JPH06113832A

JPH06113832A - ジゴキシンに対し高い親和性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリッドセルライン及びその製造法

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Publication number: JPH06113832A
Application number: JP5127341A
Authority: JP
Inventors: Carl-Julius Struck; − ユリウスストラツクカール
Original assignee: Boehringer Ingelheim GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim GmbH
Priority date: 1983-08-20
Filing date: 1993-05-28
Publication date: 1994-04-26
Anticipated expiration: 2011-02-28
Also published as: DE3485966D1; JPH0630617B2; JPH0819160B2; EP0134552B1; DE3330160A1; CA1233775A; EP0134552A2; US4703003A; EP0134552A3; ATE81867T1; JPS60110289A

Abstract

(57)【要約】【目的】ハイブリッドセルライン及びその製造方法。【構成】ジゴキシンをマウスに免疫しその脾細胞とミ
エローマ細胞とを融合し、得られる融合細胞から、ジギ
トキシン及びスピロノラクトンに対して低い交叉反応性
を示しジゴキシンに対して高い親和性を有するモノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリッドセルラインを選択す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はジギタリス配糖体である
ジゴキシンに対し高い親和性を有し、関連する配糖体や
スピロノラクトンに対して低い選択性を有するモノクロ
ーナル抗体、このモノクローナル抗体を産生するセルラ
イン、この抗体の使用、そしてこのモノクローナル抗体
を含む試験系に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在西ドイツにおいて毎日３００万人の
心臓病患者がジギタリス配糖体による治療を受けている
〔Ｊ．Ｒ．Ｏｃｈｓ，Ｇ．Ｂｏｄｅｍ．Ｍｅｄ．Ｗｅｌ
ｔ３０，６０２（１９７８）〕。従ってこの群の配糖
体は最も頻繁に処方されている。この群の中でジゴキシ
ンが最も重要であり、９０％以上はジゴキシンが使用さ
れている。しかしジギタリス配糖体が広く頻繁に使用さ
れているからといって、これらの物質が治療範囲の狭い
という危険性を有している物質であることを忘れてはな
らない。従って効果的かつ安全な治療を行なうためには
ジギタリス濃度を連続的に追跡することが必須であり、
この目的のために種々の異なった試験方法が開発されて
いる。これらの方法においては、配糖体に対して生体に
より産生された抗体が試薬として使用されている。これ
らの抗体は、ジギタリスで免疫した動物の血清から得ら
れる。こうしてポリクローナル抗体、すなわち異なった
抗体を含有する抗血清が得られる。しかしながら多くの
ジゴキシンの試験系における大きな問題はジギトキシン
（第１２位に水酸基が存在しない点のみがジゴキシンと
異なる物質）との強い交叉反応である。

【０００３】

【化１】（１）ジゴキシン、（２）ジギトキシン、（３）スピロ
ノラクトンの構造式

【０００４】しかしジギトキシンの交叉反応よりもさら
に重要な問題は、スピロノラクトン（たとえばＡｌｄａ
ｃｔｏｎｅ^TM）による交叉反応性妨害の可能性があるこ
とである。スピロノラクトンはアルドステロン拮抗剤で
あり、ジゴキシンと共に頻繁に投与され、多くの測定
系、さらに市販製剤において存在する。スピロノラクト
ンは実質的に高い投与量で使用されるため、試験系がス
ピロノラクトンとジゴキシンを充分区別できない場合
は、スピロノラクトンが高ジゴキシン濃度として現われ
る危険性がある。ウサギやヒツジにおいて常法により産
生される抗血清の交叉反応性を改良するために、アフィ
ニティクロマトグラフィーによる面倒な精製が試みられ
ている。しかしここでの問題は（精製収率が低いために
起きる）大量の抗血清の不足であり、交叉反応性の改良
にはしばしば検出感度の有意な低下がつきまとうことで
ある。収率が悪いのは、高感度の原因となる高親和性の
抗体はアフィニティカラムからの溶出が非常に困難であ
るか又は不可能であるためである。

【０００５】抗体産生の従来法に変わるものとして１９
７０年代末期より、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの
先駆的な仕事１９７５／７６〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，
４９５（１９７５）〕に基くハイブリドーマセルライン
の細胞培養による抗体の産生がしだいに重要になってき
た。これらのセルラインはあらかじめ免疫したマウスの
脾細胞をマウスの腫瘍セルラインと体細胞融合させ、次
にクローニング操作を繰返すことにより得られる。ハイ
ブリドーマ細胞は全て単一の親細胞に由来しているた
め、均一な特異性を有する単一の型の抗体、モノクロー
ナル抗体（ｍＡＫ）のみを産生するという点で区別され
る。ハイブリドーマ細胞は腫瘍セルラインであるため理
論的には無限に増殖でき、理論的に無限大の量の抗体を
産生することができる。ジゴキシンによる治療を受けて
いる患者の連続的な追跡、や中毒の治療の試験のために
は、前述の代表的な性質から、試験系にｍＡＫを用いる
ことが当然好ましい。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は体細胞
融合により、ジギタリス配糖体であるジゴキシンに対し
高い親和性を有するモノクローナル抗体を開発すること
であった。すでに述べた様にジゴキシン検査においては
他物質による交叉反応の問題が特に重要である。したが
って本発明のもうひとつの目的は、関連の配糖体（特に
ジギトキシン）に対する親和性が低く、アルドステロン
拮抗剤であるスピロノラクトンに対し感度が低いことを
特徴とする、ジギタリス配糖体であるジゴキシンに対し
高い親和性を有するモノクローナル抗体を開発すること
であった。抗体は全ての抗体に共通の定常部分と、ポリ
ペプチドの可変部分から成り、抗体の特異性は可変部に
のみ依存する。生物を抗原で刺激して抗体を作らせる
と、この抗原に対する免疫グロブリンが産生される。し
かし抗原にはいくつかの抗原決定基があり抗体の結合部
位がいくつか存在するため、同じ抗原に対する抗体では
あるが親和定数が異なり特異性の異なる抗体の混合物が
作られる。問題は、もし可能ならばジゴキシンに対し高
い親和性と特異性という２つの性質を兼ね備えた抗体を
この混合物の中から見つけることである。これまで使用
されてきた試験で得られた好ましい感度を有するモノク
ローナル抗体は、ポリクローナル抗体と同じ短所を有し
ている。すなわちそれらはジゴキシンに対し親和性はあ
るが、ジギトキシン及び／又はスピロノラクトンに対す
る交叉反応性も無視できないということである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】ジゴキシンで免疫した後
得られたマウスの脾細胞をマウスの腫瘍セルラインと公
知の方法により融合し、この体細胞融合させた細胞を適
当な培地中で培養し、特別なスクリーニング試験により
同定、選択することにより、所期の抗体（すなわちジゴ
キシンに対する高い親和性と感度を有するモノクローナ
ル抗体）を産生するハイブリッド細胞を得ることがで
き、本発明の目的は驚く程うまく達成された。このため
同一の細胞培養液の上澄液の同一の試料について、一方
ではジゴキシンに対する結合活性を、もう一方ではジギ
トキシンに対する結合活性をラジオイムノアッセイ法で
調べた。この活性を相互に比較することにより、ジゴキ
シン存在下ではきわめて活性が強く、ジギトキシン存在
下では活性の弱いｍＡＫを産生するセルラインを選択す
ることができた。この高度に特殊な細胞を単離し、確立
した。

【０００８】マウスの免疫、脾細胞の単離、細胞の融
合、ハイブリッドの培養と選択、所期の抗体を産生する
ハイブリッドのサブクローニング、ハイブリッドや抗体
の単離は全て、当業者に公知の方法に従い実施した。文
献としてはＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎの
Ｎａｔｕｒｅ２５６，４９５（１９７５）、Ｈｏｃｈ
ｋｅｐｐｅｌらのＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１
８，４３７（１９８１）及びＳｅｃｈｅｒらのＮａｔｕ
ｒｅ２８５，４４６（１９８０）を参照。免疫には、
当業者は通常使用されるＢａｌｂ／ｃマウスを用いるこ
とができる。ハイブリッドの安定化及び複製には培養は
ｉｎｖｉｔｒｏ又はｉｎｖｉｖｏでできる。ｉｎ
ｖｉｖｏ培養の場合は、あらかじめ腫瘍刺激物質で処理
したマウスの腹腔にハイブリッドを注入する。次に腹水
より所期の特異性を有する複製されたモノクローナル抗
体を単離し、必要な場合は精製する。

【０００９】本発明によるこのモノクローナル抗体はジ
ゴキシンに対し高い親和性を有することが判明し、試験
系に使用するための基本的条件は満たしている。ポリク
ローナル性の大多数の通常の抗ジゴキシン血清や文献
〔Ｙｅｌｔｏｎ．Ｄ．Ｅ．，Ｓｃｈａｒｆｆ，Ｍ．
Ｄ．；Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５０，６５７
−６８０，（１９８１）；ｍａｒｇｏｌｉｅｓ，Ｎ．
Ｍ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ｍ．Ｍ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．
Ｗ．；Ｎｏｖｏｔｎｙ，Ｊ．；ＨａｂｅｒＥ．；ｉｎ：
ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄ
Ｆｃｅｌｌｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ；Ｈａｍｍｅｒｌｉ
ｎｇ，Ｇ．Ｊ．；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，Ｕ．；Ｋｅａ
ｒｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．；ｅｄｓ．；ｐｐ３６７−３７４
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄ（１９
８１）；Ｂａｎｇ，Ｂ．Ｅ．；Ｈｕｒｍｅ，Ｍ．；Ｉｕ
ｎｔｕｎｅｎ，Ｋ．；Ｍａｋｅｌａ，Ｏ．；Ｓｃａｎ
ｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．４１，７５
−７８（１９８１）；Ｈｕｎｄｅｒ．Ｍ．Ｍ．；ｍａｒ
ｇｏｌｉｅｓ，Ｍ．Ｎ．Ｊｕ，Ａ．；Ｈａｂｅｒ．
Ｅ．；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２９，１１６５−１１
７２（１９８２）〕に記載のいくつかの他のモノクロー
ナル抗ジゴキシン抗体と比較すると、本発明のｍＡＫは
ジゴキシンに対する特異性が著しく高い。ジゴキシンに
類似のジギトキシンのような物質も明瞭に区別される
（交叉反応性は約１．３％）。

【００１０】他の構造が類似の化合物（たとえばステロ
イド）についても交叉反応性が見られないことは確認さ
れた。ジゴキシンと共に投与されることの多いアルドス
テロンの拮抗剤であるスピロノラクトンに対する親和性
が極めて小さいことから、治療の追跡にこのｍＡＫの使
用は特に好ましい。この場合交叉反応性はわずかに０．
００７％と無視できる程小さい。この抗−ジゴキシンモ
ノクローナル抗体を用いてＭｉｃｒｏｔｉｔｅｒ^TMプレ
ート中で試験系を確立した。この試験系により時間がか
なり節約できたばかりでなく、必要な試薬の量も大幅に
減少した。特に「ミクロ−ＲＩＡ」（ＲＩＡ＝ラジオイ
ムノアッセイ）ではその感度（検出限界：０．８ｎｇ／
ｍｌ）のよさのため、治療量のジゴキシンの投与後の、
前処理をしていない血漿試料の測定が可能になる。要す
るに本発明のｍＡＫを用いる試験系は、現在市販されて
いるキットに比較して感度、特異性共に優れている。

【００１１】このミクロ試験系は、ルーチンの検査とし
て有効に実施可能である。モノクローナル抗体を用いる
ＲＩＡの特別の利点は、増殖し続けるセルライン（細胞
培養の浮遊液中、又はマウスの腹水中）として、一定の
性質を持ったモノクローナル抗体を理論的に無限量産生
できる抗体の供給源に、理論的に無限の期間戻ることが
できるだろうということである。図面の説明図１：２匹の動物における抗体産生の増加。図２：１０日増殖後の細胞クローンの顕微鏡像。図３：腹水のアフィニティクロマトグラフィーによる精
製の溶出パターン（ＤＥＡＥＡｆｆｉＧｅｌＢｌ
ｕｅ^TMを使用）。図４：ｍＡＫＤ５０（“ミクロ−ＲＩＡ”系）を使用
した場合のジゴキシン−ＲＩＡの感度。４回の測定値の
平均値（±標準偏差）（ｍＡＫ稀釈１：４０，０００，
Ｔ＝６，０００ｃｐｍ，ｂｏ＝４０％，ＮＳＢ＝１．７
％）。図５：ジゴキシンミクロ−ＲＩＡにおける、構造類似物
質の妨害。図６：「ミクロ−ＲＩＡ」の操作の流れ。個々の操作は
１．９．２（方法）に詳述されている。要約：１００μｌの試料又はジゴキシン標準物質、１０
０μｌの¹²⁵Ｉ−ジゴキシン、そして１００μｌの抗ジ
ゴキシンｍＡＫをピペットで採りＭｉｃｒｏｔｉｔｅｒ
^TMプレートの穴に入れる。室温でインキュベーション
後、結合した放射能と遊離の放射能をテキストラン活性
炭を用いて分離する。各混合液の一定量をとり結合した
放射能を測定する。

【００１２】以下本発明をさらに詳しく説明する。１．方法１．１免疫物質の調製ハプテンとしてのジゴキシンと担体分子としての牛血清
アルブミン（ＢＳＡ、マイルズ）より成る免疫物質複合
体はＢｕｔｌｅｒ＆Ｃｈｅｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．
Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）５７，７１−７８（１９６７）の方
法により調製した。１．２供血体であるマウスの免疫免疫にはＢａｌｂ／ｃ株のマウスのみ用い、２０匹のマ
ウスの群を免疫する。ジゴキシン−ＢＳＡと完全フロイ
ントアジュバント（ＣＦＡ，ディフコラボラトリーズ）
１：３の比の乳濁液を各マウスの腹腔内に投与する（マ
ウス一匹につき免疫原２０−５０μｇ）。４週間後に
０．９％ＮａＣｌ中のジゴキシン−ＢＳＡを２０−５０
μｇ追加免疫する。必要であれば４週間おきにこの追加
免疫を数回繰返す。マウスの免疫反応を定期的に血液試
料を採取して追跡する（Ｐｌ．ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａ
ｌｓ）全血中の抗体価を測定するために市販のＲＩＡキ
ット（ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＰＲＯＤＵＣＴＳ社）の
試薬を用いる。

【００１３】１．３マウスの癌セルラインの培養セルライン×６３．ＡＧ８−６５３〔Ｋｅａｒｎｅｙ
ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３，１５４８（１９７
９）〕を融合に用いる。この細胞は凍結用培地中で液体
窒素で−１９６℃にして保存する。融合の一週間前に一
部をとって溶かし、ＲＰＭＩ１６４０培地のはいった
シャーレ（直径１０ｃｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ）に入れる。
対数増殖期の細胞を融合に用いる。１．４体細胞融合最後の追加免疫をしてから３−４日後に無菌条件下で、
免疫したマウスの脾臓をとり出す。ステンレス製の網
（孔の大きさ１００μｍ）の上で注意深くすりつぶした
後、脾細胞から結合組織を分離し、ＰＢＳ（リン酸緩衝
生理食塩水）につける。ＤＰＢＳ（ダルベッコーＰＢ
Ｓ）で２回洗い（１，０００ｒｐｍで５分間遠心分
離）、次にＤＰＢＳにつける。この混合液中で脾細胞と
Ａｇ８細胞を２：１で混合する。ポリエチレングリコー
ル−ＤＰＢＳ（ダルベッコーＰＢＳ中ＰＥＧ４０００
７１％，ＤＭＳＯ６％；ＲＯＴＨ／ＳＩＧＭＡ／ＳＥ
ＲＯＭＥＤより販売）を加えて、細胞融合を開始する。
１分後にダルベッコーＰＢＳ（ＤＰＢＳ）を加えてＰＥ
Ｇを稀釈する。ＰＥＧが完全になくなるまで細胞浮遊液
を洗い、次に１０⁶細胞／ｍｌの濃度になるようにヒポ
キサンチン／アミノプテリン／チミジン選択培地（Ｌｉ
ｔｔｌｅｆｉｅｌｄのＨＡＴ培地）に入れる。この選択
培地中では融合した細胞のみ生存でき、浮遊液中の融合
してない細胞やＡｇ８細胞は生存できない。

【００１４】１．５ハイブリドーマ細胞の培養融合後の細胞浮遊液（ＨＡＴ培地中）をピペットで２０
０μｌずつとり、Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ^TMプレート（Ｃ
ＯＳＴＡＲｔｙｐｅ３５９６）の９６個の穴の中に
入れる。３７℃、相対湿度９５％で、９３％の空気と７
％のＣＯ₂の雰囲気中で培地を変えないでインキュベー
ター中で通気をしながら７−１０日間インキュベートす
る。この間に定期的に細胞の増殖を追跡する。２−３週
間後に、この目的のために開発した特別のスクリーニン
グ法（１．９を参照）を用いて、陽性の培養液（すなわ
ち所期の特異性を有する免疫グロブリンを産生している
培養液）を同定する。同時に培養液をＨＡＴ培地からＨ
Ｔ培地にそしてＲＰＭＩ１６４０培地に順番にかえて
いく。１．６ハイブリドーマ培養細胞のクローニング陽性の増殖培養液を大容量の培養容器（ＣＯＳＴＡＲ細
胞培養プレートｔｙｐｅ３５２４又は３５０６）中で増
殖させる。以下のクローニングは「限界稀釈クローニン
グ」法により実施する。この方法では陽性の培養液を稀
釈して新しく培養を始めたとき移植された細胞数が統計
的にそれぞれ１０又は１個になるようにする。８−１２
日後に単一の細胞から出発した大きなコロニーがすでに
見えるようになる。本当にモノクローナルの細胞（単一
の共通の親細胞から得られた培養細胞）が増殖している
ことを確認するため、クローニング操作は少なくとも２
回行なう。

【００１５】１．７ハイブリドーマ培養細胞の増加１．７．１培養細胞の増加（ｉｎｖｉｔｒｏ）約１０³個の細胞を１０ｍｌのＲＰＭＩ１６４０のは
いったシャーレ（直径１０ｃｍ，ＧＲＥＩＮＥＲ）の中
にまく。シャーレのかわりに細胞培養ビンを使ってもよ
い。数日後に細胞を含まない上澄液中に細胞の分泌した
ｍＡＫが含まれている。これは直接ＲＩＡに使用し得
る。１．７．２マウスの腹水の増加（ｉｎｖｉｖｏ）腹膜を調整するために鉱物油Ｐｒｉｓｔａｎ^TM（ＲＯＴ
Ｈ）０．５ｍｌをＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内投与す
る。７−６０日以内にこうして前処理したマウスの腹腔
内に一匹あたり１０⁶−１０⁷個のハイブリドーマ細胞
の浮遊液（ＰＢＳ中）を投与する。８−１０日後に腹腔
にカニューレをさしこんで細胞を含有する腹水を集め
る。遠心分離（１，０００ｒｐｍ，１０分）により腹水
から細胞成分を分離する。モノクローナル抗体を含有す
る上澄画分も（必要な場合は稀釈してから）分注して−
７０℃で保存するか、又はアフィニティクロマトグラフ
ィーで精製する。

【００１６】１．８腹水の精製Ｂｒｕｃｋらの方法〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．
５３，３１３−３１９（１９８２）〕により精製する。１．８．１腹水の前処理腹水を１，０００×ｇで５分間遠心分離して細胞成分を
沈澱させる。超遠心分離（１００，０００×ｇ，３０
分）により細胞断片とフィブリン塊を分離除去する。次
に上澄画分を１００倍量のトリス−ＨＣｌ緩衝液（０．
０２ｍ／ｌ、ｐＨ７．２）で一晩透析する。そして１
０，０００×ｇで１５分間遠心分離する。１．８．２クロマトグラフィー前処理した腹水１ｍｌをＤＥＡＥＡｆｆｉ−Ｇｅｌ
Ｂｌｕｅ^TM（ＢＩＯ−ＲＡＤ）（ベッド容積７ｍｌ）を
充填したカラムに添加する。カラムをカラムの緩衝液
（トリス−ＨＣｌ、０．０２ｍ／ｌ、ｐＨ７．２）で洗
う。異なる蛋白をＮａＣｌの濃度勾配（０−１００ｍｍ
ｏｌ／ｌ）で流速３０−４０ｍｌ／ｈで溶出する。１−
２ｍｌの画分を集める。溶出中各画分の蛋白含量を追跡
する。抗体を含む画分を集め０．０２％ＮａＮ₃添加後
４℃で保存する。

【００１７】１．９全血、細胞培養上澄画分と腹水に
おける抗体検出のためのスクリーニング試験ジゴキシンのｍＡＫの開発の過程に細胞培養上澄画分に
おける抗体を見出す方法として２つの方法（固相酵素免
疫定量法とラジオイムノアッセイ）を用いた。スクリー
ニング段階ですでに、ジゴキシンに対し交叉反応性の低
いｍＡＫの選択にはラジオイムノアッセイが特に優れて
いることがわかった。１．９．１固相免疫定量法ＥＬＩＳＡプレートの調製固相酵素免疫定量法（ＳＰ−ＥＬＩＳＡ）として抗体産
生の一般的スクリーニング試験を行なった（ＥＬＩＳＡ
＝ｅｎｚｙｍｅｌａｂｅｌｌｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏ
ｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）。免疫において免疫物質とし
て用いたジゴキシンＢＳＡ結合物で、Ｍｉｃｒｏｔｉｔ
ｅｒ^TMプレートの９６個の穴をまず被覆し（５６μｇ／
穴）、３７℃で９０分インキュベートする。残っている
遊離の非特異的結合部位を牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
（ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ、０．０５％ツイーン２０、
０．０２％ＮａＮ₃）でブロックする。生理食塩水（２
回蒸留水中０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５％ツイーン
２０、０．０２％ＮａＮ₃）で２回洗浄後、こうして前
処理したプレートを湿潤箱中４℃で４週間まで保存す
る。

【００１８】ＥＬＩＳＡ法各細胞培養上澄画分を、あらかじめ被覆したプレートの
各穴にピペットで入れる。３７℃で９０分間インキュベ
ーション後、穴の中の内容物を捨て、プレートを生理食
塩水で３回洗う。抗原（ジゴキシン−ＢＳＡ）に結合し
得る抗体、したがって細胞上澄画分の固相に結合し得る
抗体を検出するために、検出試薬としてアルカリ性ホス
ファターゼで標識した第２抗体（ＭＥＤＡＣＬｔｄ．
製のヤギ抗マウス免疫グロブリン、抗−ＩｇＭ）を用い
る。さらにインキュベーション（９０分、３７℃）後、
ホスファタゼーゼ基質（ｐ−ニトロフェニルホスフェー
トの２ナトリウム塩、ＳＩＧＭＡ，０．１％ジエタノー
ルアミン緩衝液、ｐＨ９．０、１００μｌ／穴）を添加
して酵素反応を開始させる。室温で約１時間反応後、陽
性の培養液の細胞上澄画分を含有するプレート中の穴
に、有意な黄色の発色がみられる。Ｍｉｃｉｏｔｉｔｅ
ｒ^TM系に一致する８−チャンネル光度計（Ｔｉｔｅｒｔ
ｅｋＭｕｌｔｉｓｋａｎ．ＦｌｏｕｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ製）を用いて、プレート中の発色反応を直
接定量する。

【００１９】１．９．２抗体産生のスクリーニングの
ためのラジオイムノアッセイスクリーニング用ＲＩＡはマイクロタイタープレート中
で「ミクロ−ＲＩＡ」（下記）として行なう。混合液は
下記の試薬より成る。細胞培養上澄液１００μｌ¹²⁵ Ｉ−ジゴキシントレーサー１００μｌ（ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＰＲＯＤＵＣＴＳ）又は¹²⁵Ｉ−ジゴキシントレーサー１００μｌ（ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＰＲＯＤＵＣＴＳ）正常ヒト血清１００μｌ（ＭＡＩＮＴＺ血液銀行）周囲温度でインキュベーション（３０−４５分）後、遊
離の放射活性と抗体に結合した放射活性をデキストラン
被覆活性炭（ＭＥＲＣＫ）のリン酸緩衝液浮遊液を加え
て１５００×ｇで１０分間遠心分離して分離する。Ｍｉ
ｃｒｏｔｉｔｅｒ^TMプレートの各穴から一部採り、結合
した放射活性（上澄液中）をガンマシンチレーションカ
ウンター（ＫＯＮＴＲＯＮＭＲ４８０Ｃ）で測定す
る。

【００２０】１．１０ジゴキシンのラジオイムノアッ
セイ１．９．２で記載したスクリーニング試験と同様にし
て、ジゴキシンＲＩＡをＭｉｃｒｏｔｉｔｅｒ^TMプレー
ト中の「シクロ−ＲＩＡ」として行なう。この場合の混
合液は下記の試薬より成る。抗ジゴキシンｍＡＫ１００μｌ¹²⁵ Ｉ−ジゴキシントレーサー１００μｌ血漿試料１００μｌ又は血漿中のジゴキシン標準液１００μｌピペッティング操作は（各試料又は標準液を採取する場
合を除き）８チャンネル又は１２チャンネルピペット
（ＴＩＴＥＲＴＥＫ^TM ＦＬＯＷＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ製）を用いて行なう。インキュベーション時間や
他の操作は全てスクリーニングＲＩＡと同じである。

【００２１】１．１１ｍＡＫの免疫グロブリンのサブ
クラスの決定ｍＡＫは固相ＥＬＩＳＡ系において一層特徴が出る。Ｍ
ｉｃｒｏｔｉｔｅｒ^TMプレートの穴を抗原（ジゴキシン
−ＢＳＡ）で被覆する。こうして細胞培養液のｍＡＫで
調製したプレートをインキュベーション（３７℃で２時
間）後、種々のクラスそしてサブクラスの抗マウス免疫
グロブリンや種々のクラスの免疫グロブリンのＬ鎖やＨ
鎖を使用して、２回目のインキュベーション（３７℃で
１時間）を行なう。次に酵素標識ヤギ抗ウサギ免疫グロ
ブリンを加え１時間インキュベートし、ｐ−ニトロフェ
ニルホスフェートを添加して酵素反応を開始させる。

【００２２】２．結果２．１マウスの免疫応答免疫後何週間かすると２０匹の群のマウスのうち１３匹
の全血中に、ラジオイムノアッセイで抗ジゴキシン抗体
を産生しているのが検出される。特に免疫反応性の高い
ことがわかったマウスだけを、次の融合実験における脾
臓の提供マウスとして用いる。図１に２匹のマウスの抗
体産生の上昇の例を示してある。２．２ハイブリドーマセルラインの確立融合のもうひとつのセルラインとしてはＰ３×６３．Ａ
ｇ８−６３５−Ｔｈのみを用いる。こうして５０−８０
％の融合頻度（ＨＡＴ選択培地で生存している細胞の比
率）が規則的に得られる（表１）。

【００２３】

【表１】ＨＡＴ選択培地特異抗体を分確立した融合番号で増殖している融合頻度泌しているコハイブリコロニーの数ロニーの数ドーマ ─────────────────────────────────── １７３１４８1.７％１１２０２９９５2.０％３１２８４４８７7.８％６１ ───────────────────────────────────

【００２４】表１例としてあげた３回の融合実験にお
ける融合収率の要約。融合１７：もともと３８４個の培養からスタートした；
融合２０と２８：もともと５７６個の培養。安定した増
殖と抗体産生を示すコロニーを「限界稀釈クローニン
グ」法（培養した細胞を融合後稀釈し、２個のＭｉｃｒ
ｏｔｉｔｅｒ^TMプレート（１９２個の培養）に入れ、各
新しい培養液中の細胞数が統計的に１であるようにす
る）によりクローニングする。１０日後にプレートの各
穴に最初のクローン細胞が肉眼で検出できる。この段階
では顕微鏡で規則的で均一な細胞の増殖が容易にみられ
る（図２）。正確に１週間おきにまず固相ＥＬＩＳＡ法
でそして次にＲＩＡ法で、各クローンの抗ジゴキシン抗
体の産生を追跡する。数週間にわたって継続的に抗体を
産生するクローンを２つの異なる方法で増やす。第１の
方法では培養細胞の浮遊液を大きなシャーレの中か又は
細胞培養ビンの中へ入れる（ｉｎｖｉｔｒｏ系）。第
２の方法では、Ｐｒｉｓｔａｎ^TMで前処理したマウスの
腹膜における腹水としてハイブリドーマクローンを増殖
させる（ｉｎｖｉｖｏ系）。細胞浮遊液の一部を凍結
保存する。

【００２５】２．３培養細胞と腹水におけるｍＡＫの
産生２つの系におけるセルラインの遺伝的安定性従って目的
のモノクローナル抗体を産生する能力を、ＲＩＡ法によ
り抗体価を絶えず調べることによりかなり長期間にわた
って追跡する。こうすると安定なクローンは比較的少数
であることがわかる。大多数のクローンでは数週間する
と抗体価が絶えず低下するため、ＲＩＡにおける放射性
トレーサーの同一の結合力を得るためには、腹水又は培
養細胞の上澄液をさらに濃縮しなければならないという
事実より、それらのクローンは遺伝的に不安定であるこ
とがわかる。ハイブリドーマ株が腹水として増殖してい
るマウスはまた種々の物質、特に蛋白、従って免疫グロ
ブリンそして破壊的酵素（例えばプロテアーゼ）を腹水
中に放出する。これらの成分は又後で腹水を試験系で使
用するとき問題となるので、腹水を精製することが好ま
しい。

【００２６】２．４腹水の精製ＤＥＡＥＡｆｆｉＧｅｌＢｌｕｅ^TMを用いるアフ
ィニティクロマトグラフィーで腹水を精製する。ＮａＣ
ｌ濃度勾配（０−１００ｍｍｏｌ／ｌ）で溶出中にＩ
ｇＧ画分を破壊的プロテアーゼ（これはＮａＣｌ濃度が
１２０ｍｍｏｌ／ｌより高いときのみ溶出される）や
アルブミンから分離する（図３）。モノクローナル抗ジ
ゴキシン抗体は、ＮａＣｌ３５−５０ｍｍｏｌ／ｌ
のＩｇＧピークで溶出される。ピーク画分（６５−７
０）の蛋白濃度は８０μｇ／ｍｌである。プロテアーゼ
検査キット（ＢＩＱＲＡＤ）を用いると、ＩｇＧピー
クの画分にはプロテアーゼが汚染していないことが証明
できる。ＩｇＧピークの蛋白濃度が最も高い画分が、放
射活性ジゴキシントレーサーに対し最も親和性の高い画
分と必ずしも一緒に溶出していないことが結合定量法
（ＲＩＡ）によりわかる。

【００２７】２．５ジゴキシンに対するｍＡＫの性質２．５．１免疫グロブリンサブクラス抗ジゴキシン抗体ｍＡＫＤ２８−Ａ９１−１６−Ｂ６
４（Ｄ５０と省略）はサブクラスＩｇＧ₁の免疫グロブ
リンでありＬ鎖はカッパ型である。２．５．２親和性ｍＡＫＤ２８−Ａ９１−１６−Ｂ６４についてジゴキ
シンに対する結合の親和定数はラジオイムノアッセイの
データを用いて求める。この測定結果と２つの市販のＲ
ＩＡキットのポリクローナル抗体と比較した結果を表２
に示す。

【００２８】

【表２】 ─────────────────────────────────── 結合試薬Ｋａ^-1〔モル^-1〕 ─────────────────────────────────── ｍＡＫＤ５０ 4.１×１０⁹ 抗血清Diagnostic Products 6.０×１０⁹ 抗血清Becton-Dickson 4.１×１０⁹ ───────────────────────────────────

【００２９】表２ｍＡＫＤ５０のＫａ値と市販のキ
ットの抗血清のＫａ値の比較ジゴキシンに対するｍＡＫの親和定数はＲＩＡのデータ
より求めた。表のＫａ値より抗ジゴキシンｍＡＫは親和
性の高い抗体であることがわかる。その親和定数はポリ
クローナル抗体と同じオーダーである。２．５．３感度ｍＡＫＤ５０を用いるＲＩＡ系の感度を求めるため
に、標準液濃度が０．０３ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／
ｍｌの範囲で各濃度に４点を用いて測定する（図４）。
検出限界（「ミクロ−ＲＩＡ」では）は１ｎｇ／ｍｌよ
り有意に低値であり、この点からもｍＡＫのジゴキシン
に対する親和性の高さがわかる。

【００３０】２．５．４特異性図４から明らかな様に、各点の何回かの測定値の変動は
非常に少ない。測定の再現性の正確さを示す例として、
表３に絶対標準偏差及び相対標準偏差と共に図４の標準
曲線を得たデータを示す。

【００３１】

【表３】 ─────────────────────────────────── ジゴキシン％ｂ／ｂ(c) 絶対相対〔ng／ml〕標準偏差標準偏差 ─────────────────────────────────── 0.０３９9.２４ 2.３５ 2.３７％ 0.０５９8.５３ 3.０３ 3.０８％ 0.１９7.１３ 1.９３ 1.９９％ ───────────────────────────────────

【００３２】表３ジゴキシン「ミクロ−ＲＩＡ」の精
度（試験のパラメータについては図４を参照）試験系（たとえば追跡治療）において抗ジゴキシン抗体
を用いている場合は特に、ジゴキシンと他の類似の物質
（たとえばある場合にはステロイドのような内因性の物
質、又はアルドステロンの拮抗剤であるスピロノラクト
ンのようにジゴキシン療法において一緒に投与される物
質）をどれだけ区別できるかということがきわめて重要
である。又ジゴキシンと、ステロイド環の１２位のＯＨ
基がないという点でのみジゴキシンと異なるジギトキシ
ンを明瞭に区別できることが好ましい。ｍＡＫＤ２８
−Ａ９１−１６−Ｂ６４は「ミクロ−ＲＩＡ」において
ジゴキシンに対し非常に優れた特異性を示す（図５）。
ジギトキシンとの交叉反応性は１．３％であり、スピロ
ノラクトンに対する交叉反応性は０．００７％である。
同様に試験した種々のステロイドによる妨害はほんのわ
ずかである（図５）。

【００３３】２．４．５ジゴキシン測定用「ミクロ−
ＲＩＡ」スクリーニング試験においてはマイクロタイター系が特
に優れていた。培養細胞の上澄液画分を同じ格子構造を
有する試験プレートに移す可能性があるため特別のピペ
ッティング装置（１２チャンネルピペット）を使用する
ことができ、人手と時間が大幅に減少できる。スクリー
ニングアッセイでの充分な経験を考慮してマイクロタイ
ター格子系の利点をジゴキシンの検査自身にも使用し
た。従来のＲＩＡ試験管（プラスチック試験管、７５×
１２ｍｍ、ＳＡＲＳＴＥＤＴ）でもともと実施されてい
たＲＩＡを、マイクロタイター系に適応させた。この目
的のために測定容積を３００μｌに減らした。結合した
放射能と遊離の放射能の分離は、５０μｌを越えない量
の適当な濃度の活性炭浮遊液により行なう。こうして有
用なＲＩＡ系が得られる。この系の操作を図６に模式的
に示す。本明細書のＲＩＡのデータは全て（標準曲線、
特異性の証拠など）、この測定系を用いて求めた。測定
容量が少ないということは、操作時間が大幅に節約でき
る（「ミクロ−ＲＩＡ」系では１時間あたり約３００本
の試料が処理できる）のみでなく、必要な試薬の量も減
らすことができる。セルラインＭＡＫＤ５０（Ｄ２８
−Ａ９１−１６−Ｂ６４）は１９８３年１２月２１日に
番号Ｉ−２７２でＣＮＣＭ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｎ
ａｔｉｏｎａｌｅｄｅｃｕｌｔｕｒｅｓｄｅｍ
ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）、パスツール研究所、
パリーに寄託した。

【００３４】使用した緩衝液と培地の組成１．緩衝液１．１ダルベッコーＰＢＳ（ＤＰＢＳ，量はｍｇ／
ｌ）文献：Ｅａｒｌｅ，Ｗ．Ｒ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｎａ
ｔ．ｃａｎｃｅｒＩｎｓｔ．４，１６５（１９４３）Ｈａｎｋｓ，ＪＨ．ａｎｄＲ．Ｅ．Ｗａｌｌａｃｅ，
Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．７１，
１９６（１９４９）Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，Ｒ．ａｎｄＭ．Ｖｏｇｔ，Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．９９，１６７（１９５４）ＰＢＳ Earl's Hanks' （ダルベッコー) Salts Salts ＮａＣｌ 8000 6800 8000 ＫＣｌ 200 400 400 Ｎａ₂ＨＰＯ₄ 1150 - 48 ＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ - 140 - ＫＨ₂ＰＯ₄ 200 - 60 ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ 100 - - ^* ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ - 200 200 ^* ＣａＣｌ₂ 100 200 140 グルコース - 1000 1000 フェノールレッド - 10 10 ＮａＨＣＯ₃ - 2200 350 ＊本来の組成はＭｇＣｌ₂６Ｈ₂Ｏ１００ｍｇ／ｌ
とＭｇＳＯ₄７Ｈ₂Ｏ１００ｍｇ／ｌである。

【００３５】１．２リン酸緩衝液（ＰＢＳ，量はｇ／
ｌ） 9.６ｍＭ，ｐＨ＝７．４ＮａＣｌ８．０ＫＣｌ０．２Ｎａ₂ＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ１．４４ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．２１．３炭酸水素ナトリウム緩衝液０．１ｍｏｌ／ｌＮａＨＣＯ₃（２回蒸留水中）０．１ｍｏｌ／ｌＮａ₂ＣＯ₃（２回蒸留水中）ｐＨ９．０に調整１．４酢酸ナトリウム緩衝液（０．１ｍｏｌ／ｌ）８．２０３ｇＣＨ₃ＣＯＯＮａ２９．２２ｇＮａＣｌ８００ｍｌＨ₂Ｏ中酢酸でｐＨ４．０に調整し、２回蒸留水で１リットルに
調整する。

【００３６】１．５グリシンＨＣｌ緩衝液（０．１ｍ
ｏｌ／ｌ）溶液ａ：０．１ｍｏｌ／ｌグリシン（７．５０５ｇ／
ｌ）＋０．１ＭＮａＣｌ（５．８５ｇ／ｌ）溶液ｂ：０．１ｍｏｌ／ｌＨＣｌ緩衝液の組成：溶液ａ８８％溶液ｂ１２％ｐＨ３．２１．６生理食塩水洗浄液（ＥＬＩＳＡ用）０．１５ｍｏｌ／ｌＮａＣｌ０．０５％ツイーン２００．０２％ＮａＮ₃ ２回蒸留水中１．７ブロッキング緩衝液（ＥＬＩＳＡ用）０．５％ＨＳＡ０．０５％ツイーン２０ＰＢＳ中０．０２％ＮａＮ₃ １．８ジエタノールアミン緩衝液（ＥＬＩＳＡ用）ジエタノールアミン４８ｍｌＭｇＣｌ₂（５２．２６ｍｇＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ）
ｌ₂・６Ｈ₂Ｏ）２回蒸留水４００ｍｌ１ｍｏｌ／ｌのＨＣｌでｐＨ９．０に調整し、２回蒸留
水で５００ｍｌにする

【００３７】２．ポリエチレングリコール溶液（融合
用）ＰＥＧ４０００２０ｇ２０分間オートクレーブ（１２１℃）８０℃に冷やす２８ｍｌのＤＰＢＳ（１５％ＤＭＳＯ含む）を加える３．細胞培養培地３．１ＰＰＭＩ１６４０培地（量はｍｇ／ｌ）文献：Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｅ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．
Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１９９，５１９（１９６７）ＮａＣｌ６０００ＫＣｌ４００Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１５１２ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１００Ｃａ（ＮＯ₃）₂・４Ｈ₂Ｏ１００Ｄ−グルコース２０００フェノールレッド５ＮａＨＣＯ₃ ２０００Ｌ−アルギニン２００Ｌ−アスパラギン５０Ｌ−アスパラギン酸２０Ｌ−シスチン５０Ｌ−グルタミン３００Ｌ−グルタミン酸２０グリシン１０Ｌ−ヒスチジン１５Ｌ−ヒドロキシプロリン２０Ｌ−イソロイシン５０Ｌ−ロイシン５０Ｌ−リジン−ＨＣｌ４０Ｌ−メチオニン１５Ｌ−フェニルアラニン１５Ｌ−プロリン２０Ｌ−セリン３０Ｌ−スレオニン２０Ｌ−トリプトファン５Ｌ−チロシン２０Ｌ−バリン２０グルタチオン１ビオチン０．２ビタミンＢ₁₂ ０．００５Ｄ−ＣＡ−パントテン酸塩０．２５塩化コリン３葉酸１Ｌ−イノシトール３５ニコチンアミド１ｐ−アミノ安息香酸１ピリドキシン・ＨＣｌ１リボフラビン０．２チアミン・ＨＣｌ１液体培地は１０ｍｇ／ｌのフェノールレッドを含有する
さらに：０．００２ｍｏｌ／ｌＬ−グルタミン１０⁵ Ｕ／ｌペニシリン−ストレプト
マイシン２×１０^-5 ｍｏｌ／ｌメルカプトエタノール１０−１５％ＦＣＳ

【００３８】３．２ＨＡＴ培地／ＨＴ培地Ａ：アミノプテリン３．８２ｍｇ／２００ｍｌ２回
蒸留水ＨＴ：ヒポキサンチン２７２．２０ｍｇ（２００ｍｌ
２回蒸留水中）チミジン７６．５０ｍｇＨＡＴ培地：基礎溶液Ａ１０ｍｌ＋基礎溶液ＨＴ１０ｍ
ｌＲＰＭＩ１６４０（添加物を全て加えてある）１
０００ｍｌＨＴ培地：基礎溶液ＨＴ１０ｍｌＲＰＭＩ（添加物を全て加えてある）１０００ｍｌ３．３凍結用培地７０％ＤＰＢＳ１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキサイド）２０％ＦＣＳ（牛胎児血清）

【図面の簡単な説明】

【図１】２匹の動物における抗体産生の増加。

【図２】１０日増殖後の細胞クローンの顕微鏡像。

【図３】腹水のアフィニティクロマトグラフィーによる
精製の溶出パターン（ＤＥＡＥＡｆｆｉＧｅｌＢｌ
ｕｅ^TMを使用）。

【図４】ｍＡＫＤ５０（“ミクロ−ＲＩＡ”系）を使
用した場合のジゴキシン−ＲＩＡの感度。４回の測定値
の平均値（±標準偏差）（ｍＡＫ稀釈１：４０，００
０，Ｔ＝６，０００ｃｐｍ，ｂｏ＝４０％，ＮＳＢ＝
１．７％）。

【図５】ジゴキシンミクロ−ＲＩＡにおける、構造類似
物質の妨害。

【図６】「ミクロ−ＲＩＡ」の操作の流れ。個々の操作
は１．９．２（方法）に詳述されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｇ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 5/20 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ジゴキシンに対し高い親和性と選択性を
有するモノクローナル抗体を産生することを特徴とす
る、ハイブリッドセルライン。
【請求項２】産生するモノクローナル抗体のジギトキ
シンに対する交叉反応性が１．３％未満であることを特
徴とする、請求項１記載のハイブリッドセルライン。
【請求項３】産生するモノクローナル抗体のスピロノ
ラクトンに対する交叉反応性が０．００７％未満である
ことを特徴とする、請求項１又は２記載のハイブリッド
セルライン。
【請求項４】マウスにジゴキシンを免疫し、ジゴキシ
ン、ジギタリス配糖体およびスピロノラクトンを用い
て、体細胞融合の通常の操作段階に必要なハイブリッド
細胞の選択をすることにより産生される、請求項１から
３のいずれか１項に記載のハイブリッドセルライン。
【請求項５】ジギタリス配糖体としてジギトキシンを
用いることにより産生される、請求項４記載のハイブリ
ッドセルライン。
【請求項６】ａ）マウスを免疫原で処理し、ｂ）これらのマウスの脾細胞をマウスのミエローマ細
胞で融合し、ｃ）融合していない細胞のハイブリッドを分離除去
し、ｄ）免疫原に対するモノクローナル抗体を産生するハ
イブリッドを選択し、そしてｅ）必要な場合にはハイブリッドを単離する請求項１
から３のいずれか１項に記載のハイブリッドセルライン
の製造方法において、ジゴキシンをａ）の免疫原として
使用し、ジゴキシン、ジギタリス配糖体そしてスピロノ
ラクトンを用いてｄ）の選択を行なうことを特徴とす
る、上記方法。
【請求項７】ジギタリス配糖体としてジギトキシンを
用いることを特徴とする、請求項６記載の方法。