JPH01144991A - 血液凝固第8因子の精製方法 - Google Patents
血液凝固第8因子の精製方法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、血液凝固第■因子の製造に関し、特に、新規
なモノクロナール抗体を用いた血液凝固第■因子の精製
方法に関する。
なモノクロナール抗体を用いた血液凝固第■因子の精製
方法に関する。
1且立1造
血液凝固第■因子(以下、F■と略称する)は、抗血友
病A因子、抗血友病因子、抗血友病グロブリンなどとも
よばれ、第■因子凝固活性タンパク質(F■−proc
oagulant protein、以下F■Cと略称
する)とフォン・ビルブラント因7− (以下v〜VF
と略称する)とから成ることが知られている。
病A因子、抗血友病因子、抗血友病グロブリンなどとも
よばれ、第■因子凝固活性タンパク質(F■−proc
oagulant protein、以下F■Cと略称
する)とフォン・ビルブラント因7− (以下v〜VF
と略称する)とから成ることが知られている。
このうち、F■Cは、血液凝固の内因系経路に関与する
血漿蛋白質である。その機能は、分子レベルの血jα凝
固のカスケード反応中、ファクター■aによるファクタ
ーXの活性化において、コファクターとして作用するこ
とであり、生体における止血反応に本質的に重要である
。
血漿蛋白質である。その機能は、分子レベルの血jα凝
固のカスケード反応中、ファクター■aによるファクタ
ーXの活性化において、コファクターとして作用するこ
とであり、生体における止血反応に本質的に重要である
。
遺伝的なX染色体連鎖出血性疾患である血友病Aは、血
漿中にある生理活性を有するFVjlCの遺伝的欠損ま
たは障害に起因するものであることが知られている。し
たがって、血友病A患者の血液凝固障害に基づく出血に
対しては、欠乏するF■Cの補充によって止血を図るF
VfflC補充療法が最も合理的でかつ確実な治療法と
して広く臨床的に用いられている。
漿中にある生理活性を有するFVjlCの遺伝的欠損ま
たは障害に起因するものであることが知られている。し
たがって、血友病A患者の血液凝固障害に基づく出血に
対しては、欠乏するF■Cの補充によって止血を図るF
VfflC補充療法が最も合理的でかつ確実な治療法と
して広く臨床的に用いられている。
又、F■Cは、v w Fと複合体を形成することによ
って、比較的安定に保たれると考えられている。このv
w Fを含む製剤は、常染色体性優性遺伝による出血
性疾患であるフォノ・ビルブランド病の補充療法に臨床
的に利用できる。
って、比較的安定に保たれると考えられている。このv
w Fを含む製剤は、常染色体性優性遺伝による出血
性疾患であるフォノ・ビルブランド病の補充療法に臨床
的に利用できる。
現在、FVIC補充療法には、ヒト血漿より精製した濃
111F■製剤が多く用いられている。しかし、FVI
Cは、血漿中の濃度が極めて低く(約0.1μg/!1
1>、かつ、そ°の性状が生化学的に非常に不安定であ
るために、F■Cの高純度の精製は極めて困難である。
111F■製剤が多く用いられている。しかし、FVI
Cは、血漿中の濃度が極めて低く(約0.1μg/!1
1>、かつ、そ°の性状が生化学的に非常に不安定であ
るために、F■Cの高純度の精製は極めて困難である。
したがって、現在入手可能な血漿由来の濃縮F■製剤は
、1%以下のFVIICタンパク質(比活性、2単位/
鵬gタンパク以下)を含有するものであり、かなり多く
の夾雑タンパク質を含んでいる。このことは、既存の濃
縮F■製剤を頻回にわたって投与しなければならない血
友病Aの治療上、重要な問題、特に、濃縮F■製剤中の
夾雑タンパク質(アロ抗原など)に起因すると推測され
ている免疫異常の問題、さらには、肝炎や後天性免疫不
全症候群(AIDS)等に関与する夾雑ウィルス伝播と
いう副作用の危険性の問題を提起している。近年、加熱
濃縮FW製剤の臨床応用によって、肝炎ウィルス、AI
DSウィルス等の伝播は回避できることも報告される様
になったが、未だ、 肝炎発生に関して安全であるとの
確証は得られていない。
、1%以下のFVIICタンパク質(比活性、2単位/
鵬gタンパク以下)を含有するものであり、かなり多く
の夾雑タンパク質を含んでいる。このことは、既存の濃
縮F■製剤を頻回にわたって投与しなければならない血
友病Aの治療上、重要な問題、特に、濃縮F■製剤中の
夾雑タンパク質(アロ抗原など)に起因すると推測され
ている免疫異常の問題、さらには、肝炎や後天性免疫不
全症候群(AIDS)等に関与する夾雑ウィルス伝播と
いう副作用の危険性の問題を提起している。近年、加熱
濃縮FW製剤の臨床応用によって、肝炎ウィルス、AI
DSウィルス等の伝播は回避できることも報告される様
になったが、未だ、 肝炎発生に関して安全であるとの
確証は得られていない。
したがって、より高度に精製されたF■製剤を臨床的に
使用し、夾雑タンパク質の除去はもちろんのこと、混入
ウィルスの伝播の可能性も著しく減することは非常に有
益である。
使用し、夾雑タンパク質の除去はもちろんのこと、混入
ウィルスの伝播の可能性も著しく減することは非常に有
益である。
最近、ヒトFvIIICII伝子がクローニングされ、
(J、 Qitschierら、 N a t、
u r e 、 uユ、 1326〜330 。
(J、 Qitschierら、 N a t、
u r e 、 uユ、 1326〜330 。
1984)、さらに、生理活性のあるヒトFVICが、
組換えDNA技術によって発現されている、 (w。
組換えDNA技術によって発現されている、 (w。
1、 Woodら、 Nature、 3JJ、
330〜337. 1984; J。
330〜337. 1984; J。
J、Tooleら、 Nature、 IJJ、
342〜347. 1987; M、A。
342〜347. 1987; M、A。
Truettら、 DNA、 4. 333〜34
9. 1985; ^。
9. 1985; ^。
Paviraniら、 BiotechnologY
’2. 38’)−392,1987など)。
’2. 38’)−392,1987など)。
このような組換えDNA技術によるF■製剤の開発にお
いても、発現のための宿主である培養動物細胞等に由来
する製剤中の夾雑タンパクの混入は一層厳重に回避せね
ばならないであろう、なぜなら、製剤を頻回投与する必
要のある血友病A患者にとって、製剤中の異種動物由来
の夾雑タンパクは、アレルゲンとなる可能性が高く、重
篤な、あるいは致命的なアレルギー反応を惹起すること
すら子息されるからである。
いても、発現のための宿主である培養動物細胞等に由来
する製剤中の夾雑タンパクの混入は一層厳重に回避せね
ばならないであろう、なぜなら、製剤を頻回投与する必
要のある血友病A患者にとって、製剤中の異種動物由来
の夾雑タンパクは、アレルゲンとなる可能性が高く、重
篤な、あるいは致命的なアレルギー反応を惹起すること
すら子息されるからである。
このような観点からも、F■(特にFVIIIC)を高
度に精製することができる技術は、非常に重要である。
度に精製することができる技術は、非常に重要である。
′ 。
F■を精製するためには従来より各種の方法が提案され
ており、特に、血漿由来のヒトF■Cを高度精製すべく
多くの試みがなされている。その中で最も、高純度のF
VICの生産を可能にしている技術は ■vwFに対するモノクロナール抗体をマトリックス(
担体)結合させて用いる免疫吸着クロマトグラフィーと
、アミノヘキシル−アガロースクロマトグラフ(−との
組合せ(T、 S、 Zimmerman、特開昭58
−131918号) ■上記と同様の免疫吸着クロマトグラフィーと、陰イオ
ン交換体(Mono Q get、 (phar+aa
cia社)など)によるHPLCの組合せ (L、0゜Andersonら、特開昭61−2052
19 ’)■CaCl2存在下のゲルろ過と、QAEセ
ルロースクロマトグラフィーの組合せ、 (P、 J、
Fay、 PANS。
ており、特に、血漿由来のヒトF■Cを高度精製すべく
多くの試みがなされている。その中で最も、高純度のF
VICの生産を可能にしている技術は ■vwFに対するモノクロナール抗体をマトリックス(
担体)結合させて用いる免疫吸着クロマトグラフィーと
、アミノヘキシル−アガロースクロマトグラフ(−との
組合せ(T、 S、 Zimmerman、特開昭58
−131918号) ■上記と同様の免疫吸着クロマトグラフィーと、陰イオ
ン交換体(Mono Q get、 (phar+aa
cia社)など)によるHPLCの組合せ (L、0゜Andersonら、特開昭61−2052
19 ’)■CaCl2存在下のゲルろ過と、QAEセ
ルロースクロマトグラフィーの組合せ、 (P、 J、
Fay、 PANS。
υ、 7200〜7204.1982)である。
■、■の方法は、FWCの生理的存在形態であるF ’
Jm C/ v w F複合体に対して、第一段階とし
てマトリックス結合した抗v w Fモノクロナール抗
体への吸着と、引き続いて行うCaCl2水溶液による
溶出によって、マI・リックス結合した抗vwF抗体−
v w F / F II C複合体からFvfflC
のみを溶離するという原理を基本としたものである。こ
れは、F■/ v w F複合体がCaCl2(または
NaC1存在下)で解離して遊離のFWC(又はv w
F )を生じる事実を背景とする。■の方法は出発材
料であるFWC/ V W F複合体に対して、まずC
aCl2存在下でFWCをF Vli C/ v w
F複合体から解離させ、ゲルろ過でvwFより低分子I
のFWCを分離したのち、さらにイオン交換クロマトグ
ラフィーによって精製するものである。いずれの方法に
よっても、最終的に、v w Fから解離した形のFV
ICのみを得ることを目的としている。
Jm C/ v w F複合体に対して、第一段階とし
てマトリックス結合した抗v w Fモノクロナール抗
体への吸着と、引き続いて行うCaCl2水溶液による
溶出によって、マI・リックス結合した抗vwF抗体−
v w F / F II C複合体からFvfflC
のみを溶離するという原理を基本としたものである。こ
れは、F■/ v w F複合体がCaCl2(または
NaC1存在下)で解離して遊離のFWC(又はv w
F )を生じる事実を背景とする。■の方法は出発材
料であるFWC/ V W F複合体に対して、まずC
aCl2存在下でFWCをF Vli C/ v w
F複合体から解離させ、ゲルろ過でvwFより低分子I
のFWCを分離したのち、さらにイオン交換クロマトグ
ラフィーによって精製するものである。いずれの方法に
よっても、最終的に、v w Fから解離した形のFV
ICのみを得ることを目的としている。
上記のv w Fに対するモノクロナール抗体を用いた
■および■の方法は、固定北枕v w F抗体=VwF
の結合を介して結合したv w F / F VI C
複合体から、CaC12(またはNaC1)のごとき塩
を用いることによりvwFとFWICとを解離させてF
WCを得ようとするものである。しかしながら、そのよ
うな塩によるv w FとFVffiCの解離は選択的
な・ものではなく、実際には、活性を有するFWCのみ
ならず、v w Fとの結合能を残し且つ失活したFW
Cも解離させてしまう、この活性を有しないFWCの除
去は困難であり、最終製剤中に残存して該製剤の比活性
を減少させることになる。すなわち、最終製剤の比活性
が出発材料中の失活したF■(/ v w F複合体の
含量によって制限を受けることになる。同様のことは、
出発材料であるFWC/ v w F複合体に対して、
直接、CaCl2のごとき塩を適用してFvICを該複
合体から解離させようとする前記■の方法についてもあ
てはまる。
■および■の方法は、固定北枕v w F抗体=VwF
の結合を介して結合したv w F / F VI C
複合体から、CaC12(またはNaC1)のごとき塩
を用いることによりvwFとFWICとを解離させてF
WCを得ようとするものである。しかしながら、そのよ
うな塩によるv w FとFVffiCの解離は選択的
な・ものではなく、実際には、活性を有するFWCのみ
ならず、v w Fとの結合能を残し且つ失活したFW
Cも解離させてしまう、この活性を有しないFWCの除
去は困難であり、最終製剤中に残存して該製剤の比活性
を減少させることになる。すなわち、最終製剤の比活性
が出発材料中の失活したF■(/ v w F複合体の
含量によって制限を受けることになる。同様のことは、
出発材料であるFWC/ v w F複合体に対して、
直接、CaCl2のごとき塩を適用してFvICを該複
合体から解離させようとする前記■の方法についてもあ
てはまる。
さらに、前記■や■のごとき方法においては、FWCを
溶出させた後に、v w Fも精製し回収しようとする
時に、v w Fに対するモノクロナール抗体からvw
Fを溶出させるために、強力な抗原=抗体の結合を切断
できるような変性溶出液の使用が避けられない。この結
果、回収v w Fの生理活性が少なからず損失すると
いう欠点がある。
溶出させた後に、v w Fも精製し回収しようとする
時に、v w Fに対するモノクロナール抗体からvw
Fを溶出させるために、強力な抗原=抗体の結合を切断
できるような変性溶出液の使用が避けられない。この結
果、回収v w Fの生理活性が少なからず損失すると
いう欠点がある。
加えて、上述したような方法においては組換えDNA技
術等で生産した遊離のFWCのみを含む材料を直接出発
材料にすることができず、出発材料に制限があることも
大きな欠点である。
術等で生産した遊離のFWCのみを含む材料を直接出発
材料にすることができず、出発材料に制限があることも
大きな欠点である。
口の、・を
本発明は、前述したような従来技術の欠点を克服したF
■の精製方法を得ることを目的とする。
■の精製方法を得ることを目的とする。
本発明行は、このために努力を重ねた結果、活性を有す
るFWCのみに特異的に結合し、かつ、その結合性が特
定の金属イオンの存在濃度に依存するようなモノクロナ
ール抗体を確立し、このモノクロナール抗体を利用する
ことによってF■を高度にt#製することができる方法
を見出した。かくして、本発明に従えば、活性を有する
FWCに対して特異的な結合性を有し且つ該結合性が2
価または3価の金属の陽イオンの存在する濃度に依存す
るモノクロナール抗体を適当な担体に固定化して吸着体
とし; FWCまたはくおよび)FWC/ vwF複合
体を含有する出発材料を前記M属陽イオンの非存在下ま
たは低濃度下に前記吸着体に適用してFWCまたは(お
よび)FWC/ v w F複合体を前記モノクロナー
ル抗体に結合させ:前記金属陽イオンを高濃度で含有す
る溶液を用いて前記FVIIICまたはくおよび)FW
C/ v w F複合体を前記モノクロナール抗体がら
溶離させる工程を含むことを特徴とするF■の精製方法
が提供される。
るFWCのみに特異的に結合し、かつ、その結合性が特
定の金属イオンの存在濃度に依存するようなモノクロナ
ール抗体を確立し、このモノクロナール抗体を利用する
ことによってF■を高度にt#製することができる方法
を見出した。かくして、本発明に従えば、活性を有する
FWCに対して特異的な結合性を有し且つ該結合性が2
価または3価の金属の陽イオンの存在する濃度に依存す
るモノクロナール抗体を適当な担体に固定化して吸着体
とし; FWCまたはくおよび)FWC/ vwF複合
体を含有する出発材料を前記M属陽イオンの非存在下ま
たは低濃度下に前記吸着体に適用してFWCまたは(お
よび)FWC/ v w F複合体を前記モノクロナー
ル抗体に結合させ:前記金属陽イオンを高濃度で含有す
る溶液を用いて前記FVIIICまたはくおよび)FW
C/ v w F複合体を前記モノクロナール抗体がら
溶離させる工程を含むことを特徴とするF■の精製方法
が提供される。
本発明によるF■の精製方法は、FVrfiCのみを精
製して回収する場合に適用されるのみならず、FWCお
よびvwFのそれぞれを精製して回収する場合、あるい
は、FWC/ v w F 複合体として回収する場合
にも適用される。
製して回収する場合に適用されるのみならず、FWCお
よびvwFのそれぞれを精製して回収する場合、あるい
は、FWC/ v w F 複合体として回収する場合
にも適用される。
本発明において用いるモノクロナール抗体は、後述する
ように、常法に従い、精製F■を免疫したマウスの肺臓
細胞とマウスミエローマ細胞のハイブリドーマから誘導
されたものである。この抗F■Cモノクロナール抗体は
、市販されているような従来より入手できる抗FVIC
モノクロナール抗体とは異なり、活性を有するFWCの
みに特異的に結合し、しかも、この結合性は、C&イオ
ンのごとき2価または3価の金属の陽イオンの非存在下
(または低イオン濃度下)では発揮されるが、そのよう
な&属イオンの高濃度下では消失するという特性を有す
る。
ように、常法に従い、精製F■を免疫したマウスの肺臓
細胞とマウスミエローマ細胞のハイブリドーマから誘導
されたものである。この抗F■Cモノクロナール抗体は
、市販されているような従来より入手できる抗FVIC
モノクロナール抗体とは異なり、活性を有するFWCの
みに特異的に結合し、しかも、この結合性は、C&イオ
ンのごとき2価または3価の金属の陽イオンの非存在下
(または低イオン濃度下)では発揮されるが、そのよう
な&属イオンの高濃度下では消失するという特性を有す
る。
したがって、本発明の方法においては、当該モノクロナ
ール抗体を適当な担体(マトリックス)に固定化して吸
着体とし、Caイオンのごとき金属陽イオンの非存在下
または低濃度下において(Caイオンの場合、0.02
M以下、好ましくは0.005M以下)FVIIICを
含む出発材料(F * C/ v w F複合体として
FWCが存在するものを含む)を該吸着体に適用すれば
、抗FWC抗体−F■Cの結合が生じることにより出発
材料が吸着体に吸着される。この抗FVII[C抗体−
FWCの結合は、2価または3価の金属陽イオン(例え
ば、Mg、^l、 Mn、 Co)を高濃度で含有する
溶液を用いることにより解離される。
ール抗体を適当な担体(マトリックス)に固定化して吸
着体とし、Caイオンのごとき金属陽イオンの非存在下
または低濃度下において(Caイオンの場合、0.02
M以下、好ましくは0.005M以下)FVIIICを
含む出発材料(F * C/ v w F複合体として
FWCが存在するものを含む)を該吸着体に適用すれば
、抗FWC抗体−F■Cの結合が生じることにより出発
材料が吸着体に吸着される。この抗FVII[C抗体−
FWCの結合は、2価または3価の金属陽イオン(例え
ば、Mg、^l、 Mn、 Co)を高濃度で含有する
溶液を用いることにより解離される。
例えば、本発明に従えば、0.1〜1.0Mの濃度のC
aイオン水溶液または適当な緩衝液によって抗FVIC
抗体−FVIC結合が確実に解離されて、FVICまた
はFWC/ v w F複合体がモノクロナール抗体固
定化吸着体から溶出される。
aイオン水溶液または適当な緩衝液によって抗FVIC
抗体−FVIC結合が確実に解離されて、FVICまた
はFWC/ v w F複合体がモノクロナール抗体固
定化吸着体から溶出される。
上述したように、活性を有するFWCのみに特異的に結
合し、かつ、金属イオン(PAえばCaイオン)の存在
下でのFMICの微細なコンフォメーション変化に対し
て、結合性の変化するモノクロナール抗体を利用して、
免疫吸着クロマトグラフィーを行う本発明による精製法
では、■F■Cを精製し回収する場合において、出発材
料中のFVfflCがvwFと複合体を形成しているが
否かには無関係であり、遊離のFVICのみをよむ材料
を直接出発材料にすることもできる。■活性を有するF
WCとのみ結合しうるモノクロナール抗体を使用するた
め、出発材料中に含まれる失活したFWCすらも選択的
に除去することができ、より比活性の高い高純度のF1
4Cを得ることができる。■F■C/ v w F複合
体を含む材料を用いた場合、高純度FVIICのみなら
ず、活性を損なわずに精製されたvwFの回収を行うこ
とができる。このようにして得られるv w Fは、フ
ォノ・ビルブランド病の治療の目的にも有効に使用でき
る他、組換えDNA技術で発現されたFWCの安定化剤
としても利用し得る。
合し、かつ、金属イオン(PAえばCaイオン)の存在
下でのFMICの微細なコンフォメーション変化に対し
て、結合性の変化するモノクロナール抗体を利用して、
免疫吸着クロマトグラフィーを行う本発明による精製法
では、■F■Cを精製し回収する場合において、出発材
料中のFVfflCがvwFと複合体を形成しているが
否かには無関係であり、遊離のFVICのみをよむ材料
を直接出発材料にすることもできる。■活性を有するF
WCとのみ結合しうるモノクロナール抗体を使用するた
め、出発材料中に含まれる失活したFWCすらも選択的
に除去することができ、より比活性の高い高純度のF1
4Cを得ることができる。■F■C/ v w F複合
体を含む材料を用いた場合、高純度FVIICのみなら
ず、活性を損なわずに精製されたvwFの回収を行うこ
とができる。このようにして得られるv w Fは、フ
ォノ・ビルブランド病の治療の目的にも有効に使用でき
る他、組換えDNA技術で発現されたFWCの安定化剤
としても利用し得る。
本発明を利用した高純度FVIfiC,vwFまたは、
FWC/ v w F複合体の精製方法の諸工程の一例
を以下に示す。
FWC/ v w F複合体の精製方法の諸工程の一例
を以下に示す。
■まず、本発明によって得た、活性に特異的であり、か
つ高濃度金属イオン(例えばCaイオン)存在下でのF
WCの微細なコンフォメーション変化に対して結合性を
失う性質を有するモノクロナール抗体を7トリツクス(
担体)に固定化したカラムに、該金属イオンの非存在下
または低イオン濃度の条件下で、FWC,F■/ v
w F複合体のいずれか、又は両者を含む出発材料を適
用する。出発材料としては、例えば、血漿、クリオプレ
シピテート溶解物、濃縮F■調製剤どFWCを含む血液
由来の両分、及び、組換えDNA技術により生産された
FWCを含む材料などがこれにあたる。
つ高濃度金属イオン(例えばCaイオン)存在下でのF
WCの微細なコンフォメーション変化に対して結合性を
失う性質を有するモノクロナール抗体を7トリツクス(
担体)に固定化したカラムに、該金属イオンの非存在下
または低イオン濃度の条件下で、FWC,F■/ v
w F複合体のいずれか、又は両者を含む出発材料を適
用する。出発材料としては、例えば、血漿、クリオプレ
シピテート溶解物、濃縮F■調製剤どFWCを含む血液
由来の両分、及び、組換えDNA技術により生産された
FWCを含む材料などがこれにあたる。
■次に、カラムに非特異的に結合した夾雑タンパク質を
除去するために、適切な洗浄用緩衝液でカラムを充分洗
浄する。ここまでの工程で、失活した、あるいは活性を
有しないFWCも除去される。
除去するために、適切な洗浄用緩衝液でカラムを充分洗
浄する。ここまでの工程で、失活した、あるいは活性を
有しないFWCも除去される。
■v w Fの分離精製も必要とされる場合には、その
後、F vgiC/ v w F複合体の解離を促すよ
うな高濃度の塩(例えば、0.15〜3.0M、好まし
くは0゜8〜1.0MのNaCI)を含む溶液で、さら
にカラムを洗浄すると、v w Fを高純度に含む溶出
液を回収することができる。■最後に、カラムに結合し
ている活性を有するFVICを高濃度の金属イオン(0
゜1〜1.014のCaイオン、好ましくは、0.2〜
0.5MのCaイオン)を含む溶液で溶出させる。溶出
液中には、高純度のFWCが含まれる。■溶離したFW
Cまたはv w Fを含む溶液の脱塩、緩衝液置換は透
析やゲルろ過の方法によって容易に行うことができる。
後、F vgiC/ v w F複合体の解離を促すよ
うな高濃度の塩(例えば、0.15〜3.0M、好まし
くは0゜8〜1.0MのNaCI)を含む溶液で、さら
にカラムを洗浄すると、v w Fを高純度に含む溶出
液を回収することができる。■最後に、カラムに結合し
ている活性を有するFVICを高濃度の金属イオン(0
゜1〜1.014のCaイオン、好ましくは、0.2〜
0.5MのCaイオン)を含む溶液で溶出させる。溶出
液中には、高純度のFWCが含まれる。■溶離したFW
Cまたはv w Fを含む溶液の脱塩、緩衝液置換は透
析やゲルろ過の方法によって容易に行うことができる。
■濃縮のためには、既知の方法である限外ろ適法や凍結
乾燥法、アミノへキシルアガロースクロマトグラフィー
などの方法を用いることができる。
乾燥法、アミノへキシルアガロースクロマトグラフィー
などの方法を用いることができる。
もし、最終的に、F■/ V W F複合体の形で分離
精製を行いたい場合には、■の工程を省くことによって
、目的を達することができる。
精製を行いたい場合には、■の工程を省くことによって
、目的を達することができる。
以下、本発明の特徴をさらに明らかにするため、実施例
に沿って本発明を説明する。
に沿って本発明を説明する。
実施例
I F =。
プールしたヒト血漿を冷融解後、得られたクリオプレシ
ピテートから、0.1Mグリシン−2単位/mlヘパリ
ン溶液でF■を抽出した。最終濃度が、0.5×になる
ようにポリエチレングリコール4000を添加後、pi
(6,5,5℃で30分間冷処理を行い、冷不溶性タン
パクを沈澱除去し、上清を得た(E、 J。
ピテートから、0.1Mグリシン−2単位/mlヘパリ
ン溶液でF■を抽出した。最終濃度が、0.5×になる
ようにポリエチレングリコール4000を添加後、pi
(6,5,5℃で30分間冷処理を行い、冷不溶性タン
パクを沈澱除去し、上清を得た(E、 J。
t(ershgoldら、 J、 Lab、 1
4ed、 LZ、 23〜32. 1966;J、
Newn+anら、 Br、 J、 Ila
emat、 、74. 1〜20 1971;L、
Thorellら、 Thro+5bsis Re5e
arch ’35431〜450、1984)、 さ
らに、その上清に、8単位/+1ヘパリンを添加後、5
℃、1時間冷処理し、冷不溶性タンパクをさらに除去し
、上清を得た。あらかじめ、0、04M トリス塩酸緩
衝液(pl(6,8)で、平衡化しておいたDHAE−
TOYOPEAL (東洋曹達社製)に、その上清を展
開、吸着後、最終濃度0.5M NaClの塩濃度勾配
溶出法により、F■を含む両分を溶出した。
4ed、 LZ、 23〜32. 1966;J、
Newn+anら、 Br、 J、 Ila
emat、 、74. 1〜20 1971;L、
Thorellら、 Thro+5bsis Re5e
arch ’35431〜450、1984)、 さ
らに、その上清に、8単位/+1ヘパリンを添加後、5
℃、1時間冷処理し、冷不溶性タンパクをさらに除去し
、上清を得た。あらかじめ、0、04M トリス塩酸緩
衝液(pl(6,8)で、平衡化しておいたDHAE−
TOYOPEAL (東洋曹達社製)に、その上清を展
開、吸着後、最終濃度0.5M NaClの塩濃度勾配
溶出法により、F■を含む両分を溶出した。
この両分に、最終濃度が12%となるようにポリエチレ
ングリコール4000を添加したのち、pH6,5に調
整し、遠心後、F■を高純度に含む沈澱を得た。
ングリコール4000を添加したのち、pH6,5に調
整し、遠心後、F■を高純度に含む沈澱を得た。
この沈澱を、0.1Mリジン塩酸塩およびQ、 15M
NaC1を含む0.02Mイミダゾール緩i液、pH
6,8で溶解後、マウスの免疫およびモノクロナール抗
体のスクリーニングのためのラジオイムノアッセイ(R
IA)に用いる抗原として使用した。
NaC1を含む0.02Mイミダゾール緩i液、pH
6,8で溶解後、マウスの免疫およびモノクロナール抗
体のスクリーニングのためのラジオイムノアッセイ(R
IA)に用いる抗原として使用した。
■ −ロー −。
ハイブリドーマの調製においては、まず、精製F■を用
いて、Ba1b/cマウスを高度免疫した。免疫方法は
、文献等(t(、P、 Mullerら、 Blood
述。
いて、Ba1b/cマウスを高度免疫した。免疫方法は
、文献等(t(、P、 Mullerら、 Blood
述。
100(1〜1006. 1981; F、 Ro
tblatら、 J、 Lab。
tblatら、 J、 Lab。
Cl1n、 Med、 IJu、 793〜805.1
983)に、記載されている方法に準じた。すなわち、
精製F■(28tl)と完全フロイント・アジュバント
との混液をマウスの腹腔内に投与し、つづいて、精製F
■と不完全フロイント・アジュバントとの混液を、2週
間ごとに、4回腹腔内投与した。さらに10日後、アジ
ュバントなしに、精製F■(28U)を、尾静脈に投与
した。3日後、マウス膵臓細胞と、マウス・ミエローマ
細胞(P3tll )とを、ポリエチレングリコール4
000存在下で、常法どうりに、14胞融合を行った(
Kohlerら、 Nat、ure 出、 495.1
975)、 生成したハイブリドーマを、96ウエル
プレート4枚に、まき込み、HAT選択培地で、約1
週間培養し、ハイブリドーマのみを選択培養した。その
後、10%ウシ胎児血清を含むRP M I 164
0培地と培地交換しハイブリドーマをコンフルエントに
なるまで培養した。その培養上清を、RIA、およびF
■抑制物質活性測定法により、スクリーニングし、目的
とするモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを
選択した。
983)に、記載されている方法に準じた。すなわち、
精製F■(28tl)と完全フロイント・アジュバント
との混液をマウスの腹腔内に投与し、つづいて、精製F
■と不完全フロイント・アジュバントとの混液を、2週
間ごとに、4回腹腔内投与した。さらに10日後、アジ
ュバントなしに、精製F■(28U)を、尾静脈に投与
した。3日後、マウス膵臓細胞と、マウス・ミエローマ
細胞(P3tll )とを、ポリエチレングリコール4
000存在下で、常法どうりに、14胞融合を行った(
Kohlerら、 Nat、ure 出、 495.1
975)、 生成したハイブリドーマを、96ウエル
プレート4枚に、まき込み、HAT選択培地で、約1
週間培養し、ハイブリドーマのみを選択培養した。その
後、10%ウシ胎児血清を含むRP M I 164
0培地と培地交換しハイブリドーマをコンフルエントに
なるまで培養した。その培養上清を、RIA、およびF
■抑制物質活性測定法により、スクリーニングし、目的
とするモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを
選択した。
(1)RIAによるスクリーニング
■精製F■のコーティング
RIA用フレキシブル・アッセイプレート(96ウエル
、ファルコン製)に、50μ又/ウエルづつ添加し、4
℃、−夜装置した。 0.15M )facI、0.
1πウシ血清アルブミン(以下BSAと略す)、0.1
% Tween 20および0.1X NaLを含む0
.0XMす71tlli液、pl!7.2でプレートを
5回洗浄した。この洗浄は各スデップに移る前に必ず実
施した。
、ファルコン製)に、50μ又/ウエルづつ添加し、4
℃、−夜装置した。 0.15M )facI、0.
1πウシ血清アルブミン(以下BSAと略す)、0.1
% Tween 20および0.1X NaLを含む0
.0XMす71tlli液、pl!7.2でプレートを
5回洗浄した。この洗浄は各スデップに移る前に必ず実
施した。
■ウシ血清アルブミンによるブロッキング0.15M
NaClおよび0.IX NaN3を含tr O,OI
M!J :/ 酸MYft液pl(7,2(以下、pB
sと略す)ニBSAを溶解し、最終濃度1%とした。
NaClおよび0.IX NaN3を含tr O,OI
M!J :/ 酸MYft液pl(7,2(以下、pB
sと略す)ニBSAを溶解し、最終濃度1%とした。
この溶液を各ウェルに100μ9添加した、37°C1
2時間インキュベートした。
2時間インキュベートした。
■ハイブリドーマ培養上清の添加
培養上清をPBSで10倍希釈した溶液を各ウェルに添
加し、4℃、−夜装置した。
加し、4℃、−夜装置した。
■1281−ヒツジ抗マウスIgG
+251−ヒツジ抗マウX TgG 50MM (20
,000cpm)を、各ウェルに添加し、37℃、2時
間インキュベートした。
,000cpm)を、各ウェルに添加し、37℃、2時
間インキュベートした。
■測定
γ−カウンターを用いて、各ウェルの放射活性を測定し
な。
な。
対照として精製F■の代わりに、ヒトIgG、またはヒ
トフィブリノーゲン、またはヒトフィブロネクチンを、
それぞれ、プレートにコーティングし、同時にスクリー
ニングを行った。培養上清がこれらの抗原を用いたRI
A法で陰性であり、精製F■に対してのみ陽性を示した
ものを、陽性ハイブリドーマとした。この陽性ハイブリ
ドーマについて、さらに、下記に示す方法F■抑制物質
活性を測定した。
トフィブリノーゲン、またはヒトフィブロネクチンを、
それぞれ、プレートにコーティングし、同時にスクリー
ニングを行った。培養上清がこれらの抗原を用いたRI
A法で陰性であり、精製F■に対してのみ陽性を示した
ものを、陽性ハイブリドーマとした。この陽性ハイブリ
ドーマについて、さらに、下記に示す方法F■抑制物質
活性を測定した。
(2)F■抑制物質活性測定
F■抑制物質活性測定は、Bethesda法(C。
Kasperら、 Thrombos、 Diat
、hes、 llaemorh、 3J。
、hes、 llaemorh、 3J。
869〜872.1975)に準じて、各ハイブリドー
マの培養上清を、スクリーニングした。
マの培養上清を、スクリーニングした。
■各ハイブリドーマ培養上清を、56℃、30分間イン
キュベートした。
キュベートした。
■バルビタールM衝液で、5倍希釈した正常人血漿と、
加熱後の培養上清を同量、混合し、37℃、2時間イン
キュベートした。
加熱後の培養上清を同量、混合し、37℃、2時間イン
キュベートした。
■混合溶液0.11に、活性化リン脂質溶液と第■因子
欠乏血漿をそれぞれ、0.11添加し、37℃、3分間
インキュベートした。
欠乏血漿をそれぞれ、0.11添加し、37℃、3分間
インキュベートした。
00.025M CaC1z 0.1mlを添加し、凝
固時間を測定した。
固時間を測定した。
■コントロールよりも、凝固時間が、10秒以上延長す
るものを陽性とした。
るものを陽性とした。
RIA、F■抑制物質活性測定結果より、5個の陽性ハ
イブリドーマセルライン(No、 313.471゜4
73、409.562)を同定した。
イブリドーマセルライン(No、 313.471゜4
73、409.562)を同定した。
(3)クローニング
抗FVIC抗体を産生ずるこれらの5個のハイブリドー
マについて、他のモノクローナル抗体を産生する細胞及
びモノクローナル抗体を産生じない細胞を確実に除去す
るために、2回のクローニングを行った。クローニング
は、限界希釈法により行った。すなわち、各ハイブリド
ーマの希釈浮遊液を、各ウェル化り理論上1個の細胞に
なるように、96ウエル・プレートに添加した。10〜
14日後、各ウェルの培養上清を、前に示したF■抑制
物質活性測定法により、スクリーニングし、陽性ハイブ
リドーマセルラインを選択した。クローニングをさらに
確実にするために、再クローニングを実施した。
マについて、他のモノクローナル抗体を産生する細胞及
びモノクローナル抗体を産生じない細胞を確実に除去す
るために、2回のクローニングを行った。クローニング
は、限界希釈法により行った。すなわち、各ハイブリド
ーマの希釈浮遊液を、各ウェル化り理論上1個の細胞に
なるように、96ウエル・プレートに添加した。10〜
14日後、各ウェルの培養上清を、前に示したF■抑制
物質活性測定法により、スクリーニングし、陽性ハイブ
リドーマセルラインを選択した。クローニングをさらに
確実にするために、再クローニングを実施した。
(4)マウス腹水からの抗F■C抗体の精製このように
して得られた5種のセルラインを、あらかじめ、ブリス
タン投与されていたマウスの腹腔内に投与した。8〜1
4日後、マウス腹腔から、腹水を採取した。採取した腹
水は、遠心により沈澱物を除去し、次いで最終濃度18
% Na230nによる塩析で、 IgG画分を沈澱
として得た。0.05Mリン酸緩衝液、pH8,2で、
Ig(i沈澱を溶解し、同様の!!衝液に対して透析後
、水で5倍希釈した。あらかじめO、01Mリン酸緩衝
液で平衡化したDE^E−3ephacel (Pha
rmacia社製)に、IgG画分を展開、吸着後、最
終濃度0.3M NaC1の塩濃度勾配溶出法によりI
gG画分を、溶出した。
して得られた5種のセルラインを、あらかじめ、ブリス
タン投与されていたマウスの腹腔内に投与した。8〜1
4日後、マウス腹腔から、腹水を採取した。採取した腹
水は、遠心により沈澱物を除去し、次いで最終濃度18
% Na230nによる塩析で、 IgG画分を沈澱
として得た。0.05Mリン酸緩衝液、pH8,2で、
Ig(i沈澱を溶解し、同様の!!衝液に対して透析後
、水で5倍希釈した。あらかじめO、01Mリン酸緩衝
液で平衡化したDE^E−3ephacel (Pha
rmacia社製)に、IgG画分を展開、吸着後、最
終濃度0.3M NaC1の塩濃度勾配溶出法によりI
gG画分を、溶出した。
■ ロー
(+ > IgGサブクラスの決定
抗F■抗体のIgGサブクラスを、オフタロニー法によ
り同定した。抗原として、50倍濃縮した各セルライン
の培養上清を用い、抗体として、各1gGサブクラス(
IgG+、 IgGg−、IgG2b、 IgGi)に
特異的な抗マウスIgG家兎血清を用いた。
り同定した。抗原として、50倍濃縮した各セルライン
の培養上清を用い、抗体として、各1gGサブクラス(
IgG+、 IgGg−、IgG2b、 IgGi)に
特異的な抗マウスIgG家兎血清を用いた。
その結果、ハイブリドーマ・セルライン562゜473
により産生された抗体は、IgG+であり、セルライン
313.471.409により産生された抗体は、Ig
G2*であった。
により産生された抗体は、IgG+であり、セルライン
313.471.409により産生された抗体は、Ig
G2*であった。
(2)F■抑制物質活性
各セルラインのマウス腹水より精製したモノクローナル
抗体について、Bethesda法によりF■抑制物質
活性を測定した。
抗体について、Bethesda法によりF■抑制物質
活性を測定した。
上記抗体のうち、セルライン562により産生された抗
体のみが、F■抑制物質活性を示し、179RU/鵬g
であった。
体のみが、F■抑制物質活性を示し、179RU/鵬g
であった。
本発明で得たモノクロナール抗体の、活性を有するFV
IIICに対する結合の特異性を、ELISA法を用い
て測定した。モノクロナール抗体は、本発明で得たNo
、 562及び、対照として市販の2種の抗FVIAC
モノクロナール抗体(Bioscot社製、ES112
゜USI+4 ’)を測定に用いた。ELISA法によ
るF■C抗原量の測定のための試料としては、失活した
F■Cのみを含む試料として正常ヒト血清、また、本来
の活性を有するFV[lICを含む試料として、新たに
クエン酸採血した同一人のヒト血漿を用いな。
IIICに対する結合の特異性を、ELISA法を用い
て測定した。モノクロナール抗体は、本発明で得たNo
、 562及び、対照として市販の2種の抗FVIAC
モノクロナール抗体(Bioscot社製、ES112
゜USI+4 ’)を測定に用いた。ELISA法によ
るF■C抗原量の測定のための試料としては、失活した
F■Cのみを含む試料として正常ヒト血清、また、本来
の活性を有するFV[lICを含む試料として、新たに
クエン酸採血した同一人のヒト血漿を用いな。
正常ヒト血漿中のFvIcは、血液凝固反応過程中に、
トロンピン、活性型第X因子、活性型プロティンCによ
って特異的に消化され、その後、経時的にその活性を消
失する( D、 Eatonら、旧oche■−1st
ry、 25.505〜512 (1986) )、し
たがって、血清中では、F■C活性はほとんど検出され
ず、F■C抗原性のみが残存することが知られている。
トロンピン、活性型第X因子、活性型プロティンCによ
って特異的に消化され、その後、経時的にその活性を消
失する( D、 Eatonら、旧oche■−1st
ry、 25.505〜512 (1986) )、し
たがって、血清中では、F■C活性はほとんど検出され
ず、F■C抗原性のみが残存することが知られている。
(J、E、Brownら、 J、 Lab、 Cl
1n、 Med、、 101゜793〜805 (
1983)) ここで試料として用いた血清及び血漿のF■C活性は、
F■因子欠乏血漿を用いた活性化部分的トロンボプラス
チン時間法により、血清で0.0125単位/m+以下
、血漿で0.6単位/■lであった。
1n、 Med、、 101゜793〜805 (
1983)) ここで試料として用いた血清及び血漿のF■C活性は、
F■因子欠乏血漿を用いた活性化部分的トロンボプラス
チン時間法により、血清で0.0125単位/m+以下
、血漿で0.6単位/■lであった。
ELISA法による、モノクロナール抗体と試料中のF
■C抗原との反応性の測定は、次の如く行った。
■C抗原との反応性の測定は、次の如く行った。
■モノクロナール抗体のコーティング
96ウエルのマイクロタイタープレートに、o、15M
NaClを含む10+sMリン酸M街液(以下PBS
と略す)で50Mg/層lに調整された各モノクロナー
ル抗体溶液を、50μJ! /’)xル分注し、4℃1
6時間放置し、モノクロナール抗体をプレートに結合さ
せた。
NaClを含む10+sMリン酸M街液(以下PBS
と略す)で50Mg/層lに調整された各モノクロナー
ル抗体溶液を、50μJ! /’)xル分注し、4℃1
6時間放置し、モノクロナール抗体をプレートに結合さ
せた。
■洗浄
添加したモノクロナール抗体溶液をマイクロタイタープ
レートから吸引除去したのち、0.1%7yePn−2
0を含むPBS (以下PBS−Tweenと略す)で
プレートを5回洗浄し、最終的にPBS−Tweenを
吸引除去した。
レートから吸引除去したのち、0.1%7yePn−2
0を含むPBS (以下PBS−Tweenと略す)で
プレートを5回洗浄し、最終的にPBS−Tweenを
吸引除去した。
■ブロッキング
4xウシ血清アルブミンを含むPBS−Tween (
以下PBS−Tween−B3Aと略す)100μJl
を各ウェルに添加し、37℃4時間インキュベートした
。
以下PBS−Tween−B3Aと略す)100μJl
を各ウェルに添加し、37℃4時間インキュベートした
。
■洗浄
■の操作と同様にPBS−Tweenで5回洗浄を行っ
た。
た。
■試料添加
試料である血清又は、血漿をPBSで段階希釈した溶液
を、各々、I OOノtλ/ウェルづつ添加したのち、
4°C16時間放置した。
を、各々、I OOノtλ/ウェルづつ添加したのち、
4°C16時間放置した。
■洗浄
■の操作と同様に、I’BS−Tweenで5回洗浄を
行った。
行った。
■第2次抗体の添加及び発色
ヘルオキシダーゼを結合させた市販の抗F■Cモノクロ
ナール抗体(llybritech社製、171−F8
)を、PIIS−Tween−11SA中に含む溶液を
、各ウェルに 100μλづつ添加し、37°C2時間
インキュベートした。2と同様の洗浄操作を施したのち
、次に、0.1Mクエン酸−0,2Mリン酸2ナトリウ
ム水溶液50鴎l中0−フエニルジアミンIOB、及び
5x過酸化水素水75μλを含む溶液を、各ウェルに1
00μλづつ添加し、室温で30分間反応させ、492
nmの吸光度を測定した。その結果(図1)、本発明で
得た抗F■Cモノクロナール抗体No、562(図1の
C参照)は、対照に用いた抗F■Cモノクロナール抗体
(図1のAおよびB参照)と異なり、血漿中のF■Cと
のみ特異的に結合し、血清中のFVIICとは反応しな
かった。
ナール抗体(llybritech社製、171−F8
)を、PIIS−Tween−11SA中に含む溶液を
、各ウェルに 100μλづつ添加し、37°C2時間
インキュベートした。2と同様の洗浄操作を施したのち
、次に、0.1Mクエン酸−0,2Mリン酸2ナトリウ
ム水溶液50鴎l中0−フエニルジアミンIOB、及び
5x過酸化水素水75μλを含む溶液を、各ウェルに1
00μλづつ添加し、室温で30分間反応させ、492
nmの吸光度を測定した。その結果(図1)、本発明で
得た抗F■Cモノクロナール抗体No、562(図1の
C参照)は、対照に用いた抗F■Cモノクロナール抗体
(図1のAおよびB参照)と異なり、血漿中のF■Cと
のみ特異的に結合し、血清中のFVIICとは反応しな
かった。
すなわち、No、 562は活性を有するFVIIIC
とのみと反応することが示唆された。加えて、別の実験
より、No、 562は、0j514 CaCl2存在
下でゲルろ過を施し、F■C/ v w F複合体より
解離した精製F■Cとも、定量的に結合することが示さ
れた。
とのみと反応することが示唆された。加えて、別の実験
より、No、 562は、0j514 CaCl2存在
下でゲルろ過を施し、F■C/ v w F複合体より
解離した精製F■Cとも、定量的に結合することが示さ
れた。
本発明で得た抗FVICモノクロナール抗体の結合性が
、F■Cのコンフォメーションに特異的であることを示
すために、実施例[mlで示したELjSA法を用いて
以下の実験を行った。
、F■Cのコンフォメーションに特異的であることを示
すために、実施例[mlで示したELjSA法を用いて
以下の実験を行った。
市販の濃縮F■製剤(コンファク1−F8)を試料とし
て、最終F■C活性が1単位/ml又は0.25単位/
mlとなるように、0.15M NaC1を含む50m
M)リスh1衝液(pH7,4)で希釈した。
て、最終F■C活性が1単位/ml又は0.25単位/
mlとなるように、0.15M NaC1を含む50m
M)リスh1衝液(pH7,4)で希釈した。
同時に、それぞれの溶液中のC&イオン濃度が5mMか
ら350+*MとなるようにCaCl2を添加した試料
(バッファー)も用意した。それらの溶液を試料として
、実施例[rV]のELISA法によってF■Ct’A
原量の測定を行った。ただし、実施例[IV]のELI
SA法の5の操作の前、及び、6の操作の前に、生理食
塩水で2回プレートを洗浄する操作を加えた。
ら350+*MとなるようにCaCl2を添加した試料
(バッファー)も用意した。それらの溶液を試料として
、実施例[rV]のELISA法によってF■Ct’A
原量の測定を行った。ただし、実施例[IV]のELI
SA法の5の操作の前、及び、6の操作の前に、生理食
塩水で2回プレートを洗浄する操作を加えた。
その結果(図2)、抗F■Cモノクロナール抗体No、
562は、Caイオン濃度の増加に伴ってF[Cに対
する結合性が減少し、75mM以上のCaイオン存在下
では、その結合性がほとんど消失した6文献(D、Ea
tonら、 Biochemistry、25 505
〜512 (1986))によると、高濃度Caイオ
ンの存在は、トロンビンによるF■Cの消化反応を完全
に阻害することが知られている0本実験でNo、 56
2のFMICに対する結合性が消失したCaイオン濃度
は、トロンビンによるFMICの消化反応が完全に阻害
される時のCaイオン濃度とほぼ一致する。また、高濃
度Caイオン(例えば0.3M CaCl2)を含有す
る中性緩衝液中で、FVICの活性は比較的安定に保持
される。
562は、Caイオン濃度の増加に伴ってF[Cに対
する結合性が減少し、75mM以上のCaイオン存在下
では、その結合性がほとんど消失した6文献(D、Ea
tonら、 Biochemistry、25 505
〜512 (1986))によると、高濃度Caイオ
ンの存在は、トロンビンによるF■Cの消化反応を完全
に阻害することが知られている0本実験でNo、 56
2のFMICに対する結合性が消失したCaイオン濃度
は、トロンビンによるFMICの消化反応が完全に阻害
される時のCaイオン濃度とほぼ一致する。また、高濃
度Caイオン(例えば0.3M CaCl2)を含有す
る中性緩衝液中で、FVICの活性は比較的安定に保持
される。
以上の事実も考慮すると、本実験の結果は、高濃度Ca
イオンによってもたらせられたFVIICのコンフォメ
ーション変化に対応して、モノクロナール抗体No、
562の結合性が減少したことを示すと考えられる。す
なわち、No、 562は、Caイオン非存在下または
低Caイオン濃度下でのF■Cのコンフォメーションを
特異的に認識するモノクロナール抗体であると解釈され
る。
イオンによってもたらせられたFVIICのコンフォメ
ーション変化に対応して、モノクロナール抗体No、
562の結合性が減少したことを示すと考えられる。す
なわち、No、 562は、Caイオン非存在下または
低Caイオン濃度下でのF■Cのコンフォメーションを
特異的に認識するモノクロナール抗体であると解釈され
る。
No、 562モノクロナ一ル抗体は、実施例[IV]
[■]で示したように、活性を有するFVIICとのみ
特異的に結合し、かつ、その特異的結合性は、高濃度C
aイオン存在下で消失する。したがって、N。
[■]で示したように、活性を有するFVIICとのみ
特異的に結合し、かつ、その特異的結合性は、高濃度C
aイオン存在下で消失する。したがって、N。
、562を用いた免疫吸着クロマトグラフィーを応用す
れば、原理的に活性を有するF■Cのみのvr製が可能
であり、かつ、その溶出時に活性を良く保持させること
のできる高濃度塩化カルシウム溶液を使用することがで
きる。このことは比活性の高い、高純度のF■製剤の調
製を可能とする。又、出発材料としては、前述した如く
、FVICを含む血漿等の血液由来の両分、さらには、
組換えDNA技術などの応用により培養細胞から産生さ
れたFVICを含む材料を用いることができる。
れば、原理的に活性を有するF■Cのみのvr製が可能
であり、かつ、その溶出時に活性を良く保持させること
のできる高濃度塩化カルシウム溶液を使用することがで
きる。このことは比活性の高い、高純度のF■製剤の調
製を可能とする。又、出発材料としては、前述した如く
、FVICを含む血漿等の血液由来の両分、さらには、
組換えDNA技術などの応用により培養細胞から産生さ
れたFVICを含む材料を用いることができる。
この方法を用いたF■Cの精製の一例を以下に示す。
市販の濃縮F■製剤(コンファクトpe)を出発材料と
して、抗F■Cモノクロナール抗体No。
して、抗F■Cモノクロナール抗体No。
562を用いた免疫吸着クロマトグラフィーを次の如く
行った。
行った。
■モノクロナール抗体のマトリックスへの固定化モノク
ロナール抗体の固定化に用いるマトリックスとしては、
蛋白質、とくにF■自体に対して高度の親和性をもたな
い物質、例えばガラスピーズ、アガロース及びその誘導
体が望ましい6本実験では、交叉結合アガロースゲルで
あるセファロースCL2B’ CPharmacia社
製)をマトリックスとして、J、 T’orathらの
方法(J、 Chromatography、 Plf
l、53〜56.1973>に準じて、No、 562
モノクロナ一ル抗体を固定化した。調製した免疫吸着体
には、ゲル1鱈当り1.8+wgのモノクロナール抗体
を結合させた。
ロナール抗体の固定化に用いるマトリックスとしては、
蛋白質、とくにF■自体に対して高度の親和性をもたな
い物質、例えばガラスピーズ、アガロース及びその誘導
体が望ましい6本実験では、交叉結合アガロースゲルで
あるセファロースCL2B’ CPharmacia社
製)をマトリックスとして、J、 T’orathらの
方法(J、 Chromatography、 Plf
l、53〜56.1973>に準じて、No、 562
モノクロナ一ル抗体を固定化した。調製した免疫吸着体
には、ゲル1鱈当り1.8+wgのモノクロナール抗体
を結合させた。
■免疫吸着クロマトグラフィー
以下の操作は、すべて室温で行った。
■で調整した免疫吸着体(ゲル容積14m1)をカラム
に充填し、0.15M NaC1,2mM NaC1a
、5%グリセロール、0.1mMフッ化フェニルメチル
スルホニル及び、0.05%NaN3を含む5hMイミ
ダゾール桜街液pH6,8(以下イミダゾール緩衝液と
略す)で平衡(ヒした0次に、25単位/■lのF■C
を含むコンファクトFOIO1をカラムに適用して、活
性を有するF■Cのみを免疫吸着体に吸着させた。その
後、イミダゾールwL衝液で、カラムを十分洗浄したの
ち、さらに3M NaC1を含むイミダゾール)! W
r 液で洗浄を行なった。
に充填し、0.15M NaC1,2mM NaC1a
、5%グリセロール、0.1mMフッ化フェニルメチル
スルホニル及び、0.05%NaN3を含む5hMイミ
ダゾール桜街液pH6,8(以下イミダゾール緩衝液と
略す)で平衡(ヒした0次に、25単位/■lのF■C
を含むコンファクトFOIO1をカラムに適用して、活
性を有するF■Cのみを免疫吸着体に吸着させた。その
後、イミダゾールwL衝液で、カラムを十分洗浄したの
ち、さらに3M NaC1を含むイミダゾール)! W
r 液で洗浄を行なった。
その後、再びイミダゾールjIIFr液で十分カラムを
洗浄したのち、0.35MCλC12を含むイミダゾー
ルv1衝液をカラムに流して、F■Cを溶出した。
洗浄したのち、0.35MCλC12を含むイミダゾー
ルv1衝液をカラムに流して、F■Cを溶出した。
以上のクロマトグラフィーの溶離パターンを図3に示し
た。!&終的に回収されたF■Cの活性量は、免疫吸着
体に結合したF■Cの活性量の約90χであり、比活性
で、出発材料に対して約500倍以上精製された。
た。!&終的に回収されたF■Cの活性量は、免疫吸着
体に結合したF■Cの活性量の約90χであり、比活性
で、出発材料に対して約500倍以上精製された。
上清製された。
4.[K面の簡惟な麦明
図1は、本発明において用いる抗FWCモノクロナール
抗体の特異性を市販の抗F■Cモノクロナール抗体と比
較して示すグラフである。
抗体の特異性を市販の抗F■Cモノクロナール抗体と比
較して示すグラフである。
(212は、本発明において用いる抗F■Cモノクロナ
ール抗体の活性F■Cに対する特異性がCaイオンイ虚
度に依存することを示すグラフである。
ール抗体の活性F■Cに対する特異性がCaイオンイ虚
度に依存することを示すグラフである。
図3は、本発明の方法に従いF■Cを精製するときのク
ロマ(・グラフィーの溶離パターンを示すものである。
ロマ(・グラフィーの溶離パターンを示すものである。
Claims (2)
- (1)活性を有するFVIIICに対して特異的な結合性を
有し且つ該結合性が2価または3価の金属の陽イオンの
存在する濃度に依存するモノクロナール抗体を適当な担
体に固定化して吸着体とし;FVIIICまたは(および)
FVIIIC/vwF複合体を含有する出発材料を前記金属
陽イオンの非存在下または低濃度下に前記吸着体に適用
してFVIIICまたは(および)FVIIIC/vwF複合体
を前記モノクロナール抗体に結合させ;前記金属陽イオ
ンを高濃度で含有する溶液を用いて前記FVIIICまたは
(および)FVIIIC/vwF複合体を前記モノクロナー
ル抗体から溶離させる工程を含むことを特徴とする血液
凝固第VIII因子の精製方法。 - (2)前記金属陽イオンがCaイオンであり、0.02
M以下のCaイオン濃度下においてFVIIICまたは(お
よび)FVIIIC/vwF複合体を含有する出発材料を前
記吸着体に適用し、また、0.1〜1.0MのCaイオ
ン濃度を有する溶液を用いてFVIIICまたは(および)
FVIIIC/vwF複合体の前記モノクロナール抗体から
の溶離を行う特許請求の範囲第(1)項に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP30726887A JPH01144991A (ja) | 1987-12-02 | 1987-12-02 | 血液凝固第8因子の精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP30726887A JPH01144991A (ja) | 1987-12-02 | 1987-12-02 | 血液凝固第8因子の精製方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01144991A true JPH01144991A (ja) | 1989-06-07 |
Family
ID=17967070
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP30726887A Pending JPH01144991A (ja) | 1987-12-02 | 1987-12-02 | 血液凝固第8因子の精製方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH01144991A (ja) |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1997039033A1 (de) * | 1996-04-12 | 1997-10-23 | Immuno Aktiengesellschaft | Reinigung von faktor viii-komplex durch immunaffinitätschromatographie |
WO2012133782A1 (ja) * | 2011-03-30 | 2012-10-04 | 中外製薬株式会社 | 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法 |
JPWO2012133782A1 (ja) * | 2011-02-25 | 2014-07-28 | 中外製薬株式会社 | 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法 |
US9828429B2 (en) | 2007-09-26 | 2017-11-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR |
US9868948B2 (en) | 2008-04-11 | 2018-01-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly |
US10253100B2 (en) | 2011-09-30 | 2019-04-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Therapeutic antigen-binding molecule with a FcRn-binding domain that promotes antigen clearance |
US10919953B2 (en) | 2012-08-24 | 2021-02-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | FcgammaRIIB-specific Fc region variant |
US11046784B2 (en) | 2006-03-31 | 2021-06-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies |
US11267868B2 (en) | 2013-04-02 | 2022-03-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Fc region variant |
US11820793B2 (en) | 2011-11-30 | 2023-11-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Drug containing carrier into cell for forming immune complex |
US11827699B2 (en) | 2011-09-30 | 2023-11-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for producing antibodies promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities |
US11891434B2 (en) | 2010-11-30 | 2024-02-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly |
-
1987
- 1987-12-02 JP JP30726887A patent/JPH01144991A/ja active Pending
Cited By (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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JP2009161547A (ja) * | 1996-04-12 | 2009-07-23 | Baxter Innovations Gmbh | 高度に精製された第viii因子コンプレックス |
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US11248053B2 (en) | 2007-09-26 | 2022-02-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR |
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US9868948B2 (en) | 2008-04-11 | 2018-01-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly |
US9890377B2 (en) | 2008-04-11 | 2018-02-13 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly |
US11359194B2 (en) | 2008-04-11 | 2022-06-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule capable of binding two or more antigen molecules repeatedly |
US10472623B2 (en) | 2008-04-11 | 2019-11-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule capable of binding two or more antigen molecules repeatedly |
US11891434B2 (en) | 2010-11-30 | 2024-02-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly |
JP6074360B2 (ja) * | 2011-02-25 | 2017-02-01 | 中外製薬株式会社 | 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法 |
US10618965B2 (en) | 2011-02-25 | 2020-04-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for altering plasma retention and immunogenicity of antigen-binding molecule |
JPWO2012133782A1 (ja) * | 2011-02-25 | 2014-07-28 | 中外製薬株式会社 | 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法 |
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