NL8600206A

NL8600206A - Werkwijze voor het winnen van een vitamine k afhankelijk carboxylase-complex, werkwijze voor het bereiden van antilichamen ten aanzien van het vitamine k afhankelijke carboxylase/niet-gecarboxyleerde bloedstollingsfactoren-complex, dragermaterialen met dergelijke antilichamen, waaraan een carboxylase-complex is gebonden, werkwijze voor het carboxyleren van glutaminezuur bevattende exogene produkten met deze dragermaterialen alsmede de op met deze laatstgenoemde werkwijze verkregen produkten gebaseerde farmaceutische preparaten.

Info

Publication number: NL8600206A
Application number: NL8600206A
Authority: NL
Original assignee: Univ Limburg
Priority date: 1986-01-29
Filing date: 1986-01-29
Publication date: 1987-08-17
Also published as: WO1987004719A1; JPS63502956A; US5100798A; EP0260277A1

Description

H.0. 33.476 1 'l <&

Werkwijze voor het winnen van een vitamine K afhankelijk carboxylase-complex, werkwijze voor het bereiden van antilichamen ten aanzien van het vitamine K afhankelijke carboxylase/niet-gecarboxyleerde bloedstol— lingsfactoren-complex, dragermaterialen met dergelijke antilichamen, 5 waaraan een carboxylase-complex is gebonden, werkwijze voor het car— boxyleren van glutaminezuur bevattende exogene produkten met deze dragermaterialen alsmede de op met deze laatstgenoemde werkwijze verkregen produkten gebaseerde farmaceutische preparaten.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het winnen van een vitamine K afhankelijk carboxylase-complex uit biologisch materiaal, dat ten dienste kan worden gemaakt voor het omzetten van bijvoorbeeld een microbiologisch bereide bloedstollingsfactor IX-precursor tot de 15 bloedstollingsfactor IX.

Zoals bekend lijden patiënten, welke de bloedstollingsfactor IX missen, aan hemofilie B. Als mogelijkheid deze patiënten te helpen worgden heden ten dage op grote schaal concentraten van deze stollingsfactoren gemaakt, welke concentraten gewonnen worden uit menselijk bloedplas-20 ma. Echter kleven aan het inspuiten van menselijke bloedprodukten bij patiënten velerlei bezwaren. Als bezwaren kunnen worden genoemd: 1) het overbrengen van ziekten zoals hepatitis en AIDS; 2) het moeten voeren van uitgebreide bloedplasma-campagnes voor het inzamelen van het benodigde bloed; en 3) het extraheren van de betreffende stollingsfactoren uit menselijk bloedplasma is omslachtig en kostbaar.

Uit Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol. 79, blz. 6461-6464, november 1982 en Biochemistry 1983, 22, blz. 2087-2097 is de mogelijkheid bekend om het DNA-fragment, dat voor factor IX codeert, te isoleren en in bacte-30 riën in te bouwen. Deze bacteriën vermenigvuldigen zich snel en produceren tegelijkertijd de gewenste stollingsfactor IX, welke uit het kweek-medium kan worden gewonnen (zie Biochemistry 1984, 23, blz. 1626-1634).

Met de bovengenoemde methode is het risico van ziekte-overbrenging uitgesloten, is men onafhankelijk van bloeddonors en is bovendien het 35 productieproces goedkoper. Echter bestaat er voor de op deze wijze bereide stollingsfactor IX nog een fundamenteel probleem. Voor de biologische activiteit van deze factor is het namelijk van essentieel belang, dat zij een z.g. post-translationele modificatie ondergaat. Deze modificatie bestaat uit de gammacarboxylering van de 10 N-terminale aminozuur-40 residuen. Zoals bijvoorbeeld uit Haematologia 18 (2), blz. 71-97 (1985) v- ·: 0 '· -* -* 2 blijkt is het enzym, dat voor deze carboxyleringsreactie zorg draagt, het vitamine K-afhankelijke carboxylase, welk enzym niet in bacteriën voorkomt. Het bovenbedoelde, met behulp van door DNA-recombinanttechniek aangepaste bacteriën geproduceerde factor IX is derhalve biologisch in-5 actief en niet bruikbaar ter suppletie van het tekort bij hemofilie-B-patiënten. Eenzelfde probleem speelt bij de met behulp van DNA-recombi-nanttechniek aangepaste bacteriën geproduceerde niet-gecarboxyleerde bloedstollingsfactoren II, VII en X.

De uitvinding heeft derhalve ten doel een werkwijze te ontwikkelen 10 om niet-gecarboxyleerde stollingsfactoren II, VII, X en in het bijzonder IX in de biologisch actieve vorm om te zetten. Uit Biochimica et Bio— physica Acta, 714 (1982) 361-265 is het bekend, dat men in principe voor het winnen van het carboxylase-complex kan uitgaan van twee typen lever, bij voorkeur runderlever, namelijk: (a) normale lever en (b) lever van 15 koeien, welke tevoren behandeld zijn met vitamine K-antagonisten. Door deze behandeling hopen zich niet-gecarboxyleerde bloedstollingsfactoren op in de lever, alwaar zij gecomplexeerd zijn aan het carboxylase-com-plex. Bij het geval van de normale lever verkrijgt men dus een "sub-straat-vrij" enzym en bij met vitamine K-antagonisten behandelde dieren 20 verkrijgt men een enzym-substraat-complex. Dit laatste complex is zeer hecht en kan, voorzover bekend, slechts gesplitst worden door koken in 10% SDS.

Hoewel het carboxylase aantoonbaar is in leverhomogenaten en in de microsomale fractie daaruit, zijn dit soort preparaten te onzuiver om 25 bijvoorbeeld de bloedstollingsfactor IX-precursor te kunnen carboxyleren. Voorts wordt bij voorkeur een z.g. "solid-phase"-carboxylase gebruikt, waarbij het enzym gekoppeld is aan een vaste drager zodat het enzym na de carboxy lering gemakkelijk uit de oplossing kan worden verwijderd.

30 In een eerste poging van aanvraagster, welke in FEBS-Letters 123 (1981) 215-218 is beschreven is uitgegaan van antistoffen welke waren opgewekt tegen gezuiverde normale stollingsfactoren uit runderbloed. Deze antistoffen werden eveneens gezuiverd, gekoppeld aan een vaste drager en gebruikt voor de extractie van een leverhomogenaat uit koeien, 35 welke met vitamine K-antagonisten waren behandeld. De antistoffen tegen de normale stollingsfactoren hadden ook affiniteit voor de nog niet ge-carboxyleerde substraat-moleculen. Met behulp van de verkregen solid-phase-antilichamen konden de enzym-substraat-complexen dus specifiek uit het leverhomogenaat geëxtraheerd worden. De binding vond hierbij plaats 40 via het substraat. Het op deze wijze bereide solid-phase-carboxylase - -K.« 1 - ·.·> * .·» .1 3 ^ * bleef in vitro zeer actief en was in staat om zowel het gecomplexeerde (endogene) substraat alsook toegevoegde (exogene) substraten te carboxy-leren. De volgorde waarin dit gebeurde was altijd eerst het endogene en vervolgens het exogene substraat. Opgemerkt wordt in dit verband, dat 5 het enzym ook na carboxylering van het endogene substraat hieraan gebonden bleef. Het bovengenoemde solid-phase-carboxylase bezat echter het nadeel, dat slechts kleine exogene substraten konden worden gecarboxy— leerd (zie mede Biochimica et Biophysica Acta 831 (1985) blz. 94-98).

Daar stollingsfactor-precursors zoals factor IX- precursor groot zijn 10 werden deze (waarschijnlijk door sterische hindering van het nog gebonden endogene substraat) niet met behulp van het bovenbeschreven solid--phase-carboxylase gecarboxyleerd.

Gevonden werd, dat men het bovengeschetste probleem kan opheffen door bij de carboxylering van exogene substraten uit te gaan van een 15 substraat-vrij carboxylase-complex. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een geschikte werkwijze voor het winnen en insolu-bilizeren van een gezuiverd vitamine-K-afhankelijk carboxylase- complex uit biologisch materiaal waarbij men a) het carboxylase-complex bevattende biologische materiaal in een neu-20 trale buffer suspendeert, welke een detergens bevat; b) de suspensie centrifugeert en de supernatant af voert; c) het bij de centrifugebehandeling verkregen membraan gebonden carboxy-lase-complex-deel in een neutrale buffer opneemt, welke buffer een detergens in een ten opzichte van trap (a) verhoogde activiteit en 25 een zout bevat, d) de onder trap (c) verkregen suspensie centrifugeert en e) de onder trap (d) verkregen supernatant aan een precipitatiebehande-ling met een zout, een gradiënt-centrifugatie en een chromatografie-behandeling onderwerpt.

30 Bij voorkeur past men in trap (a) als biologisch materiaal de mi- crosomale fractie van runderleverhomogenaten toe, in het bijzonder van geantistolde runderen. Geantistolde runderen zijn derhalve runderen, welke van tevoren met vitamine K-antagonisten zijn behandeld. Voorts wordt in trap (a) met voordeel als neutrale buffer een op KC1 en Tris-35 -HC1 gebaseerde buffer met een pH van 7,4 gebruikt en als detergens de verbinding GHAPS (3-([3-cholamidopropylJ-dimethylammoniol)-l-propaansul-fonaat.

In de trappen (c) en (e) wordt als zout met voordeel ammoniumsul-faat toegepast. Voorts wordt in deze trap (e) een sucrose-gradiëntcen-40 trifugatie alsook een gelpermeatie-chromatografie toegepast.

·; . v ' 9 0 ->· 4

Met behulp van het op deze wijze sterk gezuiverde carboxylase-complex, wat weliswaar nog uit meerdere eiwitten bestaat maar zich als één complex gedraagt, is het mogelijk antistoffen in zoogdieren op te wekken. Wanneer het carboxylase-complex bereid wordt uit geantistolde 5 proefdieren en derhalve als enzym/substraat-complex wordt ingespoten, worden antistoffen verkregen, welke na een op zichzelf bekende zuivering in staat zijn carboxylase uit een homogenaat van onbehandelde runder-levers specifiek en volledig te precipiteren. Derhalve heeft de uitvinding tevens betrekking op dragermateriaal, dat antilichamen ten opzichte 10 van het carboxylase/substraat-complex bevat, waarbij deze antilichamen gebonden zijn aan een op bovenstaande wijze opgenomen carboxylase-complex. Met bijzondere voorkeur is dit laatstgenoemde carboxylase-complex substraat-vrij. Met een dergelijk substraatvrij carboxylase-complex bevattend dragermateriaal is het namelijk mogelijk grote exogene substra-15 ten te carboxyleren, m.a.w. met dergelijke geactiveerde dragermaterialen is het mogelijk microbiologisch bereide stollingsfactoren zoals in het bijzonder factor IX, waarvan de betreffende glutaminezuureenheden nog in de gamma-carboxyglutaminezuureenheden dienen te worden omgezet, van de inactieve vorm naar de actieve vorm te brengen.

20 De onderstaande voorbeelden dienen slechts ter illustratie van de uitvinding en dienen niet beperkend te worden uitgelegd.

Voorbeeld I

Uit een leverhomogenaat van runderen wordt volgens standaardmetho-25 den de microsomale fractie bereid. Deze microsomen worden geresuspen-deerd in een buffer, welke 0,5 M KC1, 20 mM Tris-HCl (pH: 7,4), en 0,5% (w/v) van het detergens CHAPS bevatten. Na centrifugeren (1 h, 150 000 g) bevindt ongeveer 50% van het carboxylase zich in het supernatant. Dit carboxylase-deel wordt volgens de stand der techniek aangeduid als het 30 opgeloste carboxylase en kan tot nu toe nauwelijks verder worden gezuiverd. Dit supernatant wordt afgevoerd en de behandeling wordt voortgezet met de andere helft van het carboxylase, η·1· het membraan gebonden deel in de pellet van de laatste centrifuge-run. Het carboxylase wordt uit dit materiaal geëxtraheerd met een buffer, welke 0,5 M KC1, 20 mM Tris-35 -HC1 (pH: 7,4), 1% (w/v) CHAPS en 1,5 M (NH4)2S04 bevat. Na een tweede centrifugatie volgt een precipitatie met behulp van (NH4)2S04 (eindconcentratie is 3 M), een sucrose-gradiënt centrifugatie (gradiënt van 20-60% sucrose, 40 000 rpm, 18 h) en een gelperme-atie-chromatografie op een AcA 44 kolom. Op deze wijze wordt een "car-40 boxylase-complex" verkregen, dat weliswaar uit meerdere eiwitten bestaat o * - ^ ^ · ' y ΰ 5 maar dat zich als êên complex gedraagt.

Het op bovengenoemde wijze verkregen carboxylase-complex werd ingespoten bij konijnen voor het opwekken van antistoffen. Bij dit voorbeeld is uitgegaan van leverhomogenaten van geantistolde runderen zodat het 5 carboxylase-complex als een enzym/substraat-complex werd toegediend. De antistoffen, welke op op zichzelf bekende wijze werden verkregen, waren in staat het carboxylase-complex uit onbehandelde proefdieren specifiek en volledig te precipiteren, waarbij het carboxylase ook als immuun complex volledig actief bleef.

10 De bovengenoemde antistoffen werden op op zichzelf bekende wijze gezuiverd en aan een vaste drager zoals Sephadex gebonden. Bij gebruik van deze geïmmobiliseerde antistoffen voor het winnen van carboxylase bleek, dat het carboxylase op specifieke wijze uit een homogenaat van een lever van een rund, dat niet met vitamine K-antagonisten was behan-15 deld kon worden gewonnen. Het op deze wijze bereide solid-phase carboxylase was zeer wel in staat grote substraten zoals microbieel verkregen stollingsfactoren, bijvoorbeeld microbieel verkregen factor IX, van de inactieve vorm in de actieve vorm te brengen.

20 Voorbeeld II

Een contlnuous-flow-systeem voor de carboxylering van exogene substraten.

Het in voorbeeld I beschreven solid-phase-carboxylase wordt in een 25 kolom gebracht en op een doorstroomsysteem aangesloten; de ingrediënten, welke nodig zijn voor de carboxyleringsreactie zijn: dithiothreitol (5 mM), vitamine K-hydrochinon, bicarbonaat, moleculaire zuurstof (opgelost in de buffer) en het te carboxyleren substraat zoals de factor IX-pre-cursor. Na doorleiden van de samenstelling bevindt zich in het effluent 30 van de kolom naast de al dan niet afgewerkte co-factoren ook het gecar-boxyleerde produkt, n.1. factor F IX, wat op eenvoudige wijze kan worden geïsoleerd.

Gebleken is, dat de efficiëntie van de bovengenoemde reactie met een factor 5-10 kan worden opgevoerd door verhoging van de bicarbonaat-35 concentratie van de gebruikelijke 0,7 mM tot 50 mM.

^ * ** n v , ·

Claims

1. Werkwijze voor het winnen van een vitamine K-afhankelijk carbo-xylase-complex uit biologisch materiaal, met het kenmerk, dat men 5 a) het carboxylase-complex bevattende biologische materiaal suspendeert in een een neutrale buffer, welke een detergens bevat, b) de suspensie centrifugeert en de supernatant afvoert, c) het bij de centrifugebehandeling verkregen membraan gebonden carboxy-lase-complexdeel in een neutrale buffer opneemt, welke een detergens 10 in een ten opzichte van trap (a) verhoogde activiteit en een zout be·· vat, d) de onder trap (c) verkregen suspensie centrifugeert en e) de onder trap (d) verkregen supernatant aan een precipitatlebehande-ling met een zout, een gradiënt-centrifugatie en een chromatografie- 15 behandeling onderwerpt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men in trap (a) als biologisch materiaal de microsomale fractie van runderleverhomo-genaten toepast.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat men in trap 20 (a) als biologisch materiaal de microsomale fractie van leverhomogenaten van geantistolde runderen toepast.

4. Werkwijze volgens een of meer der conclusies 1-3, met het kenmerk, dat men in trap (a) als neutrale buffer een op KC1 en Tris-HCl gebaseerde buffer met een pH van 7,4 toepast.

5. Werkwijze volgens een of meer der conclusies 1-4, met het kenmerk, dat men in trap (a) als detergens 3-([3-cholamidopropyl]dime-thylammoniol)-l-propaansulfonaat toepast.

6. Werkwijze volgens een of meer der conclusies 1-5, met het kenmerk, dat men in de trappen (c) en (e) ammoniumsulfaat als zout 30 toepast.

7. Werkwijze volgens een of meer der conclusies 1-6, met het kenmerk, dat men in trap (e) de gradiëntcentrifugatie met sucrose uitvoert en als chromatografiebehandeling een gelpermeatie-chromatografie toepast.

8. Werkwijze voor het bereiden van antilichamen ten opzichte van het vitamine K-afhankelijke carboxylase of ten aanzien van het vitamine K-afhankelijke carboxylase/factor II, VII, IX of X-precursor-complex, met het kenmerk, dat men het volgens een of meer der conclusies 1-7 verkregen carboxylase-complex in zoogdieren injecteert en de opgewekte 40 antilichamen op op zichzelf bekende wijze wint. j LI 0 > 7 v-._ -

9. Dragermateriaal, bevattende antilichamen, verkregen overeenkom*" stig de werkwijze volgens conclusie 8, gebonden aan een carboxylase-complex.

10. Dragermateriaal volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat bet 5 aan de antilichamen gebonden carboxylase-complex substraat-vrij is.

11. Werkwijze voor bet vervaardigen van dragermateriaal volgens conclusie 9 of 10, met het kenmerk, dat men antilichamen, verkregen overeenkomstig de werkwijze volgens conclusie 8 bindt aan een drager en vervolgens een homogenisaat van een carboxylase-bevattend biologisch 10 materiaal over de drager leidt.

12. Werkwijze voor het carboxyleren van exogene produkten met een gelnsolubiliseerd vitamine K-afhankelijk carboxylase-complex, met het kenmerk, dat men een microbiologisch bereid translatieprodukt van cDNA, coderend voor de factor II, VII, IX of X of andere carboxyleerbare ei- 15 witten onder invloed van een onder conclusie 9 of 10 gedefinieerd dra*-germateriaal omzet.

13. Microbiologisch bereide factoren II, VII, IX en X of andere carboxyleerbare eiwitten, waarvan de betreffende carboxyleerbare gluta— minezuureenheden in gamma-carboxy-glutaminezuureenheden zijn omgezet.

14. Microbiologisch bereide factor IX, waarvan de 10 N-terminale glutaminezuureenheden in gamma-carboxy-glutaminezuureenheden zijn omgezet*

15. Farmaceutisch preparaat, gekenmerkt door een gehalte aan een of meer factoren II, VII, IX en/of X of andere carboxyleerbare eiwitten 25 volgens conclusie 13 of 14 respectievelijk verkregen volgens de werkwijze overeenkomstig conclusie 12. **** t·s