JPH01100196A - ファクター８：ｃの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は一般に蛋白質の精製方法に向けられ、そして
さらに詳しくは、ファクターＶＩＩＩ：Ｃ、フォン・ビ
ルブラント因子（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　ｆａ
ｃｔｏｒ）及びこれらの複合体を不均一（ｈｅｔｅｒｏ
ｇｅｎｅｏｕｓ）生物学的流体から精製する方法に関す
る。

〔従来の技術〕

ファクターＶＩＩＩ：Ｃプロコアギュラント（ｐｒｏｃ
ｏ−ａｇｕｌａｎｔ）蛋白質〔抗血友病因子（ａｎｔｉ
ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃｆａｃｔｏｒ）としても知られて
いる〕は血液凝固のイントリンシック・パスウェイ（ｉ
ｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ）における関与体で
あり、ファクターＸの活性化においてコファクターとし
て作用する。ファクターＶＩＩＩ：Ｃプロコアギエラン
ト蛋白質（ファクターＶＩＩＩ：Ｃ）はフォン・ビルブ
ラント因子（ｖＷＦ）との非共有結合複合体として血漿
中を低濃度（約２００ｎｇ／ｄ）で循環する。

幾つかの遺伝的疾患はこれら２種類の蛋白質と関連して
いる。遺伝的Ｘ染色体関連出血疾患である血友病Ａ〔古
典血友病（ｃｌａｓｓｉｃ　ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ）と
しても知られている〕を有する個体においてはファクタ
ーＶＩＩＩ：Ｃ活性が存在しない。血友病Ａは最も一般
的な遺伝的凝固異状であって１００，０００人中約６人
に生ずる（Ｂｌｏｏｍ、Ｎａｔｕｒｅ　３０３　：　４
７４−４７５゜１９８３）。フォン・ビルブラント病は
遺伝的出血異状であって、活性ｖＷＦのレベルの低下の
ために出血時間の延長をもたらす。この異状はｉｏｏ、
ｏｏ。

人中約１人に生ずる（Ｌ、Ｈａｒｋｅ、Ｉｌｅｍｏｓｔ
ａｔｔｓ　Ｍａｎｕａｌ第二版、　Ｆ、Ａ、Ｄａｖｉ３
社、フィラデルフイ′ア、　Ｐａ。

１９７４）。最近、これら２種類の出血異状に罹った個
体はファクターＶＩＩＩ：Ｃ及びｖＷＦが富化された濃
縮物により治療される。これらの蛋白質濃縮物は多数の
提供者のプールされた血液から調製され、製造するのが
高価であり、そして必要な特定の因子が富化されてはい
るがファクターＶＩＩＩ：Ｃの含有量はなお１％未満で
あり、そして他の蛋白質により汚染されている。さらに
、これらの凝固因子源としてプールされたヒト血漿を使
用するため濃縮物中にウィルス（例えば肝炎ウィルス及
び旧Ｖ：Ｉ）が汚染している危険があり、そして濃縮物
を投与される多くの血友病患者が感染を受けている。

血漿中でのその少い存在、極端な感受性、及びフォン・
ビルブラント因子との会合により、ファクターＶＩＩＩ
：Ｃの精製は複雑なものとなっている。

組換細胞中でのクローン化ファクターＶＩＩＩ：Ｃの発
現は達成されている（Ｗｏｏｄ等、　Ｎａｔｕｒｅ　３
１２　：　３３０−３３７．１９８４　；　Ｔｏｏｌｅ
等、　Ｎａｔｕｒｅ　３１２：　３４２−３４７；Ｔｒ
ｕｅｔｔ等、　ＤＮＡ　４　：　３３３　３４９．１９
８５）が、組換蛋白質は十分に精製され又は特徴付けら
れていない。

ファクターＶＩＩＩ：Ｃのための多くの精製方法が試み
られているが、これらは幾分限定された効率により特徴
付けされる。例えば、Ｆａｒｒｕｇｉａ等（Ｔｈｒｏｍ
ｂ。

Ｈａｅｍｏｓｔ、　５１：３３８　３４２，１９８４）
は親水性ポリマーにより血漿又は深冷沈澱物（ｃｒｙｏ
ｐｒｅｃ　ｉ　ｐ　ｉ　ｔａ　ｔｅ）からファクターＶ
ＩＩＩ：Ｃを沈澱せしめることを含むファクターＶＩＩ
Ｉ：Ｃの精製法を記載しており、他方Ｗａｇｎｅｒ等（
Ｔｈｒｏｍｂ、Ｄｔａｔｈ、　Ｈａｅｍｏｒｒｈ、旦：
６４゜１９６４）はレシチンによる沈澱を用いる血漿又
１ま深冷沈澱物からのファクターＶＩＩＩ：Ｃの精製を
記載している。さらに％　　Ｍａｄａｒａｓ等（Ｉｌａ
ｅｍｏｓｔ、　　７　：　３２１−３３１．１９７８）
は、イオン交換カラム上でのクロマトグラフィー及びゲ
ル濾過、並びにこれに続くヘパリン−セファロースアフ
ィニティークロマトグラフィーを用いる、血漿又は深冷
沈澱物からのファクターＶＩＩＩ：Ｃの精製を記載して
いる。ｋｎｖｔｓｏｎ及びＦａｓｓ（Ｂｌｏｏｄ　影し
６１５−６２４．１９８２）はブタのファクターＶＩＩ
Ｉ：Ｃの精製のための多段法を記載している。一般に、
これらの方法はファクターＶＩＩＩ：Ｃを低い収量で、
そして多くの場合ｖＷＦとの複合体として生成する。

ウシ血漿由来の高度に精製されたウシ−ファクターＶＩ
ＩＩ：Ｃの調製がＶｅｈａｒ及びＤａｖｉｅ（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉ−１Ｄ畳田：　４０１−４１０．１９８０）に
より記載されており、この方法においては精製方法の最
終段階としてゲル濾過及びファクターＸ−セファロース
カラム上でのクロマトグラフィーを用いる。Ｔｕｄｄｅ
ｎｈａｍ等（Ｊ、Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ、　９３　
：　４０−５３．１９７９）は免疫アフィニティークロ
マトグラフィーを用いてファクターＶＩＩＩ：Ｃを精製
する方法を記載している。

精製されたファクター■：３はカルシウムイオン勾配を
用いてカラムから）８出される。＾ｕｓｔｅｎ　（Ｂｒ
ｉｔｉｓｈＪ、ｔ（ａｅｍａｔ、　４３　：　６６９，
１９７９）はアミノヘキシルセファロースクロマトグラ
フィーを用いて汚染血漿蛋白質からファクターＶＩＩＩ
：Ｃを分離する方法を記載している。しかしながら、こ
れらの方法は：ａ縮された生成物をもたらさない。

Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ及びＦｕｌｃｈｅｒ（米国特許Ｎａ
４，３６１，５０９゜１９８２年）は２カラム法を用い
て濃縮された高純度ファクターＶＩＩＩ：Ｃを製造する
方法を開示している。

アガロースビーズに結合したｖＷＦに対するモノクロー
ナル抗体から成る第一カラムは出発材料からファクター
ＶＩＩＩ：Ｃを精製するために役立った。

精製されたファクターＶＩＩＩ：Ｃの濃縮のために使用
される第二カラムはアミノヘキシル置換アガロースから
成っていた。

Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ等（前掲）、並びにＺｉｍｉｅｒｍ
ａｎ及びＦｕｌｃｈｅｒ（前掲）により記載されたよう
なイムノアフィニティークロマトグラフィーの使用によ
り生ずる主たる欠点はアフィニティーマトリクスの再生
及び再使用並びに非−ヒト抗体による生成物の汚染であ
る。上記のイムノアフィニティーカラムはファクターＶ
ＩＩＩ：Ｃ−ｖＷＦ複合体のりＷＦ部分を結合する。イ
ムノアフィニティーカラムのカルシウムイオン処理によ
り遊離のファクターＶＩＩＩ：Ｃが放出されるが、ｖＷ
Ｆはカラムに強く結合したままである。しかしながら、
この方法により精製されたファクターＶＩＩＩ：Ｃはし
ばしば、カラムから浸出した非−ヒト抗体により汚染さ
れる。さらに、抗体とｖＷＦとの間の強い結合のため、
カラムの再使用の前掲として、結合したｖＷＦの溶出を
達成するため強力な脱着剤の使用が必要である。これら
の方法はｖＷＦの生物学的活性の喪失及び／又は抗体の
免疫学的性質の喪失を導くことができ、カラムの寿命を
短かくする。従って、ファクターＶＩＩＩ：Ｃの商業的
製造のためのその様なカラムの使用は高価なもの・とな
り、他方、生物学的に活性なりＷＦＯ単離のためのそれ
らの使用はどう見ても困難である。さらに、強力な脱着
剤の幾らかはヒト系に対して毒性であり、その使用は生
成物の使用前にそれらを除去することを必要とする。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ファクターＶＩＩＩ：Ｃ及びｖＷＦを精製するために使
用されている現在の方法の欠点の観点から、純粋なファ
クター■：　Ｃ−、ｖ　Ｗ　Ｆ及び／又はファクターＶ
ＩＩＩ：Ｃ−ｖＷＦ複合体の高収量をもたらす代替情製
法のための技術が必要である。本発明はこの必要性を満
たし、そしてさらに関連する他の利点を提供する。

〔問題点を解決するための手段〕

要約すれば、本発明はファクターＶＩＩＩ：Ｃ（ＦＶＩ
ＩＩ：Ｃ）、フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）又は
これらの複合体を不均一生物学的流体から精製する方法
を開示する。この方法は、ファクターＶＩＩＩ：Ｃ又は
ｖＷＦのいずれかに対して特異的な結合ペプチドであっ
て不溶性マトリクスに結合しているものを用いる。

ｖＷＦを精製することに向けられた本発明の第一の観点
において、この方法は一般に（ａ）グリコプロティンＩ
ｂのアミノ末端３４０アミノ酸の少なくとも一部分を含
んで成りｖＷＦに特異的に結合するペプチドであって不
溶性マトリクスに結合したものに生物学的流体を暴露し
、こうしてｖＷＦを該ペプチドに特異的に結合せしめ；
　（ｂ）前記結合したｖＷＦを前記ペプチドから溶出し
；そして（ｃ）ｖＷＦを含有する溶出液を集める、こと
を含んで成る。この方法はさらに、非特異的に結合した
因子をマトリクスから洗浄すること、及び収集段階に続
いてｖＷＦを濃縮することを含むことができる。好まし
い具体例において、溶出の段階は結合したｖＷＦをｐＨ
勾配又は高塩緩衝液に暴露することを含んで成る。ある
態様において、前記ペプチドは約４〜２０アミノ酸から
成り、そしてグリコプロティンＩｂのア引ノ酸１６５−
２６０の部分に対応する配列を含んで成る。該ペプチド
はまた、ＰＥＰ−１２、ＰＵＰ　−１３、ＰＥＰ−１４
、ＰＥＰ−１５、ＰＥＰ　−１６又はＰＥＰ−１７のご
ときペプチドであることができる。

ファクターＶＩＩＩ：Ｃ−ｖＷＦ複合体を精製すること
に向けられた本発明の他の観点において、この方法は一
般に（ａ）フォン・ビルブラント因子に特異的に結合す
るペプチド（このペプチドは不溶性マトリクスに結合し
ている）に生物学的流体を暴露し、こうしてファクター
ＶＩＩＩ：Ｃ−ｖＷＦ複合体を特異的に前記ペプチドに
結合せしめ；　（ｂ）結合したファクターＶＩＩＩ：Ｃ
−ｖＷＦ複合体をペプチドから溶出し；そして（ｃ）フ
ァクターＶＩＩＩ：Ｃ−ｖＷＦ複合体を含有する溶出液
を集める、ことを含んで成る。この方法はさらに、非特
異的に結合した因子を前記マトリクスから洗浄すること
、及び前記集めた複合体を濃縮することを含むことがで
きる。

不均一生物学的流体からファクターＶＩＩＩ：Ｃを精製
することに向けられたこの発明の第三の観点において、
この方法は一般に（ａ）フォン・ビルブラント因子（ｖ
ＷＦ）に特異的に結合するペプチドに生物学的流体を暴
露し、ここで該ｖＷＦはファクターＶＩＩＩ：Ｃと複合
体を形成しており、そして該ペプチドは不溶性マトリク
スに結合しており、こうしてファクターＶＩＩＩ：Ｃ−
ｖＷＦ複合体を該ペプチドに特異的に結合せしめ；　（
ｂ）前記ファクターＶＩＩＩ：Ｃを前記複合体から溶出
し；そして（ｃ）ファクターＶＩＩＩ：Ｃを含有する溶
出液を集める、ことを含んで成る。好ましい態様におい
て、前記ペプチドはファクターＸ又はファクターＩＸの
少なくとも部分を含んで成る。特に好ましい態様におい
て、前記ペプチドはグリコプロティンＩｂの全部又は一
部を含んで成る。この方法はまた、非特異的に結合した
因子をマトリクスから洗浄すること、及び収集段階に続
いてファクターＶＩＩＩ：Ｃを濃縮することを含む。

ファクターＶＩＩＩ：Ｃを精製することに向けられたこ
の発明の他の観点は、（ａ）不均一生物学的流体中のフ
ァクターＶＩＩＩ：Ｃ−ｖＷＦ複合体を解離せしめ；　
（ｂ）ファクターＶＩＩＩ：Ｃに特異的に結合するペプ
チド（このペプチドは不溶性マトリクスに結合している
）に前記解離した複合体を暴露し；（Ｃ）結合したファ
クターＶＩＩＩ：Ｃを前記ペプチドから溶出し；そして
（ｄ）ファクターＶＩＩＩ：Ｃを含有する溶出液を集め
ることを一般に含んで成る方法 ＦＶＩＩＩ：Ｃ−ｖＷＦ複合体を含有する不均一生物学
的流体からファクターＶＩＩＩ：Ｃを精製することに向
けられたこの発明の他の観点において、この方法は一般
に（ａ）ＦＶＩＩＩ：Ｃ又はｖＷＦのいずれかに特異的
に結合するペプチド（このペプチドは不溶性マトリクス
に結合している）に生物学的流体を暴露し、こうしてＦ
ＶＩＩＩ：Ｃ−νＷＦ複合体を該ペプチドに特異的に結
合せしめ；　（ｂ）結合した複合体を前記ペプチドから
溶出せしめ；　（Ｃ）前記Ｆ■−Ｃ−ｖＷＦ複合体を解
離せしめ；そして（ｄ）ＦＶＩＩＩ：Ｃを単離する、こ
とを含んで成る。

この発明はまた、前記の方法において使用するために適
当なペプチドをも開示する。この発明のこれらの観点及
び他の観点は、以下の記載及び図面への言及により明ら
かになるであろう。

〔具体的な記載〕

本発明を記載するのに先立って、後で使用される幾つか
の用語を定義することが発明の理解のために有効であろ
う。

・、−・ゝ　°：細胞、細咋の部分、又は細胞生成物を
含有し、１又は複数の蛋白質を含む任意の流体。不均一
生物学的流体としては血液、血漿、血清、細胞溶解物、
細胞−条件化媒地及びこれらの両分を包含する。

前記のごとく、本発明は、不溶性マトリクスに結合した
ファクターＶＩＩＩ：Ｃ又はｖＷＦのいずれかに対して
特異的な結合ペプチドを用いてファクターＶＩＩＩ：Ｃ
及び／又はｖＷＦを精製する方法を提供する。ファクタ
ーＶＩＩＩ：Ｃ，ｖＷＦ及びこれらの複合体を精製する
ための結合ペプチドの使用は現状の精製方法に対して大
きな利点を有する。好ましくは４０個以下のアミノ酸を
有する前記の結合ペプチドは、ｖＷＦ又はファクターＶ
ＩＩＩ：Ｃに対して特異的な抗体を製造するコストの数
分の−で商業的に合成することができる。さらに、この
明細書に記載する結合ペプチドは非共有結合によりｖＷ
Ｆ又はファクターＶＩＩＩ：Ｃと結合し、生成物は複合
体（ｖＷＦ−ファクターＶＩＩＩ：Ｃ）として又は純粋
な生成物（ファクターＶＩＩＩ：Ｃ又はｖＷＦ単独）と
して溶出され得る。高イオン強度緩衝液を用いる生成物
の溶出は結合ペプチドを損傷せず、そして最小限の再処
理により再使用可能なカラムをもたらすであろう。本発
明の他の主要な利点は結合ペプチドがヒトに由来するこ
とである。結合ペプチドの幾らかがマトリクスから脱離
しそして生成物を汚染する場合、異種性抗体に比べて免
疫原性が低く、そしてペプチドのサイズが小さいことが
血漿からのその迅速な除去をもたらすであろう。その結
果、最終調製物中に存在するすべてのペプチド汚染物は
生成物の正常な機能を妨害しないはずである。

ファクターＶＩＩＩ：Ｃ及び／又はフォン・ビルブラン
ト因子を精製する場合に使用するのに適する結合ペプチ
ドは、グリコプロティンＩｂ、ファクター■、ファクタ
ーｘ１フォン・ビルプラント因子及びファクター■に由
来することができる。これらのペプチドはファクターＶ
ＩＩＩ：Ｃ又はｖＷＦと特異的に相互作用する。

血漿中で、ｖＷＦ及びファクターＶＩＩＩ：Ｃは非共有
的に結合した複合体として存在する（例えば、Ｌ、Ｗ、
１ｌｏｙｅｒ、Ｂｌｏｏｄ　５８　：　１−１３．１９
８１を参照のこと）。

高イオン強度緩衝液、例えば０．２５Ｍ〜０．５ＭＣａ
Ｃ１、又は１ＭＮａｃｊ！による処理によって前記２種
類の蛋白質は分離され得る。

グリコプロティンＩ　ｂ　（ＧＰＩｂ）はｖＷＦと相互
作用して暴露された表皮下（ｓｕｂｅｎｄｏｔｈｅｌｉ
ａｌ）コラーゲンへの血小板の付着を促進する血小板受
容体である。ＧＰＩｂはジスルフィド結合したα−鎖と
β−鎖とから成るヘテロダイマーであり、α−鎖はりＷ
Ｆ結合ドメインを含有する鎖である（Ｏｋｖｍｕｒａ等
、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５３　：　３４５３
３４４３．１９７８）。

本発明の実施において使用するための結合ペプチドは３
種類の゛一般的方法のいずれかにより単離することがで
きる。第一の方法は、長さにして約１０〜４０アミノ酸
、好ましくは約２０アミノ酸のオーバーラツプするペプ
チドを合成すること含む。

この様なペプチドは当業界においてよく知られた方法（
Ｍａｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、
　８５　：　２１４９−２１５４．１９６３；　　Ｈｏ
ｕｇｈｔｅｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡ８２　：　５１３１−５１３５．１９８５）に
より合成され、あるいはこれらのペプチドは要求に従っ
て、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｌｏ−５ｙｓｔｅ渭Ｓ（フォス
ター市、カリホルニア）又はＢｌｏ−５ｅａｒｃｈ　（
サン・ラフアニル、カリホルニア）のごとき商業的供給
者により製造され得る。これらのペプチドは、結合蛋白
質（グリコプロティンＩｂ、ファクター■、ファクター
Ｘ又はｖＷＦ）の１つ　　゛又は結合蛋白質の適当な部
分のアミノ酸配列に対応する。次にペプチドは不溶性マ
トリクス又はサポート、例えばミクロタイタープレート
に結合され、そしてファクターＶＩＩＩ：Ｃ，フォン・
ビルプラント因子、又はファクターＶＩＩＩ：Ｃ−ｖＷ
Ｆ複合体を含有する溶液が添加される。インキュベーシ
ョン期間の後、未結合蛋白質が除去され、そしてファク
ターＶＩＩＩ：Ｃ又はｖＷＦに対して向けられたラベル
された抗体、が添加される。インキュベーションの後、
過剰の抗体が除去され、そして結合した抗体の量が測定
される。結合した抗体の量は注目の蛋白質を結合するペ
プチドの能力に比例する。

あるいは、結合はラベルされたファクターＶＩＩＩ：Ｃ
又はｖＷＦを用いて直接測定することができる。

結合ペプチドを同定する第二の方法は特異的相互作用に
関与する結合蛋白質の適切な結合領域を決定するための
遺伝子工学技法に鯨る。結合蛋白質をコードするｃＤＮ
Ａ配列をプラスミドベクター中にクローン化してｃＤＮ
Ａの発現がファージエフプロモーターの制御下にあるよ
うにする。プラスミドを単離し、そしてＴ７ボリメラー
ゼを用いて、Ｍｅｌｔｏｎ等（Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、　１２ニア０３５　７０５６．１９８４）により
記載されているのと実質的に同様にして、インビトロに
おいて転写せしめる。生ずるＲＮＡをランダムブライミ
ング法（Ｍａｎｉａｔｉｓ等１３　、　Ｍｏ１ｅ−堡佳
肛コ１勉力ｖ」コ）　Ｌａα江Ｉ旦び」１す復工、コー
ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、１９Ｂ２
）によるｃＤＮＡクローニングのための鋳型として使用
し、そしてこうして生産されたｃＤＮＡを用いてλｇｔ
　１１発現ライブラリーを調製する（Ｙｏｕｎｇ及びＤ
ａｖｉｓ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０
　：　１１９４．１９８３）、このライブラリーを、プ
ローブとして注目のラベルされた蛋白質を用いてリガン
ドブロッティング技法（Ｓｉｋｅｌａ及びｌ１ａｈｎ、
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４
　：３０３８−３０４２．１９８７によりスクリーニン
グする。結合ペプチドを発現するクローンをマツプして
、適切な結合ペプチドの正確な位置及び配列を決定する
。

適切なペプチドを単離するための第三の方法は、制限さ
れた蛋白質分解的開裂及び化学的開裂による精製された
結合蛋白質の消化に頼る。適当な消化方法にはＣＨＢｒ
開裂、及び蛋白質分解酵素、例えばトリプシン、キモト
リプシン、リジン・エンドペプチダーゼ又はＳ、アウレ
ウス（Ｓ、ａｕｒｅｕｓ）　Ｖ、−８プロテアーゼによ
る開裂が含まれる。蛋白質は血漿から単離され（例えば
、Ｃｈｏｐｅｋ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ−１Ｄ薯２５　
：　３１４６−３１５５．１９８６　、又はＯｓ　ｔｅ
ｒｕｄ及びＲａｐａ−ｐｏｒｔ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　ヱ４　　：　　５２６０
−５２６４゜１９７７により記載されている）、あるい
は組換細胞により生産される（例えば、Ｈａｇｅｎ等、
　ＥＰ　２００゜４２１）。ファクターＩＸ（Ｋｕｒａ
ｃｈｉ及びＤａｖｉｅ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、’ＵｓＡ　　Ｌ１：　６
４６１−６４６４，１９８２；へｎ５ｏｎ等、　Ｎａｔ
ｕｒｅ　３１５　：　６８３−６８５．１９８５）、フ
ァクターＸ３７０２　；　Ｌｅｙｔｕｓ等、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒ　　２５　：　５０９Ｂ−５１０２゜１
９８６）　、フォノ・ビルブラント因子（Ｓａｄ　ｌｅ
ｒ等。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、■ＳＡ　　８
２　　：　６３９４−６３９８．１９８５　　；Ｇｉｎ
ｓｂｅｒｇ等、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２８　：　１４０
１　１４０６．１９８５）、及びファクター■（Ｔｏｏ
ｌｅ等、　Ｎａｔｕｒｅ　３１２　：　３４２−３４７
、１９８４）をコードするＤＮＡ配列が記載されている
。

ｖＷＦ又はファクターＶＩＩＩ：Ｃのいずれかに対して
特異的な結合ペプチドを同定し、前記の様にして合成し
、そして次に商業的に入手可能な不溶性マトリクスのい
ずれかに連結する。マトリクスの例にハＣＮＢｒ　　＠
性化セファロース４Ｂ（ファルマシア、スエーデン）、
ＡＨ−セファロース４Ｂ（ファルマシア）、ＣＨ−セフ
ァロース４Ｂ（ファルマシア）、活性化ＣＨ−セファロ
ース４Ｂ（）”アルマシア）、アフィーーゲル（ビオ−
ラド。

リッチモンド、カリホルニア）、及びリアクチ−ゲル（
Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ）　（ＧＦ−２０００）　（ピア
ス・ケミカル・カンパニー、ロックフォード、イリノイ
）が含まれる。ペプチドをマトリクスに結合するために
使用されるカップリング反応は文献中に知られている種
々の方法のいずれかである。カップリング反応は次のペ
プチド官能を使用することができる：ペプチド又はリガ
ンドのアミノ官能（へｘｅｎ等。

Ｎａｔｕｒｅ　２１４　：　３０２．１９６７　；　Ｂ
ｅｔｈｅｌｌ等、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２５４　：　２５７２−２５７４．１９７９　；　Ｂ、
Ｓ、Ｃｏｆｆｅｒ、　Ｂｌｏｏｄ　５５　：１６９．１
９８０）　　；ペプチド又はリガンドのカルボキシ官能
（Ｂ、Ｔ、Ｋａｕｆｍａｎ及びＪ、Ｖ、Ｐｉｅｒｃｅ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｔｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｍｕｎ、　４４　：　
６０８　６１３．１９７１）　；又はチオール基（Ｌ、
Ｒｕｄｅｎ及び■、Ｆ、Ｄｅｕｔｓｈ、Ｊ、Ｂｉｏ１．
Ｃｈｅｍ。

％這：　５１９−５２４．１９７８）。精製の効率を増
強するためにカラムマトリクスと結合ペプチドとの間の
スペーサーを用いることもできる（Ｐａｎｔｏｌｉａｎ
ｏ等。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２３　：　１０３７−１０４２．１
９８４）。マトリクスへの連結を容易にするためにペプ
チドの末端にリジン又はシスティン残基を付加すること
が好ましい。

前記のごとく、種々の不均一生物学的流体からファクタ
ーＶＩＩＩ：Ｃもしくはフォン・ビルブラント因子又は
これらの複合体を精製するために、この明細書に記載す
るアフィニティー精製系を使用することができる。これ
らは血漿、血漿由来濃縮物及び細胞溶解物並びに組換細
胞からの培地を包含する。組換細胞中でファクターＶＩ
ＩＩ：Ｃを生産する方法は−ｏｏｄ等（前掲）、Ｔｏｏ
ｌｅ等（前掲）及びＴｒｕ−ｅｔｔ等（前掲）により記
載されている。Ｋａｕｆｎ＋ａｎ及びＡｄａｍｓｏｎ（
Ｗｏ　８７１０４１８７）は、ｖＷＦの存在下で培養さ
れる組換細胞を用いてファクターＶＩＩＩ：Ｃ−型蛋白
質を製造する方法を記載している。

ファクター■：　Ｃ％　　Ｖ　Ｗ　Ｆ又はファクターＶ
ＩＩＩ：Ｃ−ＷＷＦ複合体の精製のため、ｖＷＦ又はフ
ァクターＶＩＩＩ：Ｃ−ｖＷＦ複合体がペプチドに結合
するような条件下で、生物学的流体がマトリクス結合ペ
プチドに暴露される。この暴露の段階に続き、非特異的
に結合した因子をカラムから洗浄するのが好ましい。お
よそ中性ｐＦｌの低イオン強度緩衝液、好ましくはカラ
ムへの負荷において使用したのと同一の緩衝液によりカ
ラムを洗浄することができる。特に好ましい緩衝液は１
５０ｍＭ　ＮａＣＪを含有する２０ｍＭイミダゾール（
ｐＨ６，８）である。次に、結合した複合体又は注目の
蛋白質をカラムから溶出し、そして集める。ファクター
ＶＩＩＩ：ＣまたはｖＷＦの精製のため、ｐＨ勾配又は
高イオン強度緩衝液の使用により？８出を達成すること
ができる。

ファクターＶＩＩＩ：Ｃ−ｖＷＦ複合体は好ましくはｐ
Ｈ勾配の使用により溶出する。ファクターＶＩＩＩ：Ｃ
−ｖＷＦ複合体からファクターＶＩＩＩ：Ｃを精製する
ため、高イオン強度緩衝液を用いてカラムからファクタ
ー■＝Ｃを溶出するか、あるいは複合体を溶出し、そし
て次に高イオン強度緩衝液中で解離せしめる。

好ましい態様においては集めた蛋白質を濃縮する。

好ましい濃縮方法には凍結乾燥及び商業的に入手可能な
濃縮ユニット（例えば、アミコン）の使用が含まれる。

次に、例により本発明を例示するが、これによって本発
明の範囲を限定するものではない。

ファクターＶＩＩＩ：Ｃ結合は、ファクターＶＩＩＩ：
Ｃ冨化蛋白質濃縮物及びファクターＶＩＩＩ：Ｃに対し
て向けられた放射性ラベルされたモノクローナル抗体を
用いて直接アッセイされる。９６−ウェル切離しミクロ
タイタープレート（ダイナミック、アレキサンドリア、
　Ｖａ　）を天然蛋白質又はペプチドによりコートする
。ファクターＶＩＩＩ：Ｃ冨化蛋白質：ａ縮物をプレー
トに加え、そして１時間インキュベートする。インキュ
ベーションの後、過剰のファクターＶＩＩＩ：Ｃをプレ
ートから除去する。特にファクターＶＩＩＩ：Ｃに対し
て向けられた放射性ラベルされたモノクローナル抗体を
プレートに加え、そして１時間インキュベートする。イ
ンキュベーションの後、過剰のラベルを除去し、そして
結合した抗体を測定する。

あるいは、結合ペプチドでコートされたプレートを用い
て直接結合をアッセイすることができる。

放射性ラベルされたファクターＶＩＩＩ：Ｃを、結合ペ
プチドへのファクターＶＩＩＩ：Ｃ結合の直接測定とし
て用いることができる。ｖＷＦに対して特異的な結合ペ
プチドを同定するため、このアッセイにおいて、放射性
ラベルされたｖＷＦを容易に置き換えることができる。

１列ヨ’ｌ、　　ｖＷＦに・する６２１６１士人ドメイ
ンの西前記のごとく、ｖＷＦに対する結合ドメインはＧ
ＰＩｂのα−鎖中に存在する。ＧＰＩｂのα−鎖をコー
ドするｃＤＮＡはクローン化されそして配列決定されて
おり、そして第１図に示される。ＧＰＩｂの成熟α鎖の
最初の３４０アミノ酸をカバーするオーバーラツプする
、２０アミノ酸長のペプチドの合成により結合領域が決
定される。

ＧＰＩｂ分子のアミノ末端半分に由来する２２の合成ペ
プチドをｖＷＦ−ファクター遁複合体に結合する能力に
ついてスクリーニングすることにより、ＧＰＩｂのｖＷ
Ｆ−ファクター■結合領域を同定した。

合成ペプチド（バイオサーチ社、サン・ラフアニル、カ
リホルニア）は対間で５−残基オーバーランプを有する
２〇−残基断片として設計された。

アミノヘキサン酸活性化セファロース−４Ｂ（シグマ・
ケミカル社、セントルイス、　Ｍｏ、から得られるＣＨ
−活性化セファロース４Ｂ）に合成ペプチドのアミノ基
を連結することにより得られるアフィニティーゲルを用
いて、結合についてペプチドをスクリーニングした。要
約すれば、この実験手順は、再構成されたファクター■
濃縮物（アルファ・セラピラテインク・コーポレーシコ
ン、ロサンゼルス、カリホルニア）をゲル結合ペプチド
と混合し、生ずる複合体を洗浄し、そしてファクター■
活性を溶出することを含む。ファクター■に結合する固
定化されたＧＰＩｂ−由来ペプチドの能力を、出発材料
、カラム洗浄液及びカラム溶出液中のファクター■活性
を決定することにより評価した。

ペプチド（５〜１０ＩＩｗ）をＤＭＳＯ（２〜３ｍり中
に溶解し、等容量のカップリング緩衝液（０，１ＭＮａ
ＨＣＯ＊　、　ｐＨ８，０）と混合し、そして次に３〜
５−の膨潤し前洗浄されたＣＨ−活性化セファロース４
Ｂ（このゲルは、製造者が示唆するようにして処理され
た）に加えた。混合物をロッカー上で４℃にて２０時間
インキュベートした。カップリング反応を２２℃にて１
時間継続した。次に、ゲルをカラムに注入し、そして洗
浄緩衝液により洗浄し、次にＤＭＳＯにより洗浄した。

最終洗浄液（カップリング上清）を分析に共した。ゲル
を０．２Ｍグリシン（ｐ［Ｉ　８．２　）によりブロッ
クし、そして１５０ｍＭＮａｃ１を含有する２０ｍＭイ
ミダゾール緩衝液（ｐｆ（６，８）により２２℃にて１
時間面飽和した。

ペプチドがカップリングし、グリシンでブロックし、Ｂ
ＳＡで処理したカラムをＩＢＳにより十分に洗浄し、そ
して下記のようにして結合実験において使用した。同じ
方法を使用し、但し処方からペプチドを省略することに
より対照カラムを調製した。出発材料、カンプリング上
清及び最初の洗浄液中のペプチドの量をニンヒドリン試
薬により評価した後、カップリングの程度を計算した。

この方法を用いて、４０〜６０％の各ペプチドがアフィ
ニ・ティークロマトグラフィー・ゲルに結合したことが
見出された。

ＩＢＳ中に再構成されたファクター■濃縮物をＧＰＩｂ
−セファロースと混合し、そしてロッカー上で２２℃に
て２時間インキュベートした。インキュベーション期間
の終りにおいてゲル懸濁液をカラムに注入し、沈降せし
め、そして２８０ｎｍにてモニターした溶出液の吸光が
ベースラインに達するまでＩＢＳにより洗浄した。カラ
ムに結合したファクター■を、０．５　Ｍ　ＮａＣ１及
び０．２％トウイーンー８０を含存するＩＢＳにより溶
出した。洗浄及び溶出中の溶剤の流速は０．７ｄ／分に
保持した。

出発材料、カラム流出液及び溶出液中のファクター■活
性を一段階クロッティングアッセイにより定量してカラ
ムの性能を評価した。クロッティングアッセイにおける
標準として、プールされた正常ヒト血漿を使用した。メ
ガ−１フアクター■標準（アルファ・セラピウティソク
・コーポレーション、ロサンゼルス、カリホルニア）を
用いて、プールされた正常血漿を換算した。ファクター
■を欠く血漿及びプールされた正常血漿はジョーシロキ
ング・バイオメディカル社、オーバーランドバーク、　
Ｋａｎｓ、から得た。クロッティングアッセイはＭＬＡ
−エレクトラ−８００自動凝固タイマー（メディカル・
ラボラトリ−・オートメーション社、ニューヨーク）を
用いて行った。

結合実験からのデーターは、再構成された濃縮物中のフ
ァクター■に結合することができる４種類のペプチドを
同定した。これらのペプチドはＧＰｌｂのアミノ酸セグ
メント１６５−１８４．１８０−１９９．１９５−２１
４、及び２４０−２５９に対応する。これら４種類のペ
プチドの一次配列を第１表に示す。

第一１−表 ＧＰＩｂのファクター■結合ペプチドのアミノ酸配列１
６５　　１８４　　　　ＡＧＬＬＮＧＬＥＮＬＤＴＬＬ
ＬＱＥＮＳＬ　　　　Ｐｅｐ−１２１８０−１９９ＱＥ
ＮＳＬＹＴＩＰＫＧＦＦＧＳＩＩＬＬＰＦ　　Ｐｅｐ−
１３１９５２１４１１ＬＬＰＦＡＦＬＨＧＮＰＷＬＣＮ
ＧＥＩＬ　　　Ｐｅｐ−１４結合実験からのデークーを
第２表に示す。

以下余白 第２表 出発材料　　６２　　　６２　　　６２　　　６２　　
　６２流出液　４２．４　１１．６　２２　　２０．２
　６０．８出発材料　　２７．４　　２７．４　　２７
．４　　２７．４　　２７．４流出液　２４　　６．２
　１２．２　８．０　２８（８８）　　（２２，６）　
（４４，５）　（２９，２）　（１０２）セットＢにお
いては、実験に先立ち、ゲルを水、５０％ＣＨ，ｔＣＮ
　、及びこれに続いてＩ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ６、８）によ
り前洗浄した。ＮＡ、：ファクター■の溶出を試みなか
った。

カッコ中の数値は、それらの両分中のファクター■の％
を示す。

第２表に示すデーターは、ＧＰＩｂのｖＷＦ−ファクタ
ー■結合領域が該蛋白質のアミノ酸残基１６５と２６０
との間に位置することを示している。このデーターはさ
らに、結合部位がＧＰＩｂ分子中の残基の線状の範囲か
らのアミノ酸から作られおり、そしてこのＳＪＩＭに由
来するペプチドをファクター■又はｖＷＦ−ファクター
■複合体のアフィニティー精製のために使用され得ると
いう概念を支持している。これらの結果に基き、ＧＰＩ
ｂのアミノ酸残５２１５−２３９に由来するペプチドが
ｖＷＦ−ファクター■複合体の結合に関与することが予
想される。この領域を代表する２個のオーバーラツプす
るペプチドの配列（Ｐｅｐ−１５及びＰｅｐ−１６を称
する）を第３表に示す。

第一１−表 領域　　　　　配　列　　　　　名称 １２０　２２９　　ＮＣＥＩＬＹＰＲＲＷＬＱＤＮＡＥ
ＮＶＹＶ　　Ｐｅｐ−１５２２５２４４ＥＮＶＹＶＷＫ
ＱＧＶＤＶＫＡＭＴＳＮＶＡ　　Ｐｅｐ−１６劃」ユ　
ｖＷＦ上のファク　−ＶＩＩＩ：Ｃに・する士人ｖＷＦ
上のファクターＶＩＩＩ：Ｃに対する結合ドメインは、
ｖＷＦの限定された蛋白質分解的開裂又は化学的開裂を
用いて決定される。Ｃｈｏｐｅｋ等（Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　２５　：　３１４６　３１５５．１９８６）により記
載された方法によってｖ、ＷＦを精製する。精製された
ｖＷＦをＣＮＢｒ開裂（Ｅ、Ｇｒｏｓｓ及びＢ、Ｗｉｔ
ｋｏｐ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

０μｍ％狂：　１８５６−１８６０．１９６２）を用い
る分解にかけてｖＷＦペプチドを生じさせる。あるいは
、例えばトリプシン、キモトリプシン、リジンエンドペ
プチダーゼ、又はスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ
ｔａ　ｈ　１ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）　Ｖ　　
Ｂプロテアーゼ（Ｃｈｏｐｅｋ等、前掲）を用いてペプ
チドを生じさせる。

ｖＷＦの化学的又は酵素的消化からのペプチド混合物を
ＨＰＬＣ／ゲル浸透カラム（ＧＦ−２５０、デュポン）
上でのクロマトグラフィーにかける。この最初の精製に
続き、ゲル浸透カラムからの個々のピークを、０．１％
トリフルオロ酢酸を含有する水／ｎ−プロパツール勾配
又は水／アセトニトリル勾配を用いる肝ＬＣカラム上で
さらに精製する。

あるいは、フォン・ビルブラント因子のアミノ酸配列（
Ｔｉｔａｎｉ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　２５　
：　３１７１　３１Ｂ４゜１９８６）に基いてオーバー
ラツプするペプチドを合成する。

例１及び例２に記載した結合アッセイにおいて、精製さ
れたペプチドを使用する。

ファクターＸ及びＩＸａを、Ｍｏｄ　ｉ等（Ｔｈｒｏｍ
ｂ、Ｒｅｓ。

３６　：　５３７−５４７．１９８４）により記載され
た方法により精製する。例２及び３に記載した化学的及
び酵素的方法を用いて、天然型及び還元されアルキル化
された形の、これらの精製されたファクターに由来する
精製されたペプチドが生ずる。

例１及び例２に記載したような結合アッセイを用いてペ
プチドをスクリーニングする。

以下余白 Ｊｌ１３６　　ｖＷＦに・して　−・な′七人ペプチド
をアフィティ−マトリクス（例えば例２に記載したよう
にして調製したもの）を、ファクターＶＩＩＩ：Ｃを含
有するサンプルと共にインキュベートする。

この混合物を４℃にて一夜インキユベートする。

次に、結合したファクターＶＩＩＩ：Ｃ又はｖＷＦ−フ
ァクターＶＩＩＩ：Ｃ複合体を伴うアフィニティーマト
リクスをカラムに充填し、そして適当な緩衝液〔すなわ
ち、２０ｍＭイミダゾール−ＨＣＩｔ　（ｐＨ６，８）
。

１０ｍＭ　ＣａＣｌ２２又は１０％グリセロール〕によ
り洗浄する。このカラムをカルシウム又はナトリウムイ
オン勾配により洗浄することによって、特異的に結合し
たファクターＶＩＩＩ：Ｃの溶出を行う。結合したファ
クターＶＩＩＩ：Ｃは約０．３　Ｍ　ＣａＣｊ！　ｚに
て溶出する。結合したファクターＶＩＩＩ：Ｃ−ｖＷＦ
複合体はｐＨ勾配によりカラムから溶出する。所望によ
り、溶出した複合体をＣａＣ１ｚ処理によって解離せし
め、そしてファクターＶＩＩＩ：Ｃ及び／又はｖＷＦを
サイズ分画（例えば、ゲル濾過）により回収することが
できる。

ファクターＶＩＩＩ：Ｃ結合ペプチドは、例３において
記載したようなフォン・ビルブラント因子に由来する。

好ましくは末端リジン又はシスティン残基を含有するペ
プチドを例２に記載したように固体マトリクスに連結す
る。

ファクターＶＩＩＩ：Ｃ−ｖＷＦ複合体のサンプルを０
、３　Ｍ〜０．５　Ｍ　ＣａＣｆ　２に調整する。次ニ
コノサンプルを調製されたアフィニティーマトリクスと
混合し、そして混合物のＣａＣｆｆｚ濃度を低下せしめ
てマトリクスへのファクターＶＩＩＩ：Ｃの結合を可能
にする。次に、混合物をカラムに充填し、そして適当な
緩衝液で洗浄する。結合したファクターＶＩＩＩ：Ｃは
０．３　Ｍ＝　０．５　Ｍ　ＣａＣ（１２により、洗浄
されたカラムから？８出する。

以上、この発明の具体的な態様を記載したが、この発明
の本質を逸脱することなく種々の変更を行うことができ
よう。

【図面の簡単な説明】

第１−１図及び第１−２図は、ヒトグリコプロティンＩ
　ｂ　　（ＧＰＩｂ）のα鎖をコードするｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列及び予想されるアミノ酸配列を示す。成
熟蛋白質のアミノ末端は＋１から始まり負番号（−１６
〜−１）はシグナルペプチドを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、グリコプロテイン I ｂのアミノ末端の３４０アミ
   ノ酸の少なくとも一部分を含んで成り、フォン・ビルブ
   ラント因子（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　ｆａｃｔ
   ｏｒ）に特異的に結合するペプチド。 ２、前記ペプチドが約４〜４０個のアミノ酸から成る、
   請求項１に記載のペプチド。 ３、前記ペプチドが末端リジン又はシステイン残基を含
   有する、請求項１に記載のペプチド。 ４、前記ペプチドが約４〜４０個のアミノ酸から成り、
   そしてグリコプロテイン I ｂのアミノ酸１６５−２６
   ０の部分に対応する配列を含んで成る、請求項１に記載
   のペプチド。 ５、前記ペプチドがＰＥＰ−１２、ＰＥＰ−１３、ＰＥ
   Ｐ−１４、ＰＥＰ−１５、ＰＥＰ−１６及びＰＥＰ−１
   ７から成る群から選択されたものである、請求項１に記
   載のペプチド。 ６、長さにして４〜４０アミノ酸のフォン・ビルブラン
   ト因子の少なくとも一部分を含んで成り、ファクターV
   III：Ｃに特異的に結合するペプチド。 ７、長さにして４〜４０アミノ酸のファクターIXの少な
   くとも一部分を含んで成り、ファクターVIII：Ｃに特異
   的に結合するペプチド。 ８、長さにして４〜４０アミノ酸のファクターＸの少な
   くとも一部分を含んで成り、ファクターVIII：Ｃに特異
   的に結合するペプチド。 ９、前記ペプチドが末端リジン又はシステイン残基を含
   有する、請求項６〜７のいずれか一項に記載のペプチド
   。 １０、フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）又はファク
   ターVIII：Ｃ−フォン・ビルブラント因子複合体を不均
   一生物学的流体から精製する方法であって、 該生物学的流体を、不溶性マトリクスに結合した請求項
   １〜６のいずれかに記載のペプチドに暴露し、こうして
   ｖＷＦ又はファクターVIII：Ｃ−ｖＷＦ複合体を該ペプ
   チドに特異的に結合せしめ；前記結合したｖＷＦ又はフ
   ァクターVIII：Ｃ−ｖＷＦ複合体を前記ペプチドから溶
   出し；そして前記ｖＷＦ又はファクターVIII：Ｃ−ｖＷ
   Ｆ複合体を含有する溶出液を集める； ことを含んで成る方法。 １１、前記暴露段階に続いて前記マトリクスから非特異
   的に結合した因子を洗浄することを含んで成る、請求項
   １０に記載の方法。 １２、前記収集段階に続いてファクターVIII：Ｃ−ｖＷ
   Ｆ複合体又はｖＷＦを濃縮することを含んで成る請求項
   １０に記載の方法。 １３、前記溶出段階が、前記結合したｖＷＦ又はファク
   ターVIII：Ｃ−ｖＷＦ複合体をｐＨ勾配又は高塩緩衝液
   に暴露することを含んで成る、請求項１０に記載の方法
   。 １４、ファクターVIII：Ｃ−ｖＷＦ複合体を含有する不
   均一生物学的流体からファクターVIII：Ｃを精製する方
   法であって、 該生物学的流体を、不溶性マトリクスに結合した請求項
   １〜９のいずれか一項に記載のペプチドに暴露し、こう
   してファクターVIII：Ｃ−ｖＷＦ複合体を該ペプチドに
   特異的に結合せしめ； 前記複合体からファクターVIII：Ｃを溶出し；そして、 ファクターVIII：Ｃを含有する溶出液を集める；ことを
   含んで成る方法。 １５、前記溶出段階が前記結合した複合体を高イオン強
   度溶液に暴露することを含んで成る、請求項１４に記載
   の方法。 １６、ｖＷＦ及びファクターVIII：Ｃの複合体からファ
   クターVIII：Ｃを精製する方法であって、ファクターV
   III：Ｃ−ｖＷＦ複合体を解離せしめ；解離した複合体
   をファクターVIII：Ｃに特異的に結合するペプチド（こ
   のペプチドは不溶性マトリクスに結合している）に暴露
   し、こうしてファクターVIII：Ｃを該ペプチドに特異的
   に結合せしめ；前記結合したファクターVIII：Ｃを前記
   ペプチドから溶出し；そして ファクターVIII：Ｃを含有する溶出液を集める；ことを
   含んで成る方法。 １７、ファクターVIII：Ｃ−ｖＷＦ複合体を含有する不
   均一生物学的流体からファクターVIII：Ｃを精製する方
   法であって、 ファクターVIII：Ｃ又はｖＷＦのいずれかに特異的に結
   合するペプチド（このペプチドは不溶性マトリクスに結
   合している）に生物学的流体を暴露し、こうしてファク
   ターVIII：Ｃ−ｖＷＦ複合体を該ペプチドに特異的に結
   合せしめ； 前記結合した複合体を前記ペプチドから溶出し；前記フ
   ァクターVIII：Ｃ−ｖＷＦ複合体を解離せしめ；そして ファクターVIII：Ｃを単離する； ことを含んで成る方法。 １８、活性療法物質として使用するための請求項１〜９
   のいずれか一項に記載のペプチド。