JPH08157500A - Fas抗原の定量法 - Google Patents
Fas抗原の定量法Info
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- JPH08157500A JPH08157500A JP33048594A JP33048594A JPH08157500A JP H08157500 A JPH08157500 A JP H08157500A JP 33048594 A JP33048594 A JP 33048594A JP 33048594 A JP33048594 A JP 33048594A JP H08157500 A JPH08157500 A JP H08157500A
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- JP
- Japan
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- asn
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- fas antigen
- fas
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 下記の配列を有する人工ペプチド(一部を変
更又は欠損してもよい)又は細胞内領域を含む可溶性F
as抗原を免疫原として得られるポリクローナル抗体あ
るいはモノクローナル抗体。 Cys-Asn-Ile-Thr-Ser-Asp-Ser-Glu-Asn-Ser- Asn-Phe-Arg-Asn-Glu-Ile-Gln-Ser-Leu-Val 【効果】 本抗体はFas抗原の細胞内領域を特異的に
認識しうるものであり、本抗体を用いたサンドイッチE
LISA法によってFas抗原を測定することにより、
SLE、RA等自己免疫疾患の診断が可能となる。
更又は欠損してもよい)又は細胞内領域を含む可溶性F
as抗原を免疫原として得られるポリクローナル抗体あ
るいはモノクローナル抗体。 Cys-Asn-Ile-Thr-Ser-Asp-Ser-Glu-Asn-Ser- Asn-Phe-Arg-Asn-Glu-Ile-Gln-Ser-Leu-Val 【効果】 本抗体はFas抗原の細胞内領域を特異的に
認識しうるものであり、本抗体を用いたサンドイッチE
LISA法によってFas抗原を測定することにより、
SLE、RA等自己免疫疾患の診断が可能となる。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、Fas抗原の細胞内領
域を認識する特異的抗体に関するものである。この抗F
as抗体は、細胞内領域を含むSoluble For
m Fas(Soluble Fas:可溶性Fas)
をも特異的に認識することができるので、本発明は、こ
の性質を利用することによりELISA法を用いて該S
oluble Fasの効率的且つ正確な分析系を確立
することにもはじめて成功したものである。
域を認識する特異的抗体に関するものである。この抗F
as抗体は、細胞内領域を含むSoluble For
m Fas(Soluble Fas:可溶性Fas)
をも特異的に認識することができるので、本発明は、こ
の性質を利用することによりELISA法を用いて該S
oluble Fasの効率的且つ正確な分析系を確立
することにもはじめて成功したものである。
【0002】本発明によれば、Soluble Fas
の存在様式、つまりSolubleFasが細胞内領域
を含むものなのかあるいは細胞外領域のみ(すなわち、
細胞表面上で切断されたForm)なのかを明らかにす
ることができ、SLEやRAといった自己免疫疾患の診
断が血液検体からきわめて容易に実施できる。
の存在様式、つまりSolubleFasが細胞内領域
を含むものなのかあるいは細胞外領域のみ(すなわち、
細胞表面上で切断されたForm)なのかを明らかにす
ることができ、SLEやRAといった自己免疫疾患の診
断が血液検体からきわめて容易に実施できる。
【0003】
【従来の技術】Fasは、多くの細胞表面上のアポトー
シス シグナリング受容体分子であって、細胞内領域と
細胞外領域とからなる蛋白質である。しかし、従来、細
胞外領域に対する抗体しか開発されておらず、従って、
細胞内領域を含むSoluble Fasのみを選択的
に測定することは、従来、実施できなかった。
シス シグナリング受容体分子であって、細胞内領域と
細胞外領域とからなる蛋白質である。しかし、従来、細
胞外領域に対する抗体しか開発されておらず、従って、
細胞内領域を含むSoluble Fasのみを選択的
に測定することは、従来、実施できなかった。
【0004】しかるに、ごく最近になって、全身性紅斑
性狼瘡(systemic lupus erythe
matosus,SLE)の患者血清検体中に正常人以
上のSoluble Form Fasが存在すること
が明らかになった(Science,vol.263,
25 March,1994,p.1759−176
2)。そこで、SLEを含む自己免疫疾患を診断するた
めに、細胞内領域を含むSoluble Fasのみを
細胞外領域のSoluble Fasと区別して正確に
分析する必要が生じてきた。
性狼瘡(systemic lupus erythe
matosus,SLE)の患者血清検体中に正常人以
上のSoluble Form Fasが存在すること
が明らかになった(Science,vol.263,
25 March,1994,p.1759−176
2)。そこで、SLEを含む自己免疫疾患を診断するた
めに、細胞内領域を含むSoluble Fasのみを
細胞外領域のSoluble Fasと区別して正確に
分析する必要が生じてきた。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
技術の現状においてなされたものである。すなわち、上
記のように、従来は細胞外領域のFasを認識する抗体
しか開発されておらず、本年発見されたSoluble
Form Fasを定量する際、その存在様式が細胞
内を含むFasなのか細胞外のみのFasなのか区別が
出来ない。本発明は、Fasの細胞内領域(C末端)特
異抗体を開発し、従来と同様の抗体との組みあわせの測
定系を確立する事で、Soluble Fasの存在様
式を明らかにする目的でなされたものである。
技術の現状においてなされたものである。すなわち、上
記のように、従来は細胞外領域のFasを認識する抗体
しか開発されておらず、本年発見されたSoluble
Form Fasを定量する際、その存在様式が細胞
内を含むFasなのか細胞外のみのFasなのか区別が
出来ない。本発明は、Fasの細胞内領域(C末端)特
異抗体を開発し、従来と同様の抗体との組みあわせの測
定系を確立する事で、Soluble Fasの存在様
式を明らかにする目的でなされたものである。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するため、各方面から検討した結果、Fas抗原の細
胞内領域のC末端のペプチドを合成し、これを動物に免
疫したところ、その血清中にC末端側特異性ポリクロー
ナル抗体を生成せしめること、そしてこれを精製するこ
とにはじめて成功した。また、該合成ペプチドで動物を
免疫することにより、C末端側特異性抗体を産生する免
疫細胞が得られること、この免疫細胞はミエローマ細胞
と融合してハイブリドーマを形成すること、そして更に
このハイブリドーマを培養することによってC末端側特
異性モノクローナル抗体が得られることも、はじめて確
認した。
成するため、各方面から検討した結果、Fas抗原の細
胞内領域のC末端のペプチドを合成し、これを動物に免
疫したところ、その血清中にC末端側特異性ポリクロー
ナル抗体を生成せしめること、そしてこれを精製するこ
とにはじめて成功した。また、該合成ペプチドで動物を
免疫することにより、C末端側特異性抗体を産生する免
疫細胞が得られること、この免疫細胞はミエローマ細胞
と融合してハイブリドーマを形成すること、そして更に
このハイブリドーマを培養することによってC末端側特
異性モノクローナル抗体が得られることも、はじめて確
認した。
【0007】そして更に、こ(れら)の抗体とFasの
細胞外領域を認識する抗体を組み合わせたサンドイッチ
ELISA法を新たに開発し、この方法によれば血清等
各種サンプル中の細胞内領域を含むSoluble F
orm Fasのみを選択的に測定できることを確認
し、該Soluble Fasの特異的分析系を確立す
るのに成功した。
細胞外領域を認識する抗体を組み合わせたサンドイッチ
ELISA法を新たに開発し、この方法によれば血清等
各種サンプル中の細胞内領域を含むSoluble F
orm Fasのみを選択的に測定できることを確認
し、該Soluble Fasの特異的分析系を確立す
るのに成功した。
【0008】そして本分析法によれば、SLEやRA
(rheumatoid arthritis、関節リ
ウマチ炎)といった自己免疫疾患の患者血清中の細胞内
領域を含むSoluble Form Fasのみを正
確に測定できることも確認し、本分析法がこれらの疾患
の診断に利用できる等の効果も併せ確認し、これらの新
知見を基礎に更に検討の結果、本発明が完成されたもの
である。以下、本発明について詳述する。
(rheumatoid arthritis、関節リ
ウマチ炎)といった自己免疫疾患の患者血清中の細胞内
領域を含むSoluble Form Fasのみを正
確に測定できることも確認し、本分析法がこれらの疾患
の診断に利用できる等の効果も併せ確認し、これらの新
知見を基礎に更に検討の結果、本発明が完成されたもの
である。以下、本発明について詳述する。
【0009】本発明に係る抗体を作成するための免疫原
としては、Fas抗原の分子全体(細胞内領域を含む可
溶性Fas抗原)又はFas抗原の細胞内領域のC末端
をペプチド合成機により合成して使用する。合成ペプチ
ドとしては、例えば、1〜20個のアミノ酸からなる次
のアミノ酸配列を有するペプチドが使用できる。 Cys-Asn-Ile-Thr-Ser-Asp-Ser-Glu-Asn-Ser- Asn-Phe-Arg-Asn-Glu-Ile-Gln-Ser-Leu-Val また、本発明においては、上記した合成ペプチドにおい
て、アミノ酸の一部を他のアミノ酸に変更したり又は欠
損させたりした改変ペプチドも、合成ペプチドと全く同
様に、免疫原として使用することができる。
としては、Fas抗原の分子全体(細胞内領域を含む可
溶性Fas抗原)又はFas抗原の細胞内領域のC末端
をペプチド合成機により合成して使用する。合成ペプチ
ドとしては、例えば、1〜20個のアミノ酸からなる次
のアミノ酸配列を有するペプチドが使用できる。 Cys-Asn-Ile-Thr-Ser-Asp-Ser-Glu-Asn-Ser- Asn-Phe-Arg-Asn-Glu-Ile-Gln-Ser-Leu-Val また、本発明においては、上記した合成ペプチドにおい
て、アミノ酸の一部を他のアミノ酸に変更したり又は欠
損させたりした改変ペプチドも、合成ペプチドと全く同
様に、免疫原として使用することができる。
【0010】このような合成ペプチドを免疫原として使
用する場合、免疫応答を促進する目的で、Freund
のアジュバントその他各種のアジュバントを使用した
り、ウシサイログロブリン、BSA(Bovine S
erum Albumin:ウシ血清アルブミン)、K
LH(Keyhole limpet hemocya
nine:keyhole limpetのヘモシアニ
ン)その他各種キャリアーを結合したりして、動物を免
疫する。
用する場合、免疫応答を促進する目的で、Freund
のアジュバントその他各種のアジュバントを使用した
り、ウシサイログロブリン、BSA(Bovine S
erum Albumin:ウシ血清アルブミン)、K
LH(Keyhole limpet hemocya
nine:keyhole limpetのヘモシアニ
ン)その他各種キャリアーを結合したりして、動物を免
疫する。
【0011】これらの免疫原でウサギ、ラット、マウ
ス、ヤギ等各種の動物を必要回数免疫し、常法にしたが
って抗血清を得る。抗血清から目的とする合成ペプチド
特異抗体を精製するには、抗体精製の常法にしたがい、
硫安塩析、アフィニティー精製イオン交換カラムクロマ
トグラフィー、分子篩カラムクロマトグラフィー(ゲル
濾過)、プロテインAカラムクロマトグラフィー等を行
えばよい。
ス、ヤギ等各種の動物を必要回数免疫し、常法にしたが
って抗血清を得る。抗血清から目的とする合成ペプチド
特異抗体を精製するには、抗体精製の常法にしたがい、
硫安塩析、アフィニティー精製イオン交換カラムクロマ
トグラフィー、分子篩カラムクロマトグラフィー(ゲル
濾過)、プロテインAカラムクロマトグラフィー等を行
えばよい。
【0012】アフィニティー精製(抗原固定化カラムク
ロマトグラフィー)の場合、合成ペプチドをカラムに固
定し、抗血清をチャージして特異抗体をカラムに吸着さ
せた後、溶出液を用いて特異抗体を外し、これを回収す
ることにより、高純度の抗Fasポリクローナル抗体が
得られる。純度を高めるためには、これらの精製手段を
組み合わせたり、くり返したりすればよい。
ロマトグラフィー)の場合、合成ペプチドをカラムに固
定し、抗血清をチャージして特異抗体をカラムに吸着さ
せた後、溶出液を用いて特異抗体を外し、これを回収す
ることにより、高純度の抗Fasポリクローナル抗体が
得られる。純度を高めるためには、これらの精製手段を
組み合わせたり、くり返したりすればよい。
【0013】本発明に係るモノクローナル抗体の作成
は、次のようにして行う。先ず、上記と同様にして、例
えば雄BALB/cマウスその他の動物を用い、上記し
た合成ペプチド(改変ペプチドを含む)又はFas抗原
の分子全体を免疫原として充分な抗体価が得られるまで
免疫した後、細胞融合のために、脾臓、リンパ節等免疫
細胞を無菌的に摘出する。
は、次のようにして行う。先ず、上記と同様にして、例
えば雄BALB/cマウスその他の動物を用い、上記し
た合成ペプチド(改変ペプチドを含む)又はFas抗原
の分子全体を免疫原として充分な抗体価が得られるまで
免疫した後、細胞融合のために、脾臓、リンパ節等免疫
細胞を無菌的に摘出する。
【0014】脾臓を無菌的に摘出し、脾細胞を溶出さ
せ、マウス骨髄腫細胞と適当な細胞融合促進剤の使用に
より、細胞を融合させる。細胞融合に用いる骨髄腫細胞
はP3−Ag8−γ、p3−X63−Ag8、P3−X
63−Ag8−U1、NSI−Ag4/1、X63−A
g8−6,5,3、SP2/0−Ag14、MPC11
−45.6TG1.7、S194/5XX0,BU,1
等が用いられる。好ましい細胞融合促進剤としては、例
えば平均分子量が1000〜6000のポリエチレング
リコールなどが挙げられる。また、電気パルスによる融
合も可能である。
せ、マウス骨髄腫細胞と適当な細胞融合促進剤の使用に
より、細胞を融合させる。細胞融合に用いる骨髄腫細胞
はP3−Ag8−γ、p3−X63−Ag8、P3−X
63−Ag8−U1、NSI−Ag4/1、X63−A
g8−6,5,3、SP2/0−Ag14、MPC11
−45.6TG1.7、S194/5XX0,BU,1
等が用いられる。好ましい細胞融合促進剤としては、例
えば平均分子量が1000〜6000のポリエチレング
リコールなどが挙げられる。また、電気パルスによる融
合も可能である。
【0015】細胞融合に使用する骨髄腫細胞は、8−ア
ザグアニン耐性株でヌクレオチド生合成のサルベージ経
路に必要なヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシル
トランスフェラーゼを欠くため、HAT培地(ヒポキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地)中では
ヌクレオチドの合成ができず、生き残れない。よって細
胞融合を行った後、HAT培地にて一定期間、例えば1
0〜14日間培養することにより、脾細胞と骨髄腫が融
合したハイブリドーマのみを選択することができる。
ザグアニン耐性株でヌクレオチド生合成のサルベージ経
路に必要なヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシル
トランスフェラーゼを欠くため、HAT培地(ヒポキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地)中では
ヌクレオチドの合成ができず、生き残れない。よって細
胞融合を行った後、HAT培地にて一定期間、例えば1
0〜14日間培養することにより、脾細胞と骨髄腫が融
合したハイブリドーマのみを選択することができる。
【0016】細胞融合後、一定期間、例えば10〜14
日間培養後の培養上清を採取し、ELISA法にて、合
成ペプチドとの反応が認められたwellの細胞をHT
培地(ヒポキサンチン、チミジンを含む培地)にて培養
し、スケールアップをはかり、非免疫マウス脾細胞をフ
ィーダー細胞に用いた限界希釈法により、クローニング
を行う。クローニング後、ELISA法によって再度ス
クリーニングを行い、抗体産生能が高く、増殖の良い、
しかも安定なクローンを選択し、抗Fas特異抗体産生
ハイブリドーマを得、スケールアップ後、細胞の凍結保
存を行う。
日間培養後の培養上清を採取し、ELISA法にて、合
成ペプチドとの反応が認められたwellの細胞をHT
培地(ヒポキサンチン、チミジンを含む培地)にて培養
し、スケールアップをはかり、非免疫マウス脾細胞をフ
ィーダー細胞に用いた限界希釈法により、クローニング
を行う。クローニング後、ELISA法によって再度ス
クリーニングを行い、抗体産生能が高く、増殖の良い、
しかも安定なクローンを選択し、抗Fas特異抗体産生
ハイブリドーマを得、スケールアップ後、細胞の凍結保
存を行う。
【0017】モノクローナル抗体の製造は、ハイブリド
ーマを血清添加培地ならびに無血清培地にて培養するイ
ン・ビトロ法、あるいはハイブリドーマをマウス腹腔に
移植して、腹水を採取する、イン・ビボ法にて行い、上
記と同様に、硫安塩析、イオン交換カラムクロマトグラ
フィー、分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテイン
Aカラムクロマトグラフィー、抗原固定化カラムクロマ
トグラフィー等によって精製できる。
ーマを血清添加培地ならびに無血清培地にて培養するイ
ン・ビトロ法、あるいはハイブリドーマをマウス腹腔に
移植して、腹水を採取する、イン・ビボ法にて行い、上
記と同様に、硫安塩析、イオン交換カラムクロマトグラ
フィー、分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテイン
Aカラムクロマトグラフィー、抗原固定化カラムクロマ
トグラフィー等によって精製できる。
【0018】こうして作成した抗体は、ポリクローナル
及びモノクローナル抗体のいずれも、Fasの細胞内領
域を特異的に認識することができ、しかも更に、細胞内
領域を含むSoluble Form Fasも特異的
に認識することができる。このような抗体は、従来全く
知られておらず、新規な生理活性物質である。
及びモノクローナル抗体のいずれも、Fasの細胞内領
域を特異的に認識することができ、しかも更に、細胞内
領域を含むSoluble Form Fasも特異的
に認識することができる。このような抗体は、従来全く
知られておらず、新規な生理活性物質である。
【0019】本発明に係るFasの細胞内特異抗体は、
上記した新規にして卓越した特異性を有するので、Fa
sの精製に利用できるほか、Fasの細胞内領域やそれ
を含むSoluble Form Fasの測定にも利
用することができる。この測定を簡便且つ正確に行うた
めに鋭意研究した結果、サンドイッチELISA法を開
発するのに成功した。
上記した新規にして卓越した特異性を有するので、Fa
sの精製に利用できるほか、Fasの細胞内領域やそれ
を含むSoluble Form Fasの測定にも利
用することができる。この測定を簡便且つ正確に行うた
めに鋭意研究した結果、サンドイッチELISA法を開
発するのに成功した。
【0020】サンドイッチELISA法は、Fasの細
胞外領域を認識する抗体をマイクロタイタープレートに
固相化し、本発明に係る特異抗体をHRP等の酵素で標
識してconjugateを作成し、基質をOPDとす
ることによりサンドイッチELISA法を実施すること
ができる。スタンダードとしては、バキュロウイルス
(baculovirus)発現系で得た組み換えFa
s(細胞壁内を除く全分子)を利用し、ここにサンドイ
ッチELISA法による免疫分析系を確立した。
胞外領域を認識する抗体をマイクロタイタープレートに
固相化し、本発明に係る特異抗体をHRP等の酵素で標
識してconjugateを作成し、基質をOPDとす
ることによりサンドイッチELISA法を実施すること
ができる。スタンダードとしては、バキュロウイルス
(baculovirus)発現系で得た組み換えFa
s(細胞壁内を除く全分子)を利用し、ここにサンドイ
ッチELISA法による免疫分析系を確立した。
【0021】この免疫分析系に使用するFasの細胞内
特異抗体−標識conjugateは、標識抗体の作成
技術が適宜利用可能であって、例えば、酵素標識の場合
には、本特異抗体にチオール基を導入し、マレイミド基
を導入した酵素と反応させたり、あるいは、本特異抗体
をF(ab)′フラクションに消化し、マレイミド基を
導入した酵素と反応させて、目的とする標識抗体を作成
することができる。
特異抗体−標識conjugateは、標識抗体の作成
技術が適宜利用可能であって、例えば、酵素標識の場合
には、本特異抗体にチオール基を導入し、マレイミド基
を導入した酵素と反応させたり、あるいは、本特異抗体
をF(ab)′フラクションに消化し、マレイミド基を
導入した酵素と反応させて、目的とする標識抗体を作成
することができる。
【0022】標識酵素としては、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ(HRP)のほか、アルカリフォスファターゼ
(AP)、β−ガラクトシダーゼ、ALB、GOD等常
用される酵素が適宜使用可能である。また、標識として
は酵素のほか、ローダミンやフルオレセイン イソチア
シアネート(FITC)等の蛍光色素やフェリチン等を
用いて直接標識することも可能である。
ダーゼ(HRP)のほか、アルカリフォスファターゼ
(AP)、β−ガラクトシダーゼ、ALB、GOD等常
用される酵素が適宜使用可能である。また、標識として
は酵素のほか、ローダミンやフルオレセイン イソチア
シアネート(FITC)等の蛍光色素やフェリチン等を
用いて直接標識することも可能である。
【0023】このようにしてサンドイッチELISA法
によるイムノアッセイシステムを構築することにより、
Fas抗原の細胞内領域、それを含むSoluble
Form Fasを正確且つ簡便に測定することができ
る。以下、本発明の実施例について記載する。
によるイムノアッセイシステムを構築することにより、
Fas抗原の細胞内領域、それを含むSoluble
Form Fasを正確且つ簡便に測定することができ
る。以下、本発明の実施例について記載する。
【0024】
【実施例1:抗体の作成】次の操作により、抗Fasポ
リクローナル抗体を作成した。
リクローナル抗体を作成した。
【0025】(1)ペプチド合成 Fas抗原のC末端(細胞内領域)をペプチド合成機
(Model 431APeptide Synthe
sizer)により合成し、以下のペプチド配列(20
mer)からなる人工ペプチドを得た。 Cys-Asn-Ile-Thr-Ser-Asp-Ser-Glu-Asn-Ser- Asn-Phe-Arg-Asn-Glu-Ile-Gln-Ser-Leu-Val
(Model 431APeptide Synthe
sizer)により合成し、以下のペプチド配列(20
mer)からなる人工ペプチドを得た。 Cys-Asn-Ile-Thr-Ser-Asp-Ser-Glu-Asn-Ser- Asn-Phe-Arg-Asn-Glu-Ile-Gln-Ser-Leu-Val
【0026】(2)抗原結合物の作成 上記によって得た人工ペプチド4mgとマレイミド活性
化KLH(Pierce)2mgを用いてペプチド−K
LH結合物(conjugate)を作成した。同様に
人工ペプチド4mgとマレイミド活性化BSA(Pie
rce)2mgを用いて人工ペプチド−BSA結合物
(conjugate)を作成した。
化KLH(Pierce)2mgを用いてペプチド−K
LH結合物(conjugate)を作成した。同様に
人工ペプチド4mgとマレイミド活性化BSA(Pie
rce)2mgを用いて人工ペプチド−BSA結合物
(conjugate)を作成した。
【0027】(3)免疫 人工ペプチド−KLHを免疫原とし、更にフロイント
(Freund)の完全アジュバント(FCA)又はフ
ロイントの不完全アジュバント(FIA)を用いて、ウ
サギ(white 日本白色種)を以下により免疫し
た。 1回目: Peptide−KLH 0.5mg+F
CA s.c. 2〜6回目:Peptide−KLH 0.5mg+F
IA s.c.
(Freund)の完全アジュバント(FCA)又はフ
ロイントの不完全アジュバント(FIA)を用いて、ウ
サギ(white 日本白色種)を以下により免疫し
た。 1回目: Peptide−KLH 0.5mg+F
CA s.c. 2〜6回目:Peptide−KLH 0.5mg+F
IA s.c.
【0028】(4)ELISA法による抗体の力価チェ
ック 抗原として、次の3種を用い、第1抗体として抗Fas
ポリクローナル抗体、第2抗体としてビオチン抗−ウサ
ギIgG(Vector社)を用いて、ELISA法に
よる抗Fas抗体の力価チェック(反応性チェック)を
行った。 人工ペプチド−KLH 10μg/ml 50μl コ
ーティング 人工ペプチド−BSA 10μg/ml 50μl コ
ーティング 人工ペプチド 10μg/ml 50μl コ
ーティング 4℃で1夜放置
ック 抗原として、次の3種を用い、第1抗体として抗Fas
ポリクローナル抗体、第2抗体としてビオチン抗−ウサ
ギIgG(Vector社)を用いて、ELISA法に
よる抗Fas抗体の力価チェック(反応性チェック)を
行った。 人工ペプチド−KLH 10μg/ml 50μl コ
ーティング 人工ペプチド−BSA 10μg/ml 50μl コ
ーティング 人工ペプチド 10μg/ml 50μl コ
ーティング 4℃で1夜放置
【0029】ELISA法は、次の操作によって行っ
た。 ブロッキング:1/4希釈 Block ace(大日
本製薬)保持2時間 第1抗体:抗−Fas抗体 保持2時間 PBS中で4回洗浄 第2抗体:ビオチン抗−ウサギIgG(Vector
社) 保持1時間 PBS中で4回洗浄 アビジン−ビオチン化HRP複合体(Vector社)
保持30分 PBS中で4回洗浄 OPD(4mg/10ml クエン酸−リン酸緩衝液
pH5.0)+30% H2O2 4μl 100μl/
well〜10分 停止:2N H2SO4 50μl/well 測定:A490/655 得られた結果を図1に示す。
た。 ブロッキング:1/4希釈 Block ace(大日
本製薬)保持2時間 第1抗体:抗−Fas抗体 保持2時間 PBS中で4回洗浄 第2抗体:ビオチン抗−ウサギIgG(Vector
社) 保持1時間 PBS中で4回洗浄 アビジン−ビオチン化HRP複合体(Vector社)
保持30分 PBS中で4回洗浄 OPD(4mg/10ml クエン酸−リン酸緩衝液
pH5.0)+30% H2O2 4μl 100μl/
well〜10分 停止:2N H2SO4 50μl/well 測定:A490/655 得られた結果を図1に示す。
【0030】(5)精製 免疫したウサギの全血を回収し、これを3000rpm
で5分間遠沈して血清を分離した。得られた血清を次の
2工程で処理して、抗体を精製した。
で5分間遠沈して血清を分離した。得られた血清を次の
2工程で処理して、抗体を精製した。
【0031】第1工程:血清50mlに飽和硫安を50
ml加えると、γ−グロブリン(抗体)の沈殿が生成し
てくる。これを8000rpmで15分間遠沈し、次い
でPBS中で透析した。
ml加えると、γ−グロブリン(抗体)の沈殿が生成し
てくる。これを8000rpmで15分間遠沈し、次い
でPBS中で透析した。
【0032】第2工程:上記で得た抗体50mlに0.
06M酢酸塩(pH4.0)を100ml加え、カプリ
ル酸を4ml滴加した。次いで8000rpmで15分
間遠沈した。上清140mlにSASを140ml加
え、次いで8000rpmで15分間遠沈し、PBS
50mlに溶かした後、第1工程と同様にPBS中で透
析してアンモニウムイオンを除去し、精製抗体を得た。
06M酢酸塩(pH4.0)を100ml加え、カプリ
ル酸を4ml滴加した。次いで8000rpmで15分
間遠沈した。上清140mlにSASを140ml加
え、次いで8000rpmで15分間遠沈し、PBS
50mlに溶かした後、第1工程と同様にPBS中で透
析してアンモニウムイオンを除去し、精製抗体を得た。
【0033】
【実施例2:サンドイッチELISA系の構築】96ウ
エルのプレートとしては、ELISA MS−8496
F用のSUMILONマルチウエルプレート(住友ベー
クライト社)を使用した。このプレートに、1ウエル当
り50μlのDX−3(DNAX社/DNAX Res
earch Institute of Molecu
lar and Cellular Biology,
Inc.から供給可能な製品であって、膜結合ヒトFa
sを遺伝子導入により発現させたマウス肥満細胞株P8
15を免疫原として得られた抗ヒトFasモノクローナ
ル抗体であるが、この抗体はFas抗原の細胞外領域を
認識する抗体である。)(PBSで100倍希釈したも
の)を加え、37℃で3時間(又は4℃で1夜)放置し
た。
エルのプレートとしては、ELISA MS−8496
F用のSUMILONマルチウエルプレート(住友ベー
クライト社)を使用した。このプレートに、1ウエル当
り50μlのDX−3(DNAX社/DNAX Res
earch Institute of Molecu
lar and Cellular Biology,
Inc.から供給可能な製品であって、膜結合ヒトFa
sを遺伝子導入により発現させたマウス肥満細胞株P8
15を免疫原として得られた抗ヒトFasモノクローナ
ル抗体であるが、この抗体はFas抗原の細胞外領域を
認識する抗体である。)(PBSで100倍希釈したも
の)を加え、37℃で3時間(又は4℃で1夜)放置し
た。
【0034】次いで、上清を除去した後、1ウエル当り
200μlのBLOCK ACE(大日本製薬社製品、
但しPBSで2倍に希釈したもの)を加え、37℃で2
時間(又は4℃で一夜)保持し、Fas細胞外特異抗体
をマイクロタイタープレートに固相化した。
200μlのBLOCK ACE(大日本製薬社製品、
但しPBSで2倍に希釈したもの)を加え、37℃で2
時間(又は4℃で一夜)保持し、Fas細胞外特異抗体
をマイクロタイタープレートに固相化した。
【0035】上清を除去した後、1ウエル当り50μl
の検体を加え、37℃で2時間(又は4℃で一夜)保持
し、次いで、0.05% Tween PBSを用いて
5回洗浄した。これに1ウエル当り50μlの上記実施
例1で得た抗体(10μg/ml)を加えて、37℃で
1時間保持した。
の検体を加え、37℃で2時間(又は4℃で一夜)保持
し、次いで、0.05% Tween PBSを用いて
5回洗浄した。これに1ウエル当り50μlの上記実施
例1で得た抗体(10μg/ml)を加えて、37℃で
1時間保持した。
【0036】0.05% Tween PBSを用いて
5回洗浄した後、1ウエル当り50μlのHRP標識2
次抗体(抗ウサギIgG抗体)を加えて、37℃で1時
間保持した。
5回洗浄した後、1ウエル当り50μlのHRP標識2
次抗体(抗ウサギIgG抗体)を加えて、37℃で1時
間保持した。
【0037】0.05% Tween PBSを用いて
5回洗浄した後、PBSで2回洗浄した。次いで1ウエ
ル当り100μlのOPD/クエン酸リン酸緩衝液+1
μl/H2O2(1mg/ml)を加え10分間放置した
後、1ウエル当り2N H2SO4を100μl加え、O
D490を測定した。なお、クエン酸リン酸緩衝液(pH
5.0)は次の組成からなるものである。
5回洗浄した後、PBSで2回洗浄した。次いで1ウエ
ル当り100μlのOPD/クエン酸リン酸緩衝液+1
μl/H2O2(1mg/ml)を加え10分間放置した
後、1ウエル当り2N H2SO4を100μl加え、O
D490を測定した。なお、クエン酸リン酸緩衝液(pH
5.0)は次の組成からなるものである。
【0038】 0.1Mクエン酸・H2O(21.0g/l) 48.6ml 0.2MNa2HPO4・12H2O(71.628g/l) 51.4ml DDW 100ml
【0039】Standardとしては、バキュロウイ
ルスを培養して得られた組換えFas(細胞壁内を除く
全分子)を利用した。その製法は次のとおりである。
ルスを培養して得られた組換えFas(細胞壁内を除く
全分子)を利用した。その製法は次のとおりである。
【0040】PCRにてヒト可溶性Fas(s−h−F
as)のcDNAをクローニングし、COS細胞/SR
α296ベクター及び昆虫由来のSf−9細胞/bac
ulo virus発現系にて組換えs−h−Fasを
作成した。DX2(膜結合型ヒトFasを遺伝子導入に
より発現させたマウス肥満細胞株P815でマウスを免
疫し、異なるエピトープを認識する抗ヒトFasモノク
ローナル抗体(細胞外領域を認識する)。なお、DX2
はDNAX社からも供給されている。)を用いたWes
tern blotにて、前者の培養液上清中に分子量
42kDa、35kDa、後者において35kDaのs
−h−Fasの産生分泌を確認した。
as)のcDNAをクローニングし、COS細胞/SR
α296ベクター及び昆虫由来のSf−9細胞/bac
ulo virus発現系にて組換えs−h−Fasを
作成した。DX2(膜結合型ヒトFasを遺伝子導入に
より発現させたマウス肥満細胞株P815でマウスを免
疫し、異なるエピトープを認識する抗ヒトFasモノク
ローナル抗体(細胞外領域を認識する)。なお、DX2
はDNAX社からも供給されている。)を用いたWes
tern blotにて、前者の培養液上清中に分子量
42kDa、35kDa、後者において35kDaのs
−h−Fasの産生分泌を確認した。
【0041】本法によってSoluble Form
Fasの測定を行ったところ、該Fasの濃度に応じて
A492も上昇することが確認され(図2)、ここに、サ
ンドイッチELISAアッセイシステムが確立された。
Fasの測定を行ったところ、該Fasの濃度に応じて
A492も上昇することが確認され(図2)、ここに、サ
ンドイッチELISAアッセイシステムが確立された。
【0042】また、本法によればSLE及びRA患者の
血清中におけるs−h−Fasの定量も簡便且つ正確に
行われ、SLE及びRA患者のs−h−Fas値は正常
人よりも高いことも確認され(図3)、本法がSLEは
もとよりRAその他の自己免疫疾患の診断に有用である
ことが示された。
血清中におけるs−h−Fasの定量も簡便且つ正確に
行われ、SLE及びRA患者のs−h−Fas値は正常
人よりも高いことも確認され(図3)、本法がSLEは
もとよりRAその他の自己免疫疾患の診断に有用である
ことが示された。
【0043】
【発明の効果】本発明によってはじめてFas抗原の細
胞内領域を特異的に認識するモノクローナル及びポリク
ローナル抗体が作成された。これらの抗体は従来未知の
新規物質である。
胞内領域を特異的に認識するモノクローナル及びポリク
ローナル抗体が作成された。これらの抗体は従来未知の
新規物質である。
【0044】これらの抗体は、従来認識し得なかったF
as抗原の細胞内領域を認識できるという効果のほか、
該領域を含むSoluble Form Fasを認識
できる効果を有するものである。また本発明は、この細
胞内領域を含むFas抗原の測定系を開発するのにも成
功したものである。
as抗原の細胞内領域を認識できるという効果のほか、
該領域を含むSoluble Form Fasを認識
できる効果を有するものである。また本発明は、この細
胞内領域を含むFas抗原の測定系を開発するのにも成
功したものである。
【0045】また既述のようにSLE患者の血清中には
Soluble Form Fasが存在することがご
く最近になって発見されたが、本発明によればFas抗
原の細胞内領域を測定することがはじめて可能となった
ので、従来不明瞭であったSLE患者等の自己免疫疾患
患者のSoluble Form Fasが細胞外領域
由来のものか細胞内領域由来のものかその存在様式を確
認することがはじめて可能となり、この両者の差異によ
って自己免疫疾患の正常な診断が可能となる。更にま
た、従来はSoluble Form FasがSLE
患者において高値を示すことが確認されてはいたが、R
A患者については、正常人と同等であった。しかしなが
ら、上記から明らかなように、本法によりRA患者につ
いても、正常人に比して高値を示すことが確認された。
したがって、本法はRAの診断につていも非常に有用で
ある。
Soluble Form Fasが存在することがご
く最近になって発見されたが、本発明によればFas抗
原の細胞内領域を測定することがはじめて可能となった
ので、従来不明瞭であったSLE患者等の自己免疫疾患
患者のSoluble Form Fasが細胞外領域
由来のものか細胞内領域由来のものかその存在様式を確
認することがはじめて可能となり、この両者の差異によ
って自己免疫疾患の正常な診断が可能となる。更にま
た、従来はSoluble Form FasがSLE
患者において高値を示すことが確認されてはいたが、R
A患者については、正常人と同等であった。しかしなが
ら、上記から明らかなように、本法によりRA患者につ
いても、正常人に比して高値を示すことが確認された。
したがって、本法はRAの診断につていも非常に有用で
ある。
【0046】また本発明は、臓器移植時の自己免疫作用
の研究に有用であるし、Fas蛋白質含有細胞の障害の
メカニズムが細胞死の一種であるアポトーシスに類似し
ているため、アポトーシスの研究にも有用である。
の研究に有用であるし、Fas蛋白質含有細胞の障害の
メカニズムが細胞死の一種であるアポトーシスに類似し
ているため、アポトーシスの研究にも有用である。
【0047】更に本発明によれば、サンドイッチELI
SA法を効率よく実施できる測定キットの提供にも途を
拓くものである。
SA法を効率よく実施できる測定キットの提供にも途を
拓くものである。
【図1】本発明に係る抗Fasポリクローナル抗体の力
価を示す。
価を示す。
【図2】本発明に係るELISA法による標準曲線を示
す。
す。
【図3】正常人、SLE患者、RA患者について、本発
明に係るELISA法によって測定した血清中のSol
uble Form Fas濃度の測定値を示す。
明に係るELISA法によって測定した血清中のSol
uble Form Fas濃度の測定値を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/53 D 33/577 B // C12N 15/02 C12P 21/02 C 9452−4B (C12P 21/08 C12R 1:91) (C12P 21/02 C12R 1:91)
Claims (16)
- 【請求項1】 Fas抗原の細胞内領域を認識する抗
体。 - 【請求項2】 細胞内領域がC末端側である請求項1に
記載の抗体。 - 【請求項3】 下記の配列を有するペプチドを免疫原と
して得られる抗体。 Cys-Asn-Ile-Thr-Ser-Asp-Ser-Glu-Asn-Ser- Asn-Phe-Arg-Asn-Glu-Ile-Gln-Ser-Leu-Val - 【請求項4】 該配列の一部を変更又は欠損してなるペ
プチドを免疫原としてなる請求項3に記載の抗体。 - 【請求項5】 抗体がポリクローナル抗体である請求項
1〜請求項4のいずれかに記載の抗体。 - 【請求項6】 抗体がモノクローナル抗体である請求項
1〜請求項4のいずれかに記載の抗体。 - 【請求項7】 下記の配列を有するペプチド又は細胞内
領域を含む可溶性Fas抗原を免疫原とし、必要あれば
キャリアーを付加し及び/又はアジュバントを加え、動
物に免疫し、得られた抗血清を更に精製すること、を特
徴とする請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載の抗
体を製造する方法。 Cys-Asn-Ile-Thr-Ser-Asp-Ser-Glu-Asn-Ser- Asn-Phe-Arg-Asn-Glu-Ile-Gln-Ser-Leu-Val - 【請求項8】 下記の配列を有するペプチド、あるいは
その一部を変更又は欠損してなるペプチドを用いてなる
アフィニティークロマトグラフィーによって、該抗血清
を精製すること、を特徴とする請求項7に記載の抗体を
製造する方法。 Cys-Asn-Ile-Thr-Ser-Asp-Ser-Glu-Asn-Ser- Asn-Phe-Arg-Asn-Glu-Ile-Gln-Ser-Leu-Val - 【請求項9】 下記の配列を有するペプチド又は細胞内
領域を含む可溶性Fas抗原を免疫原とし、必要あれば
キャリアーを付加し及び/又はアジュバントを加え、動
物に免疫し、得られた免疫細胞と増殖性細胞とのハイブ
リドーマを作成し、得られたハイブリドーマを培養する
こと、を特徴とする請求項1〜請求項4のいずれか1
項、又は請求項6に記載の抗体を製造する方法。 Cys-Asn-Ile-Thr-Ser-Asp-Ser-Glu-Asn-Ser- Asn-Phe-Arg-Asn-Glu-Ile-Gln-Ser-Leu-Val - 【請求項10】 該配列の一部を変更又は欠損してなる
ペプチドを免疫原として使用すること、を特徴とする請
求項7又は請求項9に記載の抗体を製造する方法。 - 【請求項11】 請求項1〜請求項6のいずれか1項に
記載の抗体及びFas抗原の細胞外領域を認識する抗体
とを使用することを特徴とする、サンドイッチELIS
A法によるFas抗原の定量法。 - 【請求項12】 Fas抗原がSoluble For
m Fas抗原であることを特徴とする請求項11に記
載のFas抗原の定量法。 - 【請求項13】 請求項1〜請求項6のいずれか1項に
記載の抗体を含有してなることを特徴とする、サンドイ
ッチELISA法によるFas抗原の定量法。 - 【請求項14】 Fas抗原の定量法が、自己免疫疾患
診断用であることを特徴とする請求項13に記載のFa
s抗原の定量法。 - 【請求項15】 自己免疫疾患が全身性紅斑性狼瘡(S
LE)又は関節リウマチ炎(RA)であることを特徴と
する請求項14に記載のFas抗原の定量法。 - 【請求項16】 Fas抗原及び/又はSoluble
Form Fas抗原を定量するために使用する抗体
であって、請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の
抗体。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP33048594A JPH08157500A (ja) | 1994-12-08 | 1994-12-08 | Fas抗原の定量法 |
CA 2164374 CA2164374A1 (en) | 1994-12-08 | 1995-12-04 | Method for quantitative determination of fas antigen |
EP95119179A EP0716095A1 (en) | 1994-12-08 | 1995-12-06 | Method for quantitative determination of fas antigen |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP33048594A JPH08157500A (ja) | 1994-12-08 | 1994-12-08 | Fas抗原の定量法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH08157500A true JPH08157500A (ja) | 1996-06-18 |
Family
ID=18233158
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP33048594A Pending JPH08157500A (ja) | 1994-12-08 | 1994-12-08 | Fas抗原の定量法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0716095A1 (ja) |
JP (1) | JPH08157500A (ja) |
CA (1) | CA2164374A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008035527A1 (fr) * | 2006-09-21 | 2008-03-27 | Mmt Co., Ltd. | ANTICORPS MONOCLONAL ANTI-C1q |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU4772299A (en) * | 1998-06-18 | 2000-01-05 | Karolinska Innovations Ab | Fas peptides and antibodies for modulating apoptosis |
US20040047900A1 (en) * | 2000-12-11 | 2004-03-11 | Allan Bruce Duncan Samuel | Treatment of posterior capsule opacification |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1991010448A1 (en) * | 1990-01-19 | 1991-07-25 | German Cancer Research Center | A cell surface antigen associated with cellular apoptosis |
EP0510691B1 (en) * | 1991-04-26 | 2004-11-03 | Osaka Bioscience Institute | DNA coding for human cell surface antigen |
-
1994
- 1994-12-08 JP JP33048594A patent/JPH08157500A/ja active Pending
-
1995
- 1995-12-04 CA CA 2164374 patent/CA2164374A1/en not_active Abandoned
- 1995-12-06 EP EP95119179A patent/EP0716095A1/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008035527A1 (fr) * | 2006-09-21 | 2008-03-27 | Mmt Co., Ltd. | ANTICORPS MONOCLONAL ANTI-C1q |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2164374A1 (en) | 1996-06-09 |
EP0716095A1 (en) | 1996-06-12 |
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