FI83669C - Foerfarande foer specifik bestaemning av pankreas -amylas. - Google Patents
Foerfarande foer specifik bestaemning av pankreas -amylas. Download PDFInfo
- Publication number
- FI83669C FI83669C FI844608A FI844608A FI83669C FI 83669 C FI83669 C FI 83669C FI 844608 A FI844608 A FI 844608A FI 844608 A FI844608 A FI 844608A FI 83669 C FI83669 C FI 83669C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- amylase
- salivary
- monoclonal antibody
- antibody
- pancreatic
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 title description 33
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 title description 33
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 title description 33
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 title description 32
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims abstract description 37
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 claims abstract description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 102100033770 Alpha-amylase 1C Human genes 0.000 claims description 32
- 108010026386 Salivary alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 32
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 25
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 21
- 108010029785 Pancreatic alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 19
- 102100026367 Pancreatic alpha-amylase Human genes 0.000 claims description 19
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 14
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims description 9
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 6
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 5
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 claims description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 4
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 4
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010057899 Maltose phosphorylase Proteins 0.000 claims description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims description 3
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 claims description 3
- 125000006501 nitrophenyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004368 Modified starch Substances 0.000 claims description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 235000019426 modified starch Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000002019 doping agent Substances 0.000 claims 4
- 108090001003 Beta-phosphoglucomutases Proteins 0.000 claims 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims 2
- 241000288673 Chiroptera Species 0.000 claims 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 abstract description 16
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 abstract 4
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 abstract 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 22
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- LOTKRQAVGJMPNV-UHFFFAOYSA-N 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(F)C([N+]([O-])=O)=C1 LOTKRQAVGJMPNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FSRMLWKBCQFLJA-HTZQGQHSSA-N (2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3s,4r,5r,6r)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-nitrophenoxy)oxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxy-4,5-dihyd Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O[C@@H]3[C@H](O[C@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H](O[C@@H]5[C@H](O[C@H](O[C@@H]6[C@H](O[C@H](OC=7C=CC(=CC=7)[N+]([O-])=O)[C@H](O)[C@H]6O)CO)[C@H](O)[C@H]5O)CO)[C@H](O)[C@H]4O)CO)[C@H](O)[C@H]3O)CO)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FSRMLWKBCQFLJA-HTZQGQHSSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEUIKXVPXLWUDU-UHFFFAOYSA-N 4-diazoniobenzenesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC=C([N+]#N)C=C1 UEUIKXVPXLWUDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- NYTOUQBROMCLBJ-UHFFFAOYSA-N Tetranitromethane Chemical compound [O-][N+](=O)C([N+]([O-])=O)([N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O NYTOUQBROMCLBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 239000003392 amylase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000006193 diazotization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ZRVNHXQGRJLLIT-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen sulfate Chemical compound [K+].[K+].OS([O-])(=O)=O.OS([O-])(=O)=O ZRVNHXQGRJLLIT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000006396 nitration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/824—Immunological separation techniques
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/828—Protein A
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
- Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
Description
1 83669
Menetellä haiman α-amylaasin spesifiseksi määrittämiseksi
Keksintö kohdistuu haiman α-amylaasin spesifiseen määrittämiseen syljen α-amylaasin ohella.
α-amylaasi (E.C.3.2.1.1) hajottaa 1,4-d-glukosidisitoutuneita oligo- ja polysakkarideja maltoosiksi ja malto-oligosakkarideiksi hydrolysoimalla pääasiassa satunnaisesti 1,4-a-glykosidi-sidoksia. Teollisten käymismeneteImien ohella entsyymillä on huomattavaa merkitystä kliinisessä analytiikassa ja diagnostiikassa. Ruumiin nesteiden, kuten seerumin, virtsan ja pohjukaissuolen eritteen, α-amylaasipitoisuus muuttuu nimittäin melkoisesti lukuisissa sairaustiloissa. Ruumiissa esiintyy pääasiassa kuitenkin kahta a-amylaasia, eli haiman ja syljen entsyymejä. Koska ainoastaan haiman entsyymillä on diagnostista merkitystä, niin tavoitteena on kyetä erottamaan nämä molemmat a-amylaasit toisistaan (harvinaisten ja ainoastaan vähäisessä määrin esiintyvien muiden isoentsyymien ohella). Vaikeutena on tällöin se, että näiden monimutkaisten muotojen rakenteet ovat samankaltaiset ja että ne ovat immunologisesti identtiset /K. Lorentz, Laboratoriumsblätter 32: 118 (19822/. Syljen entsyymin aktiivisuuden poistamiseksi käytetään tunnetusti adsorboimista anionivaihtajaan, inhibointia vehnäproteii-nilla tai elektroforeesia, tai elektrofokusointia. Kuitenkin nämä menetelmät ovat joko erotuskyvyltään epätyydyttäviä tai liian monimutkaisia rutiinidiagnostiikkaan. Tunnetuista menetelmistä ainoastaan julkaisussa Clin. Chem,_28/7, 1525-1527 (1982) kuvattu prosessi syljen entsyymin inhiboimiseksi vehnän-alkioista peräisin olevalla inhibiittorilla ei ole liian aikaavievä rutiinidiagnostiikassa käytettäväksi, kuitenkin sen se-lektiivisyys on epätyydyttävää. Myös optimaalisella inhibiittorin pitoisuudella syljen entsyymiin jää noin 13 % sen aktiivisuudesta, kun taas haiman entsyymin aktiivisuus pienenee noin 81 %:iin.
2 83669 Näin ollen keksintö perustuu tämän haitan poistamis-tavoitteeseen sekä tehtävään kehittää sellainen menetelmä ja reagenssi, joiden avulla haiman a-amy-laasin määrittäminen ruumiin nesteistä syljen a-amylaasin ohella on mahdollista nopeasti, yksinkertaisesti ja luotettavasti.
Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisesti menetelmällä haiman a-amylaasin spesifiseksi määrittämiseksi syljen α-amylaasin ohella ruumiin nesteistä, erityisesti seerumista, pohjukaissuolen nesteestä tai virtsasta siten, että saadaan järjestelmä a-amylaasin toteamiseksi syljen α-amylaasin inhibiittorin läsnäollessa, joka järjestelmä on tunnettu siitä, että inhibiittorin asemasta siihen lisätään sellaista monoklonaalista vasta-ainetta, jonka haiman a-amylaa-siin kohdistuva ristikkäisreaktiivisuus on 5 % tai sitä alhaisempi.
Keksinnön mukainen menetelmä perustuu monoklonaalisen vasta-aineen erittäin yllättävään keksimiseen, jonka vasta-aineen haiman entsyymiin kohdistuva ristikkäisreaktiivisuus on hyvin vähäinen. Tämä ei ollut odotettavissa, sillä tunnettua oli, että syljen ja haiman entsyymit ovat immunologisesti identtiset (Gerhard Pfleiderer, Lab. Med 7, 189-193; K. Lorentz loc. cit.). Morton K. Schwarz esittää julkaisussa "Immunoassay of Enzymes - an Overview" (1983), sivut 4-9, muun muassa, että ihmisen syljen a-amylaasia vastaan vaikuttavat vasta-aineet estävät syljen entsyymin toiminnan 78-%:isesti, haiman entsyymin toiminnan 75-%:isesti. Täten ennalta ei ollut aavistettavissa, että sellaisen menetelmän, jonka avulla 3 8 3 6 69 nämä molemmat entsyymit voitaisiin käytännöllisesti katsoen erottaa toisistaan kvantitatiivisesti immunologisin perustein, kehittäminen olisi mahdollista.
JP-hakemusjulkaisusta 58 183 098 on tunnettu monoklo-naalisen vasta-aineen käyttö syljen a-amylaasin inhibiittorina määritettäessä haiman α-amylaasin aktiivisuutta isoentsyymiseoksesta.
Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä lähtee siitä periaatteesta, että haiman α-amylaasin ja syljen α-amylaasin erottamiseksi kehon nesteistä voidaan käyttää monoklonaalista vasta-ainetta estoai-neena syljen entsyymille, jonka vasta-aineen haiman entsyymiin kohdistuva ristireaktiivisuus on korkeintaan 5 %.
Japanilaisessa julkaisussa tätä tehtävää ei ole ratkaistu. Viitejulkaisussa kuvatulla menetelmällä ei kyetä saamaan annettuja ominaisuuksia omaavia vasta-aineita.
Uusi, keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetty monoklonaalinen vasta-aine on tallennettu kokoelmaan NCACC (National Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, GB) numerolla 84111305 (klooni 79), 84111304 (klooni 1A813E10), 84111303 (klooni 1A814A7), 84111302 (klooni 32C516E3), 84111301 (klooni 32C518F11). Keksinnön mukaisesti sitä voidaan valmistaa 4 83669 natiivilla tai modifioidulla syljen α-amylaasilla tapahtuvalla koe-eläinten immunoinnilla, näin saatujen iramunoitujen eläinten B-lymfosyyttien ja transformoivien aineiden välisellä fuusiolla, näin muodostettujen, monoklonaalisen vasta-aineen tuottavien hybridisolujen kloonauksella ja viljelyllä, ja mainitun vasta-aineen eristämisellä. Rotat ja hiiret ovat erityisen sopivia eläimiä syljen a-amylaasin vasta-aineiden valmistamiseen. Immunointi suoritetaan joko ihmisen natiivilla syljen α-amylaasilla tai modifioidulla syljen amylaasilla. Natiivia entsyymiä käytettäessä tähän tarkoitukseen soveltuvat tavanomaiset kaupalliset, elektroforeettisesti homogeeniset valmisteet. Kemiallisesti modifioitua syljen a-amylaasia voidaan samoin valmistaa tunnetuilla entsyymimodifikaation menetelmillä, kuten lähemmin on esitetty esimerkiksi patentissa DE-AS 25 43 994. Sopivia modifiointiaineita ovat esimerkiksi N-bromisukkinimidi (NBS) hapetettaessa proteiinin tryptofaani-ryhmiä (BBA 143 (1967) 462-472), karboksimetylointi jodiase- t.aatilla (IAA) , joka vaikuttaa pääasiassa histidiiniin tai nitraus tetranitrometaanilla (J. Biol. Chem. 238 (1963) 3307), diatsotointi diatsotoidulla sulfaniilihapolla (Meth. Enzymol.
25 (1972) 515-531) sekä muuntaminen dinitrofluoribentseenillä (DNFB) (J. Biol. Chem. 243 (1968) 5344-253). Natiivia entsyymiä lukuunottamatta parhaimmaksi soveltui tällöin DNFB:llä modifioitu entsyymi.
Immunointi suoritetaan tavalliseen tapaan antamalla natiivia tai modifioitua entsyymiä, mieluummin yhdessä apuaineen kanssa. Apuaineena käytetään mieluiten alumiinihydroksidia yhdessä Bordatella pertussisiksen kanssa.
Mikäli immunointiin käytetään natiivia syljen a-amylaasia, niin tällöin immunointi suoritetaan mieluummin vähintään 9 kuukauden aikana vähintään 7 immunoinnilla (injektoinneilla I.P.). Modifioitua syljen α-amylaasia käytettäessä tarkoituksenmukaiseksi osoittautui immunoinnin osan suorittaminen in vitro. Kuitenkin vähintään kaksi immunointia tulee suorittaa 5 8 3 6 69 in vivo, ennen kuin in vitro-immunoinnit toteutetaan. Jälkimmäisessä tapauksessa immunoitujen eläinten B-lymfosyyttejä viljellään edelleen tymosyyteillä käsitellyssä alustassa, ja alustaan lisätään antigeenejä.
Onnistuneen immunoinnin jälkeen immunoitujen eläinten B-lymfo-syytit fuusioidaan tavanomaisilla menetelmillä transformoivien aineiden kanssa. Esimerkkejä sellaisista transformoivista aineista, joita keksinnön puitteissa voidaan käyttää, ovat myeloomasolut, transformoivat virukset, kuten esimerkiksi Epstein-Barr-virus tai DE-kuulutusjulkaisussa 32 45 665 esitetyt aineet. Fuusio suoritetaan Koehler:in ja Milstein:in tunnetulla menetelmällä (Nature 256 (1975) 495-997). Näin muodostetut hybridisolut kloonataan tavallisella tavalla, esimerkiksi jotakin tavanomaista kaupallista solulajia käyttämällä, ja saatuja, toivottua monoklonaalista vasta-ainetta muodostavia klooneja viljellään. Hybridisolujen syövänkaltaisesta kasvusta johtuen niitä voidaan edelleen viljellä määräämättömän pituisen ajan, ja ne tuottavat toivottua monoklonaalista vasta-ainetta millaisia määriä tahansa. Näin saaduista monoklonaali-silla vasta-aineilla voidaan syljen a-amylaasi absorboida kvanti-: tatiivisesti ruumiin nesteistä, joten jäljelle jäävän amylaasi- aktiivisuuden voidaan katsoa kuuluvaksi haiman α-amylaasille.
Keksinnön mukaisessa määritysmenetelmässä voidaan käyttää näitä monoklonaalisia vasta-aineita sellaisenaan, tai niitä paloja, joissa ilmenevät vastaavat immunologiset ominaisuu-.. det (Fc~pala). Tästä syystä käsitteellä "monoklonaalinen vasta-aine” ymmärretään ohessa myös näitä paloja. Sekä täydellisiä vasta-aineita että niiden paloja voidaan käyttää immobilisoidussa muodossa.
Yllättävästi keksinnön mukaisesti käytetyn monoklonaalisen vasta-aineen haiman a-amylaasiin kohdistuva ristikkäisreaktii-visuus on 5 % tai alhaisempi, ja useissa tapauksissa sen ris-tikkäisreaktiivisuus saavuttaa vain arvon 1 %. Tästä syystä se 6 83669 soveltuu tähän saakka tunnetun, vehnänalkioista peräisin olevan estoaineen asemesta haiman a-amylaasin spesifiseen määrittämiseen ruumiin nesteistä.
ot-amylaasin määrittäminen sinänsä suoritetaan tähän tarkoitukseen tunnettuja menetelmiä käyttäen. Koska keksinnön mukainen monoklonaalinen vasta-aine sitoo selektiivisesti syljen a-amy-laasia poistaen sen täten entsyymin aktiivisuusmäärityksestä, niin monoklonaalisen vasta-aineen läsnäollessa suoritetuissa α-amylaasimäärityksissä saadut arvot vastaavat pelkästään haiman entsyymin aikaansaamaa aktiivisuutta.
Keksinnön mukainen menetelmä toteutetaan mieluummin sellaisella α-amylaasin toteamisjärjestelmällä, joka sisältää maltopolyoosia, jonka molekyylissä on 4-7 glukoosijäännöstä, maltoosifosforylaa-sia, !'-fosfoglukomutaasia, glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaa-sia ja NADrtä.
Toinen, keksinnön puitteissa mielellään käytetty järjestelmä α-amylaasin toteamiseksi koostuu nitrofenyylimaltopolyoosista, jonka molekyylissä on 4-7 glukoosijäännöstä, ja a-glukosidaa-sista.
Edelleen suositeltava α-amylaasin toteamisjärjestelmä koostuu määritettävissä olevin ryhmin modifioidusta tärkkelyksestä.
Käsite modifioitu tärkkelys sisältää esimerkiksi sellaisen tärkkelyksen, joka on modifioitu määritettävissä olevin ryhmin, esimerkiksi yhtiön Pharmazia, Ruotsi, tavanomaisen kaupallisen tuotteen "Phadebas", sekä DE-kuulutusjulkaisussa 28 12 154 esitetyn tuotteen sekä hajoamisominaisuuksiltaan muunnetun tärkkelyksen, esimerkiksi karboksimetyylitärkkelyksen ja raja-dekstriinin. Kaikki nämä järjestelmät ovat tunnettuja, joten niitä ei tarvitse tässä tarkemmin kuvata.
Keksinnön mukaisen menetelmän toteuttamiseksi saatetaan näyte-neste asianmukaisesti keksinnön mukaisen vasta-aineen kanssa I.
7 83669 suspension muotoon, jonka jälkeen liukenematon materiaali poistetaan, mieluiten lyhyellä sentrifugoinnilla. Jäljelle jäävä kirkas jäännös käytetään tämän jälkeen tavanomaiseen α-amylaasikokeeseen.
Keksinnön mukaisen reagenssin puitteissa monoklonaalinen vasta-aine, sekä täydellisenä vasta-aineena että kappaleiden muodossa, voi olla myös kiinnitettynä kiinteään kantajaan, esimerkiksi immunosorptiiviseen paperiin tai muovista valmistettujen putkien tai letkujen pinnalle. Tällä tavalla syljen a-amylaasi sitoutuu kantajaan, eli kiinteään faasiin, ja nestemäisestä faasista voidaan täten ilman lisäerottamista määrittää jäännösaktiivisuus, joka kuuluu haiman entsyymille.
Keksinnön puitteissa saavutetaan erityisen hyviä tuloksia, kun siinä käytetään sellaista monoklonaalista vasta-aine-valmistetta, joka on sekoitettu useiden erilaisten kloonien tuottamista monoklonaalisista vasta-aineista.
Koska monoklonaalisesta vasta-aineesta ja sen antigeenistä, eli syljen a-amylaasista muodostunut kompleksi on liukoinen, mikäli monoklonaalista vasta-ainetta ei käytetä immobilisoidussa muodossa, niin lisäksi toinen mahdollisuus sen erottamiseen on monoklonaalisen vasta-aineen tai koe-eläimissä immunoinnilla aikaansaatujen vasta-aineiden saostavan aineen lisääminen.
Tällöin muodostuu liukenematon kompleksi, joka sisältää syljen a-amylaasia, monoklonaalista vasta-ainetta ja saostavaa ainetta.
Saostavana aineena käytetään mieluiten monoklonaalista vasta-ainetta vastaan vaikuttavaa tai koe-eläimissä immunoinnin aikaansaamiin vasta-aineisiin vaikuttavaa vasta-ainetta (siis vasta-vasta-ainetta). Toisena mahdollisuutena on proteiini A:n lisääminen, mieluiten immobilisoidussa muodossa.
Keksinnön mukaisen menetelmän toteutusmuodon toteuttamisen tarkoituksenmukaisena muotona on muodostaa ensin monoklonaalisesta vasta-aineesta ja vastavasta-aineesta koostuva kompleksi, 8 83669 joka tämän jälkeen lisätään tutkittavaan nesteeseen, joka sisältää α-amylaasit. Vaihtoehtoisesti voidaan kuitenkin ensin lisätä vain monoklonaalinen vasta-aine, ja syljen a-amylaa-sin kanssa syntyvän antigeeni-vasta-ainekompleksin muodostamiseksi suoritetun inkuboinnin jälkeen lisätään vastavasta-aine liukenemattoman kompleksin muodostamiseksi.
Keksinnön mukaisen menetelmän vastavasta-ainetta käyttävään toteutusmuotoon soveltuvat periaatteessa kaikki monoklonaalis-ta vasta-ainetta vastaan vaikuttavat tai koe-eläinten muodostamaa vasta-ainetta vastaan vaikuttavat vastavasta-aineet. Käytettäessä hiiriä tai rottia syljen a-amylaasin antiseerumin tuottamiseen käytetään mieluiten lampaan muodostamaa vastavasta-ainetta .
Keksinnön toisena kohteena on reagenssi haiman a-amylaasin spesifiseksi määrittämiseksi syljen α-amylaasin ohella ruumiin nesteistä, erityisesti seerumista, pohjukaissuolinesteestä, plasmasta tai virtsasta, joka reagenssi sisältää järjestelmän α-amylaasin toteamiseksi ja syljen α-amylaasin estoaineen, ja joka on tunnettu siitä, että se sisältää estoaineen asemasta monoklonaalista vasta-ainetta, jonka haiman a-amylaasiin kohdistuva ristikkäisreaktiivisuus on 5 % tai sitä alhaisempi.
Mitä keksinnön mukaisen reagenssin sisältämään järjestelmään α-amylaasin toteamiseksi ja mitä muihin olosuhteisiin tulee, niin edellä esitetyt menetelmään perustuvat toteutusmuodot ovat vastaavasti voimassa.
Keksinnön avulla haiman α-amylaasin yksinkertainen ja nopea määrittäminen syljen α-amylaasin ohella ruumiin nesteistä on mahdollista erittäin spesifisesti, joten keksintö parantaa kliinisen diagnostiikan mahdollisuuksia.
Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä edelleen.
li 9 83669
Esimerkki 1 A) Balb/c-hiiret immunoidaan 100 ^ug:lla alumiinihydroksidissa olevaa ihmisen syljen amylaasia yhdessä BORDATELLA PERTUSSIS-aineen kanssa. Immunointi suoritetaan uudestaan kolme, neljä kertaa kulloinkin 50 ^,ug:lla samassa apuaineessa olevaa ihmisen syljen amylaasia aikarytmin ollessa noin kahdeksan viikkoa. Viimeinen immunointi suoritetaan suonen sisäisesti neljä vuorokautta ennen fuusiota 50 ^,ug:lla fysiologisessa suolaliuoksessa olevaa syljen amylaasia.
B) Pernasolujen ja Ag8.653 (ATCC CRL 1580) tai SP2/0 (ATCC CRL 1581) myeloomasolujen välinen fuusio suoritetaan julkaisussa J. of Imm. Meth. Voi. 39, 285-308 esitetyn standardi-menetelmän mukaisesti. Perna- ja myeloomasolujen välinen fuu-siosuhde on 5:1. Fuusiotuotteet levitetään 10:lle. suuruudeltaan 24 olevalle viljelymaljalle (yhtiöstä Costar), ja niitä ruokitaan 5 x I0^:llä vatsakalvon eritesolulla viljelyalustaa kohden. Positiiviset primääriviljelmät. (katso esimerkki 3) kloonataan kolmosta neljään viikkoa fuusion jälkeen fluoresenssiakti-voituja solulajeja käyttäen. Solut siirretään yksittäin suuruudeltaan 96 oleville Costar-maljoille, ja niitä ruokitaan 2 x lO^rllä vatsakalvon eritesolulla.
Esimerkki 2 cx-amylaasin modifiointi dinitrofluoribentseenillä 20 ^umol syljen amylaasia/1 ja 20 mmol dinitrofluoribentsee-niä/1 (liuotettuna pieneen etanolimäärään) sekoitetaan keskenään ja seosta inkuboidaan huoneen lämpötilassa 10 minuuttia.
Tämän jälkeen liuosta dialysoidaan 20 tuntia fosfaattipuskuria (50 mmol/1, pH 6,8) vastaan (kylmähuoneessa). Tämän jälkeen dialysaatin ekstinktio erotusspektrissä on kasvanut 0,070 yksikköä aallonpituudella 360 nm. Liuos pakastetaan immunoin-tiin saakka. Dialysaatin proteiinipitoisuus on 15 ^umol/1.
Hiiret immunoitiin, kuten esimerkissä 1 on esitetty, näin saadulla modifioidulla α-amylaasilla. Kaikki modifioidulla amylaasilla immunoidut hiiret kuolevat toisen immunoinnin ίο 83 669 jälkeen. Tästä syystä näiden hiirien pernasolut otetaan viljelmään ensimmäisen annoksen jälkeen, ja niitä immunoidaan vielä neljän vuorokauden ajan Luben:in menetelmällä (Molec. Immunology Voi. 17 (1980) 635-639) "in vitro" siten, että 30 ml:ssa alustaa on läsnä 100 ^,ug:aa antigeeniä. Neljän vuorokauden kuluttua nämä solut fuusioidaan ja niitä käsitellään edelleen esimerkissä 1 saatujen pernasolujen tavoin.
Esimerkki 3
Immunoitujen hiirien seerumin tai hybridisolujen viljelyjään-nöksen tai vesivatsojen amylaasia sitovien vasta-aineiden pitoisuuden ja spesifisyyden määrittämiseksi käytetään koe-periaatteena ELISA-menetelmää. Tätä tarkoitusta varten kooltaan 96 oleviin ELISA-levyihin (valmistaja NUNC) levitetään lammas-vasta-hiiri-Fc-vasta-ainekerros. Epäspesifisen sitoutumisen pienentämiseksi levitetään tämän jälkeen maljoille naudan seerumin albumiinin (2 % fysiologisessa suolaliuoksessa) muodostama kerros. Tämän jälkeen vasta-aineen sisältävää näytettä tai sen erilaisia laimennoksia inkuboidaan.
Tätä käsittelyä seuraava inkubointi suoritetaan yhdessä joko syljen amylaasi-peroksidaasi-(P0D)-konjugaatin kanssa, tai haiman amylaasi-POD-konjugaatin kanssa. Sitoutuneen P0D:n aktiivisuus määritetään ABTSrllä (2,2 '-at sinodi-_/3-etyyli-bentstiatsoliinisulfonaatti (6]_/) (pH 4,4) ja ekstinktio otetaan suoraan sitoutuneen hiiri-vasta-aineen mitaksi. Ristik-käisreaktion määrittämiseksi jokaisessa kokeessa syljen ja haiman amylaasi-POD-sidos määritetään erikseen, ja syljen amylaasi-POD: llä saatu ekstinktio asetetaan 100 % sitoutumiseksi. Samanaikaisesti haiman amylaasi-POD:llä saatu ekstinktio ilmoittaa prosentteina syljen amylaasi-POD:n ekstinktiosta näytteen ristikkäisreaktion.
Neljä sellaista kloonia löydettiin, joilla haiman a-amylaasi-PODrn sitoutumista ei lainkaan tapahtunut, ja viisi kloonia, joiden ristikkäisreaktiot olivat arvojen 1,5 % ja alle 5 % välillä. Seulonnan jälkeen valikoidut kloonit laajennetaan.
RPMI-alusta on esitetty julkaisussa J.A.M.A. 199 (1957) 519 ja sitä on kaupallisesti saatavana.
n 83 669
Esimerkki 4
Lammas-vasta-hiiri-vasta-aineella tapahtuva monoklonaalisen vasta-aineen (MAK) immobilisointi ja myöhemmin seuraava syljen amylaasin sitominen
Hiiren vesivatsa
Lammas-vasta-hiiri-vasta-ainetta (IgGFcy): 19 g/1
Fosfaattipuskuri, pH = 7,0; 0,05 mol/1
Fosfaattipuskuri, pH = 7,0; 0,05 mol/1 2 %:sen naudan seerumin albumiinin kanssa
Ihmisen syljen amylaasia: 1000 U/l ( ,umol muuttunutta substraat-tia/ml/min (37°C), 4-nitrofenyylimaltoheptaosidin toimiessa substraattina)
Ihmisen haiman amylaasia: 1000 U/l Etikkahappoa: 0,5 mol/1 Dikaliumvetysulfaattiliuos: 2 mol/1
Vesivatsasta saatu MAK sekoitetaan lammas-vasta-hiiri-vasta-aineen kanssa suhteessa 1:100. Tämä seos laimennetaan fosfaattipuskurilla ja sitä ravistetaan 15 minuuttia 37°C:ssa. Muodostunut sakka pestään kahdesti puskurilla, jonka jälkeen se liuotetaan etikkahappoon (noin 1/5:aan alkuperäisestä tilavuudesta) . 5 minuutin ravistelun jälkeen lisätään K2HP04~liuosta suhteessa 1:2. Jälleen muodostuu sakkaa. Tämä pestään kahdesti fosfaattipuskurilla, jossa on RSA:ta (naudan seerumin albumiinia) ja tämän jälkeen kahdesti pelkällä puskurilla.
Sitten sakka suspendoidaan puskuriin, jonka tilavuus on 1/5 alkuperäisestä tilavuudesta. 50 ^ul sakkaa lisätään 50 ^ul:aan syljen tai haiman amylaasia, ja seosta inkuboidaan 15 minuuttia huoneen lämpötilassa. Sitten sakka sentrifugoidaan erilleen ja jäännöstä käsitellään edelleen esimerkissä 7 esitetyllä tavalla. Vertailuna käytetään sellaista amylaasinäytettä, joka sakan sijasta käsiteltiin 50 ^ul:lla puskuria.
12 83669
Esimerkki 5 MAK:n sitominen syljen amylaasiin ja sitä seuraava saostami- nen lammas-vasta-hiiri-vasta-aineella_
Monoklonaaliset vasta-aineet sisältävä vesivatsa laimennetaan puskurilla suhteessa 1:50. 50 ^ul tätä liuosta ravistellaan 50 ^,ul:n syljen tai haiman amylaasia kanssa 15 minuuttia huoneen lämpötilassa. Vertailunäytteenä käytetään toisaalta puskurilla laimennetun vesivatsan seosta (vesivatsan nolla-arvo) ja toisaalta amylaasin ja puskurin muodostamaa seosta (amylaasiaktiivisuuden vertailu). Tämän jälkeen lisätään 50 ^ul saostavaa vastavasta-ainetta. Seosta pidetään 10 minuuttia huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen sakka sentrifugoidaan pois, ja jäännös käsitellään esimerkin 7 mukaisesti.
Esimerkki 6 MAK:in immobilisointi lammas-vasta-hiiri-vasta-aineella ja sitä seuraava ihmisen syljen amylaasin sitominen syljen ja haiman amylaasien seokseen.
Esimerkin 5 mukaisesti ihmisen haiman ja syljen amylaasien muodostamaa seosta (kulloinkin 1000 U/l) inkuboidaan esikäsi-tellyn sakan kanssa. Sentrifugoinnin jälkeen jäännöstä käsitellään edelleen esimerkin 7 mukaisesti.
Esimerkki 7 Jäljelle jäävän haiman amylaasin määrittäminen Esimerkkien 4-6 mukaisesti 50 ^ul jäännöstä lisätään 1 ml:aan kaupallisesti saatavilla olevaa reagenssia a-amylaasin määrittämiseksi 4-nitrofenyylimaltoheptaosidin toimiessa substraattina (Boehringer Mannheim, tilausnumero 568589). Jäännöksen aktiivisuus määritetään ohjeiden mukaisesti 37°C:n lämpötilassa. Jäännösaktiivisuudet saadaan prosenttisina aktiivisuuksina kulloinkin mitattujen vertailunäytteiden suhteen. Esimerkissä 4 jäännösaktiivisuus syljen amylaasilla on 0-5 % ja haiman amylaasilla 70-95 %. Esimerkin 5 mukaisten kokeiden jäännös-aktiivisuudet syljen amylaasilla ovat 0-5 % ja haiman amylaa- li 13 83669 silla 80-95 %. Molempien entsyymien samanaikainen läsnäolo (esimerkki 6) tekee syljen amylaasin spesifisen saosta-misen mahdolliseksi haiman amylaasin jäädessä aktiiviseksi, ja jolloin se voidaan määrittää 80-95 %:sesti.
Claims (19)
1. Menetelmä haiman α-amylaasin spesifiseksi määrittämiseksi ruumiin nesteistä, erityisesti seerumista, plasmasta, pohjukaissuolen nesteestä tai virtsasta, joka sisältää myös syljen α-amylaasia käyttäen järjestelmää α-amylaasin toteamiseksi, tunnettu siitä, että ruumiin nesteeseen lisätään monoklonaalista vasta-ainetta, joka sitoutuu spesifisesti syljen a-amylaasiin ja jonka haiman α-amylaasiin kohdistuva ristikkäisreaktiivisuus on 5 % tai sitä alhaisempi, liukenemattoman kompleksin muodostamiseksi monoklonaali-sen vasta-aineen ja syljen α-amylaasin välille, erotetaan liukenematon kompleksi ja sitten käytetään järjestelmää a-amylaasin toteamiseksi ja mitataan haiman a-amylaasi.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sellaista monoklonaalista vasta-ainetta käytetään, jota vasta-ainetta saadaan immunisoimalla koe-eläimiä natiivilla tai modifioidulla syljen a-amylaasilla, fuusioimalla immunisoitujen eläinten B-lymfosyyttejä transformoivien aineiden kanssa, näin muodostettuja hybridisoluja kloonaamalla ja viljelemällä, ja eristämällä monoklonaalinen vasta-aine.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koe-eläiminä käytetään rottia tai hiiriä.
4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunisointia suoritettaessa apuaineena käytetään alumiinihydroksidia ja Bordatella pertussis -ainetta.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 2-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunisointi suoritetaan natiivilla syljen a-amylaasilla ja että immunisointi suoritetaan vähintään seitsemään kertaan vähintään yhdeksän kuukauden aikana. is 83669
6. Jonkin patenttivaatimuksen 2-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunisointi suoritetaan modifioidulla syljen a-amylaasilla, ja että vähintään kaksi immunisointia suoritetaan in vivo, jota seuraa vähintään yksi immunisointi in vitro, jossa B-lymfosyyttejä viljellään tymosyyteillä käsitellyssä alustassa.
7. Jonkin patenttivaatimuksen 2-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transformoivina aineina käytetään myeloomasoluj a.
8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liukenematon kompleksi muodostetaan käyttämällä monoklonaalista vasta-ainetta immobilisoidussa muodossa.
9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liukenematon kompleksi muodostetaan lisäämällä seostavaa ainetta.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä käytetään seostavana aineena monoklonaali-sen vasta-aineen anti-vasta-ainetta.
11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että seostavana aineena käytetään proteiini A:ta.
12. Patenttivaatimuksen 9, 10 tai 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä käytetään edeltäkäsin muodostettua, monoklonaalisesta vasta-aineesta ja anti-vasta-aineesta koostuvaa kompleksia.
13. Jonkin patenttivaatimuksen 10-12 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä käytetään lampaan vasta-ainetta anti-vasta-aineena. 1 2 Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetel 2 mä, tunnettu siitä, että a-amylaasin toteamiseen käytettä- i6 83669 vässä järjestelmässä käytetään reagenssia, joka sisältää maltopolyoosia, jossa on 4-7 glukoosijäännöstä, maltoosifos-forylaasia, β-fosfoglukomutaasia, glukoosi-6-fosfaattidehyd-rogenaasia ja NAD:tä.
15. Jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että järjestelmänä α-amylaasin toteamiseksi käytetään reagenssia, joka sisältää nitrofenyylimaltopolyoo-sia, jonka molekyylissä on 4-7 glukoosiyksikköä, yhdessä α-glukosidaasin kanssa.
16. Jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että α-amylaasin toteamisjärjestelmänä käytetään tärkkelystä, joka on modifioitu määritettävissä olevin ryhmin.
17. Reagenssi haiman α-amylaasin spesifiseen määrittämiseen ruumiin nesteistä, erityisesti seerumista, pohjukaissuoli-nesteestä, plasmasta tai virtsasta, joka sisältää syljen a-amylaasia, sisältäen järjestelmän α-amylaasin toteamiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää a) sellaista monoklo-naalista vasta-ainetta, jota saadaan immunisoimalla koe-eläimiä natiivilla tai modifioidulla syljen a-amylaasilla, fuusioimalla immunisoitujen eläinten B-lymfosyyttejä transformoivien aineiden kanssa, näin muodostettuja hybridisoluja kloonaamalla ja viljelemällä, ja eristämällä monoklonaalinen vasta-aine, jonka haiman a-amylaasiin kohdistuva ristikkäis-reaktiivisuus on 5 % tai sitä alhaisempi, sekä b) seostavaa ainetta, joka saostaa monoklonaalisen vasta-aineen ja syljen α-amylaasin muodostaman kompleksin. 1 2 3 4 Reagenssi haiman α-amylaasin spesifiseen määrittämiseen 2 ruumiin nesteistä, erityisesti seerumista, pohjukaissuoli-nesteestä, plasmasta tai virtsasta, joka sisältää syljen α-amylaasia, sisältäen järjestelmän α-amylaasin toteamisek 3 si, tunnettu siitä, että se sisältää sellaista monoklonaa- 4 lista vasta-ainetta, jota saadaan immunisoimalla koe-eläimiä natiivilla tai modifioidulla syljen a-amylaasilla, fuusioi- i7 83669 maila immunisoitujen eläinten B-lymfosyyttejä transformoivien aineiden kanssa, näin muodostettuja hybridisoluja kloonaamalla ja viljelemällä, ja eristämällä monoklonaalinen vasta-aine, jonka haiman a-amylaasiin kohdistuva ristikkäis-reaktiivisuus on 5 % tai sitä alhaisempi, immobilisoidussa muodossa.
19. Patenttivaatimuksen 17 tai 18 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää a-amylaasin toteamisjärjestelmänä maltopolyoosia, jossa on 4-7 glukoosijäännöstä, maltoosifosforylaasia, β-fosfoglukomutaasia, glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasia ja NAD:tä.
20. Patenttivaatimuksen 17 tai 18 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää α-amylaasin toteamisjärjes-telmänä nitrofenyylimaltopolyoosia, jossa on 4-7 glukoosiyk-sikköä, ja a-glukosidaasia.
21. Patenttivaatimuksen 17 tai 18 mukainen reagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää α-amylaasin toteamisjärjestelmänä määritettävissä olevin ryhmin modifioitua tärkkelystä. 1 Menetelmä syljen a-amylaasia vastaan vaikuttavan mono-klonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että immunisoidaan koe-eläimiä natiivilla tai modifioidulla syljen a-amylaasilla käyttäen apuaineena alumiinihydroksidia ja Bordatella pertussis -ainetta, fuusioidaan immunisoitujen eläinten B-lymfosyyttejä transformoivien aineiden kanssa, kloonataan ja viljellään näin muodostettuja hybridisoluja ja eristetään monoklonaalinen vasta-aine. 18 83669
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3342736 | 1983-11-25 | ||
| DE19833342736 DE3342736A1 (de) | 1983-11-25 | 1983-11-25 | Hybridoma-antikoerper |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI844608A0 FI844608A0 (fi) | 1984-11-23 |
| FI844608L FI844608L (fi) | 1985-05-26 |
| FI83669B FI83669B (fi) | 1991-04-30 |
| FI83669C true FI83669C (fi) | 1991-08-12 |
Family
ID=6215298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI844608A FI83669C (fi) | 1983-11-25 | 1984-11-23 | Foerfarande foer specifik bestaemning av pankreas -amylas. |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4939082A (fi) |
| EP (1) | EP0150309B1 (fi) |
| JP (2) | JPS60155134A (fi) |
| AT (1) | ATE44320T1 (fi) |
| AU (1) | AU550266B2 (fi) |
| CA (1) | CA1313150C (fi) |
| CS (1) | CS256383B2 (fi) |
| DD (1) | DD233142A5 (fi) |
| DE (2) | DE3342736A1 (fi) |
| DK (2) | DK162727C (fi) |
| ES (1) | ES537835A0 (fi) |
| FI (1) | FI83669C (fi) |
| YU (1) | YU45971B (fi) |
| ZA (1) | ZA849140B (fi) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4757001A (en) * | 1984-02-16 | 1988-07-12 | Fujirebio Kabushiki Kaisha | Method of measuring biological ligand by utilizing amylase |
| DE3500526A1 (de) * | 1985-01-09 | 1986-07-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Spezifisch hemmender s-amylase-mak |
| DE3508384A1 (de) * | 1985-03-08 | 1986-11-06 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Hemmung humaner speichel- und pankreasamylase durch monoklonale antikoerper |
| DE3525926A1 (de) | 1985-07-19 | 1987-01-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur spezifischen bestimmung von pankreas-alpha-amylase |
| WO1987000526A1 (en) * | 1985-07-26 | 1987-01-29 | The University Of Virginia Alumni Patents Foundati | Immunochemical assays for human amylase isoenzymes and related monoclonal antibodies, hybridoma cell lines and production thereof |
| DE3903114A1 (de) * | 1989-02-02 | 1990-08-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung eines enzyms aus einem isoenzymgemisch sowie hierfuer geeigneter testtraeger und dessen verwendung |
| DE3929355A1 (de) * | 1989-09-04 | 1991-03-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur spezifischen bestimmung von pankreas-(alpha)-amylase |
| JPH085919B2 (ja) * | 1989-11-10 | 1996-01-24 | 日本商事株式会社 | 唾液―α―アミラーゼ活性阻害モノクローナル抗体およびそれを用いる膵臓―α―アミラーゼの分別定量法 |
| GB9024970D0 (en) * | 1990-11-16 | 1991-01-02 | Genzyme Uk Ltd | Assay |
| KR20030079382A (ko) * | 2002-04-04 | 2003-10-10 | 최태부 | 소화 효소-지방산 복합체를 항원으로하여 생산된 항체 및이의 이용 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2258822A1 (de) * | 1972-12-01 | 1974-06-06 | Merck Patent Gmbh | Verfahren und mittel zur analyse von isoenzymmustern |
| JPS58183098A (ja) * | 1982-04-20 | 1983-10-26 | Wako Pure Chem Ind Ltd | アイソザイム分別定量法 |
| DE3245665A1 (de) * | 1982-05-04 | 1983-11-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur herstellung permanenter tierischer und humaner zellinien und deren verwendung |
| US4474892A (en) * | 1983-02-16 | 1984-10-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Two-site immunoassays using monoclonal antibodies of different classes or subclasses and test kits for performing same |
| DE3508384A1 (de) * | 1985-03-08 | 1986-11-06 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Hemmung humaner speichel- und pankreasamylase durch monoklonale antikoerper |
-
1983
- 1983-11-25 DE DE19833342736 patent/DE3342736A1/de not_active Ceased
-
1984
- 1984-11-21 ES ES537835A patent/ES537835A0/es active Granted
- 1984-11-22 DD DD84269782A patent/DD233142A5/de not_active IP Right Cessation
- 1984-11-22 CA CA000468445A patent/CA1313150C/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-11-22 CS CS848967A patent/CS256383B2/cs unknown
- 1984-11-22 JP JP59246409A patent/JPS60155134A/ja active Granted
- 1984-11-22 YU YU196984A patent/YU45971B/sh unknown
- 1984-11-22 DK DK555584A patent/DK162727C/da not_active IP Right Cessation
- 1984-11-23 FI FI844608A patent/FI83669C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-11-23 AT AT84114172T patent/ATE44320T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-11-23 EP EP84114172A patent/EP0150309B1/de not_active Expired
- 1984-11-23 DE DE8484114172T patent/DE3478821D1/de not_active Expired
- 1984-11-23 ZA ZA849140A patent/ZA849140B/xx unknown
- 1984-11-26 AU AU35874/84A patent/AU550266B2/en not_active Ceased
-
1989
- 1989-03-21 US US07/326,885 patent/US4939082A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-10-25 DK DK257690A patent/DK257690A/da not_active Application Discontinuation
-
1991
- 1991-06-07 JP JP3136054A patent/JPH05232117A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK162727B (da) | 1991-12-02 |
| EP0150309B1 (de) | 1989-06-28 |
| FI844608L (fi) | 1985-05-26 |
| FI83669B (fi) | 1991-04-30 |
| DK555584D0 (da) | 1984-11-22 |
| AU3587484A (en) | 1985-05-30 |
| YU45971B (sh) | 1992-12-21 |
| FI844608A0 (fi) | 1984-11-23 |
| ZA849140B (en) | 1985-07-31 |
| EP0150309A3 (en) | 1985-08-21 |
| DK257690D0 (da) | 1990-10-25 |
| ES8507568A1 (es) | 1985-09-16 |
| JPH0436343B2 (fi) | 1992-06-15 |
| DE3342736A1 (de) | 1985-06-05 |
| ATE44320T1 (de) | 1989-07-15 |
| JPS60155134A (ja) | 1985-08-15 |
| AU550266B2 (en) | 1986-03-13 |
| DK162727C (da) | 1992-05-11 |
| EP0150309A2 (de) | 1985-08-07 |
| JPH05232117A (ja) | 1993-09-07 |
| ES537835A0 (es) | 1985-09-16 |
| DK555584A (da) | 1985-05-26 |
| DE3478821D1 (en) | 1989-08-03 |
| CS256383B2 (en) | 1988-04-15 |
| YU196984A (en) | 1989-12-31 |
| DD233142A5 (de) | 1986-02-19 |
| US4939082A (en) | 1990-07-03 |
| CS896784A2 (en) | 1987-08-13 |
| CA1313150C (en) | 1993-01-26 |
| DK257690A (da) | 1990-10-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH06113832A (ja) | ジゴキシンに対し高い親和性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリッドセルライン及びその製造法 | |
| FI83669C (fi) | Foerfarande foer specifik bestaemning av pankreas -amylas. | |
| EP0311383B1 (en) | Monoclonal antibody to methamphetamine, preparation of the same, assay method and assay kit of methamphetamine | |
| KR910002957B1 (ko) | 췌장의 α-아밀라제를 정량하는 방법 및 시약 | |
| EP0274198B1 (en) | Immunoassay kit | |
| WO2006085441A1 (ja) | Ａｄａｍｔｓ１３活性検定用抗体及び活性検定方法 | |
| US5573918A (en) | Process and reagent for specific determination of pancreatic alpha amylase | |
| JPH10226700A (ja) | Ｍｉａの検出のためのイムノアッセイ | |
| KR100207351B1 (ko) | 항 인체 플라스민-알파2-플라스민 억제물질 복합체 항체, 하이브리도마 및 면역학적 측정방법 | |
| JPH11151085A (ja) | 抗ヒトメダラシンモノクローナル抗体、その製造方法及びそれを用いる免疫学的測定方法 | |
| JPH0677017B2 (ja) | ヒト▲ｉｖ▼型コラーゲンのサンドイツチ酵素免疫学的定量法 | |
| JP5663313B2 (ja) | ストロムライシン１と特異的に反応するモノクローナル抗体 | |
| JP3841364B2 (ja) | 抗ヒトビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンｉｉｉ 複合体モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法 | |
| JP2868808B2 (ja) | 活性化血小板抗原測定試薬 | |
| JP2006265138A (ja) | ネコトリプシノーゲン及び／又はネコトリプシンに対するモノクローナル抗体 | |
| WO2000009739A1 (fr) | Anticorps monoclonal agissant contre la trypsine canine | |
| JPH0441307B2 (fi) | ||
| JPH03228691A (ja) | モノクローナル抗体 | |
| JPH07165798A (ja) | ５−ジヒドロテストステロン特異性モノクロナール抗体 | |
| JPH0346116B2 (fi) | ||
| JPH0772148A (ja) | ヒトｉｖ型コラーゲンのサンドイッチ酵素免疫学的定量用試薬 | |
| JPH04131092A (ja) | モノクローナル抗体とこれを産生するハイブリドーマ細胞株、およびこれを用いる免疫学的測定法 | |
| CS265494B1 (cs) | Myší lymfocytámí hybridom produkující protilátky proti e antigenu viru hepatitidy B (HBeAg) | |
| JPH01500722A (ja) | 膵臓α‐アミラーゼに対する抗体の産生及び診断への使用 | |
| JPH021555A (ja) | ヒトプロティンｓの免疫学的測定方法、それに用いる測定試薬及びキット |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH |