JP2824430B2

JP2824430B2 - 血液凝固第▲ｖｉｉ▼因子または活性型血液凝固第▲ｖｉｉ▼因子の調製方法

Info

Publication number: JP2824430B2
Application number: JP1286944A
Authority: JP
Inventors: 匡伸今村; 周三大山; 智弘中垣; 昭信船津
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1989-08-02
Filing date: 1989-11-02
Publication date: 1998-11-11
Anticipated expiration: 2013-11-11
Also published as: JPH03155797A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明はヒト血液凝固第VII因子コンホメーション特
異性モノクローナル抗体、ならびに該抗体を用いて血液
凝固第VII因子、または（および）活性型血液凝固第VII
因子の調製法に関する。

発明の背景血液凝固は、最終的にフィブリンクロットを生じさせ
る種々の血液成分または因子の複雑な相互作用からなる
過程である。一般に、凝固カスケードと称される現象に
関与する血液成分は酵素的に不活性なタンパク質である
プロエンザイム（proenzyme）またはザイモゲン（zymog
en）であり、これらのタンパク質は、活性化された別の
凝固因子の作用によりタンパク質分解酵素に転換され
る。こうして転換された凝固因子は一般に「活性化され
た因子」と称される。

血液の凝固を助長し、そしてそれによって正常の止血
に関与する２つの独立した系が存在し、これらの系は各
々、「内因性経路」および「外因性経路」と称されてい
る。内因性経路は血漿中のみ存在する因子の利用を介し
てトロンビンの形成を導く反応を意味する。該経路にお
ける中間的現象として活性型血液凝固第XI因子（F XI
a）およびカルシウムイオンにより触媒される反応であ
る血液凝固第IX因子（F IX）の活性化がある。次に、活
性型血液凝固第IX因子（F IX a）は活性型血液凝固第VI
II因子（F VIII a）、リン脂質およびカルシウムイオン
の存在下で血液凝固第Ｘ因子（F X）の活性化に関与す
る。一方、外因性経路は血漿因子、および組織抽出物中
に存在する成分が関与する。前述のプロエンザイムの１
つである血液凝固第VII因子（F VII）は、活性型血液凝
固第VII因子（F VII a）への変換の後に、組織因子およ
びカルシウムイオンの存在下でF XをF X aに転換するこ
とにより、血液凝固の外因性経路に関与する。F X aは
次に活性型血液凝固第Ｖ因子（F V a）、カルシウムイ
オンおよびリン脂質の存在下でプロトロンビンをトロン
ビンに転換する。F XのF X aへの活性化は内因性経路お
よび外因性経路の両者に共通の現象であるから、F VIII
が不足しているかまたはF VIIIの阻害物質（インヒビタ
ー）を有する血友病患者の治療のためにF VII aを利用
することができる。さらに、F VII aはF IXの活性化に
おいて役割を演ずることにより内因性経路に関与するこ
とを示唆する証拠も存在する。F VIIのF VII aへの活性
化はいくつかの異なる血漿プロテアーゼ、例えばF X a
および活性型血液凝固第XII因子（F XII a）等により触
媒される。

ところで血友病の補充療法において、F VIIIおよびF
IXを投与された個体は、これらのタンパク質に対する抗
体をしばしば生じさせ、該抗体の存在のために止血管理
は甚だ困難となる。この問題を経験する患者は通常、F
VII aを含有する活性凝固酵素および不活性凝固酵素の
混合物からなることが知られている活性化されたプロト
ンビン複合体により治療される。

さらに、最近の研究によれば、投与された少量のF VI
I aがその血漿中に高レベルの抗F VIII抗体を有する血
友病患者の重度の進行性出血を抑制するために有効であ
ることが明らかになっている（Hedner,et al.,J.Clin.I
nvest.71,p.1836（1983））。

F VIIは１本鎖糖蛋白でビタミンＫ依存性凝固因子
（プロトロンビン、血液凝固第VII因子、血液凝固第IX
因子、血液凝固第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテイン
Ｓ、プロテインＺからなり、これらは構造上の相同性が
高くプロテインビンファミリーとも呼ばれる）の１つで
ある。生理的には、組織因子（Tissue Factor）と複合
体を形成し、血液凝固の開始反応を担う重要な蛋白質で
ある。また、F VII aはF VIIのArg¹⁵²−Ile¹⁵³結合が限
定分解を受け２本鎖になった糖蛋白で、その凝固活性は
F VIIと比べ25倍程高いことが知られており、前述のよ
うに従来その止血管理が困難とされているF VIIIおよび
F IXに対する抗体を有する血友病患者の治療に有用であ
る。

従来の技術とその問題点 F VIIを調製するためには従来より各種の方法が提案
されており、特に血漿主来のヒトF VIIを調製するべく
多くの試みがなされている（Prydz,J.Scand.J.Clin.La
b.Invest.1,p.101（1964）;Gladhaug,A.et al.,Biochi
m.Biophys.Acta 215,p.105,（1970）;Laake,K.,et al.,
Thromb.Res.5,p.539,（1974）;Schiffman,S.,et al.,Th
romb Res.6,p.273（1975）;Osterud,B.,et al.,Proc.Na
tl.Acad.Sci.U.S.A.74,p.5260（1977））。しかしなが
ら、これらの調製法においてはF VIIの部分精製にとど
まり、F VIIそのものを純粋に物質として単離するまで
には至っていない。このような状況下、塩化バリウムに
よる吸着処理ならびに硫酸アンモニウムによる塩析沈澱
法、イオン交換クロマト法およびゲル過法よりなる精
製方法によりF VIIが良好に調製されることが報告され
た（Broze,Jr.G.J.et al.,J.Biol.Chem.255,p,1242（19
80））。従来、F VIIは血液中の濃度が極めて低く、ま
た、前述の類似する他のプロトロンビンファミリーとの
分離が容易でないため、血漿からF VIIを工業的規模で
単離することは困難であった。前述の方法は、血漿から
の実験室規模でのF VIIの調製という点では優れた方法
と考えられるが、工業的規模にこれを適用することは、
なお種々の困難を伴う。

発明の構成および効果上記問題点を解決するため、F VIIに対する抗体を調
製し、該抗体を適当な担体に結合させて用いる免疫吸着
クロマトグラフィーを利用する、F VIIまたは（およ
び）F VII aの調製方法が試みられた。特にモノクロー
ナル抗体を用いる免疫吸着法はその特異性の高さにより
有望視されるが、モノクローナル抗体を免疫吸着法に応
用する場合、通常、高濃度のグアニジンあるいは尿素の
様な変性剤を用いて、吸着した目的物質を溶出しなけれ
ばならず、この点が大きな問題となっていた。すなわ
ち、目的とする溶出物が血液凝固因子のごときプロテア
ーゼ等の場合、その活性を消失することが多く、医薬品
の工業的規模の製造に応用するには、なお、克服するべ
き大きな障壁残っていた。

上述の問題点を解決するべく、本願発明者等は鋭意研
究を重ねた結果、金属陽イオンの結合の有無に起因する
コンフォメーションの差異を識別するF VIIおよび（ま
たは）F VII aに対するモノクローナル抗体を見い出
し、当該モノクローナル抗体を免疫吸着クロマトグラフ
ィーに応用して、強力な変性剤を用いることなく、目的
とするF VIIおよび（または）F VII aを溶出し精製する
ことのできる出願発明を完成するに至った。すなわち、
本発明に用いられるコンフォメーション特異性モノクロ
ーナル抗体を免疫吸着体として用いる場合、金属イオン
存在下でF VIIを吸着させ、次いで吸着させたF VIIから
該因子に結合した金属イオンをEDTAの様な金属キレート
剤により除去すれば、F VIIは金属イオンと結合してい
る時とは異なるコンフォメーションをとることになり、
吸着体に対する親和性が消失し、F VIIが容易にかつ活
性を損なうことなく溶出され、精製取得することができ
る。

また、本願発明者等は、当該コンフォメーション特異
性モノクローナル抗体が、極めて低濃度の金属によるF
VIIまたは（および）F VII aのコンフォメーション変化
を認識し得ることを見いだした。従来、出発材料として
のF VIIまたは（および）F VII aを含有する血漿は、血
漿自体に含有される金属に起因する凝固を抑制するため
に、クエン酸塩等の添加によって含有される金属は捕捉
されている。比較的高濃度域での金属存在下のコンフォ
メーション変化を認識する、金属依存性モノクローナル
抗体を用いる凝固因子の調製においては、人為的な金属
イオンの添加は不可欠であり、この操作を行なうことに
よる目的とする凝固因子への悪影響は避け難いものであ
った。

本願発明によって見いだされた低濃度の金属によるF
VIIのコンフォメーション変化を認識し得る当該モノク
ローナル抗体を利用すれば、採取直後の血液にEDTAある
いはEGTAのような金属キレート剤を添加することによ
り、血漿中のカルシウムイオンに代表される金属イオン
濃度は低濃度に制御され、この血漿を前記モノクローナ
ル抗体を固定化した免疫吸着体に通液することによっ
て、凝固を生じることなく、より天然のものに近いF VI
Iまたは（および）F VII aを調製することができる。上
述のように、従来、不可能であったF VIIの好適な工業
的調製が、本発明により初めて可能となった。

さらに特筆すべきことに、本発明の方法に従えば、新
鮮血漿を陰イオン交換体で処理して得られる、Prothrom
bin family rich fraction（F VIIペーストと呼ぶ）を
原料として一段階でF VIIのみならずF VII aを調製する
ことができる。例えば、F VIIペーストを溶解する時の
温度やプロテアーゼインヒビター（AT III−ヘパリン、
ベンズアミジン等）添加の有無等の条件を選択すること
により、コンフォメーション特異性抗F VIIおよび（ま
たは）F VII aモノクローナル抗体カラム処理後の溶出
画分をF VIIとして得ることもできるしF VII aとして得
ることもできる。すなわち、F VIIペーストを溶解する
際にプロテアーゼインヒビターを添加し、かつ低温下で
処理し、該出発原料を低温下で、本発明のコンフォメー
ション特異性モノクローナル抗体カラムに適用すれば溶
出画分はF VIIとして、また、出発原料てあるF VIIペー
ストをプロテアーゼ未添加の条件で室温下で溶解し、室
温条件でコンフォメーション特異性モノクローナル抗体
カラム処理すると溶出画分はF VII aとして得ることが
できる。F VII aは従来、F VII精製後、F XII aあるい
はリン脂質、カルシウム陽イオン共存下F X aで活性化
する方法により調製していたが、活性化に用いる上記プ
ロテアーゼの調製が煩雑なうえ、その除去も大きな問題
となる。しかしながら、上記の方法によれば、原料であ
るヒト血漿から、F VIIのみならずF VII aを本願発明の
モノクローナル抗体カラムを用いることにより簡便かつ
高収率に得られるという点で、本発明の方法は従来にな
い極めて画期的なものと結論することができよう。

本発明を利用した高純度F VIIおよび（または）F VII
aの調製方法の諸工程の一例を以下に示す。

まず、本発明によって得られたカルシウムイオンをは
じめとする金属陽イオンの結合の有無に起因する、F VI
Iおよび（または）F VII aの微細なコンフォメーション
変化の差異を識別する性質を有するモノクローナル抗体
をマトリックス（担体）に固定化したカラムに、該金属
イオンの存在条件下、F VII（および）またはF VII aを
含有する出発材料を通液する。上記出発材料としては、
特に制約はないが例えば、血漿および組換えDNA技術に
よって産生されたF VIIを含有する材料等が適用され
る。

次に、カラムに非特異的に結合した夾雑タンパク質を
除去するために、適切な洗浄用緩衝液でカラムを充分洗
浄する。

カラムに結合している活性を有するF VIIおよび（ま
たは）F VII aを、EDTA等の金属キレート剤を含有する
溶液で溶出する。

溶離したF VIIおよび（または）F VII aを含有する溶
出液は、透析やゲル過法により必要に応じて脱塩、緩
衝液置換を行なう。

該凝固因子含有溶液の濃縮には、既知の方法である限
外過法、凍結乾燥法、および陰イオン交換クロマトグ
ラフィー等の方法を用いることができる。

なお、本発明に用いられるF VIIおよび（または）F V
II aに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマは工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に10
834号（FERM P−10834）の寄託番号で寄託されている。

以下、本発明の特徴をさらに明らかにするため、実施
例に沿って詳述する。

実施例コンフォメーション特異性抗F VIIモノクローナル抗体
の調製（１）第VII因子の精製新鮮凍結血漿を37℃で素早く融解した後、４℃におい
てゆっくり撹拌しながら1/10容の塩化バリウムを滴下
し、２時間放置した。4000rpm、５分間４℃にて遠心処
理を行ない沈澱を回収し、Tris−塩酸緩衝液に懸濁し
た。この溶液を30％〜70％硫酸アンモニウム塩析沈澱を
行ない、得られた沈澱を再懸濁後、DEAE−セファローズ
クロマトグラフィーを行なった。

pH6.0のリン酸バッファーで0.05M→0.5Mの塩化ナトリ
ウムの濃度勾配でF VIIを含む画分を得た。透析後、こ
の画分をQAE−セファデックスカラムに通液し、洗浄
後、塩化カルシウム含有緩衝液で溶出した。更にセファ
ッデクスＧ−100カラムでゲル過し、精製後、アミコ
ンの限外過器で濃縮した。精製したF VIIはSDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法で単一バンドを示し、他
の凝固因子の混入は認められなかった。

（２）モノクローナル抗体の調製上記で得られた精製F VIIの50μｇを50μの生理食
塩水に溶解し、アジュバントとしてDIFCO社のフロイン
トの完全アジュバント100μを加えて油中水滴型とし
たものを基礎免疫抗原とした。また追加免疫用抗原とし
て上記の精製F VII50μｇを50μの生理食塩水に溶か
して調製したものを用いた。

BALB/Cマウス７週令（♀）を用い、基礎免疫原を接種
後、追加免疫用抗原を60日目に免疫したマウスより得ら
れたマウス脾臓細胞を通常の方法によりマウスミエロー
マ細胞（P3−X63−Ag8−U1）と融合させクローニングし
て第VII因子特異性モノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマ５種を得た。各々をマウス腹腔内で増殖させ
ることによってハイブリドーマを大量に調製し、これよ
り各モノクローナル抗体を得た。

（３）抗原特異性の測定およびイムノグロブリン・サブ
クラスの同定上記（２）で得られた５種のハイブリドーマが産生す
るモノクローナル抗体の抗原特異性を次のようにして測
定した。

測定は、次の如くELISA法で行なった。

1.抗原のコーティング２枚のマイクロタイタープレートに10mMトリス−塩酸
（pH＝7.5）150mM NaClで２μg/mlに調製したヒトF VII
（上記で精製したものと同じもの）50μを添加し、37
℃で60分間インキュベートした。

2.洗浄 2mM CaCl₂及び2mM EDTAをそれぞれ含む、２通りの10m
Mトリス−塩酸（pH＝7.5）、0.5M NaCl、0.1％Tween20
分からなる緩衝液を調製し、１枚のマイクロタイタープ
レートは、2mM CaCl₂を含む緩衝液で、もう１枚のプレ
ートは2mM EDTAを含む緩衝液でそれぞれ、４回づつ洗浄
した。

3.ブロッキング１％ウシ血清アルブミンを含む10mMトリス−塩酸（pH
＝7.5）150mM NaCl溶液を調製し、その200μを各プレ
ートに添加し、37℃で30分間インキュベートした。

4.ハイブリドーマ上清添加ハイブリドーマ上清40μを各プレートの列毎に添加
し、37℃で60分間インキュベートした。

5.第２抗体及び発色各プレートにペルオキシダーゼを結合した抗マウスIg
Gウサギ抗体50μを添加し、25℃で60分間インキュベ
ートした。その後ｏ−フェニルジアミン溶液を100μ
添加し、25℃で10分間反応させ、492nmの波長で吸光度
を測定した。

結果は、第１表のとおりであり、いずれもF VII特異
性であるが、その中でクローンNo.3〜No.5はCa⁺⁺イオン
との結合によって生じるコンフォメーションのみを特異
的に認識することが判明した。なお、イムノグロブリン
サブクラスの同定はゲル内沈降反応により行なった。そ
の結果、今回得られたハイブリドーマより産生される抗
体のサブクラスはすべてIgG1であった。

（４）他のビタミンＫ依存性凝固因子に対するモノクロ
ーナル抗体の反応前記（２）で得られた各モノクローナル抗体の抗原特
異性を次の様にして更に確認した。実験は前記と同様に
ELISA法で行なった。確認する抗原として、プロトロン
ビン、F VII、F IX、F X、プロテインＣ、プロテインＳ
及びウシ血清アルブミンを用いた。各々精製した抗原を
10mM Tris−塩酸（pH＝7.5）0.1M NaClで５μg/mlに調
製し、マイクロタイタープレートに37℃60分コーティン
グした。以下、ウシ血清アルブミンによるブロッキン
グ、洗浄、モノクローナル抗体の添加、及び発色の手順
は、前記（３）と同様である。全てのクローンは、２価
のカルシウム陽イオンの存在下でF VIIのみに反応し、
他の各凝固因子及びウシ血清アルブミンとは反応しなか
った（第３−１表参照）。なお、金属キレート剤により
系からカルシウム陽イオンを除去するとクローンNo.3〜
５の第VII因子結合性は消失した（第３−２表参照）。

（６）モノクローナル抗体の他の金属イオンによるコン
フォメーションに対する特異性の測定実験は、前記（３）と同様にELISA法で行なった。前
記（１）で精製したF VIIをマイクロタイタープレート
にコーティングした。

MgCl₂、SrCl₂、BaCl₂、MnCl₂、CaCl₂（濃度はすべて2
mM）をそれぞれ含む５通りの10mMトリス−塩酸（pH7.
5）0.5M NaCl、0.1％Tween 20からなる緩衝液を調製
し、マイクロプレートの各列を上記５種類の金属イオン
を含む緩衝液でそれぞれ４回づつ洗浄した。以下、ウシ
血清アルブミンによるブロッキング、モノクローナル抗
体の第２抗体の添加及び発色の手順は、前記（３）と同
じである。

結果を第４表に示した。

その結果、金属の結合に起因するコンフォーメーショ
ンを認識するクローンNo.3〜５の３種類のクローンのう
ちNo.4および５はCa⁺⁺およびMn⁺⁺に特異性を有し、No.3
は表に見られるようにCa⁺⁺をはじめとする数種類の金属
陽イオンが適用され得ることが判明した。

（７）モノクローナル抗体の結合性に対する金属イオン
（カルシウムイオン）濃度の影響実験は、前記（３）と同様にELISA法で行なった。前
記（１）で精製したF VIIをマイクロタイタープレート
にコーティングした。

CaCl₂をそれぞれの濃度含有するように調製した10mM
トリス−塩酸（pH＝7.5）0.5M NaCl、0.1％Tween 20か
らなる緩衝液を調製し、マイクロプレートの各列を各々
の濃度のカルシウムイオンを含む緩衝液でそれぞれ４回
づつ洗浄した。以下、ウシ血清アルブミンによるブロッ
キング、モノクローナル抗体の第２抗体の添加及び発色
の手順は、前記（３）と同じである。10mMのカルシウム
イオン存在下での結合率を100％とした場合、各イオン
濃度存在下での相対結合率を第５表に表す。

この結果、本願発明のモノクローナル抗体は、1mM以
下のカルシウムイオンの存在でF VIIまたは（および）F
VII aに対して特異的な結合性を有し、該結合性がカル
シウムイオンの当該濃度域で濃度に依存して減少する特
性を有していることが明かになった。

抗F VIIモノクローナル抗体を用いた免疫吸着クロマト
グラフィーによるF VII及びF VII aの調製（１）．免疫吸着クロマトグラフィーの調製交差結合アガロースゲルであるセファロースCL4Bを担
体として常法、例えばJ.Porath et al.,J.chromatograp
y,86,p.53,（1973）に記載された方法に準じて、第４表
中クローンNo.3で規定される（寄託番号FERM P−1083
4）ハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体
を固定化した。

（２）.F VIIの調製クリオレシピテートを除去したヒト新鮮凍結血漿から
陰イオン交換処理によりProthrombin family rich画分
を溶出し、ポリエチレングリコール（PEG）処理により
沈澱濃縮した。この沈澱をプロテアーゼインヒビター存
在下、0.05M Tris、0.15M NaCl pH7.4緩衝液で溶解し、
最終濃度5mMになるようにCaCl₂を添加し、0.05M Tris
0.15M NaCl 5mM CaCl₂ pH7.4緩衝液で平衡化した（１）
で調製したコンフォメーション特異性F VIIおよび（ま
たは）F VII aモノクローナル抗体カラムに通液し、平
衡化緩衝液で洗浄後、0.05M Tris、0.15M NaCl、10mM E
DTA、pH7.4緩衝液で溶出した。溶出画分はF VII以外に
わずかな夾雑物を認めたが、更なるDEAE−Sapharoseク
ロマト処理によりSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で単一バンドのF VIIとなった。なお、すべての工程
は４℃で行なった。

（３）．新鮮血漿からのF VIIの迅速調製新鮮血漿にEGTAを最終濃度2.13mMになるように添加
し、200mMマレイン酸でpHを6.8に調整する。この時、血
漿中の遊離のカルシウムイオン濃度は約30μＭに制御さ
れる。この状態では血漿は殆ど凝固しない。こうして処
理された血漿を、30μM CaCl₂/50mMトリスマレイン酸バ
ッファーpH6.8で平衡化した、上記（１）で調製した免
疫吸着体に通液し、同バッファーで洗浄後、10mM EDTA/
50mMトリスマレイン酸バッファーpH6.8で溶出すると、S
DS−PAGEで均一なバンドを示すより天然の状態に近いF
VIIが好適に調製される。

（４）.F VII aの調製クレオプレシピテートを除去した新鮮凍結血漿から陰
イオン交換処理によりProthrombin family rich画分を
溶出し、ポリエチレングリコール（PEG）処理により沈
澱・濃縮した。この沈澱をpH7.4、0.05M Tris緩衝液
（0.15M NaCl、5mM CaCl₂含有）により室温で溶解後、
上記緩衝液で平衡化したコンフォメーション特異性抗F
VIIおよび（または）F VII aモノクローナル抗体カラム
に通液し、平衡化緩衝液で洗浄後、pH7.4 0.05M Tris緩
衝液（0.15M NaCl、10mM EDTA含有）で溶出した。溶出
画分はF VII a以外にわずかな夾雑物を認めたが、異な
るDEAE−Sepharoseクロマト処理により、SDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で単一バンドのF VII aとなっ
た。なお、この蛋白がF VII aであることは以下の証拠
により明かである。

50単位／μｇの比活性を有し、これはF VIIと比較し
て25−30倍アップしている。

SDS−ポリアクリルアミドゲル電位泳動により還元型
で２本鎖となり、その分子量が一致する。

アミノ酸配列の成績からArg¹⁵²−Ile¹⁵³の結合の切断
が認められる。

なお、血液凝固第VII因子の活性測定は以下の方法に
従った。

血液凝固第VII因子欠乏血漿を用いたプロトロンビン
（PT）時間法（参考文献Methods Enzymol.80,228−237,
1981）により測定した。すなわち、欠乏血漿0.1ml、希
釈試料0.1ml、組織トロンボプラスチン溶液0.1mlを２分
間インキュベートし、0.025M CaCl₂溶液0.1mlを添加
後、凝固するまでの時間を測定する。予め、希釈試料の
代わりに段階希釈した正常血漿を用いて標準曲線を作成
しこれより試料中の第VII因子活性を測定する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法に従いF VIIおよび（または）F V
II aを精製する時のクロマトグラフィーの溶出パターン
を示すものである。第２図は、本発明の方法に従って調製されたF VII aのS
DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示し、NR
は非還元状態の試料、Ｒは還元処理後の試料、MWマーカ
ーは分子量マーカーを表す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 15/02 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献特開平１−144991（ＪＰ，Ａ) ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．42，Ｎｏ．４（1986）, ｐ489〜498 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 16/00 - 16/46 C12P 21/00 - 21/08 C12N 15/00 - 15/90 A61K 39/395 - 39/44 A61K 38/36 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】血液凝固第VII因子（F VII）または／およ
び活性型血液凝固第VII因子（F VII a）に対して特異的
な結合性を有し、該結合性がカルシウムイオン、マンガ
ンイオン、バリウムイオン、マグネシウムイオンおよび
ストロンチウムイオンから選ばれる２価の金属陽イオン
の存在濃度に依存し、前記金属陽イオン存在下でF VII
または／およびF VII aに結合し、前記金属陽イオンの
非存在下または低濃度下ではF VIIまたは／およびF VII
aに結合しない性状を有するモノクローナル抗体。
【請求項２】少なくとも1mM以上の濃度のカルシウムイ
オン存在下で、F VIIまたは／およびF VII aに対して特
異的な結合性を有し、1mM未満の濃度のカルシウムイオ
ン濃度域では濃度に依存してF VIIまたは／およびF VII
aに対する結合性が減少する特性を有する、特許請求の
範囲第（１）項記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】工業技術院微生物工業技術研究所に寄託番
号10834号（FERM P−10834）で寄託されているハイブリ
ドーマにより産生される、特許請求の範囲第（１）項ま
たは第（２）項に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】F VIIまたは／およびF VII aに対して特異
的な結合性を有し、該結合性がカルシウムイオン、マン
ガンイオン、バリウムイオン、マグネシウムイオンおよ
びストロンチウムイオンから選ばれる２価の金属陽イオ
ンの存在濃度に依存し、前記金属陽イオン存在下でF VI
Iまたは／およびF VII aに結合し、前記金属陽イオンの
非存在下または低濃度ではF VIIまたは／およびF VII a
に結合しない性状を有するモノクローナル抗体を適当な
担体に固定化して吸着体とし、F VIIまたは／およびF V
II aを含有する出発材料を前記金属陽イオンの存在下前
記吸着体に結合させ、金属キレート剤を含有する溶液を
用いてF VIIまたは／およびF VII aを前記吸着体から溶
離させる工程を含むことを特徴とする、F VIIまたは／
およびF VII aの調製方法。
【請求項５】F VIIまたは／およびF VII aを含有する採
取直後の血漿のカルシウムイオン濃度を1mM〜10mMに抑
制し、さらに人為的な金属陽イオンの添加を行うことな
く、過剰の金属陽イオンによるF VIIまたは／およびF V
II aの損傷を回避することを特徴とする、特許請求の範
囲第（４）項記載のF VIIまたは／およびF VII aの調製
方法。
【請求項６】F VIIまたは／およびF VII aを含有する出
発材料を、カルシウムイオン、マンガンイオン、バリウ
ムイオン、マグネシウムイオンおよびストロンチウムイ
オンから選ばれる２価の金属陽イオンの存在下、請求項
１記載のモノクローナル抗体を適当な担体に固定化した
吸着体に接触させF VIIまたは／およびF VII aを前記吸
着体に吸着させる工程、及び金属キレート剤を含有する
溶液を用いてF VIIまたは／およびF VII aを前記吸着体
から溶離させる工程を室温で行うことによって、F VII
からF VII aへの活性化工程を特段必要としないF VII a
の調製方法。
【請求項７】前記F VIIまたは／およびF VII aを含有す
る出発材料が、プロトロンビンファミリーを高濃度で含
有するペーストをカルシウムイオン含有緩衝液を用いて
室温で溶解したものである、特許請求の範囲第（６）項
記載のF VII aの調製方法。