JPH02500004A - 非還元・非酵素的糖鎖形成蛋白に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 非還元・非酵素的糖鎖形成蛋白に対するモノクローナル抗体［発明の背景］ この発明は、ナシジナル・インステイテユート・オブ・ヘルス承認番号ＡＭ３２ ６６０号の援助を受けてなされた。政府はこの発明に対して何らかの権利を有す る。

ひとの真性糖尿病および動物疾患モデルにおいて観察される中枢的生化学変化は 、酵素の助けなしに起こる、蛋白質に対するグルコースの化学的付加［「非酵素 的糖鎖形成（ｇｌｙｃａｔｉｏｎ５Ｊ、以前は「非酵素的グリコジル化」と呼ば れた］である。これは、充分管理されていない糖尿病患者の血液におけるグルコ ース濃度の上昇によって起こる。それ故、特定の蛋白における非酵素的糖鎖形成 量は、糖尿病患者が彼または彼女の血糖濃度管理を良好に行っているか否かの指 標となり、また腎臓病、眼病、毛細血管病および神経病のような糖尿病にみられ る組織上の余病の進行を予知する上で価値を有し得る。

ヘモグロビン、アルブミン、フィブリノーゲン、フィブリン、低密度リボ蛋白（ ＬＤＬ）、水晶体クリスタリン、抹消神経蛋白、間質コラーゲンおよび■型基底 膜コラーゲンのような多数の蛋白が、正常者に較べて糖尿病患者で非酵素的糖鎖 形成を受ける度合が大きいことが知られている。糖鎖形成反応は、グルコースと ポリペプチドのＮ末端アミノ基またはペプチド鎖中のりジン残基のニブシロンア ミノ基間のシッフ塩基を形成する核付加を経て蛋白に対するグルコース結合をも たらす。最初の結合（アルドイミン結合を経て形成された不安定なグルコース付 加物）の形成は可逆的である。それ故、シッフ塩基はインビボで周囲のグルコー ス濃度を反映した平衡に達する。しかし時間とともにシッフ塩基の遅い化学的転 位（「アマトリ転位−・と呼ぶ）が起こり、安定なケトアミン（「アマトリ生成 物」と呼ばれる１−アミノ−１−デオキシ−２−ケト付加物）の生成をもたらす 。この反応の機構は、グリコジル化アマトリ生成物であるヘモグロビンＡ、ｃの 生成に関連する経路の研究で明らかにされた。

真性糖尿病の組織的余病に関連して、種々の蛋白の非酵素的糖鎖形成が腎臓病、 カタル形成、ニューロパシーおよびアテローム性動脈硬化の進行を含めた数々の 病理学的併発症に関連づけられた。例えば、ヘモグロビンの糖鎖形成は酸素に対 する親和性を変化させる。

水晶体クリスタリンの糖鎖形成は不透化を招き、粘膜炎症の形成に関与し得る。

コラーゲンの糖鎖形成はコラーゲン架橋の程度およびおそらく様式を変化させ、 組織の硬直を招く。ＬＤＬの糖鎖形成はこの蛋白の細胞への取込みおよび分解を 変化させる。フィブロネクチン、ラミニンおよび■型コラーゲンの非酵素的糖鎖 形成は、これら分子相互およびヘパラン硫酸との分子会合を変化させ、糖尿病の 余病にかかっている組織の基底膜の組成を変化させる可能性がある。

蛋白の非酵素的糖鎖形成の定量的測定法の開発は、主としてヘモ・グロビンにつ いてなされｆこ。適当に扱つにときの赤血球の半減期は比較的長い（約６０日） ため、グリコジル化へモグロビンアツセイは患者の血糖管理に対するそ反曲指標 を与えるが、これは前２−３力月の平均血漿糖濃度、２４時間尿糖濃度およびそ の他の代謝管理指数とよく一致する。

しかし、ヘモグロビン以外の蛋白のグリコジル化レベル定量も、血漿、尿または 生検組織中の他の容昌に入手し得る蛋白が種々の時間枠における血糖管理上の情 報を提供し得るため、重要である。例えば、アルブミンまたは低密度リボ蛋白の 半減期は３−５日であり、これら蛋白の糖鎖形成の測定は極めて短い期間のグル コース管理度を示し得る。他方、例えば皮ふコラーゲン（半減期約２−３年）の 糖鎖形成レベルの定量は、糖尿病患者についてグリコジル化ヘモグロビンの測定 で定め得るより著しく長期にわたるグルコース濃度調節能を示し得る。

アッセイは、成熟形ヘモグロビン（ヘモグロビンＡ）の総糖鎖形成レベルを測定 するようにデザインされている。このヘモグロビンＡの糖鎖形成フラクション（ 「ヘモグロビンＡＩ」と称する）は、β鎖末端バリン基および内部リジン残基の ニブシロンアミノ基がグルコースにより修飾され、正常ヘモグロビンＡ（非修飾 ヘモグロビンまたはヘモグロビンＡ。）より大きな陰電荷をもつ。他方、非酵素 的糖鎖形成の測定に関する別の臨床的基質であるヘモグロビンＡ、ｃは、β鎖末 端バリン残基のみがケトアミン結合によりグリコジル化されたヘモグロビンＡか らなる、ヘモグロビンＡ、のサブフラクションである。

ヘモグロビンの非酵素的糖鎖形成レベル測定に関する免疫学的方法は、１″５■ 標識抗体を用いたラジオイムノアッセイにより試みられている。これらの方法の うち最初のものは、グリコジル化生成物がひつじ赤血球溶解物中に証明されない との知見に基づいている。

これは、ひつじヘモグロビンがヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端グリコジル化を可能に する「ジホスホグリセラート・ポケット」を欠如するためであり得る。それ故、 Ｊ、ディピッド等、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトログ−３８巻３ ２９頁（１９７８年）が記載するように、ひつじはひとヘモグロビンＡ、ｃを非 自己と認識し、それに対する抗体を産生ずる。しかし、ポリクローナル抗体は発 生が難しく、またそれはヘモグロビン、Ａ＋ａおよびヘモグロビンＡ＋ｂ（Ａ＋ ｃ種と区別されるヘモグロビンＡ、のクロマトグラフィー安定成分）と交差反応 する。またＡｒｃ抗血清は、抗体力価の相当量の減少とＬ）うぎせいを払ってア ガロース結合ヘモグロビンＡ０による反復吸収を受けなければならない。ひと、 Ａ＋ｃに対する抗体かいぬおよびマウスヘモグロビンＡ＋ｃと充分に反応しない との知見は、抗体の立体的適合性が糖分子以上のものを含みおそらくグルコース 修飾部に隣接する蛋白の表面特性にまで拡がっているとの可能性を提する。

Ｌ、に、カーチス等、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション ７２巻１４２７頁（１９８３年）は、非酵素的糖鎖形成マウス低密度リボ蛋白と 反応するマウスモノクローナル抗体の生成を記載している。しめ化、これらの著 者は糖尿病組織に天然にみられる非還元付加物（不安定シッフ塩基またはアマト リ生成物）に対するモノクローナル抗体の産主に成功しなかつ１ニため、蛋白上 のグルコース付加物を最初に水素化はう素ナトリウムまｆ二は水素化シアノはう 素ナトリウムで還元して免疫原性ヘキソースアルコール（グルシトール・リジン ）にする必要かあった。それ故、抗体との反応性を得るためには、試料中の標的 蛋白をも同様な方法で還元してグルシトール・リジン残基を生成させる必要があ った。特に、蛋白上のリジンの種々のグリコジル化ニブシロンアミノ基の検出が インビトロでの化学還元剤により選択的に還元し得るものに限られているそれ故 、血液およびリンパ液のような生理学的流体に含まれる蛋白の如き蛋白類の非酵 素的糖鎖形成により生成する非修飾シッフ塩基またはアマトリ・グルコース付加 物を認識しそれと選択的に反応するモノクローナル抗体の出現が要望されている 。

［発明の概要の記載コ この発明は、還元されていない、非酵素的糖鎖形成血漿蛋白上のエピトープに結 合し、対応する非糖鎖形成血漿蛋白に対する交差反応性を実質的にもたないモノ クローナル抗体（ＭＣＡ）を提供するも、のである。この発明はまた、 （ａ）ｌｌｔｌｉ乳類Ｂリンパ球を、非還元・非酵素的糖鎖形成血漿蛋白で免疫 し、 （ｂ）免疫したＢリンパ球を採取し、 （ｃ）採取した上記Ｂリンパ球を悪性哺乳類Ｂリンパ球と融合させてハイブリド ーマを形成し、 （ｄ）上記ハイブリドーマから、非還元・非酵素的糖鎖形成血漿蛋白上のエピト ープに結合するとともに対応する非糖鎖形成血漿蛋白に実質的に交差反応性をも たないモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを選択し、 （ｅ）上記選択したハイブリドーマをクローン増殖させることからなる方法によ り製造されたハイブリドーマにも関するものである。

この発明の１つの実施態様によると、非還元・非酵素的糖鎖形成はっかねずみ血 しょう蛋白を含有する免疫原でマウスまたは他の哺乳類を免疫して、免疫哺乳類 の膵臓からＢリンパ球を回収する。これらのリンパ球ははつかねずみ骨髄腫細胞 と融合させハイブリドーマを生成し得る。所望のＭ　ＣＡ　、例えば免疫化のた めに使用した非還元・非酵素的糖鎖形成プラズマ蛋白と対応非糖鎖形成プラズマ 蛋白との鑑別反応を示すものの存在について、ハイブリドーマまたは環境育成培 地を試験し得る。好ましいハイブリドーマは、非糖鎖形成と、トランスフェリン 、アルブミン、フィブロネクチン等のような非還元・非酵素的糖鎖形成形のひと 血清またはプラズマ蛋白とを鑑別する能力を示すＭＣＡ類を分泌する。

従って、この発明により、非糖鎖形成血しょう蛋白との交差反応性から実質的に 含まない程度に、未還元、非酵素的糖鎖形成面しよう蛋白と対応非糖鎖形成血し ょう蛋白との判別反応性を示すモノクローナル抗体を提供する。例えば、この発 明の上記ハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体の判別スクリー ニングに使用した固相酵素免疫測定法（エリザ）によると、非還元・糖鎖形成蛋 白に対比した対応非糖鎖形成の正常蛋白の反応の際、少なくとも３５％、好まし くは少なくとも７５％吸収単位（Ａ）を増加するモノクローナル抗体は、これら の蛋白種に関する有用な差異識別を示し得る。

さらに、この発明のＭＣＡ類は、第２の糖鎖形成／非糖鎖形成蛋白対の非還元、 糖鎖構成物と選択的に結合し得、この結合は、免疫化段階（ａ）で使用されｆ二 最初の糖鎖形成蛋白への結合より、対応非糖鎖形成の第１の蛋白との比較で、よ り選択的であり得る。例えば、はっかねずみ糖鎖形成蛋白を用いた免疫化によっ て生成したＭＣＡは、ひと糖鎖形成蛋白への結合に関してより高い程度の選択性 を示し得る。

血しようまたは血清蛋白に関してここで使用する場合、「非還元」の語は、イン ビトロまたはインビボでプラズマ蛋白が非酵素的糖鎖形成された際に形成される 、シッフ塩基またはそれらの対応ケトアミン生成物がインビトロでの別の化学的 還元法、例えば、グルコース蛋白結合の安定性を増加する目的の還元を受けてい ないことを意味することを指す。従って、この発明のハイブリドーマ類は、血し よう蛋白の初期グルコース修飾に関連したエピトープ類を認識し得る抗体を生成 する。エル・ケイ・カーチスら、上記文献の記載と比較すると、糖アルコール形 （グルシトールーリシノ）への「天然」グルコース蛋白添加物の還元は、抗体発 生または非酵素的蛋白糖鎖形成の測定に必要ではない。従って、インビトロで生 成された免疫原性蛋白の定性または定量レベルでの還元はこの発明のハイブリド ーマの生成またはそれによって生成されるモノクローナル抗体の特異性における ファクターではない。

最後に、得られた非還元・非酵素的糖鎖形成蛋白に対するこの発明のＭＣＡ類の 結合の範囲は、標的蛋白上の糖鎖形成部位の数に比例して増加する。この性質は 、血しよう蛋白の糖鎖形成の範囲および存在を検出するＭＣＡの能力を促進する 。

この発明のモノクローナル抗体は、本来、非酵素的糖鎖形成蛋白と反応するそれ らの能力に関して特徴づけられるが、これらのモノクローナル抗体は、組織また は唾液、リンパ液、尿、精液０、目の流体等のような他の生理学的流体に存在す る非酵素的糖鎖形成蛋白と選択的に結合する能力を示すと考えられる。従って、 この発明は、上記試料を、上記非還元・非酵素的糖鎖形成蛋白上のエピトープと 結合するこの発明のモノクローナル抗体と反応させることから成る、血液または 尿の試料のような組織または生理学的流体試料の中の非還元・非酵素的糖鎖形成 蛋白の存在を検出する方法に向けられており、ここで上記ＭＣＡは対応非糖鎖結 合血清蛋白との交差反応性を実質的に含まないものである。

ＭＣＡ蛋白複合体の存在は、ＭＣＡ蛋白複合体を、検出可能なラベルに結合させ た第２抗体と反応させることから成る測定法によって決定し得、その抗体は、Ｍ ＣＡ上の部位に結合する。酵素標識される第２抗体を使用する固相酵素測定法も 細部をここで以下に詳細に示す。

［発明の詳細な説明］ ［モノクローナル抗体コ モノクローナル抗体を生成するための一般的な技術は、免疫哺乳類Ｂリンパ球と 悪性哺乳類Ｂリンパ球との融合に基づいている。例えば、膵臓リンパ球は、骨髄 の第−期腫瘍である悪性細胞（骨髄腫）と融合し得る［シー・ミルスティン、サ イエンティフィック・アメリカ、２４３巻、６６頁（１９８０年）］。それらの 方法は、クローン的に拡大して一連のハイブリッドセルラインを生じ、セルライ ンの各々は単一のハイブリドーマまたはクローンから得られる、融合細胞のハイ ブリッドまたはハイブリドーマを生成する。

各ハイブリドーマは、リンパ球および骨髄腫セルラインの両方の特性を有する。

抗原としてひつじの赤血球細胞で免疫した動物から採取したリンパ球のように、 ハイブリドーマ類は抗原に反応性を有する抗体（免疫グロブリン）を分泌する。

さらに、骨髄腫セルラインのように、ハイブリドーマは不死である。ワクチンを 接種した動物から得た抗血清は同一のものが再現され得ない抗体の変動性混合物 であるのに対して、ハイブリドーマによって分泌された単一型の免疫グロブリン は、抗原上の１であってしかも唯一の抗原決定基、多重性抗原性分子内構造を有 する複合体分子、または決定基類（エピトープ類）に特異的である。例えば、抗 原が糖鎖形成蛋白である場合、エピトープは、グルコース−アミノ酸結合を有す る多くの分子内構造のうちの１つであり得る。このため、単一抗原で生じたモノ クローナル抗体は、それらの生成を誘導した決定基によって互いに識別し得る。

しかしながら、特定のクローンによって産生された全ての抗体は、同一である。

されに好ましいハイブリドーマセルライン類は限りなく再現し得て、インビトロ またはインビボで容易に増殖され、さらに最良に高い濃度でモノクローナル抗体 を産生じ得る。

１、抗原 この発明によると、Ｂリンパ球前駆体を哺乳類に免疫するのに使用し得る抗原は 、広い範囲の非還元・非酵素的糖鎖形成血液プラズマ蛋白から選択し得る。上記 蛋白はラミニン、アルブミン、免疫グロブリン、トランスフェリン、低密度リボ 蛋白、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、プラスミノーゲン、プラスミンお よびそれらの混合物を包含する。例えば、非還元・非酵素的糖鎖形成総血清蛋白 は抗原標品として使用され得る。

種々の蛋白由来の非酵素的糖鎖形成蛋白の生成のための一般的な方法は、すなわ ち、ジェイ・エフ・タージョンらによる、ダイアベイツ、３４巻、４７７頁（１ ９８５年）、（その開示をここに引用して本明細書に組み込む）の文献によって 詳しく説明されている。典型的な方法によると、Ｄ−グルコースを用い、ｌＯ〜 ２０日間、穏やかな条件下、好ましくは有効量のプロテアーゼ阻害剤および防腐 剤の存在下で、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のような生理学的緩衝塩溶液中で蛋 白の混合物または蛋白類をインキュベートする。糖鎖形成蛋白を塩析によって単 離し、所望の濃度にするために生理学的塩。

溶液中に再懸濁し、さらにそれらの有効量を、哺乳類を免疫するのに使用し得る 。追加免疫（ブースティング）によって、免疫原に反応性を有する抗体を産生ず る哺乳類Ｂ細胞の数を増加させるのが好ましい。方法は、インビトロでの哺乳類 リンパ球の免疫に対しても有用である。

非還元・非酵素的糖鎖形成はっかねずみ血清蛋白はこの発明に使用するのに好適 な免疫原であるが、ひと、羊、やぎ、うさぎ等から得られたもののような、他の 非還元・糖鎖形成哺乳類蛋白も使用し得る。上記蛋白の天然に得られたかまたは 化学的に合成された免疫原性フラグメント類を免疫プロトコールでも使用し得、 さらに上記フラグメントは「非還元・非酵素的糖鎖形成プラズマ蛋白」の語の範 囲内に包含されることを意味する。

２、体細胞 抗体を産生ずるための潜在力を有する体細胞、および特にＢリンパ球はＢ細胞骨 髄腫系との融合に適している。有糸分裂をしているそれらの抗体産生細胞は、優 先的に融合する。免疫動物のリンパ節および膵臓は、この発明の融合系で使用す るのに好適なリンパ器官である。一旦免疫したまたは過免疫した動物を抗体産生 リンパ球の源として使用し得る。マウスおよびラットのリンパ球は、下に記載し たマウス骨髄腫系とかなり高い比率の安定した融合を生じる。しかしながら、う さぎ、ひと、霊長類およびかえるの細胞の使用も可能である。好ましい実施態様 として、過免疫マウスの膵臓細胞を使用して融合細胞をハイブリッドまたはハイ ブリドーマにする。

３、骨髄腫細胞 特定化骨髄腫セルラインは、ハイブリドーマ産生融合法［ジー・コーレルおよび シー・ミルスティン著、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー、６巻 、５１１頁（１９７６年）］で使用するためにリンパ腫瘍から分化させた。セル ラインは、ハイブリドーマの成育を支持する特定の選択培地での成育が不可能な 酵素欠失骨髄腫を使用することによって、非融合でしかも同様に際限なく自己増 殖する骨髄腫細胞の中からの融合ハイブリドーマの選択を容易にするように作っ た。さらに、軽または重免疫グロブリン鎖を産生させない骨髄腫セルラインまた は抗体分泌機構を欠くものを使用し得る。

セルラインの選択の３番目の理由は、融合におけるそれらの適性および効率にあ る。

数種の骨髄腫セルラインハ、Ｐ３／Ｘ６３−ＡＣ３，６５３、Ｐ３／ＮＳＩ／１ −Ａｇ４．１（ｒＮＳ−ＩＪ）、Ｓｐ２　／　０−Ａｇ１４およびＳ＋９４１５ ．ＸＸＯ，ＢＵ、１を包含する融合細胞ハイブリドーマの産主に使用し得る。Ｐ 　３／Ｘ　６３−Ａｇ３およびＰ３／ＮＳｌ／１−Ａｇ４．１セルラインは、コ ーレルおよびミルスティンにより［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロ ジー、６巻、５１１頁（１９７６年）Ｌおよびノエイー・カルネイらによって［ ジャーナル・オブ・イムノロジー、１２３巻、１５４８頁（１９７９年）コ記述 されている。ジュールマンら［ネイチャー、２７６巻、２６９頁（１９７８年） ］は、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４骨髄腫系を分化させた。

５１９４１５．ＸＸＯ，ＢＵ、Ｉ骨髄腫系は、ドロウブリッジ［ジャーナル・オ ブ・エックスペリメンタル・メディシン、１４８巻、３１３頁（１９７９年）］ による文献で報告された。

４、融合 抗体産生膵臓またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞とのハイブリッドを発生させる方 法は、通常、細胞膜の融合を誘導する１つの剤または複数の剤の存在下で、体細 胞を骨髄腫細胞と混合することから成る。同一の種の動物が、融合法で使用され る体細胞および骨髄腫細胞の源としての役割を果たすことが好ましい。融合法は 、コーレルおよびミルスティンによりネイチャー、２５６巻、４９５頁（１９７ ５年）およびヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー、６巻、５１１頁 （１９７６年）、およびガフターらにより、ツマチック・セル・アンド・モレキ ュラー・ジェネティックス、３巻、２３１頁（１９７７年）に記述されている。

それらの研究によって使用された融合誘導剤は、それぞれセンダイウィルスおよ びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であった。

５、クローンの単離、および抗体検出および生産一般に、融合細胞ハイブリッド の選択は、ハイブリドーマの成育は補助するが、正常状態で制限なく分割する非 融合骨髄腫細胞の育・成は妨げる培地で、細胞を培養することによって行なわれ る。この発明の実施例では、ヒボキサンチン・ホスホリボシル・トランスフェラ ーゼ（ＨＰＲＴ″″）を欠く骨髄腫細胞類を使用した。これらの細胞類は、ＨＰ ＲＴ陽性表現型の膵臓細胞を用いたために、融合細胞ハイブリッドが生存する培 地である、ヒボキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）培地で選択さ れる。遺伝子的に適格性を有するハイブリッドの成育を支持する培地で選択し得 る異なった遺伝的欠失（例えば、他の酵素欠失、薬物感受性等）を有する骨髄腫 細胞の使用も可能である。

融合細胞ハイブリッド類を選択的に培養するのに数週間を要し得る。この時点の 初期に、所望の抗体を産生ずるこれらのハイブリッドをクローン化し、増殖させ るために同定することが必要である。

抗体産生ハイブリッド類の検出は、文献［アール・ケネット、ティー・マッカー ンおよびケイ・ベツチトル（編集者）、モノクローナル・アンティボディーズ、 ハイブリドーマズ、「ア・二ニー・ディメンション・イン・バイオロジカル・ア ナリシス、プレミュー・プレス、ニューヨーク（１９８０年）、３７６〜３８４ 頁に］に記述されている、間接免疫蛍光法、固相酵素免疫測定法およびラジオイ ムノアッセイ技術を包含する、数種の標準アッセイ法の任意の１つによって達成 され得る。

いったん、望ましい融合細胞ハイブリッドを選択し、個々の抗体産生セルライン にクローン化すると、２つの標準法で各セルラインを増殖し得る。最初の融合の ための体細胞および骨髄腫細胞を提供するのに使用されたタイプの組織適合性動 物にハイブリドーマの試料を注射し得る。注射した動物は、融合細胞ハイブリッ ドによって産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する悪性腹水または巨大 腫瘍を発生する。血清または腹水のような、動物の体液を抜いて高濃度のモノク ローナル抗体を提供し得る。別法として、インビトロで、実験室培養容器内で、 個々のセルラインを増殖し得る。高濃度の単一特異的モノクローナル抗体をも含 有する培地をデカンテーション、ろ過または遠心によって採取し、そ２−らから 抗体を単離し得る。

６、モノクローナル抗体の特性 差別的固相酵素免疫測定法によって、糖鎖形成蛋白に関するこの発明のモノクロ ーナル抗体の結合特性も決定し得る。この測定法によって、糖鎖形成蛋白まｆニ は非糖鎖形成蛋白対照の既知量を試験プレートのウェルで物理的に固定化し、例 えば、得られたハイブリドーマ由来の消費培地の一部を添加することによって、 過剰のモノクローナル抗体と結合させる。適当なインキュベーション期間の後、 プロティン−ＭＣＡ複合体を洗浄して非結合ＭＣＡを取り除いてから、フルオレ スセインイソチオシアネートまたはペルオキシダーゼのような検出し得るラベル と結合させた、市販抗マウス抗体を用いて結合ＭＣＡを検出する。ペルオキシダ ーゼ結合の存在は、０−フェニレンジアミンのようなデベロッパーとペルオキシ ダーゼを結合することによって吸収単位として比色定量的に測定し得る。全ての 場合、糖鎖形成蛋白対非糖鎖形成対照とを観察した吸収値（Ａ）での差異は、糖 鎖形成部位と結合し！ニエビトープと結合するための、得られたＭＣＡの能力の 比較測定法を提供する。

差別的エリザ法も、糖尿病であることが既知か推定される哺乳類の生理学的流体 に存在する蛋白または蛋白類の糖鎖形成の範囲を検出し得る。例えば、試験プレ ートのウェル中での場合、血液血清のような哺乳類から抜いた体液の試料を固定 化し得、さらにこの発明のＭＣＡとのそれ自身の結合の範囲は、非糖尿病対照哨 乳類由来の体液の固定化試料によって決定し得る。標的蛋白の糖鎖形成の相対的 度合は、関連組織の病理学の範囲に経験的に相関し得る。

以下の詳細な実施例を挙げて本発明をさらに説明する。

施　１．糖鎖形成蛋白質抗原の調製 マウス非酵素的糖鎖形成蛋白質を産生じ、抗原として用いてＢａ１ｂ／ｃマウス における抗体産生を刺激し１；。２つの別々のマウス蛋白質調製物を用いて、マ ウス非酵素的糖鎖形成ラミニンおよび非酵素的糖鎖形成総血清蛋白質を免疫化し た。

分子量８５００００の細胞外基質蛋白質であるラミニンを、まずマウスＥＭＳ腫 瘍からニス・エル・パルムらの方法［ジエイ・セル・パイオル、９６巻、１２１ ８頁、１９８３年］により精製した。

精製したラミニン２５πｇ（１ｒ＝９／　ｍｌりを次いで３７℃で１２日間、保 ・与剤として１ｍＭアジ化ナトリウムを含有するリン酸塩緩衝生理的食塩水（Ｐ ＢＳ、ｐＨ７，４）中５００ｍＭ、Ｄ−グルコースを用いてインキュベートした 。プロテアーゼ・インヒビターを添加して以下の最終濃度を得ることにより、蛋 白質を蛋白質分解性崩壊からこの長期間のインビトロ・インキュベーションにわ たり保護した。最終濃度：　３７２．２ｆｆｉ９／Ｃ二ナトリウム・エチレンジ アミン四酢酸塩（Ｎａｔ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ）、３４　、８　ｚｇ／Ｑフェニルメ チルスルホニル・フルオライド（ＰＭＳＦ）、Ｑ　、　７　ｘｇ／ｒｔヘプスタ チンＡ、０．５ｚ９／Ｑレウペプチンおよび４．５トリプシン・インヒビタ一単 位／耐アプロチニン［全てシグマ・ケミカル・カンパニイ、ミズリイ州セントル イス］。１２日のインキュベーションの後、未反応性糖類、アジドおよびプロテ アーゼ・インヒビターをＰＢＳ緩衝液２ｅを６回変えながら透析して除去した。

第２の抗原調製物はマウス−糖鎖形成総血清蛋白質からなる。これは、９匹のＢ ａ１ｂ／ｃマウス（１６６週令雄または雌）の心臓穿刺により血液を得、これを 室温で３０分間凝固させ（温和な溶血を伴う）、次いで血清を集めることで調製 した。次いで、前記しｆ二ように血清を５００ｍＭＤ−グルコースおよびプロテ アーゼ・インヒビターと共にインビトロでインキュベートして、非酵素的糖鎖形 成総血清蛋白質を得た。

非酵素的糖鎖形成ラミニン２５μ９をＰＢＳ緩衝液０　、１　ｐｒＱに懸濁し、 フロイントコンプリードアシュバンド０　、１　ｚＱと混合し、８週令の５匹の Ｂａ１ｂ／ｃマウスの各々に腹腔内注入（ｉ、ｐ、）した。非酵素的糖鎖形成総 血清蛋白質を非酵素的糖鎖形成ラミニンと同様にＰＢＳ中に懸濁して投与用に調 製し、ラミニンについて前記したような５匹の他のマウスにｉ、ｐ、注入しに。

２２および７６日回しおいて、フロイントインコンプリードアシュバンド中非酵 素的糖鎖形成ラミニン（ｇＬＭＮ）２０μ９の第２注入を、非酵素的糖鎖形成ラ ミニンの第１注入を与えたマウスに対し、ｉ、ｐ、投与で行、なった。同様に、 非酵素的糖鎖形成総血清蛋白質（ｇＴＳＰ）２５μ９をこれらの時点においてフ ロイントインコンプリードアシュバンド中にて、初期ｇＴＳＰ注入を与えたマウ スにｉ、ｐ、投与しｆこ。融合の３日前（８３日）、第２免疫化について前記し たようにマウスにｇ　Ｌ　Ｍ　ＮまたはｇＴ　Ｓ　Ｐ　２５μりをｉ、ｐ、注入 した。

Ｂ、ハイプリーーマ ２つの別々の融合によりハイブリドーマを製造した。一方の融合はｇＬＭＮ−免 疫化マウスのひ臓をＰ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ　４．１マウス・メラノーマ細胞と 共にインキュベートすることで行ない、他方の融合はｇＴｓＰ−免疫化マウスの ひ臓をＰ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４．１細胞と混合することからなる。融合は、３ ５％（重！／容量）ポリエチレングリコール−１０００の存在下にひ臓細胞：メ ラノーマ細胞＝１０＋１の比率（一方のび臓はｌＸｌ０’細胞が得られ、ｌＸｌ ０’のＮＳＩメラノーマ細胞と混合）で行なった（シイ・ガルファーら、ネイチ ャー２６６巻、５５０頁、１９７７年記載、この開示を本明細書に含める）。次 いで細胞調製物を１つのウェル当り２Ｘ１０６細胞で、２０％（Ｖ／Ｖ）ウマ血 清含有標準ＨＡＴ培地（１２ｍＭヒポキサチン、９μＮ１アミノプリテンおよび ８ｍＭチミジン含有ダルベツコ・ミネラル・エッセンンヤル・メジアム）ｌＲ１ ２９２４個のウェル組織培養プレートに塗布した。これにより、ｇＬＭＮ−免疫 化ひ臓ＸＮ５−１メラノーマ細胞を有する７２個のウェル（融合体１〜７２と命 名）およびｇＴＳＰ−免疫化ひ臓×Ｎ５−１細胞を有する７２個のウェル（融合 体７３〜１４４と命名）が得られた。

３日後、各ウェルの５０％の培地を取り出し、排棄し、等量の新鮮な２０％ウマ 血清含有ＨＡＴ培地を入れ換えた。次いで細胞をこの方法で融合後６．９および １２日回し供給し、１２日回し取り出した消耗培地を、以下に記載のような特異 的抗体産生のスクリーニングのために凍結保存した（−１０℃）。初期融合後１ ４日において、以下に記載の識別スクリーニング法で最も良好な増殖を示し陽性 であった融合細胞をクローン増殖させ、細胞を、２０％血清および１０％（ｖ／ ｖ）正常ひ臓細胞順化培地含有ＨＡＴ培地０．２ｉＩ２（シイ・ガルファーら、 メソッド・エンザイモル、７３巻、１〜４６頁、１９８１年）中１つのウェル当 り１つの細胞の濃度で９６ウエルのマイクロタイタープレート内に塗布した。次 いで３週間にわたり増殖を顕微鏡で観察し、ウェルを１つのウェル当り１つのク ローンを示した特異的抗体産生についてスクリーニングのために選別した。各ク ローンは、当初の融合体番号（すなわち、１〜１４４）の後にダッシュと該クロ ーンを産生したマイクロタイタープレートのウェルの文字および番号表示を続け ることにより命名した。例えば、１Ｏ−ＣＩＯはマイクロタイタープレー−トの ウェルＣＩＯにおいてクローン・セルラインを産生じた１０番目の融合ウェルを 示す（また、ｇＬＭＮが抗原であることを示す）。さらに例えば、８３−ＤＩＯ は８３番目の当初の融合ウェル（ま？＝、ｇＴＳＰが抗原であること）およびこ のマイクロタイタープレート（ＤＩＯ）における該クローンの位置を示す。

Ｃ１識別スクリーニング法 付加的にクローン増殖させ１；クローンの選択は識別酵素結合免疫吸着剤スクリ ーニング法の結果に基づくもので、これは、その非酵素的糖鎖形成免疫原（ｇＬ ＭＮまたはｇＴＳＰ）に対し良好な抗体反応を示すがインビトロにおいて非醇素 的糖鎖形成されない蛋白質調製物（各々対照ラミニンおよび対照総血清蛋白質と 呼ばれるｃ　Ｌ　Ｍ　ＮまたはｃＴｓＰ）に対し良好な抗体反応を示さないクロ ーンを検出するものである。非糖鎖形成対照蛋白質は非酵素的糖鎖形成蛋白質に ついて前記し几と同様に処理し乙。乙だし、インキュベーション混合物にグルコ ースを全く添加しなかった。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイのために、５μ９の各抗原またはその各対照蛋白質をＰ ＢＳ緩衝液１ｊ１１２からつくり、９６ウエル・ポリスチレン・マイクロタイタ ープレートの各ウェルに０　、　Ｉ　ＭＱづつ加えＬ０プレートに圧力感受フィ ルムを覆い、３７℃で一夜インキユベートし使用前、プレートはＰＢＳ−ツイー ン含有ヌック・イムネ・ウオツシｓ１２を用い５回洗浄した（これは、ｌ０ＸＰ ＢＳ２００Ｊ！ρをＮａＣｆｆ４２．４９と混合し、蒸留水で容ｆｆ１２１２に し、ポリオキシエチレン・ソルビタン・モノラウレート（ツイーン２０）を加え 、ｐＨｓ、ｏに調節して製造）。ウェル中に残ったＰＢＳ−ツイーンは該プレー トから吸収紙に吸い取って乾燥した。

所定のクローン化細胞から取り出した消耗培地１００μｇを次いで融合体１〜７ ２由来の各クローンに対する固定化ｇ　Ｌ　Ｍ　Ｎ抗原またはｃ　Ｌ　Ｍ　Ｎ蛋 白質を含有する各ウェルに加えた。同様に、融合体７３〜１４４の各クローンか らの消耗培地１００μＣを固定化ｇＴＳＰま几はｃＴ　Ｓ　Ｐ含有ウェル各々に 加えｆ二。次いで、プレートを、サーキュラ−・プラットホーム・シェイカーで 穏やかに振とうさせながら３７℃で２時間インキュベートした。２時間後、ＰＢ Ｓ−ツイーンで前記したように５回洗浄した。ＰＢＳ−ツイーン中ｌ：５００希 釈ペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウス・イムノグロブリン（ＩｇＡｌ　１ｇＧお よびＩｇＭ、重鎖または軽鎖特異性）（クーパー・バイオメディカル、ウェスト ・チェスター、ＦＡ）１００μＱを次いでマイクロタイタープレートのウェルに 加えた。プレートを前記したように３７°Ｃて２時間インキュベートしｆ：。け 識抗体の２時間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳ−ツイーンで５回洗 浄後、基質溶液１００μＱを各ウェルに加えｒこ（基質溶液は３０％過酸化水素 ５０μＱおよびＰＢＳ−ツイーン５０ｍ！１２中オルソ・フェニレンジアミン２ ０ＪＩ９からなる）。基質溶液の添加の後約５〜１０分後、陽性ウェルの溶液は 褐色に変わり始めた。ＩＣｌ−１５分後（ウェルが完全に褐色に変わる前）、２ ．５ＭＨ！Ｓ０４５０μＣを各ウェルに加えて発色反応を停止させた。次いで、 プレートをマイクロ・エライザ・リーダーにより４９０ｎｍで読み取った。糖鎖 形成蛋白質またはその正常相対物を産生じない非関連ハイブリドーマ・クローン の順化培地を含む対照ウェルを用い、リーダーを調節して可能な限り０に近づけ た。その結果、糖鎖形成抗原を強く認識するＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩＢＭ分泌ハ イブリドーマ・クローンをこのアッセイにおいて高い吸収率の読み取りで検出し た（糖鎖形成抗原ｇＬＭＮまたは８１５０％以上）。

Ｄ、結果 前記した識別スクリーニング法で分析すると、１４４個の塗布融・合ウェルのう ち、２１個の融合生成物がまず十分に増殖し陽性結果が得られたハイブリドーマ を産生じ７＝（ｇＬＭＮについては１３で、ｇＴＳＰについては８）。これら２ １個の融合生成物の１１個は良好に増殖しつづけ、微生物汚染を示さず、クロー ン化のために選択した（ｇＬＭＮ融合体については番号２．１Ｏ１２６および４ ９、ｇＴＳＰ融合体については番号７４．８０．８３．８４．８８．８９および １００）。数個の融合ウェルはクローンを生成しなかっ几（番号２．４９．８８ および１００）。残りの融合体の各々について、９６個の各ウェルから得られた クローン数は変化した（合計３個のクローン（融合体番号２６）〜合計２９個（ 融合体番号８４）の範囲）。

良好な増殖を示し続けたクローンを前記識別スクリーニング法でスクリーニング すると、ｇＬＭＮ融合体については合計４個の陽性ハイブリドーマが検出され（ 第１表）、ｇＴｓＰ融合体については１９個の陽性ハイブリドーマが検出された 。

第２表 第１表および第２表に掲げたハイブリドーマの消耗培地は、前記したＥＬ　Ｉ　 ＳＡアッセイを用い糖尿病および正常ラットの血しょうに対しテストした。アッ セイにおけるテスト抗原は２匹の糖尿病ラットのいずれかの血しょうである（試 料番号ｌまたは試料番号２）。

年令を合わせた体重１００−１２５９の雄性ルイスラットをシモンセン・ラボラ トリイから購入しくギルロイ、ＧＡ）、１８時間の絶食後にストレプトシトシン の注入により糖尿病にしｆ二（アップジョン・カンパニイ、カラマズー、Ｍｌ） 。ストレプトシトシンをクエン酸緩衝液（ｐＨ４，５）中１．３９％溶液に調製 し、動物の体重１にｇ当りストレプトシトシン６５Ｈの用量を尾静脈注入により 静脈内投与しｆ；。次いで、生理食塩水中３０％（ｗ／ｖ）グルコース溶液を腹 腔内注入した。対照動物を前記と同様に処理した。ただし、動物にストレプトシ トシン非含有クエン酸緩衝液を静脈内注入した。この方法（ステラフニスら、デ ィアベット、２９巻、５０９頁、１９８０年）を用い、ストレプトシトシン注入 ６〜９カ月後、糸球体基部膜中の増加や糸球体および糸球体間質容量の増加のよ うなグルコースおよび識別可能な糖尿病域の乏しい制御が示された。

ストレプトシトシンの投与ののち２２力月後、各自しよう試料を採取した。対照 試料は対照ラットの血しようである（クエン酸緩衝液注入ののち２２力月後に採 取）。対照または糖尿病血しよう試料に対する所定のハイブリドーマのモノクロ ーナル抗体の結合性についてのＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイで得られた４９０ｎｍの 吸収率を糖尿病試料各々について得られた対照に対する吸収率変化％と共に、第 ３表に示した。６つのハ・イブリドーマの培地は、対照よりも大きい糖尿病試料 の著しい吸収率の増加をもにらずモノクロナール抗体を含んでいｆこ。

第３表 成熟ラット血しように対するクローン 第１表および第２表におけるハイブリドーマの消耗培地を同様に非酵素的糖鎖形 成ひと血しょうフィブロネクチンを認識する各セルラインの抗体の能力について ＥＬＩ　ＳＡアッセイを用いてテストした。インビトロでは糖鎖形成しないフィ ブロネクチンに対し該培地をテストした場合に判明した吸収率よりも大きい、抗 原としての非酵素的糖鎖形成フィブロネクチンに対し所定のハイブリドーマの消 耗培地をテストした場合のＥＬＩＳＡアッセイにおける吸収率の増加を評価した 。

１２日−非酵素的糖鎖形成ひとフィブロネクチンおよびその正常相対物は、保存 剤として１ｍＭアジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ、 ｐＨ７，４）中５００ｍＭＤ−グルコースにより３７℃でｌｊ！９／ｊｌρ蛋白 質２５Ｒ９をインキュベートすることにより調製した。プロテアーゼ・インヒビ ターもインキュベーション緩衝液に加えて、最終濃度＋　３７２．２ｘ９／（ｌ 二ナトリウム・エチレンジアミン・テトラアセテート（Ｎ　ａ！　Ｅ　Ｄ　Ｔ　 Ａ　）、３４．８ｆｆ９／＋２フエニルメチルスルホニル・フルオライド（ＰＭ ＳＦ）、０，７ｕ／（ｌペプスタチン、Ａ、０．５π９１０ルウベブチンおよび ４．５トリプシン・インヒビタ一単位／ｆ２アプロチニン（全て、シグマ、ミズ リー州セントルイスから入手）を得た。インキュベーションの１２日後、未反応 の糖をＰＢＳＩ衝液に対する広範な透析により除去した。各蛋白質の対照試料も 各々ＰＢＳおよびプロテアーゼ・インヒビター中で前記のように（ｆ二だし、グ ルコースを添加せず）インキュベートした。

テストした２３個のハイブリドーマのうち、５個は得られた吸収率読み取りの実 質的な差異に基つく非酵素的糖鎖形成ひと血しょうフィブロネクチンとその正常 相対物の間の識別的認識を示した。これらのデータを以下の第４表にまとめた。

第４表 Ｂ９．２６−Ｂ５．７４−ＤＩＯ１７４Ｇ−１１，８３−ＤＩｏ。

８４−Ｃ１１および８９−Ｇ４）を、非酵素的糖鎖形成の主要な血しょう蛋白ア ルブミン、イムノグロブリンＧおよびトランフェリンを特異的に認識する各クロ ーン化ハイブリドーマの抗体の能力について前記した識別ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセ イでテストした。以下の蛋白質の正常相対物について培地をテストした場合に判 明した吸収率以上の、非酵素的糖鎖形成ひと血しょうアルブミン、ＩｇＧま几は トランスフェリンについてクローンの消耗培地をテストした場合にＥＬＩＳＡア ッセイにおいて観察された吸収率の実質的な増加により、認識は実証されに。

テストし１ニクローンのうちの１つから得られたＭＣＡ、８３−Ｄｌｏは正常お よび非酵素的糖鎖形成のこれらと蛋白質の間を区別す６の非酵素的糖鎖形成ひと アルブミンを認識しにのに対し、正常対照ひとアルブミンの吸収率の読み取りは ０．６０であった（対照レベル以上の吸収率変化９３．３％）ｅアルブミンはひ と血しょうの主要な構成成分であり、ひと糖尿病の尿中へのその分泌が糖尿病腎 疾患において増加するので、クローン８３−ＤＩＯにより産生された抗体は血し ょう、尿、他の体液または組織試料におけるこの容易に接近可能な蛋白質の非酵 素的糖鎖形成レベルの定量化に関する診断テストにおいて有用である。

さらに、クローン８３−ＤＩＯは別の主要な血しょう蛋白の正常ひとトランスフ ェリンと非酵素的糖鎖形成ひとトランスフェリンの間の差異を認識する。このク ローンの培地は非酵素的糖鎖形成トランスフェリンについて１．１１の吸収率読 み取りであるのに対し、対照トランスフェリンの吸収率読み取りは０．５６であ った（対照レベルに対し９８．２％の吸収率変化）。しかし、８３−ＤＩＯは非 酵素的糖鎖形成１ｇＧと対照１ｇＧの間の差異を認識しない。

Ｅ、考察 本発明の方法によれば、非酵素的糖鎖形成マウスラミニン（ｇＬＭＮ）および非 酵素的糖鎖形成マウス総血清蛋白質（ｇＴｓＰ）に関するエピトープに結合でき るモノクロナール抗体を分泌するマウスハイブリドーマか製造される。第１表に 掲げたハイブリドーマはｇＬＭＮを正常ラミニン（ｃＬＭＮ）から識別すること ができるＭＣＡを分泌する。これらハイブリドーマの２つ、２６−Ｂ５および１ Ｏ−Ｃ１Ｏにより分泌されたＭＣＡは（ａ）２匹の糖尿病ラット由来の血しよう と（ｂ）正常ラット由来の血しょうの間をそれらが区別できる程度に、血清蛋白 質との選択的反応性を示す（第３表）。２６−ＢＳのＭＣＡは非酵素的糖鎖形成 ひとフィブロネクチン（ｇＦＮ）と明白には結合しないが一方、１Ｏ−ＣＩＯの 抗体はｇＦＮと強力に交差反応する（第４表）。１Ｏ−ＣＩＯの抗体ならびにハ イブリドーマ７４−Ｇｌｌの抗体はまたｇＦＮと正常フィブロネクチンの間の識 別的認識を示す。

第２表に掲げたハイブリドーマは非酵素的糖鎖形成総マウス血清蛋白質（ｇＴｓ Ｐ）を正常マウス血清蛋白質（ｃＴｓＰ）から識別できるＭＣＡを分泌する。例 えば、８３−ＤＩＯおよび８４−Ｂ９が分泌した＼１ＣＡはｃＴＳＰに対しｇＴ ｓＰを選択し、また糖尿病ラット由来の血しょうから正常ラット血しょうをそれ らが容易に識別できる程度に血清蛋白質に対する選択的結合性を示す。８３−Ｄ ＩＯまたは８４−Ｂ９のいずれも非酵素的糖鎖形成ひと血しょうフィブロネクチ ンと交差反応しないようである。しかしながら、８３−ＤＩＯによって排出され たＭＣＡは糖鎖形成および非糖鎖形成形の２つの主要なひと血しょう蛋白質であ るアルブミンとトランスフェリンに対するその結合性に関し高度の選択性を示す ことが判明した。さらに、ＭＣＡｌ　０−Ｃ１Ｏおよび８３−ＤＩＯの場合に観 察できるように、免疫原として用いられる糖鎖形成蛋白質に対し識別結合性を示 す所定のＭＣＡは第２反応糖鎖形成蛋白質に対し同一またはやや高い反応性を示 すことができる。

ハイブリドーマ２６−Ｂ５および８３−ＤＩＯの試料はアメリカン・タイプ・カ ルチャー・コレクション（ＵＳＡ、ＭＤ、ロックビル）に寄託し、各々、寄託番 号ＨＢ９１２４およびＨＢ９１２５を寄託した微生物の培養株は本発明に基づく 特許の付与による公表により利用可能になる。寄託の利用性は、米国政府により 付与され・た特許権を減損するような本発明の実施ライセンスを構成しないもの と、理解すべきである。

さらに、本発明は寄託微生物により範囲を限定すべきでない。なぜなら、寄託ハ イブリドーマは本発明の個々的な態様の特別な説明として意図したものだからで ある。事実、本明細記載のものに加えて本発明の種々の変形例が前記記載から当 業者には明白である。

補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の８） 昭和６３年１２月ｐへ日

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）哺乳類Ｂリンパ球を、非還元・非酵素的糖鎖形成血漿蛋白で免疫し 、 （ｂ）免疫したＢリンパ球を採取し、 （ｃ）採取した上記Ｂリンパ球を悪性哺乳類Ｂリンパ球と融合させてハイブリド ーマを形成し、 （ｄ）上記ハイブリドーマから、非還元・非酵素的糖鎖形成血漿蛋白上のエピト ープに結合するとともに対応する非糖鎖形成血漿蛋白に実質的に交差反応性をも たないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択し、 （ｅ）上記選択したハイブリドーマをクローン増殖させることからなる方法によ り製造されたハイブリドーマ。
2. （２）Ｂリンパ球を、免疫した哺乳類のひ臓から採取する、請求項１記載のハイ ブリドーマ。
3. （３）免疫した哺乳類がマウスである、請求項２記載のハイブリドーマ。
4. （４）Ｂリンパ球をマウスのミエローマ細胞と融合させる、請求項２記載のハイ ブリドーマ。
5. （５）哺乳類Ｂリンパ球を、有効量のラミニン、アルブミン、イムノグロブリン 、トランスフェリン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、プラスミノーゲン 、プラスミンおよびそれらの混合物からなる群から選ばれた非還元・非酵素的糖 鎖形成血漿蛋白で免疫する、請求項１記載のハイブリドーマ。
6. （６）哺乳類をマウス蛋白で免疫する、請求項５記載のハイブリドーマ。
7. （７）哺乳類を有効量の非還元・非酵素的糖鎖形成総血清蛋白で免疫する、請求 項１記載のハイブリドーマ。
8. （８）哺乳類をマウス蛋白で免疫する、請求項７記載のハイブリドーマ。
9. （９）目的とするモノクローナル抗体が、ラミニン、アルブミン、イムノグロブ リン、トランスフェリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、プラスミノー ゲン、プラスミンおよびそれらの混合物からなる群から選ばれた非還元・非酵素 的糖鎖形成血漿蛋白上のエピトープに結合する、請求項１記載のハイブリドーマ 。
10. （１０） モノクローナル抗体が非還元・非酵素的糖鎖形成ひと血漿蛋白に結合する、請求 項９記載のハイプリドーマ。
11. （１１） 請求項１記載のハイブリドーマによって産生された抗体。
12. （１２） 非還元・非酵素的糖鎖形成血漿蛋白上のエピトープに結合するとともに対応する 非糖鎖形成血漿蛋白に実質的に交差反応性をたもないモノクローナル抗体。
13. （１３） 非還元・非酵素的糖鎖形成血漿蛋白に対する結合性を示し、それが上記蛋白の糖 鎖形成度に比例して増加する、請求項１２記載のモノクローナル抗体。
14. （１４） 血漿蛋白がラミニン、アルブミン、イムノグロブリン、トランスフェリン、フィ ブリノーゲン、フィブロネクチン、プラスミノーゲン、プラスミンおよびそれら の混合物からなる群から選ばれる、請求項１２記載のモノクローナル抗体。
15. （１５） 血漿蛋白がひと血漿蛋白である、請求項１２記載のモノクローナル抗体。
16. （１６） 試料を請求項１１または１２記載のモノクローナル抗体と反応させ、蛋白・抗体 複合体の存在を、複合体と上記モノクローナル抗体に対する抗体（この抗体は検 出可能な標識と結合している）を反応させることにより測定することからなる、 粗織試料または生理学的流体試料中の非還元・非酵素的糖鎖形成蛋白の存在の検 出法。
17. （１７） 流体が血液である、請求項１６記載の方法。
18. （１８） 流体が尿である、請求項１６記載の方法。