JPH03228691A - モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はアシディックファイブロブラスドグロウスファ
クターに特異的に反応するモノクローナル抗体、及び該
モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマに関する
。

（従来の技術） アシディックファイブロブラスドグロウスファクターは
、血管内皮細胞を含む中胚葉及び外胚葉由来細胞に対し
て細胞増殖促進活性を有する細胞成長因子であり（Ｄ、
　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、ネーチャー２４９巻、
１２３〜１２７頁）、近年では主要組織における血管新
生に関わる因子の１つである可能性が示唆されている。

血管、尿、体液、組織等に含まれるアシディックファイ
ブロブラスドグロウスファクターを正確に検出すること
は被検者の生理機能を知る上で有用であり、また悪性腫
瘍の診断にも有用である。

しかし現在までにアシディックファイブロブラスドグロ
ウスファクターを測定する手段としてはバイオアッセイ
法が知られているのみであり、アシディックファイブロ
ブラスドグロウスファクターに特異的な測定方法とは言
えなかった。

（発明が解決しようとする課題） 従って、本発明はアシディックファイブロブラスドグロ
ウスファクターを測定する手段としてアシディックファ
イブロブラスドグロウスファクターに特異的に反応する
モノクローナル抗体、及び該モノクローナル抗体を産生
ずるハイブリドーマを提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段） 本発明者は、ウシ脳から精製したアシディックファイブ
ロブラスドグロウスファクターを抗原として用いて該抗
原に特異的に反応するモノクローナル抗体を得て本発明
を完成した。

すなわち本発明は、アシディックファイブロブラスドグ
ロウスファクターに特異的に反応するモノクローナル抗
体及び該モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ
を提供するものである。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明のモノクローナル抗体の製造に使用するアシディ
ックファイブロブラスドグロウスファクターはウシ脳か
らゴスポダロウ゛イッの方法（メソッド・イン・エンザ
イモロジ−４７巻、１０６〜１１９頁（アカデミツク・
プレス社））により精製される。

該アシディックファイブロブラスドグロウスファクター
は分子量１６にダルトンであり、ｐＩ５〜７等の物理化
学的性質を有するものである。

上記の様にして得られるアシディックファイブロブラス
ドグロウスファクターを抗原として使用してマウス、ラ
ット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等を免疫してもよい
が、該アシディックファイブロブラスドグロウスファク
ターをニトロセルロース製の微粒子に吸着させたものを
抗原として使用することによりさらに効率よく免疫動物
を得ることができる。

該微粒子としては上記のニトロセルロースの他、セルロ
ースアセテート製のものを使用することができ、該微粒
子の粒径は通常１０〜５００μｍである。該微粒子に上
記のアシディソクファイブロブラスドグロウスファクタ
ーを結合させるにはインキュベーション等の手段を用い
ることができ、通常は微粒子の重量に対して１０分の１
程度のアシディックファイブロブラスドグロウスファク
ターを結合させればよい。その後に、上記の様にして得
られた微粒子結合アシディックファイブロブラスドグロ
ウスファクターを１００〜３００μｇ／ｍｌで生理食塩
水に懸濁して抗原懸濁液とすることができる。

上記の抗原懸濁液を被免疫動物に接種することにより、
アシディックファイブロブラスドグロウスファクターを
抗原として免疫された動物が得られる。例えばマウスを
免疫する場合には１００μｇ／ｍｊ！の上記微粒子結合
アシデイ・ノ゛クファイブロプラスドグロウスファクタ
ー懸濁液１００μｌ（アシデイックファイブロブラスド
グロウスフアクター１０μ 好ましくは３回復腔内投与し、その後に該懸濁液１０μ
β　（アシデイックファイブロブラスドグロウスフアク
ター１μ ５〜６回復腔内投与することにより効率良くマウスを免
疫することができる。

上記の様にして得られた免疫動物を、好ましくは最終免
疫後５日目に屠殺して、リンパ節細胞、肺細胞、胸腺細
胞、末梢血細胞等の抗体産生細胞を分離することにより
抗体産生細胞を得ることができる。例えば肺細胞を抗体
産生細胞として使用する場合には、膵臓を摘出して該膵
臓から免疫細胞を取り出した後に、例えばＲＰＭＩ’１
６４０培地（極東製薬工業■製）で数回洗浄することに
より抗体産生細胞を得ることができる。

細胞融合に使用するミエローマ細胞としてはマウス、ラ
ット、ウサギ、ヒトなどの種々の動物の細胞株を使用す
ることができる。例えばヒポキサンチン・グアニン・ホ
スホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠損
するミエローマを使用することができる。このようなミ
エローマは未融合の状態ではＨ（、ＰＲＴを欠くために
ヒポキサン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地
で核酸の合成ができずに死滅するが、リンパ球と融合し
ＨＧＰＲＴ活性を回復したハイブリドーマはアミノプテ
リンで核酸の生合成を阻害されてもヒポキサンチンを利
用して成育することができるのでハイブリドーマのみが
成育する。この様なミエローマ細目色としてはマウスミ
エローマＰ３−ＮＳ−１／１／Ａｇ４．１、Ｐ　３−　
Ｘ６３−Ａｇ３．６５３、ラットミエローマＹＢ２１０
等を挙げることができる。

また、ミエローマの栄養要求性に基づいてハイブリドー
マの選択を行うことも可能である。このようなミエロー
マとしてはコレステロール要求性のＰ３−ＮＳ−１／１
／Ａｇ４．１を挙げることができ（Ｍｙｏｋｅｎ、　Ｙ
、ら、インビトロセルラー　＆デイベロノブメンタル　
バイオロジー　２５巻、４７７−４８０頁）、細胞融合
後にコレステロールを欠損させた培地で培養することに
よりリンパ球細胞からコレステロール生合成能を受は継
いだハイブリドーマのみを選択することができる。

細胞融合はＲＰＭ１１６４０等の動物細胞培養培地中で
１０７〜１０８個のミエローマ細胞と上記の抗体産生細
胞を混合比１：５〜１：２０で混合して行う。細眸、融
合促進物質としては平均分子量２０００〜６０００のポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）やポリビニルアルコー
ノへセンダイウィルス等が使用され、通常２５℃で１５
分間の融合を行えばよい。特にＰＥＧを用いることが好
ましい。

細胞融合処理後の細胞からハイブリドーマを選別するに
は選択培地における選択的増殖を行えばよい。例えば、
細胞をＲＰＭ１１６４０等の培地で１０６個／ｍｆ！と
なるように希釈した後に、マイクロタイタープレート上
に１０４〜１０５細胞数／ウエルとなる様に各ウェルに
細胞を入れ、各ウェルに例えばＨＡＴ培地等の選択培地
、若しくは例えばコレステロール等の特定の栄養源を欠
損した選択培地と交換し、以後３日間隔で選択培地を交
換して培養すればよい。例えばミエローマ細胞としてＰ
３−ＮＳ−１／−／Ａｇ４．１を使用した場合にはコレ
ステロール欠損培地であるＲＤ５Ｆ等の培地で７〜１０
日間培養することによりハイブリドーマのみを選別する
ことができる。

アシディックファイブロブラスドグロウスファクターに
特異的なモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ
を選択するには、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
により以下の様にして行えばよい。

予めアシディックファイブロブラスドグロウスファクタ
ーを含む検体をポリスチレン、ポリビニール、ポリカー
ボネート、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、シリ
コン、デキストラン、セルロース、ガラス等からなるプ
レート、ビーズ、シート、ウェノペチューブ等の面相に
吸着させ、生理食塩水を用いて洗浄した後にモノクロー
ナル抗体を反応させる。再び洗浄した後に２次抗体とし
て酵素結合抗マウス抗体を反応させて、洗浄後に酵素の
発色基質と反応させて吸光光度計、蛍光光度計等で測定
すればよい。

例えば１ウエルあたり５０〜１１０００ｎ、好ましくは
１７０ｎＨのアシディックファイブロブラスドグロウス
ファクターを２μ二の５０％アセトニトリル・テトラフ
ルオロアセティツクアシッドに溶解したものをウェルに
滴下して吸着させた後に、モノクローナル抗体を含むハ
イブリドーマ培養上清１００μβ程度を反応させる。生
理食塩水を用いて洗浄した後に１μｇ／ｍｌのアルカリ
性フォスファターゼ結合マウスＩｇＧあるいはｔｇＭを
１００μｍ程度反応させればよい。反応は通常３７℃、
３０分間で終了し、その後に生理食塩水で洗浄シた後４
−ニトロフェニルフォスフェート等の発色基質１００μ
ｇを反応させて吸光度を測定して定量を行えばよい。

上記の様にして抗体産生細胞を選別した後、限界希釈法
でクローニングを行うことにより単一のハイブリドーマ
を起源とする抗体産生細胞を得ることができる。例えば
、抗体産生の確認された細胞の増殖しているウェルの細
胞を取り出し、ＲＤ５Ｆ等の培地１ｍ１２あたり１０個
となるように希釈し、ついで親株の一方であるミエロー
マ細胞を培地１ａｌｌ！あたり２〜５万個となるように
添加し、得られた細胞希釈液を１ウエルあたり１００μ
ｌ程度で分注して７〜１０日培養すると、単一細胞から
できたコロニーが通常１ウエルあたり約１個形成される
。この様なりローニングを２〜３回繰り返すことにより
、単一のハイブリドーマを起源とするモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマを得ることができる。

上記のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは培養フ
ラスコや培養瓶を用いてＲＤ５Ｆ培地で培養することが
できるが、マウス腹腔内等で培養してもよい。好ましく
は、ＲＤ５Ｆ培地で３７℃で培養する。該ハイブリドー
マはアシディックファイブロブラスドグロウスファクタ
ーに特異的なモノクローナル抗体を産生ずるものであり
、例えばハイブリドーマ５Ｇ４を例示することができる
。

これらのモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを培養
して得られるモノクローナル抗体は正常な細胞、悪性腫
瘍、血清、尿、体液等におけるアシディックファイブロ
ブラスドグロウスファクターの検出及び定量に有用であ
る。また、該モノクローナル抗体をアシディックファイ
ブロブラスドグロウスファクターの精製に使用すること
もできる。

（実施例） 以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが
、本発明はこれらの実施例に限定されることはない。

実施例１ ラン脳からゴスポダロヴイッ等の方法で精製アシディッ
クファイブロブラスドグロウスファクターを得た。該ア
シディックファイブロブラスドグロウスファクターは、
ｐ１５〜７、分子量１６．５．１４．５．１０．０．９
．５にダルトンの物理化学的性質を有しており、ソディ
ウムドデシルサルフエート・ポリアクリルアミドゲル電
気泳動の方法により単一物であることを確認した。

上記の精製アシディックファイブロブラスドグロウスフ
ァクター１０μｇを８０μｇのニトロセルロース微粒子
（日本ミリポアリミテッド社製のメンブレンを粒径約１
００μｍに粉砕したもの）にインキユベーション（室温
下３０分間）によって結合させた後、生理食塩水０．５
　ｍｆｆ１に懸濁して抗原懸濁液とした。

５〜７週令のマウス１頭あたり上記の抗原懸濁液５００
μ！　（アシデイックファイブロブラスドグロウスフア
クター１０μ で３同腹腔内投与を行った。その後、マウスの血清中の
抗体力価を測定しながら１〜２週間間隔でアシディック
ファイブロブラストグロウスファクターｌμｇ相当の抗
原懸濁液を５〜６回復腔内投与した。

最終免疫後５日後のマウスを屠殺して膵臓を摘出した後
に、膵臓内から免疫細胞を得てＲ　Ｐ　Ｍ　１１６４０
培地５０−で数回洗浄して免疫マウス膵臓細胞とした。

一方、マウスミエローマＰ３−ＮＳ−　１／１／Ａｇ４
．１を１０％牛脂児血清添加ＲＰＭ１１６４０培地で３
日間培養増加させたものを、細胞融合処理直前にＲＰＭ
Ｉ　１６　４　０培地で数回洗浄してマウスミエローマ
細胞を調製した。

上記の免疫マウス膵臓細胞（１０８個）と上記マウスミ
エローマ細胞（１０７個）を混合してＲＰＭＩｒ６４０
摘地で数回洗浄した後に培地を除去し、細胞融合剤とし
てＲＰＭＩ１６４０培地に５００μｇ／−の濃度に溶解
したＰＥＧ溶液を１−加えて２５℃で１５分間融合処理
を行った。

その後に選択培地（ＲＤ５Ｆ）で数回洗浄を行い、細胞
数が培地１ｍｌあたり１０６個になる様に上記選択培地
で希釈した。該希釈細胞浮遊液を９６ウエル・マイクロ
カルチャープレートに１ウエルあたり１００μβずつ分
注し３７℃で培養すると７〜１０日目からハイブリドー
マの増殖したコロニーが出現した。

抗体産生細胞の確認にはＥＬＩＳＡ法を用い、ポリスチ
レン製９６ウエル・マイクロテストプレート（コースタ
−社製）に１ウエルあたりアシデインクファイブロブラ
スドグロウスファクター８５μｇを１ｍｌの５０％アセ
ニトリル・テトラフルオロアセティツク了ジッドに溶解
した溶液２μβを滴下して吸着させた後に、上記のハイ
ブリドーマを培養した培養上ａ１００μｌを反応させた
。′＆浄後に１００μβのアルカリ性フォスファターゼ
結合抗マウスＩｇＧ抗体（１μｇ／ｍ）を反応させ、生
理食塩水で洗浄した後に１００μβの４−ニトロフェニ
ルホスフェート溶ｉ（Ｉ　Ｏ００μｇ／ｍｇ）を発色基
質として反応させ、４０５ｎｍの吸光度を測定して定量
を行った。

上記の様にして、抗体産生の確認された細胞が増殖して
いるウェルの細胞を取り出し、これを培地（ＲＤ５Ｆ）
１ｍあたり１０個となる様に調製し、ついで親株の一方
であるマウスミエローマ細胞を該培地１ｍｌあたり２〜
５万個となる様に添加した。この細胞希釈液を９６ウエ
ル・マイクロカルチャープレート　（コースタ−社製）
に１ウエルあたり１００μβずつ分注した後、３７℃で
７〜１０日間培養するとコロニーが１ウエルあたり約１
個の割合で出現した。上記のクローニングを２回繰り返
して単一のハイブリドーマを起源とするモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマが得られた。

上記の様にして得られたハイブリドーマのうちハイブリ
ドーマ５Ｇ４を工業技術院微生物工業技術研究所に平成
２年１月２３日に受託番号微工研菌寄第１１２１７号（
ＦＥＲＭ　Ｐ−１１２１７）として寄託した。

実施例２ 上記のハイブリドーマ５Ｇ４を培養して得られるモノク
ローナル抗体について、アシディックファイブロブラス
ドグロウスファクターに対する特異性を検討した。対照
として、アシディックファイブロブラスドグロウスファ
クターと類似の作用機序を有しておりアミノ酸配列が高
い類似性を有するベーシックファイブロブラスドグロウ
スファクターを使用し、交差反応性を有するか否かをド
ツトブロッティング及びウェスタンプロティングにより
検討した。

ニトロセルロース膜（シ二うイヒャー・シュエル社製）
に抗原であるアシディックファイブロブラスドグロウス
ファクターとベーシックファイブロブラスドグロウスフ
ァクター（各３００ｎｇ）、及び対照としてエンドテリ
アルセルグロウスファクター（ＥＣＧＦ、日本ベーリン
ガーマンハイム山之内和製、１５０μｇ）を吸着させ、
これにハイブリドーマ５Ｇ４の培養上清中にニトロセル
ロース膜を浸は込み、３７℃で６０分間反応させた。

その後に２次抗体である抗マウス・ウサギＩｇＧと３７
℃で６０分間、アルカリ性フォスファターゼ結合抗ウサ
ギ・ヤギＩｇＧと３７℃で６０分間それぞれ反応させ、
さらに合成基質ＮＢＴ及びＢＣＩＰ（共にシグマ社製）
を用いた酵素反応で発色させてドツトブロッティングを
行った。

その結果、ハイブリドーマ５Ｇ４の培養上清に含まれる
モノクローナル抗体はアシディックファイブロブラスド
グロウスファクターに反応性を示したが、ベーシンーク
ファイブロブラスドグロウスファクターには全く反応性
を示さなかった。

ウェスタンブロッティングは以下の様にして行った。予
め抗原としてアシディックファイブロブラスドグロウス
ファクター（１２５ｎｇ）及びベーシックファイブロブ
ラスドグロウスファクター（１２５ｎｇ）を２５℃で１
２０分間ソディウムドデシルサルフエート・ポリアクリ
ルアミドゲル上で電気泳動しｊ＝（２００ｍＡ、泳動バ
ッファーとして０．１　Ｍ　）リス−Ｉ　Ｍグリシンを
使用）。その後に泳動分離された抗原をニトロセルロー
ス膜（シュライヒャー・シュエル社製）にセミドライブ
ロット法により転写し、これをハイブリドーマ５Ｇ４の
培養上清に浸は込み、３７℃で６０分間反応させた。さ
らに上記の様にして２次抗体並びに３次元抗体を反応さ
せて、合成基質ＮＢＴ及びＢＣＩＰを用いた酵素反応で
発色させた。

その結果、ハイブリドーマ５Ｇ４の培養上清から得られ
たモノクローナル抗体はアシディックファイブロブラス
ドグロウスファクターの泳動パターン上に１６．５に、
１４．５に、１０．ＯＫ、及び９．５にのバンドを与え
、これらはアシディックファイブロブラスドグロウスフ
ァクター及びその分子ファミリーの分子量と一致した。

一方ベーシックファイブロブラスドグロウスファクター
の泳動パターン上には全く反応性を示さなかった。

以上の結果から、ハイブリドーマ５Ｇ４の培養上清に含
まれるモノクローナル抗体はアシディックファイブロブ
ラスドグロウスファクターに特異的な反応性を有するこ
とが明らかである。

実施例３ 上記の様にして得られたハイブリドーマ５Ｇ４の培養上
清から得られるモノクローナル抗体について生化学的性
質を検討した。方法としてはＥＬＩＳＡ法を用い、ポリ
スチレン製９６ウエルマイクロテストプレート　（コー
スタ−社製）に１ウエルあたりアシディックファイブロ
ブラスドグロウスファクター８５μｇを１ｍｊ７の５０
％アセトニトリル・テトラフルオロアセチイラクアシッ
ドに溶解した溶液２μｌを滴下して吸着させた後に、上
記のハイブリドーマ５Ｇ４を培養した培養上洛１０μｇ
反応させた。生理食塩水で洗浄後に１００μβのアルカ
リ性フォスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ　　・μ鎖抗
体（１μｇ　／ｍｊ’）を反応させ、生理食塩水で洗浄
した後に、１００μβの４−ニトロフェニルフォスフニ
ー）溶液（１０００μｇ／ｍ１）を発色基質として反応
させ、４０５ｎｍの吸光度で測定して、上記のハイブリ
ドーマを培養した培養上清中の抗体力＜、、マウスＩｇ
Ｇであることを確認した。マウスＩｇＧであることが確
認できたため、分子量約１６０にダルトン・電気泳動易
動度ｆａｓｔ　７、沈降係数７８の蛋白質であることが
明らかになった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）アシディックファイブロブラストグロウスファク
   ターに特異的に反応するモノクローナル抗体。
2. （２）アシディックファイブロブラストグロウスファク
   ターに特異的に反応するモノクローナル抗体を産生する
   ハイブリドーマ。