JPH0638743A - 抗プロテインｃモノクローナル抗体およびそれを産生するハイブリドーマ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 抗プロテインＣモノクローナル抗体および該
抗体を産生するハイブリドーマ 【効果】 特異的抗プロテインＣ抗体を提供するととも
に大量の所望抗プロテインＣ抗体が容易に提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】この発明はハイブリドーマにより産生され
る新規なモノクローナル抗体に関する。さらに詳しく
は、この発明は、ハイブリドーマにより産生される新規
な抗プロテインＣモノクローナル抗体、抗プロテインＣ
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、抗プロ
テインＣモノクローナル抗体を用いるプロテインＣの精
製法に関する。

【０００２】この発明の抗プロテインＣモノクローナル
抗体は、哺乳動物由来のプロテインＣにより免疫された
哺乳動物から採取した脾細胞と哺乳動物のミエローマ
（骨髄腫）細胞とを融合させて生ぜしめたハイブリドー
マの細胞培養によって調製できる。脾細胞とミエローマ
細胞との融合は、融合促進剤（例えばポリエチレングリ
コール）の存在下に両者を接触させることにより達成さ
れる。小割合の脾細胞とミエローマ細胞とが融合されて
ハイブリドーマを生成する。さらに、このようにして得
たハイブリドーマは、融合された種々の脾細胞のそれぞ
れに応じて種々の抗体を産生する。しかし、このように
して得たハイブリドーマから所望の抗体を産生するハイ
ブリドーマをクローニングにより単離することが可能で
ある。

【０００３】このようにして得たクローン化ハイブリド
ーマは、栄養培地中でまたは哺乳動物の腹腔内で増殖さ
せることができ、産生した抗体は培養上清またはその哺
乳動物の腹水または血清より、天然または人工的な蛋白
源から、蛋白を単離または精製するのに一般的に用いら
れる常法で精製することができる。そのような方法とし
ては、遠心分離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、
ＤＥＡＥセルロースを用いるカラムクロマトグラフィ、
ゲル濾過、アフィニティカラムクロマトグラフィ、凍結
乾燥等のような単離および精製法が挙げられる。

【０００４】この方法の利点は、特定の決定基のみを標
的とし、また用いられるプロテインＣ調製液中に含まれ
る抗原性不純物により生起された抗体に汚染されていな
い特異的抗プロテインＣ抗体を提供することである。こ
の方法のもう一つの利点は、大量の所望抗プロテインＣ
抗体が容易に提供されることである。このようにして得
たこの発明の抗プロテインＣモノクローナル抗体は、プ
ロテインＣに対する結合能を有し、プロテインＣの免疫
吸着精製において免疫吸着剤として用いることができ
る。さらに詳しくは、この発明の抗プロテインＣモノク
ローナル抗体は、常法により活性化ポリサッカライド
（例えばファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製ブロ
ムシアン活性化セファロース４Ｂ）と反応させることに
よりポリサッカライドと結合させることができる。以
下、この発明の方法を実験の詳細をもって説明するが、
それらは例示のためのものであって限定のためのもので
はない。

【０００５】実施例１ 抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体の調製 （ｉ）免疫脾細胞の調製 ヒト血漿よりプロテインＣを精製したところ、電気泳動
により単一バンドを示した。このプロテインＣ溶液各３
０μｇをジフテリア・破傷風トキソイド・百日咳ワクチ
ン合剤（大阪大学微生物研究所製、１ｍｌ中百日咳菌２
×１０¹⁰を含有）１００μｇと共に腹腔内注射によりＢ
ＡＬＢ／ｃマウスの雌６匹に投与した。実験１において
は、１４日後さらにプロテインＣ各３０μｇの食塩溶液
を３匹に腹腔内投与した。第二回目の投与から１５日後
に同量のプロテインＣの食塩溶液をそれらのマウスに静
脈内投与した。実験２においては、プロテインＣの各３
０μｇを同じトキソイドワクチン合剤と共に残りのマウ
ス３匹に第一回目の投与１４日後に腹腔内投与した。第
二回目の投与３０日後に、プロテインＣ３０μｇの食塩
溶液を静脈内投与した。最終投与の４日後に、実験１で
はマウス２匹（１匹は死亡）、実験２ではマウス３匹を
屠殺し、脾臓を採取し、細胞融合に用いた。

【０００６】（ｉｉ）ハイブリドーマの調製 脾臓をピンセットでほぐして調製した脾細胞をケーラー
とミルスタインの方法（ネイチャー、２５６巻、４９５
−４９７頁、１９７５年参照）によりマウスミエローマ
細胞Ｐ３×６３Ａｇ８Ｕｌと融合した。すなわち、脾細
胞をダルベッコ氏改変イーグルズ・ミニマム・エッセン
シャルメディウム（最小必須培地、以下Ｄ−ＭＥＭとい
う）に浮遊させた。浮遊液中の赤血球を０．８３％塩化
アンモニウム溶液（９容量）と０．１７Ｍトリス（ヒド
ロキメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６
５，１容量）との混液で４℃で５分間処理して破壊し遠
心分離により除去した。１５％ウシ胎仔血清加Ｄ−ＭＥ
Ｍ中で培養したマウスミエローマ細胞と脾細胞をＤ−Ｍ
ＥＭで数回洗浄した。

【０００７】マウスミエローマ細胞（４×１０⁷ 個）の
浮遊液に脾細胞（２×１０⁸ 個）の浮遊液を加えた。混
液を５０ｍｌのプラスチック管（コーニング・グラス・
ワークス社製５０ｍｌコーニング遠心管）中でよく混合
した。培地を遠心分離により除去した。細胞を水浴中で
３７℃に加温した。この細胞に、振り混ぜながら４５％
ポリエチレングリコール（シグマ社製、平均分子量４，
０００）溶液（１ｍｌ）を１分間かけて徐々に加え、混
合物を室温で７分間放置した。反応混合物に５分間かけ
てＤ−ＭＥＭ１５ｍｌを滴加して細胞融合反応を停止さ
せた。大量のＤ−ＭＥＭを加えた後、混合物を遠心分離
して上清を除去した。残渣に１５％ウシ胎仔血清（セン
タウラス社製、ロット７５７）、グルタミン２ｍＭ，２
−メルカプトエタノール２×１０^-5Ｍ、硫酸ストレプト
マイシン１００μｇ／ｍｌ、ペニシリンＧ１００Ｕ／ｍ
ｌ、硫酸ゲンタマイシン８０μｇ／ｍｌおよびファンギ
ゾン（アンホテリシンＢ、ギブコラボラトリー製）を補
ったＤ−ＭＥＭよりなる完全培地（以下ＣＭという）を
加えた。混合物を少し混ぜた後、生じた融合細胞浮遊液
を２４ウエルのプレート（ヌンク社製）１０枚に脾細胞
が１ウエル当り１×１０⁶ 個になるよう１ウエル１ｍｌ
ずつ分注した。５％炭酸ガス気中３７℃で１日培養した
後、アミノプテリン（４×１０^-7Ｍ）、チミジン（１．
６×１０^-5Ｍ）およびヒポキサンチン（１×１０^-4Ｍ）
を含有するＣＭ（ＨＡＴ培地）１ｍｌを各ウエルに添加
した。１日後、各ウエルから半量の培地を吸引除去しＨ
ＡＴ培地を添加した。その後２日または３日毎に培地交
換を続けた。細胞融合１４日後にハイブリッド細胞の増
殖がほぼ全ウエルで認められた。

【０００８】（ｉｉｉ）抗プロテインＣのアッセイ ９６ウエルのプレート（Ｍ−１７４、カップＵリジッド
イミユロン、クーク社製）の各ウエルにプロテインＣ
（５０μｇ／ｍｌ）の溶液またはウシ血清アルブミン溶
液１００μｌを添加し、ウエルがプロテインＣでコート
されるようにするためプレートを４℃で一夜培養した。
つぎに、ウシ血清アルブミン（２０μｌ／ｍｌ）溶液を
加えウエルを完全にブロックした。各ウエルに上記で得
たハイブリドーマ培養上清１００μｌを添加し、３７℃
で９０分間インキュベートした。燐酸緩衝食塩水（以下
ＰＢＳという）で３回洗浄した後、アフィニティクロマ
トグラフィで精製した ¹²⁵Ｉ−標識ヤギ抗マウスＩｇＧ
Ｆ（ａｂ’）₂ 溶液（１０，０００ｃｐｍ、比活性１μ
Ｃｉ／μｇＩｇＧ）１００μｌを加え、３７℃で１時間
インキュベートした。各ウエルの放射能をガンマーシン
チレーションカウンターで測定した。ウシ血清アルブミ
ンに対して結合能を示さず、プロテインＣに対して結合
能を示す培養液を抗ヒトプロテインＣ抗体を産生する培
養液として選んだ。坑プロテインＣ活性は、実験１で試
験された２９培養液中１培養液、実験２で試験された２
２６培養液中５１培養液で検出された。

【０００９】（ｉｖ）抗ヒトプロテインＣ抗体産生ハイ
ブリドーマのクローニング プロテインＣに対して高い結合能を示す２０のハイブリ
ドーマ培養液を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細胞をフィ
ーダー層（５×１０⁶ 細胞／ｍｌ）として用い、９６ウ
エル平底マイクロプレート（ヌンク社製）を用いて限界
稀釈法によりクローニングした。

【００１０】（ｖ）抗ヒトプロテインＣモノクローナル
抗体の精製 上記で得たハイブリドーマを、１週間前にテトラメチル
ペンタデカンを投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に
移植した。約１週間後、マウスの腹腔より腹水を採取
し、その腹水から抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗
体を５０％飽和硫酸アンモニウム溶液により単離した。
すなわち、腹水からハイブリドーマを遠心分離により除
き、上清をかき混ぜながらこれに硫酸アンモニウムをそ
の最終濃度が５０％飽和濃度となるまで徐々に加えた。
混合物を氷冷下３０分間かき混ぜ、６０分間静置した。
遠心分離後、残渣を少量の２０ｍＭトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン−塩酸−２０ｍＭＮａＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．９）に溶かし、同じ緩衝液に対して透析し、
同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロース（ＤＥ５
２、ワットマン・ケミカル・セパレーション社製）カラ
ムクロマトグラフィに付した。モノクローナル抗体の溶
出は、２０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン−塩酸−２０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）と
４０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩
酸−２０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）を用いた
連続濃度勾配法で行った。このようにして得た溶出液を
プロテインＣ精製プロセスの免疫吸着剤として、またヒ
トプロテインＣのＥＬＩＳＡの抗体として用いたが、そ
の詳細は実施例２の（ｉｉ）、（ｉｉｉ）にそれぞれ述
べる。

【００１１】（ｖｉ）抗体の分子量の測定 抗体の分子量の測定はＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動により行った。 （１）非還元状態 （ａ）マウスハイブリドーマＰＣ１−１８−１０が産生
するヒトプロテインＣモノクローナル抗体１−１８−１
０：１９４，０００ （ｂ）マウスハイブリドーマＰＣ３−１５−７が産生す
るヒトプロテインＣモノクローナル抗体３−１５−７：
２０２，０００ （ｃ）マウスハイブリドーマＰＣ２−４１−３が産生す
るヒトプロテインＣモノクローナル抗体２−４１−３：
１９２，０００ （ｄ）マウスハイブリドーマＰＣ２−１０５−６が産生
するヒトプロテインＣモノクローナル抗体：１９２，０
００ （ｅ）マウスハイブリドーマＰＣ３−５４−５が産生す
るヒトプロテインＣモノクローナル抗体：１８５，００
０

【００１２】（２）還元状態 抗プロテインＣモノクローナル抗体は２−メルカプトエ
タノールによって還元され、２分子にわかれる。 （ａ）マウスハイブリドーマＰＣ１−１８−１０が産生
するヒトプロテインＣモノクローナル抗体：２６，００
０および４５，０００ （ｂ）マウスハイブリドーマＰＣ３−１５−７が産生す
るヒトプロテインＣモノクローナル抗体：２９，０００
および４６，０００ （ｃ）マウスハイブリドーマＰＣ２−４１−３が産生す
るヒトプロテインＣモノクローナル抗体：２７，０００
および５０，０００ （ｄ）マウスハイブリドーマＰＣ２−１０５−６が産生
するヒトプロテインＣモノクローナル抗体：２６，００
０および４６，０００ （ｅ）マウスハイブリドーマＰＣ３−５４−５が産生す
るヒトプロテインＣモノクローナル抗体：２８，０００
および４６，０００

【００１３】（ｖｉｉ）抗体の免疫グロブリンクラスの
同定 培養液上清に等量の飽和硫酸アンモニウム溶液を加え、
氷上で１時間放置した。遠心分離して得た沈殿物を１／
１０量のＰＢＳに溶かした。このようにして得た抗体の
免疫グロブリンの同定をオクタロニーの二重免疫拡散法
により行った。ヤギポリクローナル抗体（マイルズ社
製）をモノクローナル抗体のサブクラスの同定に用い
た。このようにして得た抗プロテインＣモノクローナル
抗体は以下の通りである。

【００１４】（１） マウスハイブリドーマＰＣ１−１
８−１０が産生した抗ヒトプロテインＣモノクローナル
抗体１−１８−１０ （ａ） サブクラス：ＩｇＧ₁ （２） マウスハイブリドーマＰＣ２−２２−１産生の
抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体２−２２−１ （ａ） サブクラス：ＩｇＧ₁ （３） マウスハイブリドーマＰＣ２−２７−４産生の
抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体２−２７−４ （ａ） サブクラス：ＩｇＧ_2a （４） マウスハイブリドーマＰＣ２−４１−３産生の
抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体２−４１−３ （ａ） サブクラス：ＩｇＧ_2b （５） マウスハイブリドーマＰＣ２−４５−９産生の
抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体２−４５−９ （ａ） サブクラス：ＩｇＧ₁ （６） マウスハイブリドーマＰＣ２−４７−８産生の
抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体２−４７−８ （ａ） サブクラス：ＩｇＧ₁ （７） マウスハイブリドーマＰＣ２−９５−２産生の
抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体２−９５−２ （ａ） サブクラス：ＩｇＧ₁ （８） マウスハイブリドーマＰＣ２−９７−１０産生
の抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体２−９７−１
０ （ａ） サブクラス：ＩｇＧ₁ （９） マウスハイブリドーマＰＣ２−１０１−１７産
生の抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体２−１０１
−１７ （ａ） サブクラス：ＩｇＧ₁ （１０） マウスハイブリドーマＰＣ２−１０５−６産
生の抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体２−１０５
−６ （ａ） サブクラス：ＩｇＧ₁ （１１） マウスハイブリドーマＰＣ２−１１５−１産
生の抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体２−１１５
−１ （ａ） サブクラス：ＩｇＧ₁ （１２） マウスハイブリドーマＰＣ３−１５−７産生
の抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体３−１５−７ （ａ） サブクラス：ＩｇＧ₁ （１３） マウスハイブリドーマＰＣ３−５４−５産生
の抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体３−５４−５ （ａ） サブクラス：ＩｇＧ_2a

【００１５】実施例２ 抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体のプロテインＣ
精製への応用 （ｉ）抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体のブロム
シアン活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア・ファイ
ン・ケミカルズ社製）との結合 ブロムシアン活性化セファロース４Ｂ（０．７ｇ）を１
ｍＭ塩酸で、ついで０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ
８．３）と０．５Ｍ塩化ナトリウムとを含有するカップ
リング緩衝液で順次洗浄し、ブロムシアン活性化セファ
ロース４Ｂのカップリング緩衝液（３ｍｌ）中溶液を調
製した。この溶液１ｍｌに実施例１で透析により調製し
た抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体３−１５−７
（蛋白３．７ｍｇ）のカップリング緩衝液（３ｍｌ）溶
液を加えた。生じた混液を室温で２時間振とうした。混
液をＧ３グラスフィルター上で５〜７ｍｌのＰＢＳで洗
浄した後、これへ１Ｍエタノールアミン−塩酸（ｐＨ
８．０、４ｍｌ）を加え、室温で２時間振とうして残っ
た活性部位をブロックした。ブロック後、生ずる抗体結
合セファロース４Ｂの溶液を０．５Ｍ塩化ナトリウムと
上記のカップリング緩衝液とを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ４．０）の溶液で続けて３回洗浄し、０．１％ウ
シ血清アルブミンを含むＰＢＳ２０ｍｌで洗浄した後、
０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２５ｍＭ燐酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化した。このようにして得
たブロムシアン活性セファロース４Ｂ結合抗ヒトプロテ
インＣモノクローナル抗体（以下抗体結合セファロース
４Ｂ、特にカラム３−１５−７という）をアフィニティ
カラムクロマトグラフィに用いた。

【００１６】（ｉｉ）プロテインＣの抗体結合セファロ
ース４Ｂへの吸着および溶出 抗体結合セファロース４Ｂ（０．５ｍｌ）を０．５Ｍ塩
化ナトリウムを含有２５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）で平衡化したカラムに充てんする。アフィニ
ティクロマトグラフィに用いる粗ヒトプロテインＣは以
下の如く調製した。健常人、男性５人の血液より得たヒ
ト血漿をベンザミジンの存在下で１Ｍ塩化バリウム溶液
２ｍｌに加えた。沈殿物を遠心分離して集め、５ｍＭベ
ンザミジン含有０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液で洗浄し
た。沈殿物を０．２５Ｍ ＥＤＴＡ−５ｍＭベンザミジ
ン溶液に溶かした。遠心分離して得た蛋白溶液をＰＢＳ
に対して透析した。粗ヒトプロテインＣ含有溶液をカラ
ムにかけ、ＰＢＳで洗浄し３Ｍチオシアン酸カリウム溶
液で溶出した。プロテインＣを後述のＥＬＩＳＡにより
アッセイした。プロテインＣ活性はカラムの素通り画分
には認められなかったので、大部分のプロテインＣはカ
ラムに結合したと考えられた。溶出したプロテインＣの
収率はカラムにかけたプロテインＣの７３．１％で、一
方わずか１％のプロテインＣと大量の夾雑蛋白とが素通
りした。結果を次の第１表に示す。

【表１】

【００１７】（ｉｉｉ）抗ヒトプロテインＣモノクロー
ナル抗体を用いるヒトプロテインＣのエンザイム・リン
クト・イムノソルベント・アッセイ 上述のようにして抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗
体を精製した。ホースラディッシュ（西洋わさび）ペル
オキシダーゼ（以下ＰＯＤという）（タイプＩＶ）、シ
グマ社製）をナカネおよびカワオイの方法［Ｒ．Ｋ．ナ
カネおよびＡ．カワオイ、ジャーナル・オブ・ヒストケ
ミストリー アンド サイトケミストリー、第２７巻、
第１１４８ページ（１９７４年）］によりモノクローナ
ル抗体に結合させた。ワン・ステップ・サンドイッチＥ
ＬＩＳＡを以下の方法で行った。室温で１時間１０μｇ
／ｍｌの抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体（Ｂ）
でプレコート処理した後、０．１％ウシ血清アルブミン
および０．０５％ツイーン２０とを含むＰＢＳで３回洗
浄した９６ウエルのプレート（住友ベークライト製）の
各ウエルに、ＰＯＤ標識抗ヒトプロテインＣモノクロー
ナル抗体（Ａ）の０．５％ウシ血清アルブミンおよび
０．０５％ツイーン２０（ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノラウレート、花王アトラス社製）含有ＰＢＳ溶液
１００μｌおよび試料または精製プロテインＣ１００μ
ｌを加えた。室温で１時間培養後、各ウエルを同じ方法
で洗浄し、２００μｌの基質液（Ｏ−フェニレンジアミ
ン 二塩酸塩２．５ｍｇ／ｍｌおよび０．０１８％過酸
化水素の０．１Ｍクエン酸−燐酸緩衝液中溶液、ｐＨ
５．４）２００μｌを加えた。３０分後２０％硫酸５０
μｌを各ウエルに加えて反応を停止させた。ＭＲマイク
ロＥＬＩＳＡマイクロリーダー（ダイナテック社製）に
より波長４９０ｎｍで反応後の吸収を測定した。結果を
次の第２表に示す。

【表２】

【００１８】この結果、酵素標識およびコーティングに
同じ抗体を用いることはある抗原決定基についての競合
のため不可能であることがわかる。これは適用可能な抗
体の組合せは異った決定基を対象とする抗体の組合せか
らなることを意味する。これらの抗体は以下のように分
類される。 グループＡ：１− １８−１０，３− ５４− ５ グループＢ：２−１０５− ６ グループＣ：３− １５− ７，２−１０１−１７，２
−１１５− １，２− ４７− ８ グループＤ：２− ２７− ４，２− ４１− ３ グループＥ：２− ４５− ９ 最も感度良くアッセイできるモノクローナル抗体の組合
せはコーティングに２−１０５−６、酵素標識に３−５
４−５を用いる組合わせである。この組合わせでＥＬＩ
ＳＡを行うと、１−１００ｎｇ／ｍｌの精製プロテイン
Ｃを検出できた。さらに、この組合わせのＥＬＩＳＡは
８０〜２，５６０倍に希釈した後もヒト血漿中のプロテ
インＣを検出することが可能であった。このＥＬＩＳＡ
で測定されたヒト血漿中のプロテインＣ濃度は４．９６
μｇ／ｍｌであった。

【００１９】（ｉｖ）モノクローナル抗体による活性化
プロテインＣ活性の阻害 プロテインＣをトロンビンで活性化すると、活性化され
た第Ｖ因子または合成基質に対してセリンプロテアーゼ
として働く活性化プロテインＣ（以下、プロテインＣａ
と記す）となる。３７℃で１時間トロンビン結合セファ
ロース４Ｂと反応させて活性化したプロテインＣを１０
０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体と共に３７℃で一夜
インキュベートした。インキュベート後、合成螢光基質
（ｔ−ブチルオキシカルボキシ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈ
ｒ−Ａｒｇ−４−メチルクマリル−７−アミド）をイン
キュベートした混合物に加え、室温で３０分間インキュ
ベートした。そして、プロテインＣａの加水分解活性に
より生じた螢光を測定した（励起：３８０ｎｍ、発光：
４６０ｎｍ）。抗体１−１８−１０および３−５４−５
はプロテインＣａ活性を７８．７％および７９．４％の
割合で阻害した。抗体２−２７−４、２−４１−３、２
−４５−９、２−４７−８、２−１０１−１７、２−１
０５−６および２−１１５−１は阻害を示さなかった。

【００２０】（ｖ）活性化第Ｖ因子に対するプロテイン
Ｃａの作用のモノクローナル抗体による阻害 プロテインＣによる活性化第Ｖ因子の不活性化に対する
モノクローナル抗体の効果を、活性化第Ｘ因子、カルシ
ウムイオンおよび燐脂質の存在下における活性化第Ｖ因
子のプロトロンビナーゼ活性の変化を測定することによ
って調べた。抗体３−５４−５、１−１８−１０、２−
１０７−１７、２−１０５−６および２−１１５−１は
プロテインＣによる活性化第Ｖ因子の不活性化を阻害し
た。

【００２１】（ｖｉ）モノクローナル抗体によるプロテ
インＣ活性化の阻害 プロテインＣをモノクローナル抗体５００μｇ／ｍｌと
共に３７℃で一夜インキュベートし、トロンビン結合セ
ファロース４Ｂを加え、混合物を振とうしながら３７℃
で１時間インキュベートした。混合物を遠心分離した
後、前記の蛍光合成基質を上清に加え、混合物を室温で
３０分間インキュベートした。同じ方法で蛍光を測定し
た。抗体２−４５−９、１−１８−１０および３−５４
−５は反応を阻害した。実施例２（ｉｖ）およびこの実
施例の結果から、抗体２−４５−９はプロテインＣのＨ
鎖に対するトロンビンの作用を阻害すると考えられた。

【００２２】（ｖｉｉ）プロテインＣインヒビターの活
性化プロテインＣに対する阻害作用のモノクローナル抗
体によるブロッキング ３０μｌの活性化プロテインＣ（２．０μｇ）と２０μ
ｌのモノクローナル抗体（９．６μｇ）を７５０μｌの
ｐＨ７．５、０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液中で４℃で一
夜インキュベートした。次いで、２００μｌのプロテイ
ンＣインヒビター（２．０μｇ）を加え、活性化プロテ
インＣの残存活性を合成蛍光基質（ｔ−ブチルオキシカ
ルボキシ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−４−メチ
ルクマリル−７−アミド）を用いて測定した。活性化プ
ロテインＣを抗体１−１８−１０で処理するとインヒビ
ターの添加前に酵素活性の１／２が残存していたが、イ
ンヒビターを加え５０分後もその活性はほとんど減少し
なかった。抗体１−１８−１０は活性化プロテインＣに
対するプロテインＣインヒビターの作用をブロックする
と考えられた。

【００２３】（ｖｉｉｉ）活性化プロテインＣによる活
性化凝固第Ｖ因子の不活化に対するプロテインＳの促進
作用の阻害 活性化プロテインＣによる活性化凝固第Ｖ因子の不活化
は他の種類のビタミンＫ依存性蛋白質であるプロテイン
Ｓによって約１５倍促進される。活性化プロテインＣを
モノクローナル抗体で４℃で一夜前処理した。活性化第
Ｖ因子の不活化に対する活性化プロテインＣの作用を実
施例２（ｖ）で記したように活性化第Ｖ因子のプロトロ
ンビナーゼ活性の変化で測定すると、活性化プロテイン
Ｃの作用に対するプロテインＳの促進作用が特異的に２
−１１５−１によって９０％、２−１０１−１７によっ
て６０％阻害された。

【００２４】（ｉｘ）モノクローナル抗体の抗原決定基 プロテインＣに対するモノクローナル抗体の抗原決定基
を、ヤギ抗マウスＩｇＧを第二抗体として用いるイムノ
ブロッティング（免疫染色）システム（バイオ・ラド・
ラボ社）オートラジオグラフィーにより調べた。抗体１
−１８−１０、２−４５−９、２−１０５−６、３−１
５−７および３−５４−５はプロテインＣのＨ鎖に結合
することがわかった。抗体２−２７−４、２−４１−
３、２−９５−２および２−１１５−１はＬ鎖に結合す
ると推定された。抗体２−４７−８および２−９７−１
０はＨ鎖とＬ鎖上のペプタイドを共に認識するかまたは
プロテインＣの蛋白構造を認識するものと推定された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 9284−4Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 7804−4Ｂ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ハイブリドーマにより産生された抗プロ
   テインＣモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 抗プロテインＣモノクローナル抗体を産
   生するハイブリドーマ。
3. 【請求項３】 抗プロテインＣモノクローナル抗体を免
   疫吸着剤として用いることを特徴とするプロテインＣの
   精製法。