JPS60120825A - 抗プロテインｃモノクロ−ナル抗体およびそれを産生するハイブリド−マ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はハイプリドーマにより産生される新規なモノ
クローナル抗体に関する。

さらに詳しくは、この発明は、ノ・イブリドーマにより
産生される新規な抗プロティンＣモノクローナル抗体、
抗プロティンＣモノクローナル抗体を産生ずるハイプリ
ドーマ、抗プロティンＣモノクローナル抗体を用いるプ
ロティンＣの精製法に関する。

この発明の抗プロティンＣモノクローナル抗体は、哺乳
動物由来のプロティンＣにより免疫された哺乳動物から
採取した胛細胞と哺乳動物のミエローマ（骨髄腫）細胞
とを融合させて生ぜしめたハイプリドーマの細胞培養に
よって調製できる。

胛細胞とミエローマ細胞との融合は、融合促進剤（例え
ばポリエチレングリコール）の存在下に両者を接触させ
ることにより達成される。小割合の胛細胞とミエローマ
細胞とが融合されてハイプリドーマを生成する。さらに
、このようにして得たハイブリＦ−マは、融合された種
々の胛細胞のそれぞれに応じて種々の抗体を産生ずる。

しかし、このようにして得たハイプリドーマから所望の
抗体を産生ずるハイプリドーマをクローニングにより単
離することが可能である。

このようにして得たクローン化ハイプリドーマは、栄養
培地中でまたは哺乳動物の腹腔内で増殖させることがで
き、産生じた抗体は培養上清またはその哺乳動物の腹水
または血清よ楓天然または人工的な蛋白源から、蛋白を
単離または精製するのに一般的に用い−られる常法で精
製すること例できる。そのような方法としては、遠心分
離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ＤＥＡＥセル
ロースを用いるカラムクロマトグラフィ、ゲル沖過、ア
フィニティカラムクロマトグラフィ、凍結乾燥等のよう
な単離および精製法が挙げられる。

この方法の利点は、特定の決定基のみを標的とし、また
用いられるプロティンＣ調製液中に含まれる抗原性不純
物により生起された抗体に汚染されていない特異的抗プ
ロティンＣ抗体を提供することである。この方法のもう
一つの利点は、大量の所望抗プロティンＣ抗体が容易に
提供されることである。

このようにして得だこの発明の抗プロティンＣモノクロ
ーナル抗体は、プロティンＣに対する結合能を有し、プ
ロティンＣの免疫吸着精製において免疫吸着剤として用
いることができる。さらに詳しくは、この発明の抗プロ
ティンＣモノクローナル抗体は、常法によシ活性化ポリ
サッカライド（例えばファルマシア・ファイン・ケミカ
ルズ社製ブロムシアン活性化セファロース４Ｂ）と反応
させることによりポリサッカライドと結合させることが
できる。

以下、この発明の方法を実験の詳細をもって説明するが
、それらは例示のだめのものであって限定のためのもの
ではない。

実施例１ 抗ヒトプロティンＣモノクローナル抗体の調製（１）免
疫肝細胞の調製 ヒト血漿よりプロティンＣを精製したところ、電気泳動
により単一バンドを示した。このプロティンＣ溶液各３
０ｐｆをジフテリア・破傷風トキソイド・百日咳ワタチ
ン合剤（大阪大学微生物研究新製、１ｍｅ中百日咳菌２
Ｘ１０１θを含有）１００戸２と共に腹腔内注射により
Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマクスの雌６匹に投与した。実
験１においては、１４日後さらにプロティンＣ各３０ｐ
９の食塩溶液を３匹に腹腔内投与した。第二回目の投与
から１５日後に同量のプロティンＣの食塩溶液をそれら
のマウスに静脈内投与した。実験２においては、プロテ
ィンＣ各３０ｐｆを同じトキソイドワクチン合剤と共に
残りのマウス３匹に第一回目の投与１４日後に腹腔内投
与した。第二回目の投与３０日後に、プロティンＣ３０
／ｉｐの食塩溶液を静脈内投与した。最終投与の４日後
に、実Ｗｋ１ではマウス２匹（１匹は死亡）、実験２で
はマウス３匹を層殺し、肺臓を採取し、細胞融合に用い
た。

（１１）ハイプリドーマの調製 肺臓をピンセットでほぐして調製した肺細胞をケーラー
とミルスフィンの方法（ネイチャー、２５６巻、４９５
−４９７頁、１９７５年参照）によりマクスミエローマ
細胞Ｐ　３　Ｘ　６３　Ａｇ８Ｕ１と融合した。

すなわち、肺細胞をダルベツコ氏改変イーグルン ズ・ミニマム・エッセシシャルメデイクム（最小必須培
地、以下Ｄ−ＭＥＭという）Ｋ浮遊させた。

浮遊液中の赤血球を０．８３　係塩化アンモニウム溶液
（９容量）と０．１７　Ｍ　）リス（ヒドロキメチル）
アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６５，１容１．）
との混液で４℃で５分間処理して破壊し遠心分離により
除去した。１５％ウシ胎仔血清加Ｄ−ＭＥＭ中で培養し
たマウスミエローマ細胞と肺細胞をＤ−ＭＥＭで数回洗
浄した。

マクスミエローマ細胞（４Ｘ１０’個）の浮遊液に肺細
胞（２Ｘ　１０８個）の浮遊液を加えた。混液を５０　
ｍｅのプラスチック管（コーニング・グラス・ワークス
社製５０　ｍｅコーニング遠心管）中でよく混合した。

培地を遠心分離により除去した。細胞を水浴中で３７℃
に加温した。この細胞に、振り混ぜながら４５％ポリエ
チレングリコール（シグマ社製、平均分子量４，０００
）溶液（１ｍｅ　）を１分間かけて徐々に加え、混合物
を室温で７分間放置した。反応混合物に５分間かけてＤ
−ＭＥＭ１５ｍｌ’を滴加して細胞融合反応を停止させ
た。大量のＤ−Ｍｌｉ：Ｍを加えた後、混合物を遠心分
離して上清を除去した。残渣に１５％クシ胎仔血消（セ
ンタクラス社製、ロット７５７　）、グルタミン２ｍＭ
、２−メルカプトエタノール２Ｘ１０　Ｍ。

硫酸ストレプトマイシン１００ｐＰ／ｍｅｓ　ペニシリ
ンＧ１００Ｕ／ｍｆ’、硫酸ゲンタマイシン８０．Ｉｌ
ｙ／ｍｅおよび７アンギゾン（アンホテリシンＢ１ギブ
コラボラトリー製）を補ったＤ−ＭＥＭよりなる完全培
地（以下ＣＭという）を加えた。混合物を少し混ぜた後
、生じた融合細胞浮遊液を２４クエルのプレート（ヌン
ク社製）１０枚に肺細胞が１クエル当りｌＸｌ０’個に
なるよう１クエルＩ　ｍｅずつ分注した。５係炭酸ガス
気中３７℃で１日培養した後、アミノプリテン（４Ｘ１
０　ＭＬチミジン（１，６Ｘ　１０−５Ｍ　）およびヒ
ポキサンチン（ＩＸＩＯ−’Ｍ）を含有するＣＭ（ＨＡ
Ｔ培地）１ｍｅを各ウェルに添加した。１日後、各ウェ
ルから半量の培地を吸引除去しＨＡＴ培地を添加した。

その後２日または３日毎に培地交換を続けた。

細胞融合１４日後にハイブリッド細胞の増殖がほぼ全ウ
ェルで認められた。

（ＩＩ）抗プロティンＣ抗体のアッセイ９６クエルのプ
レート（Ｍ−１７４、カップＵリジッドイミュロン、ク
ーク社製）の各ウェルにプロティンＣ（５０μｆ／ｍｅ
）の溶液またはウシ血清アルブミン溶液１００．ａＩ！
を添加し、ウェルがプロティンＣでコートされるように
するためプレートを４℃で一夜培養した。つぎに、ウシ
血清アルブミン（２０μｅ／ｍｅ）溶液を加えウェルを
完全にブロックした。各ウェルに上記で得たハイブリド
ーマ培養上清１００．ａｆを添加し、３７℃で９０分間
インキュベートした。燐酸緩衝食塩水（以下ＰＢＳとい
う）で３回洗浄した後、アフイニティクロマトグラフィ
で精製した１２５ニ一標識ヤギ抗マウスエｇＧＦ　（ａ
　ｂ’）２溶液（１０，０００ｃｐｍ、比活性１ｐ　Ｃ
１／ｐｙ　ＩｇＧ）１００．Ｇ’を加え、３７℃でｉ時
間インキュベートした。各ウェルの放射能をガンマーシ
ンチレーションカクンターで測定した。クシ血清アルブ
ミンに対して結合能を示さず、プロティンＣに対して結
合能を示す培養液を抗ヒトプロティンＣ抗体を産生ずる
培養液として選んだ。抗プロティンＣ活性は、実＠１で
試験された２９培養液中１培養液、実験２で試験された
２２６培養液中５１培養液で検出された。

（１■）抗ヒトプロティンＣ抗体産生ハイブリドーマの
クローニング プロティンＣに対して高い結合能を示す２０のハイブリ
ドーマ培養液を、ＢＡＬＢ／ｃマクスの胸腺細胞をフィ
ーダ一層（５Ｘ１０６細胞／ｍｅ）として用い、９６ク
エル平底マイクロプレート（ヌンク社！Ｊりを用いて限
界稀釈法によりクローニングした。

（Ｖ）抗ヒトプロティンＣモノクローナル抗体の精製上
記で得たハイブリドーマを、１週間前にテトラメチルペ
ンタデカンを投与したＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマクスの
腹腔内に移殖した。約１週間後、マウスの腹腔より腹水
を採取し、その腹水から抗ヒトプロティンＣモノクロー
ナル抗体を５０係飽和硫酸アンモニクム溶液により単離
した。

すなわち、腹水からハイブリドーマを遠心分離により除
き、上清をかき混ぜながらこれに硫酸アンモニウムをそ
の最終濃度が５０％飽和濃度となるまで徐々に加えた。

混合物を水冷下３０分間かき混ぜ、６０分間静置した。

遠心分離後、残渣を少量の２０　ｍＭ　トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン−塩酸−２０ｍＭ　ＨａＣｌ
　３衝液（ｐＨ７，９）に溶かし、同じ緩衝液に対して
透析し、同じ緩衝液で平衡化したＤＥＡＦセルロース（
ＤＥ５２、ワットマン・ケミカル・セパレーション社製
）　、’Ｊクラムロマトグラフィに付した。モノクロー
ナル抗体の溶出は、２０ｍＭ）リス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン−塩酸−２０ｍＭ　ＮａＣｌ！緩衝液（
ｐＨ７，９）と４０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミ／メタン−塩酸−２０ｍＭ　ＮａＣｊ’　Ｍ街液（ｐ
Ｈ７，９）を用いた連続濃度勾配法で行った。このよう
にして得た溶出液をプロティンＣ精製プロセスの免疫吸
着剤として、またヒトプロティンＣのＥＬ工ＳＡの抗体
として用いたが、その詳細は実施例２の（１１）、（１
）にそれぞれ述べる。

（Ｖｌ）抗体の分子量・の測定 抗体の分子量の測定は５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動により行った。

（１）非還元状態 （ａ）マクスハイブリドー−＝ｒ　Ｐ　Ｃ１−１８１０
が産生ずるヒトプロティンＣモノクローナル抗体１−１
８−１０： １９４、０００ （ｂ）マクスハイプリドーマＰＣ３−１５−７が産生ず
るヒトプロティンＣモノクローナル抗体３−１５−７： ２０２、０００ （ｃ）マウスハイブリドーマＰＣ２−４１−３が産生ず
るヒトプロティンＣモノクローナル抗体２−４１−３： １９２．０００ （ｄ）マウスハイプリドーマＰＣ２−１０５６が産生ず
るヒトプロティンＣモノクローナル抗体： １９２．０００ （ｅ）マウスハイプリドー−ｒＰＣ３，−５４−５が産
生ずるヒトプロティンＣモノクローナル抗体：１８５、
０００ （２）還元状態 抗プロティンＣモノクローナル抗体は２−メルカプトエ
タノールによって還元され、２分子にわかれる。

（ａ）　マウスバイブリドー−ｒｐｃ１−１ｓ−ｔ。

が産生ずるヒトプロティンＣモノクローナル抗体： ２６、０００および４５，０００ （ｂ）マウスハイブリドーマＰＣ３−１５−７が産生ず
るヒトプロティンＣモノクローナル抗体：２９、０００
　オＪ：び４６．０００ （ｃ）　マウスハイプリドーマＰＣ２−４１−３が産生
ずるヒトプロティンＣモノクローナル抗体＝２７、００
０および５０．　ＯＯ０ （ｄ）−ｖクスハイプリド−ｆＰｃ２−１０５−６が産
生ずるヒトプロティンＣモノクローナル抗体： ２６、０００および４６，０００ （ｅ）マクスハイプリドーマＰＣ３−５４−５７３ｆ産
生ずるヒトプロティンＣモノクローナル抗体：２８、　
ＯＯＯおよび４６．０００ （Ｖｌｌ）抗体の免疫グロブリンクラスの同定培養液上
清に等量の飽和硫酸アンモニウム溶液を加え、氷上で１
時間放置した。遠心分離して得このようにして得た抗体
の免疫グロブリンの同定をオフクロニーの二重免疫拡散
法により行った。

ヤギポリクローナル抗体（マイルズ社製）をモノクロー
ナル抗体のサブクラスの同定に用いた。

このようにして得た抗プロティンＣモノクローナル抗体
は以下の通りである。

＋１）マウスハイプリドーマＰＣＩ−１８−１０が産生
じた抗ヒトプロティンＣモノクローナル抗体ｌ−１８−
１０ （ａ）サブクラス：工ｇＧ＋ （２）マクスハイプリドーマｐｃ２−２２−１産生の抗
ヒトプロティへモノクローナル抗体２−２２１ （ａ）サブクラス：工ｇＧ＋ （３）マクスハイプリドーマＰＣ’２−２７−４産生の
抗ヒトプロティンＣモノクローナル抗体２−２７４ （ａ）サブクラス：工ｇＧ２ａ （４）マクスハイプリドーマＰＣ２−４１−３産生の抗
ヒトプロティンＣモノクローナル抗体２−４１’３ （ａ）サブクラス：　ＩｇＧ２ｂ （５）マクスハイプリドーマＰＣ２−４５−９産生の抗
ヒトプロティンＣモノクローナル抗体２−４５９ （ａ）サブクラス：工ｇＧ＋ （６）マクスハイプリドーマＰＣ２−４７−８産生の抗
ヒトプロティンＣモノクローナル抗体２−４７８ （ａ）サブクラス：工ｇＧ＋ （７）マクスハイプリドーマＰＣ２−９５−２産生の抗
ヒトプロティンＣモノクローナル抗体２−９５２ （ａ）サブクラス：　ＩｇＧ。

（８）マウスハイプリドーマＰＣ２−９７−１０産生の
抗ヒトプロティンＣモノクローナ／ｌ／　抗体２−７−
１０ （ａ）サプタラス：工ｇＧ＋ （９）マクスハイブリドー−ｖＰＣ２−，１０１−１７
産生の抗ヒトプロティンＣモノクローナル抗体２−１０
１−１７ （ａ）サブクラス：　ＩｇＧ。

（ｌＯ）マウスハイプリドーマＰ　Ｃ２−１０５−６産
生の抗ヒトプロティンＣモノクローナル抗体２−０５−
６ （ａ）サブクラス：工ｇＧ＋ （！１）マクスハイブリドーマＰＣ２−１１５−１産生
の抗ヒトプロティンＣモノクローナル抗体２−１５−１ （ａ）サブクラス：工ｇＧ＋ （１２）マクスハイブリドーマＰＣ３−１５−７産生の
抗ヒトプロティンＣモノクローナル抗体３−１５７ （ａ）サブクラス：工ｇＧ＋ （＋３）マクスハイブリドーマＰＣ３−５４−５産生の
抗ヒトプロティ、ンＣモノクローナル抗体３−５４５ （ａ）サブクラス：　ＩｇＧ２ａ 実施例２ （１）抗ヒトプロティンＣモノクローナル抗体のブロム
シアン活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア・ファイ
ン・ケミカルズ社製）との結合ブロムシアン活性化セフ
ァロース４Ｂ（０，７ｐ）を１ｍＭ塩酸で、ついで０．
１　Ｍ重炭酸す）　ＩＪクム（ｐＨ８，３）と０．５Ｍ
塩化ナトリウムとを含有するカップリング緩衝液で順次
洗浄し、ブロムシアン活性化セファロース４Ｂのカップ
リング緩衝液（’３　ｍｅ　）中温液を調製した。この
溶液１　ｍｅに実施例１で透析により調製した抗ヒトプ
ロティンＣモノクローナル抗体３−１５−７（蛋白３．
７■）のカップリング緩衝液（３ｍｔ）溶液を加えた。

生じた混液を室温で２時間振とうした。混液を０３グラ
スフイルター上で５〜７ｍｅのＰＢＳで洗浄した後、こ
れへ１Ｍエタノールアミン−塩酸（ｐＨ８，０，４ｍｅ
）を加え、室温で２時間振とうして残った活性部位をブ
ロックした。ブロック後、生ずる抗体結合セファロース
４Ｂの溶液を０．５Ｍ塩化ナトリウムと上記のカップリ
ング緩衝液とを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）
の溶液で続けて３回洗浄し、０．１％クシ血清アルブミ
ンを含むＰＢＳ２０ｍｅで洗浄した後、０．５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む２５ｍＭ燐酸す）　ＩＪクム緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）で平衡化した。このようにして得たブロムシ
アン活性セファロース４Ｂ結合抗ヒトプロティンＣモノ
クローナル抗体（以下抗体結合セファロース４Ｂ、特に
カラム３−１５−７という）をアフイニチイ力ラムクロ
マトグラフイに用いた。

（ＩＩ）フロティンＣの抗体結合セファロース４Ｂへの
吸着および溶出 抗体結合セファロース４Ｂ（０，５＋＋＋ｌりを０．５
Ｍ塩化ナトリウム含有２５ｍＭ燐酸ナトリクム緩衝液（
ｐＨ７，４）で平衡化したカラムに充てんする。

アフィニティクロマトグラフィに用いる粗ヒトプロティ
ンＣは以下の如く調製した。健常人、男性５人の血液よ
り得だヒト血漿をベンザミジンの存在下でＩＭ塩塩化パ
リハム溶液２ｅに加えた。沈澱物を遠心分離して集め、
５ｍＭベンザミジン含有０、１５　Ｍ塩化す）　ＩＪク
ム溶液で洗浄した。沈澱物を０．２５　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ
　Ａ　−５ｍＭベンザミジン溶液に溶かした。遠心分離
して得た蛋白溶液をＰ　Ｂ　’Ｓに対して透析した。粗
ヒトプロティンＣ含有溶液をカラムにかけ、ＰＢＳで洗
浄し３Ｍチオシアン酸カリウム溶液で溶出した。プロテ
ィンＣを後述のＥＬ工ＳＡによりアッセイした。

プロティンＣ活性はカラムの素通り画分には認められな
かったので、大部分のプロティンＣはカラムに結合した
と考えられた。溶出したプロティンＣの収率はカラムに
かけたプロティンＣの７３．１係で、一方わずか１チの
プロティンＣと大量の夾雑蛋白とが素通りした。

結果を次の第１表に示す。

プロティンＣ８０４６，２４１００１，０溶液 素通り画分　７８１　０．０６４　１　０．０（１）抗
ヒトプロティンＣモノクローナル抗体を用いるヒトプロ
ティンＣのエンザイム・リンクド・イムジ ノツナベント・アッセイ シダーゼ（以下ＰＯＤという）（タイプ■、シグマ社製
）をナカネおよびカワオイの方法（Ｒ，Ｋ。

ナカネおよびＡ、カワオイ、ジャーナル・オブ・ヒスト
ケミストリー　アンド　サイトケミストリー、第２７巻
、第１１４８ページ（１９７４年）〕によりモノクロー
ナル抗体に、結合させた。ワン・ステップ・サンドイッ
チＥＬ工ＳＡを以下の方法で行った。室温で１時間１０
　）’ｆ　／ｍｅの抗ヒトプロティンＣモノクローナル
抗体（Ｂｌでプレコート処理した後、０．１％クシ血清
アルブミンおよび０．０５％ツイーン２０とを含むＰＢ
Ｓで３回洗浄した９６クエルのプレート（住友ベークラ
イト製）の各ウェルに、ＰＯＤ標識抗ヒトプロティンＣ
モノクローナル抗体（Ａｌの０．５％クシ血清アルブミ
ンおよび０．０５　％ツイーン２０（ポリオキシエチレ
ンソルビクンモノラクレート、花王アトラス社製）含有
ＰＢＳ溶液１００　ｐｌおよび試料または精製プロティ
ン０１００μｌを加えた。室温ぞ１時間培養後、各ウェ
ルを同じ方法で洸浄し、２００／＋７７の基質液（０−
フェニレンジアミン　ニ塩酸塩２．５　ｆｎｇ／　ｍｅ
および０．０１８％過酸化水素の０．１Ｍクエン酸−燐
酸緩衝液中溶液、ｐＨ５，４）　２００ｏｚｅを加えた
。

３０分後２０％硫酸５０／Ｉｌ！を各ウェルに加えて反
応を停止させた。ＭＲマイクロＥＬ’ＩＳＡマイクロリ
ーグ−（グイナテック社製）により波長４９０ｎｍで反
応液の吸収を測定した。

結果を次の第２表に示す。

この結果、酵素標識およびコーティングに同じ抗体を用
いることはある抗原決定基についての競合のため不可能
であることがわかる。これは適用可能な抗体の組合せは
異った決定基を対象とする抗体の組合せからなることを
意味する。これらの抗体は以下のように分類される。

グループＡ：１−　１８−１０．３〜５４〜５グループ
Ｂ：２−１０５−６ グループＣ：３−　１５−　７．２−１０１−１７゜２
−１１５−　１．２−　４７−　８ グループＤ：２−　２７−　４．２〜４１−３グループ
Ｅ：２−４５−９ 最も感度良くアッセイできるモノクローナル抗体の組合
せはコーティングに２−１０５−６、酵素標識に３−５
４−５を用いる組合わせである。

この組合わせでＥＬ工８Ａを行うと、１−１００ｎｙ／
ｍｅの精製プロティンＣを検出できた。

さらに、この組合わせのＥＬ工ＳＡは８０〜２、５６０
倍に希釈した後もヒト血漿中のプロティンＣを検出する
ことが可能であった。このＥＬ工ＳＡで測定されたヒト
血漿中のプロティンＣ濃度は４．９６ｐｆ／ｍｅであっ
た。

（１ｖ）モノクローナル抗体による活性化プロティンＣ
活性の阻害 プロティンＣをトロンビンで活性化すると、活性化され
た第Ｙ因子または合成基質に対してセリンフロテアーセ
トして働く活性化プロティンｃ（以下、プロティンＣａ
　と記す）となる。３７℃で１時間トロンビン結合セフ
ァロース４Ｂと反応させて活性化したプロティンＣヲ１
００　）ｉｆ／　ｍｅノモノクローナル抗体と共に３７
℃で一夜インキユベートした。インキュベート後、合成
蛍光基質（ｔ−ブチルオキシカルボキシ−Ｌｅｕ　−Ｓ
ｅｒ　−Ｔｈｒ　−Ａｒｇ−４−メチルクマリル−７−
アミド）ラインキュベートした混合物に加え、室温で３
０分間インキュベートした。そして、プロティンＣａの
加水分解活性により生じた蛍光を測定した（励起：３８
０　ｎｍ、発光：４６０ｎｍ）。

抗体１−１８−１０および３−５４−５はプロティンＣ
ａ活性を７８．７％および７９．４％の割合で阻害した
。抗体２−２７−４．２−４１−３．２−４５−９．２
−４７−８．２−１０１−１７．２−１０５−６および
２−１１５−１は阻害を示さなかった。

（ｖ）活性化第Ｖ因子に対するプロティンＣａの作用の
モノクー−ナル抗体による阻害 プロティンＣによる活性化第Ｖ因子の不活性化に対する
モノクローナル抗体の効果を、活性化第Ｘ因子、カルシ
クムイオンおよび燐脂質の存在下における活性化第Ｖ因
子のプロトロンビナーゼ活性の変化を測定することによ
って調べた。

抗体３−５４−５．１−１８−１０１２−１０７−１７
．２−１０５−６および２−１１５〜１はプロティンＣ
による活性化第Ｖ因子の不活性化を阻害した。

（Ｖｌ）　モノクローナル抗体によるプロティンｃ活性
化の阻害 プロティンＣをモノクローナル抗体５００　、Ｉ’ｆ／
ｍｅト共に３７℃で一夜インキュベートシ、トロンヒン
結合セファロース４Ｂを加え、混合物を振とぅしながら
３７℃で１時間インキュベートした。混合物を遠心分離
した後、前記の蛍光合成基質を上溝に加え、混合物を室
温で３０分間インキュベートした。同じ方法で蛍光を測
定した。

抗体２−４５−９．１−１８−１０および３−５４−５
は反応を阻害した。実施例２　（Ｉｖ）およびこの実施
例の結果から、抗体２−４５−９はプロティンＣのＨ鎖
に対するトロンビンの作用を阻害すると考えられた。

（■１）プロティンＣインヒビターの活性化プロティン
Ｃに対する阻害作用のモノクローナル抗体によるブロッ
キング ３０、ａｌの活性化プロティンＣ（２，０，ａｙｌ：２
゜ｐｌＩ）モ／　りｏ−ナル抗体（９，６／ｌｙ）を７
５０　）１１のｐＨ７，，５，０，０５Ｍ　トリス塩酸
緩衝液中で４℃で一夜インキユベートした。

次いで、２００．ｌｆｔ！のプロティンＣインヒビター
（２，Ｏｆｉ？　’）を加え、活性化プロティンＣの残
存活性を合成蛍光基質（ｔ−ブチルオキシカルボキシ−
Ｌｅｕ　−Ｓｅｒ　−Ｔｈｒ　−Ａｒｇ　−４−メチル
クマリルー７−アミド）を用いて測定した。

活性化プロティンＣを抗体１−１８−１０で処理すると
インヒビターの添加前に酵素活性のＴが残存していたが
、インヒビターを加え５０分後もその活性はほとんど減
少しなかった。

抗体１−１８−１０は活性化プロティンＣに対するプロ
ティンＣインヒビターの作用をグロックすると考えられ
た。

（Ｖｌ）活性化プロティンＣによる活性化凝固第Ｖ因子
の不活化に対するプロティンＳの促進作用の阻害活性化
プロティンＣによる活性化凝固第Ｖ因子の不活化は他の
種類のビタミンに依存性蛋白質であるプロティンＳによ
って約１５倍促進される。

活性化プロティンＣをモノクローナル抗体で４℃で一夜
前処理した。活性化第Ｖ因子の不活化に対する活性化プ
ロティンＣの作用を実施例２（ｖ）で記したように活性
化第Ｖ因子のプロトロンビナーゼ活性の変化で測定する
と、活性化プロティンＣの作用に対するプロティンＳの
促進作用が特異的に２−１１５−１によって９０％、２
−１０１−１７によって６０％阻害された。

（１×）モノクローナル抗体の抗原決定基プロティンＣ
に対するモノクローナル抗体の抗原決定基を、ヤギ抗マ
クスエｇＧを第二抗体として用いるイムノプロッティン
グ（免疫染色）システム（バイオ・ラド・ラボ社）オー
トラジオグラフィーにより調べた。

抗体１−１８−１０，２−４５−９．２−１０５−６．
３−１５−７および３−５４−５はプロティンＣのＨ鎖
に結合することがわかった。抗体２−２７−４．２−４
１−３．２−９５−２および２−１１５−１はＬ鎖に結
合すると推定された。

抗体２−４７−８および２−９７−１０ｔ／′ｉＨ鎖と
Ｌ鋲止のベプタイドを共に認識するがまたはプロティン
Ｃの蛋白構造を認識するものと推定された。

出願人　藤沢薬品工業株式会社

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ハイプリドーマにより産生された抗プロティンＣ
   モノクローナル抗体。
2. （２）抗プロティンＣモノクローナル抗体を産生ずるハ
   イプリドーマ。
3. （３）抗プロティンＣモノクローナル抗体を免疫吸着剤
   として用いることを特徴とするプロティンＣの精製法。
4. （４）プロティンＣを測定するためのエングイムノν ・リンクド・イムノアドソザベント・アッセイ（酵素免
   疫測定法）。