５Ａ）により因子ＩＸの生産についてスクリーニングした。陽性のコロニーを選択し、そして因子ＩＸに対するポリクローナル抗血清を使用する放射線免疫沈澱によりスクリーニングした。この細胞系を６３と表示した。同様な方法において、自然因子ＩＸのｃＤＮＡインサートを含有するｐＤ５ベクターをｐＤ５ｎｅｏをもつ２９３の細胞の中に同時トランスフェクションした。細胞をＩＸＦＣ５および１％の６４１８を補充したＤＭＥＭの中で培１１、次いで１：１０を５つのプレートに分割した。６つのコロニーを選択し、そして１０％のＦＣＳ、　１％の６４１８および１％のＰＳＮ混合物を含有するＤＭＥＭの中の６ウエルの皿の中にプレートする。７日後、培養物を分割して半分を１０％のＦＣＳ、　１％のＧ４１８．　５　ｍｇ／ｍｌのビタミンにおよび１％のＰＳＮ混合物を含有するＤＭＥＨの中に入れ、そして半分を１０％のＦＣＳ、　１％のＧ４１Ｂおよび１％のＰＳＮ混合物を含有するＤＭＥＭの中に入れた。ビタミンＫを補充した培地の中で成長した６つのコロニーを、ＥＬＩＳＡにより因子ＩＸの生産についてスクリーニングした。ビタミンＫを補充した培地の中で成長したＥＬＩＳＡ陽性のコロニーを、因子ＩＸに対するポリクローナル抗血清を使用する放射線免疫沈澱（１？ＩＰ）によりスクリーニングした。　ＥＬＩＳＡおよびＲＩＰにより決定して最高の因子Ｉｘ生産性ＩｉＢ胞系をＤ３０と表示した。１０％の透析したＦＣＳ、　１％のＧ４１８および１％のＰＳＮ混合物を含有するＤＭＥＨの中で培養したＤ３０ｉｉ胞を、ミクロソーム調製物のために使用した。Ｄ３０およびＧ３の細胞系を、１５０５ｇｍの直径のプレートの中の１０％の透析したＦＣＳ、　１％の６４１８および１％のＰＳＮを含有するＤＭＥＨの中で培養した。各非標識細胞系の４０プレートを、代謝的に標識した細胞の１または２つのプレートと一緒にした。培地を吸引し、そして各プレートを２．５■■のベルセン（ＧＩＢＣＯＢＲＬ　）で２回すすいで細胞を除去することによって、細胞を収穫した。各組のプレートからのすすぎ液をプールし、そして２，０ＯＯＸｇで５分間遠心した。細胞の沈澱物（約２Ｘ１０’細胞）の各々を２００ｍ１のＰＢＳの中に再懸濁させ、２．０ＯＯＸｇで５分間遠心し、そして１０ｍ１の２■■Ｍの門ＳＦを含有する冷いＳＩの中に再懸濁させた。再懸濁した細胞を氷上に配置し、そして４×１５秒のパルスでパルス間の間隔を３０秒にして超音波処理し、次いで組織のホモジナイザーの７ストロークで摩砕した。これらの調製物を４，０ＯＯＸｇで４℃において１５分間遠心した。上澄み液を除去し、そして２４，０ＯＯＸｇで４℃において１時間遠心した。沈澱物（ミクロソーム）の各々を５■■の５％のＣＨＡＰＳを含有するＳｌの中に再懸濁させた。再懸濁したミクロソームを３■■の抗プロインスリンセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　（実施例３）と−緒にし、そして混合物を４℃において４時間揺り動かした。混合物を２．０ＯＯＸ　ｇで５分間遠心した。上澄み液を回収し、そして氷上に配置した。前述したように、沈澱物を５■■のＳＩですすぎ、混合し、遠心し、そして上澄み液を回収し、そして最初の上澄み液と一緒にした。次いで、ミクロソームを抗因子ＩＸ樹脂（５−ｇのＥＳＮ４抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、ニューヨーク州ニューヨーク〕を５ｓ＋ｌのＣＮＢｒ活性化セファローズとカップリングすることによって調製した）と−緒にした。この樹脂を５−１の５ＭのＸ５ＣＮで洗浄し、４℃において１時間揺り動かし、５■■のＳＩで４回洗浄し、次いでミクロソーム調製物と４℃において一夜揺り動かした０次いで、樹脂を１０■ｌの０．５ＭのＮａＣ１を含有するＳｌで４回洗浄した。カルボキシラーゼを樹脂から３つの異なる手順により溶離した。まず、樹脂を５１の５０％のエチレングリコールを含有する０、２Ｍのグリシンｐ旧０とロッカー上で４°Ｃにおいて１時間インキュベーションした０次いで混合物を４℃において１時間揺り動かし、そして２．０００Ｘｇで５分間遠心した。因子ＴＸおよび結合したカルボキシラーゼを含有する上澄み液を回収した。この溶離法はカルボキシラーゼを不活性化するが、生理学的特性決定手順、例えば、ゲル電気泳動による分析のために適当である。第２の溶離手順において、樹脂を０．１％のＣＨＡＰＳ、　１■ｇ　／　ｍ　１のホスファチジＪレコリンＩＩＩ型および１００μＭのｐｒｏ−Ｐ丁ペプチドを含有する５ｍｌのＳｌＯ中でインキュベーションした。この混合物を４°Ｃにおいて一夜揺り動かし、遠心し、そして上澄み液を回収し、そしてカルボキシラーゼ活性について測定した。カルボキシラーゼ活性の５０％が溶離液の中に見いだされた。第３の溶離手順において、ガンマ−カルボキシラーゼの反応混合物を、前述したように、冷ＮａＨＣＯｓとインキュベーションして酵素を解放することによって、カルボキシラーゼを樹脂から溶離した。２〜５霧１のカルボキシラーゼ反応溶離液を１ｍｌのレンチルレクチンセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂと混合し、そして４°Ｃにおいて一夜揺り動かした。この混合物を２．０００Ｘ　ｇで５分間遠心した。樹脂を４°Ｃにおいて２．５ｍ１（７）２０ａ＋ＨノドリシンｐＨ８，５，０，５％のＣＨＡＰＳ、１ｍｇ／ｍｌのホスファチジルコリンＶＢ型、５０μｇ／ｍｌのホスファチジルセリン、５０μｇ／■１のホスファチジルエタノールアミン、０．５ＭのＮａＣ１および０．５Ｍのマンノースとともに４℃において一夜揺り動がすことによって、ガンマ−カルボキシラーゼを樹脂から溶離した。上澄み液を回収した。同様な調製において、非標識ガンマ−カルボキシラーゼをＥＳＮ４−セファローズ（５ｅｐｈａｒｏｓｅ）のクロマトグラフィーにより精製した。カルボキシラーゼは樹脂から１０１）＋ＭのＣａＣ１□、０．１％のＣＨＡＰＳおよび１ｍｇ／ｍｌのホスファチジルコリンＩＩＩ型を含有する３１で溶離した。精製の間に取った分画のアッセイは、カルボキシラーゼ活性の約５０〜７０％が樹脂から溶離されたことを示した（表６）。麦１０３０　Ｇ３タンパク質　活性　タンパク質　活性公亘　ユ■Ｚ紅Ｙ　匹ＬＺ１１■Ｚ畦Ｙｊ」Ｚ畦細胞抽出物　１０　５　ＸＩＯ ’　１０　５Ｘ１０’ミクロソームの沈澱物　１０　５　ＸＩＯ’　１０　５Ｘ１０’樹脂前の上澄み液　５　５Ｘ１０’　５　５Ｘ１０’ＥＳＮ４上澄み液　５　２Ｘ１０’　５　２Ｘ１０’ＣａＣ１，溶離液　＜、０１　４　ＸＩＯ’　＜、０１　ＮＯＥＳＮ４ｍ脂　Ｉ　ＸＩＯ’　ｌＸｌ０’ＮＤ＝決定せず１隻五ｌラットのミクロソーム（２５０，０ＯＯｃｐ−の合計のカルボキシラーゼ活性）を、自然ポリアクリルアミドゲルのクロマトグラフィーにかけた。ミクロソーム（約０．５腸ｌ）を等しい体積の２×試料の緩衝液（０，１２５ＭのトリスＨＣＩ、　ｐ旺６．８．２０％のグリセロール、０．０１２５％のブロモフェノールブルー）と４℃において一緒にした。試料を０．３７５Ｍのトリス、１％のＰＣ／ＣＨＡＰＳ溶液（１０■１のホスファチジルセリンＶＥ型からクロロホルムを除去し、そしてワックス状残留物を２０ｍ１の１００■ｇ　／ｌａ　ＩのＣＨＡＰＳの中に再懸濁させることによって調製した）、０．１％の過硫酸アンモニウムおよび０．０２５％のＴＥＭＥＤを含有する８％のポリアクリルアミドのスラブゲル上に負荷した。ゲルを４°Ｃ１４ボルトにおいて、３ｇ／ｌのトリス塩基、１４．４ｇ／ｌのグリシンおよび１％のＰＣ／Ｃ）ＩＡＰｓ溶液を含有する流れる緩衝液の中で、染料のフロントがゲルの底から流出するまで、展開した。ミクロソーム調製物を含有するゲルのレーンを切り出し、そして２１片にスライスした。各月をカルボキシラーゼのアッセイにおいて室温で１時間インキュベーションした。１つのスライスはバックグラウンドのレベルより上のガンマ−カルボキシラーゼ活性７０００ｃρ鰯を示した。皇施■ユカルボキシラーゼをいっそう広範にグリコジル化された汚染物質から精製することができるかどうかを決定するために、部分的に精製されたラットのｐｒｏ−ＰＴ溶離液を、レンチルレクチンクロマトグラフィーの前に複雑なオリゴ糖の側鎖に結合するレクチンのレクチンクロマトグラフィーにかけた。これらのレクチンは次のものを包含する：Ｗり１ス　ガ’　Ｅｒ　ｔｈｒｉｎａ　ｃｒｉｓｔａ　ａｌｌｉ）のレクチン、これはβ−Ｄ　−ｇａｌ　（１−４）−ＤｇｌｃＮＡｃ部分に結合する、Ｐｓｅｕｄｏａｌｏｎａｓ　ａｅｒｕ　１ｎｏｓａ　ＰＡ　− Ｉのレクチン、これはＤ−ｇａ１部分に結合する、リムルス・ポリフエムス　Ｌｉｍｕｌｕｓ　ｏｌ　ｂｅ＋ｍｓ）のレクチン、これはシアル酸残基に結合する、およびｉ二り立≦乙乙０−ブス・プルブレアス　Ｔｅｔｒａ　ｏｎｏｌｏｂｕｓ　ｕｒ　ｕｒｅａｓ　のレクチン、これはα−Ｌ−ｆｕｃ部分に結合する。ｐｒｏ−ＰＴ溶離液として部分的に調製されたラットのカルボキシラーゼを、本質的に実施例１に示すように精製した。　５　Ｘ１０’ｃｐ■を含有する１腸１の溶離液を、０．５ｍｌのＣＮＢｒ活性化セファローズ（５ｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂにカップリングしたエリト１　−り１ス　ガリ　Ｅｒｔｈｒｉｎａ９１王９工１ユＶ−のレクチン、ＣＮＢｒ活性化セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂにカップリングした　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕ　１ｎｏｓａ　ＰＡ　−Ｉのレクチン、ＣＮＢｒ活性化セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂにカップリングしたｔムルス・ボ！フェムス　Ｌｉｍｕｌｕｓｏｌ　ｈａｍｓのレクチンのレクチン樹脂に添加した。この混合物を４°Ｃにおいて一夜揺り動かした。この混合物を２，０００Ｘｇで５分間遠心し、そして上澄み液を０．５ｍｌのレンチルレクチンセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂ樹脂に添加した。沈澱物を緩衝液Ａ（実施例１）の中で４回（各々０．２ｍ１）すすぎ、そして洗浄液をそれらのそれぞれの上澄み液と一緒にした。未処理のｐｒｏ−ＰＴ溶離液を含有する対照を０．５■１のレンチルレクチン− セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂに添加した。混合物を４℃において一夜揺り動かし、次いで２．ＯＯＯＸｇで５分間遠心して樹脂を回収し、そして沈澱物をＯｗｌの０．５ＭのＮａＣ１を含有する緩衝液Ａですすいだ。すすぎ手順を３回反復した。カルボキシラーゼは樹脂から、０．５ＭのＮａＣ１，０，５％のＣＨＡＰＳ、５　ｍｇ／ｍｌのホスファチジルコリンに調節し、０．５Ｍのマンノースを含有する緩衝液Ａの１■ｌで溶離した。混合物を４°Ｃにおいて一夜揺り動かした。インキュベーション後、混合物を２，０００Ｘｇで５分間遠心し、そして上澄み液を新しい管に取り出した。溶離液をカルボキシラーゼのアッセイにおいて試験し、そして８％の還元性ポリアクリルアミドゲル上で展開した。溶離液をｌＸ５Ｄｓ試料緩衝液（５０ｍＭのトリスＨＣＩ、　ｐ［１６，８，１００ｍＭのジチオスレイトール、２％のＳＯＳ、　０．１％のブロモフェノールブルー、１０％のグリセロール）に添加した。混合物を５分間沸騰させ、そして混合物を８％のポリアクリルアミドゲル上に負荷した。カルボキシラーゼのアッセイの結果は、カルボキシラーゼが工！　トリ　・り１ス　ガ！Ｅｒ　ｔｈｒｉｎａ　ｃｒｉｓｔａ　ａｌｌｉ）のレクチン、　Ｐｓｅｕｄｏｗｏｎａｓｊ！−一７ＰＡ　Ｉのレクチン、リムルス・ポリフェムス　Ｌｉｍｕｌｕｓｍのレクチンまたはテトラゴノロブス・プルプレアスＴｅｔｒａ　ｏｎｏｌｏｂｕｓ　ｕｒ　ｕｒｅａｓ　のレクチンに結合しないことを示した。ゲル電気泳動のオートラジオグラフは、これらのレクチンがカルボキシラーゼアッセイから主要な汚染物質を除去したことを示した。部分的に精製されたラットのｐｒｏ−ＰＴ溶離液を、順次に、テトラゴロブス・プルプレアス　Ｔｅｔｒ　ｏｎｏｌｏｂ　ｓ　ｕｒ　ｕｒｅａｓ　のレクチン樹脂およびレンチルレクチン−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂを使用してクロマトグラフィーにかけた０部分的に精製されたラットのカルボキシラーゼは、本質的に実施例１に記載するようにして、ρｒｏ−ＰＴペプチドを使用して精製した。　１０ｍ１の４　Ｘ１０”ｃｐ−を含有するｐｒｏ−ＰＴ溶離液を、２０５Ｍのトリシン、ｐ）＋８．５．０．１％のＣＨＡＰＳ、　１　ｓａｇ／ｍｌのホスファチシＪレコリンＶＢ型、５０μｇ／ｍｌのホスファチジルエタノールアミンおよび５０μｇ／−１のホスファチジルセリンの中に透析した。透析された溶離液を６１１１の前以て洗浄したートーゴノロブス・プルブレアス　Ｔｅｔｒａ　ｏｎｏｌｏｂｕｓ　ｕｒ　ｕｒｅａｓ　のレクチン樹脂に添加した。試料を４℃において一夜揺り動かし、２．０ＯＯＸｇで５分間遠心した。上澄み液を５ｍｌの前以て洗浄したレンチルレクチン−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂの中に取り出し、沈澱物を透析の緩衝液ですすぎ、そして第２の上澄み液を上澄み液−レクチン混合物と一緒にした。上澄み液−レクチン混合物を４℃において一夜揺り動かし、そしてこの混合物を２．０ＯＯＸｇで５分間遠心した。上澄み液を廃棄し、そして沈澱物を１０ｍ１（７）　０．５ＭのＮａＣ１に調節した緩衝液Ａで６回洗浄した。カルボキシラーゼは、レクチン樹脂から、０．５ＭのＮａＣ１，０，５％のＣＩＡＰＳ、５　ｍｇ／ｍｌのホスファチジルコリンに調節し、０．５Ｍのマンノースを含有する緩衝液Ａで４℃において一夜溶離した。試料を２，０ＯＯＸ　ｇで５分間遠心し、そして上澄み液をカルボキシラーゼアッセイにかけ、そしてＴＣＡ　ａ：Ｉさせ、そして前述したようにポリアクリルアミドゲル上で展開した。１ｍウシの肝臓のミクロソームを（本質的にＨａｒｂｅｅｋら、Ｔｈｒｏｓｂｏｓ　ｉｓ勤見ユ　５６　：　３１７−３２３．１９８９に記載されているようにして調製した）を、７０ｍ１（７）２０μＭ１７）　）　’Ｊ　スｐ［＋７．３．０．１Ｍ（７）ＮａＣ１（Ｄ中ニ３０ｍｇ／ｓｌニ再懸濁させ、そして１０５．０００　Ｘで４℃において６０分間遠心した。上澄みを廃棄し、そして沈澱物を７０畷ｌの２０−ＭのトリスｐＨ７，３，０，１ＭのＮａＣ：ｌの中に再懸濁させ、そして０．５％のＣＲＡＰＳで可溶化した。この溶液を４℃において３０分間インキエベーシッンし、次いで１５０．０００ｇで６０分間４℃において遠心した。上澄み液を廃棄し、そして沈澱物を２０＋＋Ｈのトリスｐｎ？、３　、Ｉ　ＭのＮａＣ１，１％のＣ［ＩＡＰＳの中に再懸濁させた。この！！濁液を４℃において３０分間インキエベーシゴンし、次いで抗ブロープロトロンビン樹脂（ＣＮＢｒ活性化セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂおよびウシプロトロンビンに対して親和精製したウサギ抗血清をカップリングすることによって調製した）と−緒にした。この混合物を４℃において１６時間インキュベーションし、次いでカラム（３５ｓｌＯ力ラム体積）の中に負荷し、そして樹脂を５力ラム体積の２０ａ＋Ｍのトリスｐ［＋７．３．０．１ＭのＮａＣ１，０，５％のＣＨＡＰＳ、　０．５％のホスファチジルコリン（ＩＩＩ−Ｅ）、５■ｈのジチオスレイトール（１１衝液Ｃ）で洗浄し、次いで５力ラム体積の１ｍＭのＡＴＰおよび５ｍＭのＭｇｃｌ−を含有する緩衝液Ｃで２０℃において洗浄した。結合しない物質および抗ブロープロトロンビン樹脂のアリコートを前述したようにアッセイした。一般に、カルボキシラーゼ活性の５０％を樹脂に結合することができた。カルボキシラーゼは、１１００ａのヒト因子Ｘのプロペプチド（ヒト因子Ｘの− １８〜−１配列から成る（Ｌｅｙｔｕｓら、前掲；その開示をここに引用によって加える））を含有する緩衝液で樹脂から溶離した。溶離はいくつかのバッチで実施し、各バッチについて２０℃におてい３時間インキュベーションした。溶離後の抗ブロープロトロンビン樹脂およびプロペプチド溶離液のアリコートをアッセイし、そしてカルボキシラーゼのほぼ７０％がカラムからプロペプチドによりｆＪＨされることが発見された（表７）。プロペプチド溶Ｍ’ａ　（２００鰯１）を０．５１のＳ−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　（Ｐｈａｒｇ＋ａｃｉａ）上に４°Ｃにおいて１６〜２０時間吸着させ、そしてこの樹脂を１０体積の５０ｍＭのトリスｐＨ７，４，１００５ＭのＮａＣ１，０，２５％のホスファチジルコリンＶＥ型、　０．２５％のＣＨＡＰＳで洗浄した０次いで、樹脂を０．５１の５０１のトリスｐＨ７，４，２００ｗＭのＮａＣ１，００，２５％のホスファチジルコリンＶＥ型、０．２５％のＣＨＡＰＳＯ中で３０分間揺り動かし、次いで１■１の０．５ＭのＮａＣｌに調節した同一の緩衝液の中でさらに３０分間インキュベーションした。樹脂を低速遠心しにより沈澱させた。ペプチド溶離液および塩溶離液の両者の吸着は定量的であって、この工程について１００％の回収率が得られた（表７）。次いで、Ｓ−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）から溶離された物質を２００レンチルレクチン−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Ｓｉｇｓａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、）上に吸着させた。この混合物を５ｍＭのＭｇｃｌｚ＋　５ｍＭのＣａＣ１４に調節し、そして４℃において６時間インキュベーションした。樹脂を１００倍過剰（１００体積）の５０ｍＭのトリスＨＣ１，ｐＨ７，４，１００ｍＭのＮａＣ１＋０．２５％のホスファチジルコリンＶＥ型、０．２５％のＣＨＡＰＳで洗浄し、そしてカルボキシラーゼをｌ−■の０．５Ｍのα−メチル −マンノシドおよび１０１１ＭのＥＤＴＡを含有する同一の緩衝液の中で溶離した。この工程における全体の回収率は５０％であった（表７）、プロトロンビンおよびいずれの他のビタミンに依存性タンパク質は溶離液の中で検出することができず、レンチルレクチンへのカルボキシラーゼの吸着は直接の相互作用を経て起こることを示す。活　性　タンパク質　比活性　盪１皇跋料　豆匹ｉｆ虱り一豆憇ム吐羞圭可溶化ミクロソーム　６ＸｌＯ’　５５００　１ＸＩＯ’　１洗浄済検出ミクロソーム　９Ｘ１０’　２０００　５Ｘ１０’　５プロペプチド溶離液　２Ｘ１０ ’　、１６　１ＸＩＯ”　１０’Ｓ−セファローズ溶離液１．６Ｘ１０’　、０８　２Ｘ１０”　２Ｘ１０’レンチルレクチン溶離液　４Ｘ１０”　、００２　２Ｘ１０雫　２　Ｘ　１０’＊クーマツ−ブルーまたは銀染色したゲルをＢＳＡの標準を使用して走査することによって決定した。レンチルレクチン−セファローズ（５ｅｐｈａｒｏｓｅ）からの溶離液を電気泳動にかけ、そしてゲルをクーマツ−ブルー（Ｃｏｏｓａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）で染色した。単一の９０ｋＤのバンドが観察された（第３図）、ゲルを銀染色するか、あるいは輻射線ヨウ素化したタンパク質を分析したとき、この９０ｋＤを主要なバンドであったが、いくつかの小さいタンパク質のバンドがまた存在した。プロペプチド溶離したウシのカルボキシラーゼ（１００−１の１００μＭのプロペプチドを含有する緩衝液Ｃの中の６Ｘ１０”ｃｐ−の活性）を、１ｍｌのＳ− セファローズ（５ｅｐｈａｒｏｓｅ）上に４℃において１６時間バッチ吸着させた。結合した物質を１０体積の５０ｍＭのトリスｐＨ７，４，１００＋ｅＭのＮａＣ１，０，２５％のホスファチジルコリンＶＥ型、０．２５％のＣｔｌＡＰＳで洗浄し、そして小さいアリコートの樹脂をカルボキシラーゼ活性について測定した。残留する樹脂を等しい体積のフロインドアジュバント（ＩＣＮ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａｌｇ、カリフォルニア州コスタメサ、から入手した）と混合し、そしてＢａ１ｄ／ｃマウスの中に腹腔内注射した。同一方法であるが、不完全フロインドアジュバントを使用して調製したカルボキシラーゼを用いて、このマウスを２週の間隔で促進した。抗原の第３の注射後、血清を集め、そして免疫捕捉アッセイを使用して試験した。非免疫化したマウスからの血清を対照として使用した。増加する量（０〜２０ μｌ）の血清をウシミクロソーム（５０ｔ１１の中の１．５ｍｇ）と４℃において８時間インキュベーションし、次いで５ｋＭのトリスｐＨ７，４，１００ｍＭのＮａＣ１の中のプロティンＡセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）の１：１混合物の５０５１を添加１−た、試料を４℃において１２時間揺り動かし、次いで５０１ａＭのトリスｐＨ７，４，１００ｍＭのＮａＣ１，０，２５％のホスファチジルコリンＶＬ　Ｏ，２５％のＣＩＩＡＰＳで１００倍に洗浄した。次いで樹脂を１２ｈｌのカルボキシラーゼ反応混合物中で２０″Ｃにおいて４時間インキュベーションし、１０％のＴＣＡ　（１閣ｌ）で沈澱させ、次いで沸騰により”ＣａＣ１□の除去後計数した。被験試料を展開し、カルボキシラーゼ活性がこの期間にわたって直線であることを示した。試料は二重反復実験において展開し、そして平均を各々について取った。カルボキシラーゼ注射マウスからの単離された血清では、カルボキシラーゼ活性の直線の増加が抗血清の増加とともに起こった。使用した抗血清の最高の量（２０μｌ）では、カルボキシラーゼ活性の２０％が樹脂に結合した。カルボキシラーゼのウェスタンプロット（Ｔｏｗｂｉｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７６：４３５０−４３５８．１９７９　；米国特許第４，４５２．９０１号）分析を、非免疫または抗カルボキシラーゼ血清を使用して平行に実施した。レンチルレクチン溶離したカルボキシラーゼ（１０ ’ｃｐｍの活性）を８％の変成ゲルの電気泳動にかけ、そして１゜４％のグリシン、２５−ＭのトリスＰＨ８，８，２０％のメタノールおよび０．０５％のＳＤＳの中で６０ボルト、４℃において２４時間にわたってニトロセルロース（Ｂｔｏｔｒａｃｅ　ＮＴ、　Ｇｅｌｍａｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　ミシガン州アンアーバー）に移した。ニトロセルロースをウェスタン緩衝液Ａ　（５抛ＨのトリスｐＨ７，４，５ｓ＋ＨのＥＤＴＡ、　０．０５％のＮＰ−４０，１５ｋＭのＮａＣ１および０．２５％のゼラチン）の中で洗浄し、次いで血清のｉ　：　１０００希釈物を補充した２０゜ｓｉｌのウェスタン緩衝液Ａの中でインキユベーシヨンした。４℃において１６時間揺り動かした後、ニトロセルロースをウニスタン緩衝液Ａ（３回、各１００ｍ１）の中で洗浄し、次いで′ｚｓＩ標識したウサギ抗マウスＩｇＧ　（２Ｘ　１０”ｅｐｍ）を含有する２０−１のウェスタン緩衝液Ａの中で４℃において１時間インキュベーションした。ニトロセルロースを１００ｓ＋１のウェスタン緩衝液Ｂ　（５０ｓＭのトリスｐ８７゜４．５０ｍＨのＥＤＴＡ、　０．０５％のＮＰ−４０，１ＭのＮａＣＸ、０．４％のＮ−ラウリルサルコシン、０．２５％のゼラチン）で３回洗浄し、空気乾燥し、そしてフィルムに露出した９抗カルボキシラーゼ抗血清を使用して観察された免疫反応性タンパク質のみは９０ｋＤのバンドであった（第４図）。反応性は対照血清を使用して観察されなかった（データは示されていない）。出発ミクロソーム調製物およびＳ−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）溶離液を、また、ウェスタンプロットにより分析した。精製の各段階から等しい量のカルボキシラーゼ活性が分析され、そして等しい量のカルボキシラーゼ活性が観測された。これらの結果が示すように、精製の間に活性の有無の損失は存在しなかった。１１■エミクロソーム調製物をＤ３０およびＧ３細胞（実施例３）の８０の１５（Ｉｇ＋ｓのプレート（約２Ｘ１０’細胞）から調製した。細胞をプレートからベルセン（すすぐために２．５閣ｌ／１５０ｍｍのプレート；次いで細胞と取るために２．５ｇ＋１）で取り、そして２０００Ｘｇで５分間遠心することによって濃縮した。細胞を冷ＰＢＳの中ですすぎ（合計の体積４００ｍ１）そして２０００Ｘ５分間回転した。細胞をＳＩＰ　（０，２５Ｍのスクロース、０．２５ＭのイミダゾールｐＨ７，２、２ｓＨのＰＭＳＦ　＞の中に２０ｍ１の最終体積に再懸濁させ、そして４×１５秒のバーストでバーストの間の間隔を３０秒にした超音波処理した０次いで細胞を組織のホモジナイザーの７ストロークで摩砕し、そして４ ℃において４０００Ｘｇで１５分間遠心した０次いで、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）超遠心機で４°Ｃにおいて４５．　ＯＯＯｒｐｍで１時間回転することによって、ミクロソームを上澄み液から調製した。生ずる上澄み液を廃棄し、そして沈澱物を１０ｍ＋１のＳＩＰの中で組織のホモジナイザーの７ストロークで摩砕し、次いで０．２％のＣＨＡＰＳに調節した。氷上で３０分後、試料を抗因子ＩＸ樹脂（ポリクローナル抗因子■ｘのＩｇＧから調製し、プロティンＡ−セファローズ（５ｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムで精製し、次いでＣＮＢｒ活性化セファローズ（５ｅｐｈａｒｏｓｅ）に５ｍｇ／ｍｌでカンブリングした）。抗因子ＩＸ樹脂を４℃において一夜揺り動かし、次いで０．０５ＭのトリスｐＨ７，４中の０．１ＭのＮａＣ１で洗浄し、次いで０．０５ＭのトリスｐＨ７，４゜０．１ＭのＮａＣ１，０，２５％のホスファチジルコリン、０．２５％のＣＨＡＰＳ　＋１００μＭのプロペプチド（ヒトプロトロンビンまたはヒト因子Ｘの −１８〜−１配列）で溶離した。この緩衝液の中で樹脂を４°Ｃにおいて一夜揺り動かすことによって、ＲＭを実施し、次いで上澄み液を集め、そしてそれをアッセイした。次いでプロペプチド溶離液を０．２〜０．５閣ｌのＱ−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）と−夜４℃においてインキュベーシヨンした。樹脂を０．０５ＭのトリスｐＨ７，４，０，１ＭのＮａＣ１，０，２５％のホスファチジルコリン、０．２５％のＣＨＡＰＳＯ中ですすぎ、０．２ＭのＮａＣ１に調節した同一緩衝液と４℃において３０秒間インキエベーシッンした。次いで緩衝液を０．５ＭのＮａＣ１に調節し、さらに３０秒間インキエベーシッンし、そして溶離液を集め、そしてアシセイした。タンパク質含量をゲルの走査により決定した。結果を表８に示す。ｌ工活　性　タンパク質　比活性　精製のＤ３０　１ＸＩＯ”　１００　１ＸＩＯ’　ＩＧ　３　３ｘｌＯ’　１００　３ｘｌＯ３プロペプチド゛Ｄ３０　３Ｘ１０’　、０２　１．５Ｘ１０’　１５００Ｇ　３　２Ｘ１０’　、０２　１ＸＩＯ”−セファローズ″ Ｄ３０　２ｘｌＯ’　、０１　２Ｘ１０’　２０００Ｇ　３　１ＸＩＯ’　、０１　１ＸＩＯ”代謝的にＮ識したＤ３０およびＧ３から調製したミクロソームからの溶離液を、レンチルレクチン樹脂上でさらに分別した。精製した分画をゲル電気泳動にかけ、そしてオートラジオグラフィーに露出した。第５図に示すように、Ｄ３０細胞からのレンチルレクチン溶離液はＧ３細胞の細胞の中に存在しない約６５ｋＤのバンドを含有する。全細胞抽出物をＤ３０１１胞から調製した。ｍ胞の８０枚の１５０−■のプレートを、前述したように、ベルセンで収穫し、遠心し、そして摩砕した。　０．５閣ｌのＣＨＡＰＳを添加し、そしてリゼイトを氷上に３０分間１いた６次いでリゼイトを４０００Ｘｇで１５分間遠心し、そして上澄み液を保持した。生ずる抽出物をセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カップリングｌ、、ｆ、ニーＥＳＮ４ニ吸着サセ、ソＬテ０．０５Ｍノド’Ｊ　スｐＨ７，４，０，１Ｍ（７３ＮａＣ１，０，２５％のホスファチジルコリン、０．２５％のＣＨＡＰＳ、　１００ｍＭのＣａＣ１ｇを使用して溶離した（　ＥＳＮ４はＣａ”依存性である）、溶離は４℃において１時間実施した０次いで、溶離液をコンカナバリンＡセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　（３００ｕＩ　）上に４℃で−夜インキエベーシタンすることによって吸着させた。樹脂を０．０５ＭのトリスｐＨ７，４゜０．１ＭのＮａＣ１，０，２５％のホスファチジルコリン、０．２５％のＣＨＡＰＳで洗浄し、樹脂の小さいアリコートをアッセイして活性の量をモニターし、そして樹脂の残部をＢａ１ｂ／ｃマウスに腹腔内注射した。はぼ３〜５Ｘ１０’ｃｐ −の活性／ミクロソーム／促進に使用した。Ｄ３０全細胞の抽出物の試料をウェスタンプロット分析で展開した。試料をＳＯＳ試料の緩衝液の中で５分間沸騰させ、ベックマン・マイクロフージ（Ｂｅｃｋａ＋ａｎ　Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）１２中で４の設定で室温において１分間遠心し、そして８％の不連続の変性ポリアクリルアミドゲル上で４０ボルト、室温において１５時間電気泳動させた。タンパク質をニトロセルロースに６０ボルトで２４時間の間移した。ニトロセルロースを取り出し、ウェスタン緩衝液への中で４℃においてロッキングしながら３回、２０分／洗浄で、洗浄した。ゲルを染色して転移を評価した。洗浄したニトロセルロースを２０■ｌの新鮮なウェスタン緩衝液Ａの中に入れ、そして２０μｍの抗カルボキシラーゼ抗血清（実施例８）を添加した。プロットを４°Ｃにおいて１８時間揺り動かし、次いで上のようにして３回洗浄した。プロットを１０μＩ　（０，５ｇｇ；２．０Ｘ１０ ’ｃｐ＋ｗ）のヨウ素化抗マウスＩｇＧ（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ　Ｃｏｒｐ、、ベンシルベニア州ウェストチェスター；＾−ｅｒｓｈａ腸、イリノイ州アーリントンハイツ、から入手した＋ｚｓｌでヨウ素化した）を含有する２０１の新鮮なウェスタン緩衝液Ａの中に入れ、そして４℃において１時間揺り動かした。次いでニトロセルロースを上のようにして３回洗浄し、空気乾燥し、サランの中に包装し、そしてＸ線フィルムに露出した。２施■利完全なＲＮＡを、ウシ肝臓から、グアニジンイソシアネート（Ｃｈｊｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｗｉｓｔｒ　＋月１：５２−４．１９７９）およびＣｓＣ１遠心し、（Ｇｉｌｓｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　、　Ｑ　：　２６３３− ２６３７．１９７４）を使用して調製した。　ｐｏｌｙ　（Ａ）　＋ＲＮＡを完全なＲＮＡからｏｌｉｇｏｄ　（Ｔ　）セルロースクロマトグラフ４−（ＡｖｉｖおよびＬｅｄｅｒ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ。里、影し１４０８．１９７２）を使用して選択した。第１類のｃＤＮＡを、１回ｐｏｌｙｄ（Ｔ）選択したウシ肝臓ｐｏｌｙ　（Ａ）　＋ＲＮＡから、２つの別々の反応において合成した。１つの反応（放射線標識したｄＡＴＰを含有する）を使用して、第１ｉ［の合成の量を評価した。第２の反応は放射線標識したｄＡＴＰの不存在下に実施し、そして、一部分、第２Ｍの合成の量を評価した。スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素（ＧＩＢＣＯＢＯＩＬ）を、詳しく後述するように、使用した。順次に、８μ ｌの５×逆転写酵素の緩衝液（ＧＩＢＣＯＢＲＬ：２５０＋ｍＭ　）リス■Ｃ１，ｐＨ８，３，３７５ｓＨのＫＣＩ　、および１５ｍＭの−ｇｃｌり。２．０μＩの２００ｍＭのジチオスレイトール（新しく調製したか、あるいは− ７０℃でアリコートで貯蔵した）および１０−Ｍの各ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ。ｄＴＴＰおよび５−メチルｄＣＴＰ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含有する２、Ｏａ　ｌのデオキシヌクレオチドトリホスフェート溶液を混合することによって、室温において、２．５×反応混合物を調製した０反応混合物を各６μｌの２本の管の中にアリコートで入れた。第１の管に、１．０μｌの１０ＢＣ１／μｍのα ”Ｐ−ｄＡＴＰ　（Ａｓ＋ｅｒｓｂａａ）を添加し、そしてｌＯｕ　１の水を第２の反応管に添加した。　１４μＩの５ｍＭのトリスＨＣＩ、　Ｐ１１７．４゜５０ｍＭのＥＤＴＡ中で希釈した１０ｇｇのウシ肝１ｉｐｏｌｙ　（Ａ）　＋ＲＮＡを含有する１４μｌの溶液を、２μｌの１．ｃｒｇ／μｌの第１１ｉのプライマー、ＺＣ３７４７（ＧＡＣＡＧＡ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＡＡＴ　丁ＣＡ　ＣＴＡ　ＣＴＣＧＡＧ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＴＴＴＴＴＴ　；配列ＩＯＮｏ、１０）と混合し、そしてプライマーをＲＮＡにこの混合物を６５℃に４分間加熱し、次いで氷水中で冷却することによってアニーリングした。８μｌのＲＮＡ− プライマー混合物を２本の反応管の各々に添加し、次いで５μｇの２００　Ｕ　／μｌのスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素（Ｇ４ＢＣＯＢＩ？Ｌ）を添加した。反応混合物をおだやかに混合し、そして管を４５°Ｃにおいて３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、８０μｌの１０ｍＭのトリスＨＣＩ。ｐＨ７，４，１ｍＨのＥＤＴＡを各管に添加し、試料を渦形成し、そして短時間遠心した。２μｌの各反応混合物を取り出して、合計の計数およびＴＣＡの計数（組み込まれた計数）を決定した。各試料の２μｌをアルカリ性ゲル電気泳動により分析して、第１鎖の合成の量を評価した。各試料の残部をエタノール沈澱させた。核酸を遠心により沈降させ、８０％のエタノールで洗浄し、そして１０分間空気乾燥した。第１鎖の合成は１．０ｇｇの肝臓のＤＮＡまたは２０％のＲＮＡへの転化を生じた。第２鎖のｃＤＮＡの合成は、第１Ｍの反応からのＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド上で、ＤＮＡのヘアピンの形成を生ずる第２鎖の合成の第１１のブライミングを促進する条件下に実施した。第１ＭのｃＤＮＡを含有する核酸の沈澱物を７１ｔＩｌの水の中に再懸濁した。第２鎖の合成の量を評価するために、α”Ｐ−ｄＡＴＰを非標識第１鎖のＤＮＡに添加した。ヘアピン構造の形成を促進するために、酵素を除外したすべての試薬を室温にし、そして反応混合物を室温において構成した。（あるいは、試薬を氷上に配置し、そして反応混合物を室温において構成し、そして室温において短時間平衡化した後、１６℃においてインキュベーションすることができる。）２本の反応管を各合成のために用意した。一方の反応管は非標識の第１鎖のｃＤＮＡを含有し、そして他方の反応管は放射線標識した第１ＭのｃＤＮＡを含有した。各反応管に、１０μＩの５×第２鎖の緩衝液（１００ｗＭのトリス、ｐＨ７，４，４５０ｍＭのＭＣＩ。２３ｍＭのＭｇＣ１ｇ、　５０ｗＭの（ＮＨＪ）　ｚ　（Ｓ０４）　、３μＩのベーターＮＡＤおよび１μｌの１０ｍＭの各ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）を含有するデオキシヌクレオチド、０μｌのα”Ｐ−ｄＡＴＰまたは１μｌの水（放射線標識したｄＡＴＰを非標識第１鎖のｃＤＮＡを含有する管に添加した）、０．６μｌの７Ｕ／μｌのＥ、　ｃｏｌｉ　リガーゼ（Ｎｅｅｅ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ　ｓマサチュセッツ州ベバリー）、３．１μｌの８Ｕ／μｌのＥ、　ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ａａｅｒｓｈａｗ）　、およびＩμｌの２Ｕ／μｌのＲＮアーゼ）Ｉ（ｌｄＢｃｏ　ＢＲＬ）を加えた０反応成分を１６℃において２時間インキュベーションした。インキュベーション後、３μｌを各反応管から取って、合計およびＴＣＡの沈澱可能な計数を決定した。２μｌの各試料をアルカリ性ゲル電気泳動により分析して、第２Ｍの合成の量をほぼ２倍単位の長さのバンドの存在により評価した。各試料の残部に、２μｌの２．５１ｇ／ｐｇのカキのグリコーゲン、５μｌの０．５ＭのＥＤＴＡおよび２００μｌの１０ｓ＋Ｍのトリス［ＩＣ１，ｐＨ７，４゜１ａ＋ＭのＥＤＴＡを添加し、試料をフェノール−クロロホルムで抽出し、そしてイソプロパツールで沈澱させた。核酸を遠心により沈澱させ、８０％のエタノールで洗浄し、そして空気乾燥した０反応の各々における二本［ｃＤＮＡの収量はほぼ２μｇであった。ヘアピン構造の一本鎖ＤＮＡをヤエナリヌクレアーゼにより切り取った。二本鎖ｃＤＮＡの試料を３０μｍの水の中に再懸濁させかつ一緒にした。５μｌの１０ ×ヤエナリ緩衝液（０，３ＭのＮａ０ＡＣ，ｐＨ４，６，３ＭのＮａＣ１，１抛ｉのＺｎ５Ｏ−）、５μｍの１０−Ｍのジチオスレイトール、５μｍの５０％のグリセロール、および５μｌの１０Ｕ／μｌの（Ｐｒｏ■ｅｇａＣｏｒｐ、ウィスコンシン州マデイソン）を添加し、そして反応成分を３０℃において３０分間インキュベーションした。インキュベージ５ン後、５０ｕ　１　（７）ＩＯＩＩＭ（７）　）リスＨＣ１，ｐＦ１７．４．　１　ｍＭ（７）ＥＤＴＡを各管に添加し、そして２μｌの各試料をアルカリ性ゲル電気泳動にかけて、第２鎖の生成物の単位長さのｃＤＮＡへの切断を評価した。１００μｌのＩＭのトリスＨＣＩ、　ｐＨ７，４を各試料に添加し、そして試料をフェノール−クロロホルムで２回抽出した。最後のフェノール−クロロホルムの抽山稜、ＤＮＡをイソプロパツールを沈澱させた。ＤＮＡを遠心により沈澱させ、８０％のエタノールで洗浄し、そして空気乾燥した。はぼ２μｇのＤＮＡが各反応から得られた。ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ沈澱物を３０μｌの水の中に再懸濁させた後、ｅＤＮＡをＴ４ポリメラーゼで平滑末端とした。５μｌの１０ｘＴ４ポリメラーゼ緩衝液（３３０ｓＭのトリス−アセテート、ｐＨ７，９，６７０ｍＭのＫＡｃ、　１　ｍｇ／　ｓｌのゼラｆ　７　）　、５　ｕ　Ｉ　ノ１　ｍＭ（ＤｄＮＴＰ、５　ｕ　１０）５０ｍＭノシｆｔスｌｚイ）　−ル、５μｌのＩ　Ｕ／ｕ　ＩのＴ４ポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を各管に添加した。、１５℃ において１時間インキュベーションした後、１５０μｌの１ｋＭのトリスＢＣ１，ｐＨ１，４，１ｍＨのＥＤＴＡを添加し、そして試料ラフエノール−クロロホルムで抽出し、次いでイソプロパツール沈澱させた。　ｃＤＮＡを遠心により沈澱させ、８０％のエタノールで洗浄し、空気乾燥し、そして４μｌの水の中に再懸濁させた。　ＥｃｏＲＩアダプター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＮｏ、Ｎ４０９−２０）を平滑末端のｃｌ）ＮＡに結合した。第１鎖のプライマーはＸｈｏｌクローニング部位をエンコードして、ｅＤＮＡを方向的に発現ベクターの中にクローニングさせた。　ｃＤＮＡをＸｈｏｌで消化し、次いでフェノール−クロロホルムで抽出し、そしてイソプロパツール沈澱させた。消化後、ｅＤＮＡを０．８％の溶融したアガロースゲルの中で電気泳動させ、そして２．０ｋｂを越えるｃＤＮＡをエルトラップ（Ｅｌｕｔｒａｐ）　（Ｓｃｈｌｅｉｅｈｅｒ　ａｎｄ　５ｅｈｕｅ１１．、　二ｘ−ハンプシャイヤー州）を使用して電気溶離した。５００μｌの緩衝液の中の電気溶離したｃＤＮ＾をイソプロパツール沈澱させ、そしてｃＤＮＡを遠心により沈澱させた。　ｃＤＮＡの沈澱物を８０％のエタノールで洗浄した。二本鎖にし、結合し、そしてＸｈｏｌで切断したｃＤＮＡを３４μ２の蒸留水の中に再懸濁した。５μｌのＩＯＸキナーゼ緩衝液（５００■河のトリスｐＨ７，８，１００１ｗＭのＭｇＣ１ｇ、　ｌ　ｍＭの［１ＤＴＡ）　、５　μｍの１０ −ＨのＡＴＰ、１／７１の２００■Ｈのジチオスレイトールおよび５μｌのＴ４ヌクレオチドキナーゼ（ＩＵ／ｌｌｌの、ＧＩＢＣＯＢｌ？Ｌ）をＤＮＡに添加した０反応混合物をおだやかに混合し、そして３７°Ｃにおいて１時間インキユベーシッンした。インキュベーシック後、この混合物をフェノール−クロロホルムで抽出し、クロロホルムで抽出し、そして５μｇのムラサキガイのグリコーゲン（Ｂｏｅｂｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インジアナ州インディアナポリス）を担体として使用してイソプロパツール沈澱させた。１２０ｎｇ（１，５μｍ　）のｅＤＮＡを０．５μｌの蒸留水、２μｌのラムダＵｎｉ−ＺＡＰ（Ｉ　Ｂ　ｇ　／　ｐ　１　、　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　５ｙｓｔｅｓｓ、カリフォルリうア州ラジョラ）（これはＸｈｏｌおよびＥｃｏＲＩで消化しそして仔つシ腸ホスファターゼで処理されている）、および２μｍの３×結合混合物（７μｍのＩＯＸ結合緩衝液（５００ｓＭのトリス９Ｈ７，８−１００ｍＭ（Ｚ）ＭｇＣ１ｚ。１０＋＋＋ＭのＡＴＰ、　５００μｇ　／閣１＋７）ＢＳＡ）、７μｌの１００ｍＭ１７）ＤＴＴ　、　７　ｕ　１　（ＤＴ４ＤＮＡ　リガーゼ（Ｉ　Ｕ／　ｕ　１　、　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｓ＋、インジアナ州インディアナポリス））と−緒にした。結合混合物を室温において９時間インキエベーシゴンした。結合後、ＤＮＡを製造業者が供給したプロトコルに従いギガバック・プラス（Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｐｌｕｓ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してファージのビーズの中にパッケージングした。パッケージング反応をＰＬ＞［Ｆの宿主細胞（Ｓｔｒａｔａｌｅｎｓ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　５ｙｓｔｅｓｓ）上に５９のプレート上でほぼ２５０．０００プラ一ク形成単位／プレートにおいて、はぼ１５　Ｘ　１０’の独立のプラークの収量についてプレートアウトしたやプレートを７Ｍ緩衝液（１０ｍＭのトリスｐＨ７，８，１０ｍＭの、Ｍｇ５Ｏａ）でオーバーレイし、そして室温において６時間溶離させた。液体のリゼイトを取り出し、プールし、そして４℃において貯蔵した。　５０腸ｌのクロロホルムをリゼイトに添加してバクテリアの成長を防止した０品質の試験として、ライブラリーをプローブとして放射線標識したヒトプラスミノダンＤＮＡ断片でスクリーニングした。陽性のクローンは０．５３％の頻度で見え、そしてクローンから調製したＤＮＡを分析したとき、陽性の５０％より大は全長であった。ｌ施Ｕポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および実ｍ例８に記載する部分的に精製された物質のアミノ酸のミクロ配列決定により決定したアミノ酸配列から設計したオリゴヌクレオチドを使用して、ガンマ−カルボキシラーゼをエンコードするヌクレオチド配列を得た。部分的に精製されたＳ−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）溶離液（実施例８）を、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）ｆｉＷｉ装置（Ａｓ＋１ｃｏｎ、、マサチュセッツ州デンバーズ）を使用するか、あるいは−ｅｓｓｅｌおよびＦｌｕｇｇｅ　（シリ上ｂユＢｉｏｃｈｅｍ、、　Ｌ坦：　１４１−１４３．１８４、この開示をここに引用によって加える）により記載されているように、Ｓ−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）溶離液からリン脂質を抽出しそしてメタノール／クロロホルムでそのタンパク質を溶離することによって、濃縮した。濃縮した物質を、本質的に実施例８に記載するように、８％の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの中で電気泳動させ、そしてニトロセルロースに移した。ニトロセルロースを７ミドブラツク（Ｓｉｇｍａ、ミゾリー州セントルイス）で本質的にＡｅｂｅｒｓｏｌｄら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ、　８４　：　６９７０−６９７４、１９８７）および５ｃｈａｆｆｎｅｒおよびＷｅｉｓｍａ＋ｘ（Ａｎａｌ　ｔ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。Ｊ５：５０２−５１４．１９７３）　（これらの開示をここに引用によって加える）により記載されているように染色し、そして９５ｋＤのバンドを切り出した。バンドを蒸留水ですすぎ、そして−２０℃において貯蔵した。この手順を４回反復して、マイクロ配列決定のために十分な試料を集めた。ニトロセルロース上の９０ｋＤのバンドをプールし、次いでバーバー　ト−フィクロシーフェンシング（Ｈａｒｖａｒｄ　Ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（マサチュセッツ州ケンブリッジ）によりマイクロ配列決定した。３つのペプチドのアミノ末端の配列は、表９に示すように決定された。ｌエペプチド１（配列１０　Ｎｏ、　３）Ｆ　Ｔ　Ｌ　Ｌ　Ａ　Ｐ　Ｔ　Ｓ　Ｐ　Ｇ　Ｄ　Ｔ　Ｔ　Ｐ　ｒＫ］ペプチド２（配列１０　Ｎｏ、　４）ＧＲＤＰＡＬＰＴＬＬＮＰＫペプチド３（配列ＩＤ　Ｎｏ、　５）ＤＤ　［Ｒ］　ＧＰＳＧＱＧＱＧＱＧＱＦＬＩＱＱＶＴペプチド４（配列ＩＤ　Ｎｏ、　６）ＦＩＩＤＥＧＦＩ（ＱＬＶＩＱＲペプチド５（配列１０　Ｎｏ、１９）Ｔ　Ｐ　Ｑ　Ｐ　Ｌ　Ｌ　Ｔ　［Ｇ］ペプチド６（配列１０　Ｎｏ、２０）丁ＬＰＳＧＬＤＤＹＫペプチド７（配列１０　Ｎｏ、２１）Ｌ　Ａ　Ｅ　Ｑ　Ｌ　Ｇ　Ｅ　Ａ　Ｅ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｅ　Ｌ　Ｇ　Ｐ　Ｉ、　Ａ　Ａ　Ｓ　Ｌ　Ｇ　Ａ　Ｅ　ＥＸ　［Ｌ］　Ｄ［Ｅｌここで括弧０内の残基は、表示する位置における確からしい／合理的な残基を示す。同義性ノオリコヌクレオチドの族、ＺＣ４１３５（表１０；配列ＩＤ　Ｎｏ、１１）およびＺＣ４１３６（表１０；配列ＩＤ　Ｎｏ、１３）は、ペプチド１のアミノ酸配列の末端部分（表９；配列ＩＤ　Ｎｏ、３）に相当するように設計しそして、さらに、ＥｃｏＲＩ制限部位をオリゴヌクレオチドの５′末端にサブクローニングを促進した。オリゴヌクレオチドはアプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏａｙｓｔｅｓｓ）３９４ＲＮＡ／ＤＮＡ合成装置アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ麿Ｓ、カリフォルニア州フォスターシティ−）で合成した。アンチセンスのオリゴヌクレオチドの族、ＺＣ４１３５（表１０；配列ＩＯＮｏ、１１）は１２８倍の同義性を有した。センスのオリゴヌクレオチドの族、ＺＣ４１３６（表１Ｏ；センス１２）は５１２倍の同義性を有した。ｌ且第１ゴヌクレオチドのプーイマーのＺＣ４１３５（配列１０　Ｎｏ、１１）ＡＡＡＡＴＡ　ＧＡＡ　ＴＴＣＴＴＧ　ＧＧＧ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＴＣＺＣ４１３６（配列Ｉｎ　Ｎｏ、１２）Ｔ　ＴＴ　ＴＴ　ＴＡＴＴ　ＡＧＡ　ＡＴＴ　ＣＴＴ　ＣＡＣＧＣＴ　ＧＣＴ　ＣＧＣＺＣ４１３Ｂ　（配列１０　Ｎｏ、１３）ＡＡＡｃｃｃｃＴ　ＴＴＴ　ＴＣＣＧ　ＡＣＧ　ＡＧＧ　ＣＣＧ　ＧＧＺＣ４２０４（配列ＴＯＮｏ、１４）ＴＡＴ　ＡＧＡ　ＡＴＴ　ＣＧＴ　ＧＡＣＴＴＧ　ＴＴＧ　ＧＡＴＺＣ４２０５（配列ＩＤ　Ｎｏ、１５）ＡＴＡ　ＡＧＡ　ＡＴＴ　ＣＧＡ　ＴＧＡ　ＴＣＧ　ＴＧＧ　ＴＣＣＺＣ４２１７（配列ＩＤ　Ｎｏ、１６）ＡＡＡＡＴＡ　ＡＧＡ　ＡＴＴ　ＣＧＧ　ＧＣＣＧＡＧ　ＧＧＧ　ＧＣＡＺＣ４２４１（配列ＩＤ　Ｎｏ、１７）ＡＡＡ　ＡＴＴＴＧＧ　ＴＧＧ　ＡＡＧ　ＣＣＣＴＣＧ　ＴＣＣＣＡ第１ｖＸのウシｃＤＮ＾を調製し、そしてＰＣＩ！反応のための鋳型ｃＤＮＡとして使用した。第１鎖のｃＤＮＡは、２つの別々の反応において、１回のポリｄ　（Ｔ）選択のウシ肝臓ポリ（Ａ）　十ＲＮＡから合成した。１つの反応（放射線標識したｄＡＴＰを含有する）を使用して、第１ｇの合成の量を評価した。第２の反応は放射線標識したｄＡＴＰの不存在下に実施し、そして、一部分、第２１の合成の量を評価した。スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を、詳しく後述するように、使用した。順次に、８μｌの５×逆転写酵素の緩衝液（ＧＩＢＣＯＢＲＬ；２５０ｍＭのトリスＨＣＩ、　ｐＨ８，３，３７５５ＭのＫＣＩ　、および１５＋ｗＭのＭｇＣ１ｚ）、２．０．ｃｒｌの２００ｓ＋Ｍのジチオスレイトール（新しく調製したか、あるいは−７０°Ｃでアリコートで貯蔵した）および１０ｍＭの各ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰおよび５− メチルｄＣＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含有する２、０μｌのデオキシヌクレオチドトリホスフェート溶液を混合することによって、室温において、２．５× 反応混合物を調製した０反応混合物を各６μｌの２本の管の中にアリコートで入れた。第１の管に、１．Ｏｕ　Ｉのｌ０ｕＣｉ／μｌのｃｒ”Ｐ−ｄＡＴＰ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加して、そして１．０μｍの水を第２の反応管に添加した。１４μｌの５ｚＭのトリスＭＣＩ、　ｐＨ７，４，５０＋＊ＭのＥＤＴＡ中で希釈した１０ｕｇのウシ肝臓ｐｏｌｙ（Ａ）　＋ＲＮＡを含有する１４μｌの溶液を、２μｌの１Ｍｇ／μｌの第１１Ｎ（７）プライマー、ＺＣ２９３８（ＧＡＣＡＧＡ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＣＴＡ　ＧＴＧＡＧＣＴＣＴ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＴＴ　ｉ配列ＴＯＮｏ、　９）と混合し、そしてプライマーをＲＮＡにこの混合物を６５℃に４分間加熱し、次いで氷水中で冷却することによってアニーリングした。８μｍの［？ＮＡＮブーイマー混合物を反応管の各々に添加し、次いで５Ｍｇの２０００／Ｉｌのスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を添加した０反応混合物をおだやかに混合し、そして管を４５℃において３０分間インキエベーシジンした。インキュベーシゴン後、８０ｕｌの１０ｍＭのトリスＨＣＩ、　ｐＨ７，４，１ｍＨのＥＤＴＡを容管に添加し、試料を渦形成し、そして短時間遠心した。２μｌの各反応混合物を取り出して、合計の計数およびＴＣＡの計数（！１１み込まれた計数）を決定した。各試料の２μｍをアルカリ性ゲル電気泳動により分析して、第１鎖の合成の量を評価した。５μｌの０．５ＭのＥＩＩＴＡおよびｌＯμＩの５ＭのＫＯＨを容管に添加し、そして反応成分を５分間６５℃にした。インキュベージぢン後、反応を３５μｍの８ＭのＮＨ４Ａｃおよび１３５ μｌのイソプロパツールの添加により停止した。この混合物を氷上で１５分間冷却し、そして１０，０００ｒｐ−で２０分間遠心した。沈澱物を５μｌの蒸留水の中に再懸濁させた。　１．５ｍｇの収量のｃＤＮＡが得られた。５０ｎＨの第１ＭのウシｃＤＮＡ、５　ＩＩ　Ｉの２．５ｚＭのｄＮＴＰ　（デオキシヌクレオチドトリホスフェートを含有する、Ｃｅｔｕｓ　ｓカリフォルニア州エメリービレ）、５／／ｌの１０ｘｐｃＲＩＩ衝液（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ。Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＮ）および５ａｌの各オリゴヌクレオチド（ＺＣ４１３５およびＺＣ４１３６、表１０ｉ配列ＩＤ　Ｎｏ、１１および１２）を２０ｐｍｏｌ／　ａ　ｌの出発濃度で含有するＰＣＲ反応混合物を調製した０合計の体積は５０ｕｌであった。ｌｕｌのＴａｑ　Ｉポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を添加し、そしてＰＣＲ反応を表１１に示す条件下に実施した。ｌ旦ブＷ色とと　−３サイクル９４℃で１分間３２℃で１分間７２℃で１．５分間贋ｆｆｉ上　−３５サイクル９４℃で１分間５５℃で１分間７２°Ｃで１．５分間増幅サイクルの最後のサイクル後、反応生成物を、ヌシーブ（Ｎｕｓｉｅｖｅ）ゲル（ＦＭＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、メイン州ロックランド）の中で電気泳動により分離した。５ｍ＋１の１０−Ｍのトリスル旧３．１ｓＭのＥ［ｌＴＡおよび５ａｌのフェノールの中でゲルを溶融することによって、はぼ６５塩基対のＤＮＡを単離した。この混合物を４０００ｒｐ■で室温において５分間回転しくＢｅｃｋｓ＋ａｎ　ＧＰＲ，Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州カールスパッド）そして水性層を新しい管に移した。増幅中の増幅したＤＮＡをエタノール沈澱させ、そして遠心により沈降させた。まず沈澱物を３０μｌの蒸留水の中に再懸濁することによって、Ｐｃｔ？反応を沈澱物について反復した。　ＰＣＲ試薬を前述したように添加し、そして反応混合物を５０μｌの最終体積にした。　ＰＣＲサイクルを表１１に記載するように反復したが、ブリサイクルを省略し、そして増幅サイクルを２回寛施した。生ずる反応生成物をゲル上で前述したように分離した。はぼ６５塩基対の長さのいくつかのバンドが見られ、これらは各オリゴヌクレオチドのプライマーの族を独立に使用する対照反応において見られない独特のバンドを含んだ。６５塩基対付近の領域をゲルから切断し、そしてＤＮＡを前述したように抽出した。ＰＣＲ反応を第２ラウンドの反応生成物を使用して第３回目に反復した。反応は表１１に記載するように実施したが、ブリサイクルは省略した。反応生成物を前述したようにゲル精製し、そして生ずるＤＮＡをＥｅｏＲＩで消化した。ＥｃｏＲＩ消化したＤＮＡをフェノール抽出し、そしてエタノール沈澱させた。増幅したＤＮＡを、ｐＨｃ１１８またはｐ［Ｉｃ１１９（ＥｃｏＲＩ消化により直線化しそして再循環を防止するために仔ウシアルカリ性ホスファターゼで処理されている）の中に結合した。結合混合物を、バイオラド・ジーン・パルサー（Ｂｉｏｒａｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ）　ＣＢｔｏｒａｄ　Ｒｔｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州）を使用して、製造業者が特定した高い効率の電子形質転換プロトコルに従い、ＤＨＩＯＢ能力ＬＡ互は細胞（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）の中に形質転換した。プラスミドＤＮＡを選択した形質転換体から調製し、そしてＤＮＡをガンマ−カルボキシラーゼのインサートの陽性の同定について配列決定した０表１２（配列ＩＤ　Ｎｏ、１８）に示す配列を有するクローンを単離した。さらに、サザン分析を、同義性のオリゴヌクレオチドｚｃ４１３８　（表１０；配列１０　Ｎｏ、１３）を使用して、プラスミドＤＮＡのアリコートについて実施し、ここでＺＣ４１３Ｂは、オリゴヌクレオチドのプライマーＺＣ４１３５およびＺＣ４１３６（表１０；配列１０　Ｎｏ、１１および１２）によりフランキングされた、ペプチド１の内部のアミノ酸配列（表９；配列１０　Ｎｏ、　３　）に相当した。】ＵヱＰＣＲのクローンの配列（配列夏Ｄ　Ｎｏ、１８）ＧＡＡ　ＴＴＣＴＴＴ　ＡＣＧ　ＣＴＴ　ＴＴＧ　ＧＣＡ　ＣＣＡ　ＡＣＣＡＧＴ　ＣＣＡ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＡＣＣＡＣＴＣＣＣＡＡＧ　ＡＡＴ　ＴＣペプチド３のアミノ酸配列（表９；配列ＩＯＮｏ、　５　）の末端部分に相当しかつオリゴヌクレオチドの５′末端にＥｃｏＲＩ制限部位を含有してサブクローニングを促進するように設計した、同義性オリゴヌクレオチドのプローブの族を使用して、ヌクレオチド配列を得た。オリゴヌクレオチドの族ＺＣ４２０４（表１０Ｆ配列１０　Ｎｏ、１４）は、ペプチド３（表９；配列ＩＯＮｏ、　５　）のアミノ末端部分に相当する。オリゴヌクレオチド（表９；配列ＩＤ　Ｎｏ、　５　）のカルボキシ末端部分に相当する。オリゴヌクレオチドの族ＺＣ４２１７（表１Ｏ；配列１０　Ｎｏ、１６）は、ペプチド３（表９；配列１０　Ｎｏ、　５　）の内部のアミノ末端残基に相当する。実施例１０に記載するように調製したウシ第１鎖のｅＤＮＡを、２つのＰＣＲ反応において鋳型として使用した。第１反応において、オリゴヌクレオチドの族ＺＣ４２０５（表１０ｉ配列ＩＤ　Ｎｏ、１５）を、オリゴヌクレオチドの族ＺＣ４２０４（表１０；配列１０　Ｎｏ、１４）と−緒にした。第２反応において、オリゴヌクレオチドの族ＺＣ４２０５（表１０；配列１０　Ｎｏ、１５）を、オリゴヌクレオチドの族ＺＣ４２１７（表１０；配列Ｉｎ　Ｎｏ、１６）と−緒にした。　ＰＣＲ反応は、土質的に前述したように、前述のプロトコルおよび表１３に記載する条件を使用して実施したが、ただしＰＣＲ生成物は粉砕および浸漬法を使用してゲル精製した。ゲルから適当なバンドを切断し、バンドをＴＥ　（１０ｓＭのトリスｐＨ８，１ｍＨのＥＤＴＡ　）の中でパスツールピペットで粉砕し、そして粉砕したゲルをＴＨの中で室温において一夜浸漬することによって、ＰＣＲ生成物を単離した。−夜のインキュベーション後、ゲルーＴＥ混合物をフェノール抽出し、そしてＤＮＡを含有する水性層をエタノール沈澱させる。Ｕブリサイクル　−４サイクル９４゛Ｃで１分間３６°Ｃで１分間７２℃で１．５分間１１ｍ仁り上　−２５サイクル９４°Ｃで１分間６０℃で１分間７２℃で１．５分間】ユｍＬＬ生　−２５サイクル９４゛Ｃで１分間６０゛Ｃで１分間７２℃で１．５分間表１２に示すＰＣＲ生成物の配列（配列ＩＤ　Ｎｏ、１８）を使用して、表１２のヌクレオチド１９〜３８からの２０のヌクレオチド配列（配列ＩＤ　Ｎｏ、１８）に相当するオリゴヌクレオチドのプローブを発生させた。このオリゴヌクレオチドのプローブを使用してウシ肝臓のｃＤＮＡライブラリーをブロービングし、ここでこのｃＤＮＡライブラリーは実施例１０に記載するように調製し、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（クローニング：　。のマニユアル　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕ　ｌ）　２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　ニーｓ−ヨーク州コールドやスプリング・ハーバ− １１９８９）　、その開示をここに引用によって加える）により本質的に記載されている標準の技術に従い調製した。ＰＣＲ生成物の配列から設計したオリゴヌクレオチドのプローブを、また、Ｆｒｏｈｓ＋ａｏら、（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５：８９９８−９００２゜１９８８、この開示をここに引用によって加える）により本質的に記載されているＲＡＣＥプロトコルにおいて使用して、ガンマ− カルボキシラーゼの配列を得た。ペプチド４のアミノ酸配列（表９；配列ＩＤ　Ｎｏ、　６　＞は、２０塩基対ニワタっテロ４の同義性を含有する同義性オリゴヌクレオチドノ族ヲそれから設計することができる配列を含有する。同義性第１ノゴヌクレオチドの族、ＺＣ４２４１（配列１０　Ｎｏ、１７）を、実施例１０ニ記載すルウシラムダｇｔｌｌのｃＤＮＡライブラリーのプローブとして使用する。このライブラリーを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）に記載されてしする標準の技術を使用して、スクリーニングする。陽性のクローンをプラーク精製し、そして制限および配列の分析により分析する。裏施■井モノクローナル抗体を、１ｉａｒｔ　（米国特許出願０７／１３９，９６０号、この開示をここに引用によって加える）に本質的に記載されてし）るようにして調製した。簡単に述べると、部分的に精製されたウシガンマ−カルボキシラーゼを、実施例８に記載するようにＳ−セファローズ（Ｓａｐｈａｒｏｓｅ）に、あるいはスルホ−プロピルセファローズ（５ｅｐｈａｒｏｓｅ）に結合した。結合した物質を完全フロインドアジュバント（ＩＣＮ　Ｂｉｏｃｈｅ■１ｃａｌｓ。カリフォルニア州コスタメサ）と混合し、そして１５０μｌの溶液／マウスを７週齢のＢａ１ｂ／ｃマウス（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ　Ｌａｂｓ、、カリフォルニア州ギルロイ）の中に腸腔内注射した０部分的に精製されたガンマ−カルボキシラーゼをスルホ−プロピルまたはＳ−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　（Ｐｈａｒ＋ｗａｃｉａ）に吸収させることによって促進注射物質を調製し、そして結合した物質を不完全フロインドアジュノくントと混合した。各マウスを１５０＃ｌの促進注射物質でほぼ２週の間隔で最初の２〜３カ月間促進し、その後はぼ１月の間隔で促進した。実施例８に記載するように第１の３回の注射後、抗カルボキシラーゼ抗体を発現するとして、マウスを同定した。２匹の３〜４週齢の、抗カルボキシラーゼ抗体を発現することが示された、Ｂａ１ｂ／ｃマウスを殺し、そして肺臓およびリンパ節を免疫化したマウスから取り、そして微細なメツシュのステンレス鋼のスクリーンの上部ではさみで細かく刻んだ、細かく刻んだ組織を微細なスクリーンを通して、１０ｍ１のＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯＢｌ？Ｌ）を有するベトリ皿の中に洗浄して入れた。細かく刻んだ組織の残部をスクリーンを通してスパチュラでプレスし、そしてスクリーンを５ｓ＋ｌのＲＰＭ１１６４０で洗浄した。残留する細胞物質を除去するために、スクリーンの底をかき取り、そして物質をベトリ皿に添加した。染色した組織を５０−１の遠心管の中に移し、そしてペトリ皿を１０−１のＲＰＭ１１６４０で洗浄して、残留する物質を除去した。細胞懸濁液を１０分間２００Ｘｇで遠心した。上澄み液を廃棄し、そして沈澱物を４ＭのＲＰＭ１１６４０の中に再懸濁させた。再懸濁後、１１の胎児仔ウシ血清（ＢｉｏＣｅｌＩ、カリフォルニア州カーソン）を容管に添加した。細胞懸濁液に１８ｍ１の無菌の蒸留水を添加することによって、赤血球の汚染物質を溶解した。この混合物を急速に攪拌し、そして５−１の４．２５％のＮａＣｌを容管に添加した。細胞懸濁液を２００Ｘｇで１０分間遠心した。上澄み液を廃棄し、そして沈澱物を１０ｍ１のＲＰＭ１１６４０の中に再懸濁した。残留する組織物質を除去するために、懸濁液を２層の無菌ガーゼを通して濾過して５０１の管に入れた。遠心管およびガーゼを追加の１０ｍ１のＲＰＭ１１６４０ですすいだ、生ずる細胞懸濁液の希釈物を血球計で計数してリンパ球の収量を決定した。調製した細胞を、使用するまで、室温においてほぼ１時間の間保持した。子供のマウスから得た胸腺は、細胞融合のフィーダ一層として作用する胸腺細胞源である。２匹の３〜４週齢のＢａ１ｂ／ｃマウスから得た胸腺から、胸腺細胞を調製した。胸腺をＭＳ−１培地（表１４）ですすぎ、そして微細なメツシュのステンレス鋼のスクリーン上ではさみで細かく刻んだ、細か（刻んだ組織をスクリーンを通して１０ｍ１のＭＳ−１培地で、ベトリ皿の中に入れた。胸腺組織をスクリーンを通してスパチュラでプレスしてペトリ皿の中に入れ、そしてスクリーンを１０■ｌのＭＳ−１培地で洗浄した。スクリーンの底を引っ掻いて付着した物質を除去し、そしてこの物質をペトリ皿の中にプールした。細胞を２層の無菌のガーゼを通して５０ｍ１の遠心管に移した。ペトリ皿およびガーゼを追加のＭＳ−１培地ですすいだ、細胞を２００Ｘｇで１０分間遠心した。上澄み液を廃棄し、そして沈澱物を１０■ｌのＮ５−１培地の中に再ｇ＠させた。細胞懸濁液の希釈物を血球計で計数した。収量は約４億の細胞であろう、細胞を室温において、使用するまで、貯蔵した。移二土豊並５００ｍ１の溶液について：５ｍ１　１０−Ｈの非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯＢＲＬ　、マリイランド州ガイサーバーグ）５■ｌ　１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｉｒｖｉｎｅ、カリフォルニア州すンタアナ）５ｇ＋１　２００ｍＭのし一グルタミン（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）５■ｌ１００Ｘペニシリン／ストレプトマイシン／ネオマイシン（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）７５ｍ　ｌ　不活性化胎児仔ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｓ、ユタ州ローガン）ｌ　ｇ　ＮａＨＣＯｓＵ用〆ＩＬ人上−一色３８．５ｍｇ　チミジン１３６．１−ｇ　ハイポキサンチン（Ｓｉｇｓａ、ミゾリー州セントルイス）１００（襲）じＬＬムＬ１７．６層ｇ　アミノプテリン無菌の蒸留水をアミノプテリンに添加して５０ｍ１の体積にした。アミノプテリンをＩＮのＮａＯＨの清々添加により溶解し、そして無菌の蒸留水を１００ｍ１の最終体積に添加した。この溶液を０．２２μＩのフィルターを通して濾過することによって滅菌し、そして−２０℃において貯蔵した。５Ｑ　Ｘ　ＨＡＴ５０■ｌ　１００　Ｘ　［ｌＴ５　ｓｌ　１０００ｘ　Ａストック４５ｍ１　蒸留水この溶液を０．２２μｌのフィルターを通して濾過することによって滅菌した。 −２０℃において貯蔵した。還藍豊里７ｍ１ＮＳ−１２■ｌ　胎児仔ウシ血清１　ｍｌ　ＤＭＳＯ成分を混合し、そして各凍結について新鮮にする。ＭＳ−１マウス骨髄腫細胞系を融合のために使用した。融合手順を最適にするために、ＭＳ−１系統をクローニングして、高い融合効率をもつクローンを分離した０Ｍ５−１細胞を９６ウエルマイクロタイタープレートの中に、ＭＳ−１培地＋２．５　Ｘ　１０”胸腺細胞／置Ｉ（上のようにして調製した）の中で５および１０細胞／ウエルの平均で、制限希釈することによってクローニングした。プレートを３７℃において７％のＣＯｔを使用して１０日間インキエベーシゴンした。第１０日に、細胞を顕微鏡的に検査し、そして単一のコロニーを含有するウェルについてスクリーニングした。同一の日に、２−５　Ｘ　１０’の胸腺細胞を含有する１００μｌの新鮮なＭＳ−１培地を細胞に添加した。第１４日に、最も激しく成長している単一のコロニーのうちの８つを融合のために増殖させた。８つの候補のコロニーを１．５〜２■ｌのＭＳ−１培地＋２．５Ｘ１０”胸腺細胞／ウェルを含有する個々の２４ウエルのプレートに移した。プレートを３７℃において７％のＣＯ８でインキュベーションし、そして細胞を適当な間隔で分割して、フラスコ培養に移すために十分な数の細胞を得た。各クローンからのｉ　、　ｏｏｏ万の細胞を５０ｍ１のＭＳ−１を含有する７５ｃｍ”の組織培養フラスコの中に接種した。フラスコを３７℃において７％のＣＯｔで、細胞が少なくとも５Ｘ１０’細胞／−１の密度に到達するまで、インキュベーションした０次いで、細胞を遠心により収量し、そして凍結培地（表１４）でほぼ５Ｘ１０’細胞／＊１の濃度に希釈した。細胞を１■ｌのアリコートに分割し、そして最初に一８０℃、次いで一１３０℃に、段階的に凍結した。３７℃に保持した水の中で各クローンの１つのバイアルを急速融解することによって、クローンをアッセイした。ＭＳ−１培地を含有するフラスコの中に２Ｘ１０’細胞／　ｓ　１の濃度に細胞を接種した。細胞を３７℃において７％のＣ（ｈで成長させた。細胞を毎日２Ｘ１０’ｌｌ胞／ＩＩＩにカットバックした。融合の１日前に、５０−夏の細胞培養物を含有する２つの７５ｃ■２のフラスコを準備した。各候補のＭＳ−１クローンを免疫化したマウス牌細胞と混合し、そして後述するように融合した。融合の結果は、クローンＦと表示する１つのクローンが増加した融合効率を有することを示した。融合のために、２．５Ｘ１０’のＮ５−１クローンＦを、前述するように、急速に融解し、そして調製した免疫化マウス牌細胞およびリンパ節細胞に添加した。混合した細胞を２００Ｘｇで１ｏ分間遠心し、そして上澄み液を除去した。細胞の沈澱物を１００μｌのＲＰＭ１１６４０の中に再懸濁させ、そして３７゛Ｃの水の中で加温した。ＲＰＭ１１６４０中の５０％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ　）溶液の１■ ｌを、１％の重炭酸塩ナトリウムでｐＨ７，０〜８．０の範囲に調節した。　ＰＥＧ溶液を細胞懸濁液に１分かけておだやかに撹拌しながら添加した。この溶液をさらに１分間攪拌した。１ｓｌのＭＳ−１培地を１分がけておだやかに撹拌しながら添加した。追加の１１を懸濁液に１分かげて添加した。８ｓｌのＭＳ−１培地を２分かけておだやかに撹拌しながら添加し、次いでこの懸濁液を室温において１２５Ｘｇで１ｏ分間遠心することによって沈澱させた。上澄み液を廃棄し、そして細胞を１２ｍ１のＭＳ−１培地の中におだやかに再懸濁させた。細胞を１７５ｃｍ”のフラスコの中に移した。４便の胸腺細胞（上のようにして調製した）をフラスコに添加した８体積をＮ５ −１培地で１６０ｍ１に調節し、そしてこの混合物を３７℃において７％のＣＯ，で２〜４時間インキュベーションした。インキュベーション後、３．２ｓｌの５０　Ｘ　ＨＡＴ　（表１４）を添加したや細胞懸濁液を８つの９６ウエルのプレートに２００μｌ／ウエルで移し、そしてプレートを３７°Ｃにおいて７％のＣＯ７でインキュベーションした。プレートを３日後顕微鏡検査して、はぼ５ハイブリドーマのコロニー／ウェルを期待して、融合効率を決定した。７日後、１００μｍの培地をＩＸＨＡＴおよび２．５ ×１０”胸ＭｗＪ胞／■１を含有する新鮮なＭＳ−１培地で置換することによって、細胞を供給した。ハイブリドーマを第９日と第１４日との間で特定のモノクローナル抗体の生産について試験した。モノクローナル抗体は　１１５■−ガンマ−カルボキシラーゼに選択的に結合する能力、およびペプチドの基質の中へのＣｏ２に組口込みにより測定して、カルボキシラーゼ活性を示す物質に結合する能力の両者について試験した。ヨードビーズ（Ｉｏｄｏｂｅａｄｓ）　（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）および製造業者により供給される標準のプロトコルを使用して、ガンマ− カルボキシラーゼのヨウ素化を実施した。　１００１ｊＩのガンマ−カルボキシラーゼを０．５１ＣｉのＩｔｓヨウ素をもつヨードビーズに添加し、そしてこの混合物を氷上に１５分間配置した。インキュページテン後、１．５＋ｗｌのＴＮＣ／Ｐ緩衝液（表１５）を添加し、そしてこの混合物をＧ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の上に通した。８つの分画を集め、最初の分画の体積は１．５ｓｌであり、そして引き続く分画の体積は０．５■ｌであった。すべての８つの分画をガンマカウンターで計数した。紅旦全ヱ０．１ＭのＮＮａＣ１５ｋのトリスＨＣＩ、　ｐ［１７，４０，２５％のホスファチジルコリンＶＥ型（Ｓｉｇ■ａ）０．２５％のＣ［！ＡＰＳ　（Ｓｉｇｓ＋ａ）Ｌｆｆｉ翫倉１０■１の２Ｍのトリス塩基、ｐｕｓ２５ａ＋　１の４ＭのＮａＣｌ３ｍ１のＮｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０（Ｓｉｇｍａ）５．０ｇのナトリウムデオキシコレート１．５ｇのナトリウムヨウ素１０．０　ｇのＢＳ八へ両■　１％合計の体積を１リツトルとし、そしてｐＨ８に調節した。カルボキシー−ゼ　パ人９５０μｌの３．８Ｍの硫酸アンモニウム７５０μｍの１０−ＭのＥＥＬ（ＢＯＣ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−ＯＭＥ）　（Ｂａｃｄｈｅｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ。ペンシルベニア州フィラデルフィア）１５０μｍの１％のＣＨＡＰＳＣＣｓｔＨｓｗｌＯｔＳ）　（Ｓｉｇｍａ）１５０μｍの１％のナトリウムコレート中の１％のホスファチジルコリンＩＩＩＥ型（Ｓ　ｉ　ｇｗ＋ａ　）７５ｓｌの０．２ＭのＤＴＴ　（ジチオスレイトール）１５０μｌのＮａＨ”ＣＯｓ　（（５ｓ＋Ｃｉ　／　２．５ｓｌ：ｌ＾−ｅｒｓｈａｍ、イリノイ州アーリントンハイツ）８０μｌのビタミンにハイドロキノン呈１１１益１０ｍ１の最終体積の水中の６ｇの尿素を３７℃の水浴中で、すべての尿素が溶解するまで、加熱した。１曽１の２０％のＳＯ３を添加し、そしてこの溶液を室温において貯蔵した。ＩｔｓＩ−ガンマ−カルボキシラーゼに選択的に結合するモノクローナル抗体の能力を、放射線免疫沈澱のアンセイ（ＲＩＰＡ）により試験した。結合する複合体のそれ以上の同定はゲル分離により実施した。５μｌの目５７−ガンマ−カルボキシラーゼ（前述したようにして調製した）を、マイクロタイタープレートの各ウェルに添加した。５μｌの丁ＮＣ／Ｐ　３１衝液を各ウェルに添加し、そしてＩＭのナトリウムヨウ素を各ウェルに１０曽Ｈの最終濃度に添加した。最後に、５０／７１の各モノクローナルハイブリドーマを含有する培地を添加した。プレートを４°Ｃにおいて震盪しながら１時間インキュベーションした。ＰＢＳ中で希釈したｌｕｌの０．１ｇｇ／−１のウサギ抗マウスＩｇＧ（ＣａｐｐｅｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を各ウェルに添加し、そしてプレートを４℃ において震盪しながら１時間インキュベージタンした。前以て清浄にしたパンソービン（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ）細胞（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｓ＋、カリフォルニア州うジララ）を、１ｓｌのよく混合したパンソービンをマイクロフージの中で４　”Ｃにおいて最大速度で４０秒間遠心することによって調製した。上澄み液を除去し、そして沈澱物を１ｓｌの旧Ｐ緩衝液の中に再懸濁させた。細胞を氷上で２０分間インキエベーシッンした。インキュベーション後、細胞を前述したようにしてさらに２回沈澱および再懸濁させた。細胞を４℃ において貯蔵した。インキュベーション後、２５μｌのＲＩＰ緩衝液（表１５）の中で前以て清浄にしたパンソービン　ブドウ　（Ｓｔａ　ｈ　１ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）細胞を各ウェルに添加した。プレートを、震盪器上で高速で、４℃においてインキュベーションした。ＴＢ−４０−ターを有するベックマン（Ｂｅｃｋｍａｔ＋）ＴＪ　−６遠心＠（Ｂｅｅｋｍａｎ、カリフォルニア州カールスパッド）の中でプレートを２００Ｏｒｐｍで４℃において５分間遠心することによつて、細胞を沈澱させ、そして上澄み液をベントマニホールド（Ｆｉｃｓｈｅｒ　２ｌ−ｆ６９−１０Ｌ　Ｆｉｃｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｇｒｏｕｐｓ　、カリフォルニア州すンタクララ）を使用して除去した。沈澱物を１５０μｌのＲＩＰ　緩衝液／ウェルの中に再懸濁させた。この手順をさらに２回反復した。最後のすすぎ後、各再懸濁した沈澱物をプラスチック管に移し、そしてバラカード・コブラ・オート−ガンマ（Ｐａｃｋａｒｄ　Ｃｏｂｒａ　Ａｕｔｏ−にａｍｇｔａ）カウンター（Ｄｏｗｎｅｒｓ　Ｇｒｏｖｅ、イリノイ州）で計数した。モノクローナル抗体をカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質に結合する能力について試験した。カルボキシラーゼ活性は、カルボキシラーゼ反応において” 　ｃ−ｃｏｔの組み込みの関数として測定した。各クローンからの５０ｕｌのハイブリドーマを含有する培地を、９６ウエルのリンプロ・タイターチク（Ｌｉ＋ｘｂｒｏ　Ｔｉｔｅｒｔｅｋ）マルチウェルのプレート（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の各ウェルに添加した６　５０　ｕ　１のウシミクロソームを各ウェルに添加した。混合後、プレートをコスタ−・セロクラスター・プレート・シーラー（Ｃｏｓｔａｒ　５ｅｒｏｃｌｕｓｔａｒＰｌａｔｅ　５ｅａｌｅｒ）　（Ｃｏｓｔａｒ、マサチュセッツ州ケンブリッジ）でカバーし、そして４℃においておだやかに震盪しながら１時間インキュベージタンした。１０μ＋／ウエルの１＋＋＋ｇ／ｍｌの精製したウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ、ペンシルベニア州ウェストチェスター）の１：１０希釈物を各ウェルに添加し、そしてプレートを４℃において１時間インキュベージジンした。インキュベージ５ン後、２５μｌのＴＮＣ／Ｐパンソービンｉ負ブ工盈ＵＳ迫吐且匹玉ｃｕｓ　ａｔ圧蜆ａ細胞を各ウェルに添加し、そしてプレートを４℃において１時間インキュベージジンした。前以て清浄にした細胞を前述したようにして調製したが、ただしＴＮＣ／Ｐ緩衝液（表１５）をＲＩＰ緩衝液の代わりに使用した。インキュベーション後、Ｔ■〜４０−ターを有するベックマン（Ｂａｃｋｖａｎ）ＴＪ　６遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ、カリフォルニア州カールスパッド）の中でプレートを２０００ｒｐ−で４°Ｃにおいて５分間回転した。上澄み液を吸引し、そして沈澱物を１５０μｌのＴＮＣ／Ｐ緩衝液の中に再懸濁させた。プレートを前述したように回転し、そして上澄み液を再び吸引した。沈澱物を１５０μ ｌのＴＮＣ／Ｐ　！ｌｌ液液中に再Ｍ濁させ、そして前述したように回転した。すすぎを合計３回反復した。最終のすすぎ後、沈澱物を１００．１／ウエルのＴＮＣ／Ｐ緩衝液の中に再懸濁させ、そして１３３μｌのカルボキシラーゼ反応混合物（表１５）を各試料に添加した。試料をマイクロフージ管に移し、そして室温において１時間〜１夜インキュベーションした。インキュベーション後、１１１１の１０％のトリクロロ酢酸を各試料に添加した。インキュベーション後、試料をエフペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）マイクロフージの中で４°Ｃにおいて最大速度で１５分間回転した。各試料からの１ｇ＋１の上澄み液をジンチレーシッンバイアルに移し、そして１ｍｌの無菌の水を各バイアルに添加した。試料を１つの各沸騰チップとともに、数■ ｌのみの液体が残留するまで、５分間沸騰させた。バイアルを室温に冷却し、そして１０ｗ１のパイオーセイフ（Ｂｉｏ−５ａｆｅ）　ＩＩ　（Ｒｓｅａｒｃｈ　ＰｒｏｄｕｃｔｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　、イリノイ州マウントブロスペクト）を各バイアルに添加した。試料をベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＬＳ　１８００液体シンチレーシｑンカウンターで計数した。第１日に、最初の分画からのウェルをＩｘｓ■−ガンマ−カルボキシラーゼに選択的に結合する能力について前述のＲＩＰＡアッセイによリスクリーニングした　１！＄７−ガンマ−カルボキシラーゼに選択的に結合することができる抗体を生産することが発見されたウェルを第２日にスクリーニングして、前述のカルボキシラーゼ活性のアッセイにおいてカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質に結合することができる抗体を生産するウェルを検出した。最初の融合から、１７０．１．１および１７０．３．１と表示する２つのウェルは、両者のアッセイにおいて陽性であることが発見された。第２融合からのウェルを、前述のＲＩＰＡアフセイおよびカルボキシラーゼ活性のアッセイの両者を使用して平衡にスクリーニングした。ウェルのうちで、１７１．２．１および１７１．４．４と表示する２つのクローンは、選択的に＋ｔｓ■−ガンマーカルボキシラーゼに結合しかつカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質に結合することができる抗体を生産することが示された。はぼ６０ウエルは、カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質に結合することができるが、″ｓ■−ガンマーカルボキシラーゼに結合することができない抗体を生産するとして同定された。これらの後者のクローンのうちで、１７１．５．１および１７１．４．１と表示する２つをそれ以上の使用のために選択した。６つのクローン１７０．１．１．１７０．３．１．１７１．２．１．１７１．４．１．１７１．４．４および１７１．５．１を連続希釈して９６ウエルのマイクロタイタープレートに入れて、単細胞から生ずるクローンを単離した。単細胞から生ずるクローンを再スクリーニングし、そしてクローンを拡張させた。モノクローナル系統からの培地を、本質的に次の文献に記載されているように精製するために、プロティンＡのカラムに通過させた：クロマトグーフィー：　および　ＡｆｆｊｎｉｔＣｈｒｏｍａｔｏ　ｒａｐｈ　：　Ｐｒ１ｎｃｉ　ｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）　（Ｐｈａｒｗａｃｉａ　ＦｉｎｅＣｈｅ＋＋＋１ｃａｌｓ、スウェーデン国つップサラ、１９８３、この開示をここに引用によって加える）、クローン１７０．３．１をマウスの中に腹腔的注射して腹水を獲得し、これを前述したようにプロティンＡのカラムで精製して、引き続き実験において使用するためのモノクローナル抗体を精製した。１施Ａ■ 前述のモノクローナル抗体を個々に使用して実施例１０に記載するように調製したウシラムダｇｔｌｌのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするか、あるいは各々１μｍ／ｍｌの濃度で一緒にして前記ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。実施例１２に一般に記載したように免疫化したマウスからのポリクローナル血清を、また、利用してウシラムダｇｔｌｌのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。実施例１０に記載するウシラムダｇｔｌｌのｃＤＮＡライブラリーからの１〜３００万のファージを、制限した数のＰＬＫＦ！Ｉ！胞に吸収させた。次いで、細胞をＥ、　ｃｏｌｉ　Ｙ１０９０細胞とプレートして、ｓｏ　、　ｏｏｏプラーク／１５０ｍ１プレートを得た。あるいは、１〜３００万のファージをＰＬＸＦ細胞とプレートして、５０．００（］プラーク／　１５（ｌｓ＋１プレートを得た。プレートを３７℃または４２℃で３．５時間成長させた。　１０ｗＭのＩＰＴＧの中に前以て浸漬したニトロセルロースのフィルターを、３７℃または４２゛Ｃにおいて一夜インキュベーションした。フィルターを菌叢から取り出し、そして第２の前以て浸漬したニトロセルロースのフィルターを菌叢の上に横たえ、そして３７℃または４２℃においてさらに６時間インキュベージジンした。第２フイルターを菌叢から取り出した。二重反復実験のフィルターをＴＢＳ　（５０ｗＭのトリスｐＨ８，０，１５０− 旨のＮａＣ１）の中で２回洗浄した。第２の洗浄後、フィルターをＴＢＳ＋３％のＢＳＡの中で１時間ブロックした。ブロックしたフィルターを、ＴＢＳ＋３％のＢＳＡＯ中の１〜２μｇ／鋤ｌの抗体（１７０，３，１，１，１７１，２，１、モノクローナル抗体のプールまたはポリクローナル血清）を含有する溶液に移した。フィルターを室温において４〜２０時間インキエベーシヲンした。インキュベーション後、過剰の抗体をＴＢＳで２回洗浄し、ＴＢＳ　＋　０．１％のＮＰ　−４０で１回洗浄し、ＴＢＳでさらに２回洗浄し、そして最後にＴＢＳ＋３％のＢＳＡで洗浄して除去した。フィルターをＴＢＳ＋３％のＢＳＡ　＋　”’ Ｉ−プロティンＡ　（Ａｍｅｒｓｈａｖ＊から入手したか、あるいは実施例１３に記載されているヨードビーズのヨウ素化のプロトコルを使用してＳｉｇ■ａから入手したプロティンＡをもちいてヨウ素化した）の中で、室温において４〜２０時間インキュベージコンした。過剰の標識をＴＢＳの中で２回、ＴＢＳ　＋　０．１％上のＮＰ　−４０で１回、そしてＴＢＳで３回洗浄することによって除去した。フィルターを乾燥し、そしてＸ線フィルムに露出した。陽性のプラークをプラーク精製のために取り上げた。本発明の特定の実施態様を例示の目的で記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱しないで変化および変更が可能である。したがって、本発明は添付する請求の範囲による以外限定されない。配列表（１）一般情報（ｉ）出願人：バーフナ−キャリーＬ（ｉｉ）発明の名称；ガンマ−カルボキシラーゼ及び使用の方法（ｉｉｉ）配列の数：２１（ｉｖ　）連絡先：（Ａ）宛先　：シードアンドベリー（Ｂ）街　；５番街７０１．　コロンビアセンター６３００（Ｃ）都市　：シアトル市（Ｄ）州　：ワシントン州（Ｅ）国　：アメリカ合衆国（Ｆ）郵便番号：　９８１０４−７０９２（Ｖ）コンピューター読み出し方式：％式％（ｖｉ）現先願のデーター：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日　：（Ｃ）分Ｗ４：（ｖｉ）先の出願のデーター：（Ａ）出願番号：　ｕｓ　ｏ７１５５７．２２０（Ｂ）出願日　：　１９９０年７月２３日（ｖｉ）代理人情報（Ａ）名称　：マキ　デビフドＪ（Ｂ）登録番号：　３１，３９２（Ｃ）参考／代理人番号：　９９０００８．５４４ＰＣ（ｉｘ）通信情報：（Ａ）電話　：　２０６−６２２−４９００（Ｂ）ファックス：　２０６−６８２−６０３１（２）配列ｌ０ＮＯ：１に関する情報（１）配列の特＠：（Ａ）長さ　：２１アミノ酸（Ｂ）種類　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二線状（Ｖ）フラグメントの種類：内在型（ｖｉ）起源：（Ａ）有機体二人類（ｘｉ）配列の詳細：配列ＩＤＮ０：１（２）配列ＩＤＮ０：２に関する情報（１）配列の特ｒ＆：（Ａ）長さ　：１７アミノ酸（Ｂ）種類　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二線状（Ｖ）フラグメントの種類：内在型（ｖｉ）起源：（Ａ）有機体二人類（ｘｉ　）配列の詳細：配列１０　ＮＯ：　２（２）配列１０　Ｎｏ　：　３に関する情報（Ｉ）配列の特＠：（Ａ）長さ　＝１５アミノ酸ＣＢ）種類　；アミノ酸（Ｄ）トポロジー：１ｓ状（Ｖ）フラグメントの種類：内在型（ｘｉ）配列の詳細：配列ＩＤ　Ｎｏ　：　３（２）配列ＩＤ　Ｎｏ　：　４に関する情報（Ｉ）配列の特＠：（Ａ）長さ　：１３アミノ酸（Ｂ）種類　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二線状（Ｖ）フラグメントの種類：内在型（ｘｉ）配列の詳ｗ：配列ｌ０ＮＯ：４（２）配列ＩＤ　Ｎｏ　：　５に関する情報（Ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ　：２１アミノ酸（Ｂ）種！Ｉ　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：線状（Ｖ）フラグメントの種類：内在型（ｘｉ）配列の詳細：配列１０　ＮＯ：　５（２）配列ＩＤ　Ｎｏ　：　６に関する情報（Ｉ）配列の特＠：（Ａ）長さ　：１４アミノ酸（Ｂ）種類　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二線状（Ｖ）フラグメントの種類：内在型（ｘｉ　）配列の詳細：配列Ｉｎ　Ｎｏ　：　６Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｕｙ　ＰｈｅＨｉｓ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ５１Ｏ（２）配列１０　Ｎｏ　：　７に関する情報（Ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ　：２０塩基対ＣＢ）種類　：核酸（Ｃ）Ｉ　ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：ｗＡ状（ｖｉ）直接の起源：ＣＢ）　りＯ−７：ＺＣ２５７５（ｘｉ）配列の詳細：配列ＩＤ　ＮＯ：　７ＡＣＡＴＴＣＡＧＣＡ　ＣＴＧＡＧＴＡＧＡＴ　２０（２）配列ＩＤＮ０：８に関する情報（Ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ　：２０塩基対（Ｂ）種類　：核酸（Ｃ）饋　ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｖｉ）直接の起源：、　（Ｂ）りＯ−７：ＺＣ２５７６（ｘｉ　）配列の詳細：配列１０　ＮＯ：　８ＡＴＣ丁ＡＣＴＣＡＧ　丁ＧＣＴＧＡＡＴＧＴ　２０（２）配列ｌ０ＮＯ＝９に関する情報（Ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ　：４３塩基対（Ｂ）種類　：核酸（Ｃ）鎖　ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）　りＣ！−ン：ＺＣ２９３Ｂ（ｘｉ　）配列の詳細：配列ＩＤ　Ｎｏ　：　９ＧＡＣＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＴＴＣＡＣＴＡ　ＧＴＧＡＧＣＴＣＴＴ　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴ　４３（２）配列Ｉｎ　Ｎｏ　：　ＩＯニ５Ｈする情報（１）配列の特＠：（Ａ）長さ　：４２塩基対（Ｂ）ｉｆ類　：核酸（Ｃ）Ｉ　、−末鎖ＣＤ）トポロジー二線状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）　９　ｔ）−７：ＺＣ３７４７（ｘｉ）配列の詳細；配列ＩＤ　ＮＯ：　１０ＧＡＣＡＧＡＧＣＡＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴ　ＡＣＴＣＧＡＧＴＴＴ　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＴ　４２（２）配列ＩＤ　ＮＯ：　１１に関する情報（ｒ）配列の特徴：（Ａ）長さ　；２３塩基対（Ｂ）種ｌｌ：核酸（ＣＨ！　ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）りｏ　−７：　ＺＣ４１３５（ｘｉ）配列の詳細：配列１０　ＮＯ：　１１ＡＴＡＧＡＡＴＴＣＴ　ＴＮＧＧＮＧＴＮＧＴ　ＲＴＣ２３（２）配列ＩＯＮｏ　：　１２に関する情報（Ｉ）配列の特＠：（Ａ）長さ　：２４塩基対（Ｂ）種類　：核酸（Ｃ）Ｉ　ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二線状（Ｖ）フラグメントの種！［＝内在型（■）直接の起源：（Ｂ）　’）ローン：ＺＣ４１３６（ｘｉ）配列の詳細：配列Ｉｎ　Ｎｏ　：　１２ＡＴＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＹＡＣＮＹ丁ＭＹ　ＴＮＧＣ２４（２）配列ＩＤ　Ｎｏ　：　１３に関する情報（１）配列の特徴：（Ａ）長さ　：１４塩基対（Ｂ）種！［：核酸（Ｃ）鎖　ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）りＯ−７：　ＺＣ８３Ｂ（ｘｉ）配列の詳細：配列１０　ＮＯ：　１３ＣＣＮＡＣＮＷＳＮＣＣＮＧＧ　１４（２）配列１０　Ｎｏ　：　１４に関する情報（１）配列の特＠、：（Ａ）長さ　：２４塩基対（Ｂ）種類　：核酸（Ｃ）鎖　ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：　ＺＣ４２０４（ｘｉ　）配列の詳細：配列ＩＤ　ＮＯ：　１４ＴＡＴＡＧ＾＾ＴＴＣＧＴＮＡＣＹＴＧＹＴ　ＧＤＡＴ　２４（２）配列ＩＯＮｏ　：　１５に関する情報（１）配列の特徴：（Ａ）長さ　：２４塩基対（Ｂ）種Ｗ４：核酸（Ｃ）［ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ガ）直接の起源：（Ｂ）りｏ　−７：　ＺＣ４２０５（ｘｉ　）配列の詳細；配列ＩＣＮＯ：　１５ＡＴＡＡＧＡＡ丁ＴＣＧＡＹＧＡＹＭＧＮＧ　ＧＮＣＣ２４（２）配列１０　ＮＯ：　１６に間する情報（Ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ　：２４塩基対（Ｂ）種類　：核酸（Ｃ）Ｍ　ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：線状（ｖｉ）直接の起源：ＣＢ）りｅ７−ン：ＺＣ４２１７（ｘｉ）配列の詳細：配列Ｉｎ　Ｎｏ　：　１６ＡＴＡＡＧＡＡＴＴＣＧＧＮＣＣＮＷＳＮＧ　ＧＮＣＡ　２４（２）配列１０　Ｎｏ　：　１７に関する情報（１）配列の特＠：（Ａ）長さ　：２０塩基対（Ｂ）種類　：＃ｉ酸（Ｃ）饋　ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｖｉ）直接の起源；（Ｂ）りｏ−ｙ　：ＺＣ４２４１（ｘｉ）配列の詳１：配列１０　ＮＯ：　１７ＴＧＲＴＧＲＡＡＮＣＣＹＴＣＲＴＣＣＣＡ　２０（２）配列ＩＤ　ＮＯ７１８に関する情報（１）配列の特徴：（Ａ）長さ　＝５６塩基対（Ｂ）種ｌｌ：核酸（Ｃ）饋　ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二線状（ｘｉ）配列の詳ＩＩＩ：配列１０　ＮＯ：　１８ＧＡＡＴＴＣＴＴＴＡ　ＣＧＣＴＴＴＴＧＧＣＡＣＣＡＡＣＣＡＧ丁　ＣＣＡＧＧＡＧＡＴＡ　ＣＣＡＣＴＣＣＣＡＡＧＡＡＴＴＣ５６（２）配列Ｉｎ　Ｎｏ　：　１９に関する情報（１）配列の特徴：（Ａ）長さ　二８アミノ酸（Ｂ）種！！二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二線状（Ｖ）フラグメントの種類：内在型（ｘｉ）配列の詳細：配列１０　Ｎｏ　：　１９（２）配列ＩＤ　Ｎｏ　：　２０に関する情報（１）配列の特＠：（Ａ）長さ　：１０アミノ酸（Ｂ）種類（Ｄ）トポロジー二線状（Ｖ）フラグメントの種類：内在型（ｘｉ）配列の詳細：配列１０　ＮＯ：　２０Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ（２）配列１０　ＮＯ：　２１に関する情報（１）配列の特徴：（Ａ）長さ　＝２９アミノ酸（Ｂ）種類　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二線状（Ｖ）フラグメントの種類：内在型（ｘｉ）配列の詳細：配列ＩＤ　ＮＯ：　２１Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＧＩＬＩ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　［、ｅｕ　Ｇｌｙｌ　５　１０　１５ＦＩ６．１Ｅｃｏ　ＲＸＩのぐ浄ＩＦ（内容に変更なし）要約書肝臓ミクロソームと比較して少なくとも２０，０００倍濃縮されたガンマ−カルボキシラーゼ活性を有するタンパク質組成物を提供する。更に、ガンマ−カルボキシラーゼをエンコードするＤＮＡ分子を提供する。このタンパク質組成物およびＤＮＡ分子はガンマ−カルボキシル化されたビタミンに一依存性タンパク質を生産する方法において有用である。手続補正書（方式）％式％１、事件の表示ＰＣＴ／Ｕｓ’？１１０５１７７２、発明の名称ガンマ−カルボキシラーゼおよび使用の方法３、補正をする者事件との関係　特許出願人名称　ザイモジェネティクス。インコーホレイティド４、代理人住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付６、補正の対象（１）明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文７、補正の内容（１）明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録（１）明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文　各１通国際調査報告国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．肝臓のミクロソームに比較して少なくとも２０，０００倍に濃縮されたガンマーカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質組成物。
２．前記タンパク質はウシ、ヒトおよびラットのガンマーカルボキシラーゼから成る群より選択される、請求項１に記載のタンパク質組成物。
３．前記タンパク質が肝臓のガンマーカルボキシラーゼである、請求項１に記載のタンパク質組成物。
４．前記タンパク質は固体の支持体に固定されている、請求項１に記載のタンパク質組成物。
５．前記活性は肝臓のミクロソームに比較して１００，０００倍に濃縮されている、請求項１に記載のタンパク質組成物。
６．前記タンパク質は表９のペプチド１、ペプチド２、ペプチド３、ペプチド４、ペプチド５、ペプチド６またはペプチド７のアミノ酸配列（配列ＩＤＮｏ．３，４，５，６，１９，２０および２１）を含んでなる、請求項１に記載のタンパク質組成物。
７．ガンマーカルボキシラーゼをエンコードする単離されたＤＮＡ配列。
８．前記配列は表１２のヌクレオチド１９〜ヌクレオチド３９のヌクレオチド配列（配列ＩＤＮｏ．１８）を含んでなる、請求項７に記載のＤＮＡ配列。
９．前記ガンマーカルボキシラーゼは表９のペプチド１、ペプチド２、ペプチド３、ペプチド４、ペプチド５、ペプチド６又はペプチド７のアミノ酸配列（配列ＩＤＮｏ．３，４，５，６，１９，２０および２１）を含んでなる、請求項７に記載のＤＮＡ配列。
１０．前記ガンマーカルボキシラーゼがウシ、ヒトおよびラットのガンマーカルボキシラーゼより成る群から選択されたものである、請求項７に記載のＤＮＡ配列。
１１．前記ガンマーカルボキシラーゼが肝臓のガンマーカルボキシラーゼである、請求項７に記載のＤＮＡ配列。
１２．請求項７〜１１のいずれかに記載のｃＤＮＡ配列。
１３．請求項７〜１２のいずれかに記載のＤＮＡ配列を発現するようにトランスフェクションまたは形質転換された培養された細胞。
１４．前記ガンマーカルボキシラーゼが表９のペプチド１、ペプチド２、ペプチド３、ペプチド４、ペプチド５、ペプチド６またはペプチド７のアミノ酸配列（配列ＩＤＮｏ．３，４，５，６，１９，２０および２１）を含んでなる、請求項７に記載の培養された細胞。
１５．前記細胞が哺乳動物の細胞である、請求項１３に記載の培養された細胞。
１６．前記細胞はビタミンＫ依存性タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列を発現するようにさらにトランスフェクションまたは形質転換されている、請求項１３に記載の培養された細胞。
１７．工程：ガンマーカルボキシラーゼをエンコードする第１ＤＮＡ配列およびビタミンＫ依存性タンパク質をエンコードする第２ＤＮＡ配列を発現するようにトランスフェクションまたは形質転換された細胞を培養し、そして前記第２ＤＮＡ配列によりエンコードされたビタミンＫ依存性タンパク質を単離する、からなる、ビタミンＫ依存性タンパク質を生産する方法。
１８．前記第１０ＤＮＡ配列は表１２のヌクレオチド１９〜ヌクレオチド３８のヌクレオチド配列（配列ＩＤＮｏ．１８）を含んでなる、請求項１７に記載の方法。
１９．前記ガンマーカルボキシラーゼは表９のペプチド１、ペプチド２、ペプチド３、ペプチド４、ペプチド５、ペプチド６またはペプチド７のアミノ酸配列（配列ＩＤＮｏ．３，４，５，６，１９，２０および２１）を含んでなる、請求項１７に記載の方法。
２０．前記細胞は培養された真核生物細胞である、請求項１７に記載の方法。
２１．前記細胞は培養された哺乳動物の細胞である、請求項１７に記載の方法。
２２．前記細胞を０．１〜１０μｇ／ｍｌのビタミンＫの存在下に培養する、請求項１７に記載の方法。
２３．前記ガンマーカルボキシラーゼはヒト、ウシおよびラットのガンマーカルボキシラーゼから成る群より選択される、請求項１７に記載の方法。
２４．前記ガンマーカルボキシラーゼが肝臓ガンマーカルボキシラーゼである、請求項１７に記載の方法。