JPH08120000A - 抗ヒトビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンｉｉｉ 複合体モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法 - Google Patents
抗ヒトビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンｉｉｉ 複合体モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法Info
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- JPH08120000A JPH08120000A JP6278278A JP27827894A JPH08120000A JP H08120000 A JPH08120000 A JP H08120000A JP 6278278 A JP6278278 A JP 6278278A JP 27827894 A JP27827894 A JP 27827894A JP H08120000 A JPH08120000 A JP H08120000A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規モノクローナル抗体、それ抗体を分泌す
るハイブリドーマ及びその抗体を用いる免疫学的測定方
法を提供する。 【構成】 新規モノクローナル抗体は、ビトロネクチン
・トロンビン・アンチトロンビンIII 複合体（ＶＴＡ
Ｔ）と特異的に反応するが、遊離ビトロネクチン、遊離
トロンビン及び遊離アンチトロンビンIII とは反応しな
い。 【効果】 ＶＴＡＴを高感度で定量できる。また、抗ト
ロンビン・アンチトロンビンIII 複合体（ＴＡＴ）モノ
クローナル抗体と組合わせて使用すると、更に高感度で
ＶＴＡＴを測定できる。
るハイブリドーマ及びその抗体を用いる免疫学的測定方
法を提供する。 【構成】 新規モノクローナル抗体は、ビトロネクチン
・トロンビン・アンチトロンビンIII 複合体（ＶＴＡ
Ｔ）と特異的に反応するが、遊離ビトロネクチン、遊離
トロンビン及び遊離アンチトロンビンIII とは反応しな
い。 【効果】 ＶＴＡＴを高感度で定量できる。また、抗ト
ロンビン・アンチトロンビンIII 複合体（ＴＡＴ）モノ
クローナル抗体と組合わせて使用すると、更に高感度で
ＶＴＡＴを測定できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗ビトロネクチン・ト
ロンビン・アンチトロンビンIII 複合体モノクローナル
抗体、前記モノクローナル抗体を分泌するハイブリドー
マ及び前記モノクローナル抗体を用いるビトロネクチン
・トロンビン・アンチトロンビンIII複合体の免疫学的
測定方法に関する。
ロンビン・アンチトロンビンIII 複合体モノクローナル
抗体、前記モノクローナル抗体を分泌するハイブリドー
マ及び前記モノクローナル抗体を用いるビトロネクチン
・トロンビン・アンチトロンビンIII複合体の免疫学的
測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】臨床分野において、血中のトロンビンを
測定することは、播種性血管内凝固や血栓症などの凝固
亢進状態を知るうえで重要である。しかしながら、トロ
ンビンそのものを測定することはできないので、代わり
にトロンビンが血中のアンチトロンビンIII （以下ＡＴ
III ともいう）と速やかに結合して生ずるトロンビン・
アンチトロンビンIII 複合体（以下ＴＡＴともいう）を
測定して、その量からトロンビンの量を推定して血液の
凝固活性化の指標としている。しかしながら、ＴＡＴは
血中のビトロネクチンと速やかに結合して、ビトロネク
チン・トロンビン・アンチトロンビンIII 複合体（ＶＴ
ＡＴ）を形成し、代謝される。従って、ＴＡＴを指標と
することが適切であるかどうかは、厳密な意味で不明で
ある。また、ＶＴＡＴを指標とする方が、より適切であ
るとも考えられる。
測定することは、播種性血管内凝固や血栓症などの凝固
亢進状態を知るうえで重要である。しかしながら、トロ
ンビンそのものを測定することはできないので、代わり
にトロンビンが血中のアンチトロンビンIII （以下ＡＴ
III ともいう）と速やかに結合して生ずるトロンビン・
アンチトロンビンIII 複合体（以下ＴＡＴともいう）を
測定して、その量からトロンビンの量を推定して血液の
凝固活性化の指標としている。しかしながら、ＴＡＴは
血中のビトロネクチンと速やかに結合して、ビトロネク
チン・トロンビン・アンチトロンビンIII 複合体（ＶＴ
ＡＴ）を形成し、代謝される。従って、ＴＡＴを指標と
することが適切であるかどうかは、厳密な意味で不明で
ある。また、ＶＴＡＴを指標とする方が、より適切であ
るとも考えられる。
【０００３】実際に、従来法でも、ビトロネクチン・ト
ロンビン・アンチトロンビンIII 複合体（ＶＴＡＴ）の
測定が行われていた。その測定方法では抗アンチトロン
ビンIII モノクローナル抗体を固相に固定化し、ヒト血
漿などの体液試料を接触させることにより得られる固相
抗体と結合したＶＴＡＴ複合体に対し、酵素標識した抗
ビトロネクチンモノクローナル抗体を作用させることに
よって実施されていた。
ロンビン・アンチトロンビンIII 複合体（ＶＴＡＴ）の
測定が行われていた。その測定方法では抗アンチトロン
ビンIII モノクローナル抗体を固相に固定化し、ヒト血
漿などの体液試料を接触させることにより得られる固相
抗体と結合したＶＴＡＴ複合体に対し、酵素標識した抗
ビトロネクチンモノクローナル抗体を作用させることに
よって実施されていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この方
法ではヒト血漿などの体液試料に共存しているＶＴＡＴ
に比べて大過剰（約１０万倍）のアンチトロンビンIII
の干渉を免れることは不可能であり、実際上、ＶＴＡＴ
を測定することはできない（特開平２−６６４５８号公
報）。また、ＴＡＴの測定もできない。従って、本発明
の目的は、新規なモノクローナル抗体を提供することに
より、アンチトロンビンIII の干渉を受けずに正確にＶ
ＴＡＴを測定する手段を提供することにある。
法ではヒト血漿などの体液試料に共存しているＶＴＡＴ
に比べて大過剰（約１０万倍）のアンチトロンビンIII
の干渉を免れることは不可能であり、実際上、ＶＴＡＴ
を測定することはできない（特開平２−６６４５８号公
報）。また、ＴＡＴの測定もできない。従って、本発明
の目的は、新規なモノクローナル抗体を提供することに
より、アンチトロンビンIII の干渉を受けずに正確にＶ
ＴＡＴを測定する手段を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、ビ
トロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンIII 複合
体（ＶＴＡＴ）と特異的に反応するが、遊離ビトロネク
チン、遊離トロンビン及び遊離アンチトロンビンIII
（ＡＴIII ）と反応せず、好ましくは更にトロンビン・
アンチトロンビンIII 複合体（ＴＡＴ）とも反応しない
ことを特徴とするモノクローナル抗体に関する。更に、
本発明は、前記モノクローナル抗体を分泌することを特
徴とするハイブリドーマ、及び、前記モノクローナル抗
体を用いることを特徴とするビトロネクチン・トロンビ
ン・アンチトロンビンIII 複合体（ＶＴＡＴ）の免疫学
的測定方法にも関する。更にまた、本発明は、前記モノ
クローナル抗体と共に、トロンビン・アンチトロンビン
III 複合体（ＴＡＴ）と特異的に反応するが、遊離トロ
ンビン及び遊離アンチトロンビンIII と反応しないモノ
クローナル抗体を用いて、ビトロネクチン・トロンビン
・アンチトロンビンIII 複合体（ＶＴＡＴ）と共に、ト
ロンビン・アンチトロンビンIII 複合体（ＴＡＴ）を免
疫学的に測定する方法にも関する。
トロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンIII 複合
体（ＶＴＡＴ）と特異的に反応するが、遊離ビトロネク
チン、遊離トロンビン及び遊離アンチトロンビンIII
（ＡＴIII ）と反応せず、好ましくは更にトロンビン・
アンチトロンビンIII 複合体（ＴＡＴ）とも反応しない
ことを特徴とするモノクローナル抗体に関する。更に、
本発明は、前記モノクローナル抗体を分泌することを特
徴とするハイブリドーマ、及び、前記モノクローナル抗
体を用いることを特徴とするビトロネクチン・トロンビ
ン・アンチトロンビンIII 複合体（ＶＴＡＴ）の免疫学
的測定方法にも関する。更にまた、本発明は、前記モノ
クローナル抗体と共に、トロンビン・アンチトロンビン
III 複合体（ＴＡＴ）と特異的に反応するが、遊離トロ
ンビン及び遊離アンチトロンビンIII と反応しないモノ
クローナル抗体を用いて、ビトロネクチン・トロンビン
・アンチトロンビンIII 複合体（ＶＴＡＴ）と共に、ト
ロンビン・アンチトロンビンIII 複合体（ＴＡＴ）を免
疫学的に測定する方法にも関する。
【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体は、本発明による新規な
ハイブリドーマ（好ましくはマウス・ハイブリドーマ）
を、それぞれ培地又は哺乳動物（特にはマウス）の腹腔
内で培養することによって製造することができる。本発
明によるハイブリドーマは、一般的にはＶＴＡＴで免疫
したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とを、Ｋｏｈ
ｌｅｒ及びＭｉｌｉｓｔｅｉｎの細胞融合の基本方法
〔Ｎａｔｕｒｅ，第２５６巻，４９５頁（１９７５年）
参照〕により製造することが可能である。詳細には、下
記実施例で説明する。
抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体は、本発明による新規な
ハイブリドーマ（好ましくはマウス・ハイブリドーマ）
を、それぞれ培地又は哺乳動物（特にはマウス）の腹腔
内で培養することによって製造することができる。本発
明によるハイブリドーマは、一般的にはＶＴＡＴで免疫
したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とを、Ｋｏｈ
ｌｅｒ及びＭｉｌｉｓｔｅｉｎの細胞融合の基本方法
〔Ｎａｔｕｒｅ，第２５６巻，４９５頁（１９７５年）
参照〕により製造することが可能である。詳細には、下
記実施例で説明する。
【０００７】また、上記のハイブリドーマを培養する培
地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地であれ
ばよく、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須
培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｅ
ａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ
ｍｅｄｉｕｍ 以下、ＤＭＥと記す）にウシ胎児血清、
Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸及び抗生物質（ペニシ
リンＧとストレプトマイシン）を含む培地が用いられ
る。
地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地であれ
ばよく、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須
培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｅ
ａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ
ｍｅｄｉｕｍ 以下、ＤＭＥと記す）にウシ胎児血清、
Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸及び抗生物質（ペニシ
リンＧとストレプトマイシン）を含む培地が用いられ
る。
【０００８】このようにして製造された培養液又はマウ
スの腹水から、タンパク質の単離、精製に一般的に用い
られる方法により前述の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体
を分離、精製することが可能である。そのような方法と
しては、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオ
ン交換カラムクロマトグラフィー、分子節ゲルを用いる
分子節カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多
糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、
凍結乾燥などがある。
スの腹水から、タンパク質の単離、精製に一般的に用い
られる方法により前述の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体
を分離、精製することが可能である。そのような方法と
しては、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオ
ン交換カラムクロマトグラフィー、分子節ゲルを用いる
分子節カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多
糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、
凍結乾燥などがある。
【０００９】このようにして得られた本発明の抗ＶＴＡ
Ｔモノクローナル抗体は、遊離のビトロネクチン、遊離
のＡＴIII 及び遊離のトロンビンとは結合せず、好まし
くは更にＴＡＴとも反応しないで、ＶＴＡＴとだけ結合
する能力を有し、ＶＴＡＴの免疫定量用の試薬として有
用である。本発明の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体（例
えば後述の実施例で得られたＶＡＴ−１及びＶＡＴ−
２）は、酵素免疫定量法（ＥＩＡ）あるいは発光免疫定
量法（ＬＩＡ）における試薬として使用することができ
る。酵素免疫定量法の例としては、マイクロタイターあ
るいはプラスチックチューブを用いるワン・ステップ・
サンドイッチ酵素免疫定量法を挙げることができる。こ
の酵素免疫定量法の具体例は、下記実施例７に示す通り
であるが、一般的には、ＶＴＡＴの互いに異なった抗原
決定基を認識する２種類の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗
体を用いて行い、まずマイクロタイター・プレートの穴
（ウエル）あるいはプラスチックチューブを前もって１
種類の抗体（例えばＶＡＴ−１）で感作させておき、次
に、この穴あるいはプラスチックチューブにＶＴＡＴを
含む被検体及び酵素標識した別種の抗体（例えば、ＶＡ
Ｔ−２）の溶液を入れ、約３０分間静置後清浄し、酵素
基質溶液を加えて３０分間程度酵素反応を行う。反応終
了後、比色法などにより、被検体中のＶＴＡＴの量を定
量することにより行うことが可能である。
Ｔモノクローナル抗体は、遊離のビトロネクチン、遊離
のＡＴIII 及び遊離のトロンビンとは結合せず、好まし
くは更にＴＡＴとも反応しないで、ＶＴＡＴとだけ結合
する能力を有し、ＶＴＡＴの免疫定量用の試薬として有
用である。本発明の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体（例
えば後述の実施例で得られたＶＡＴ−１及びＶＡＴ−
２）は、酵素免疫定量法（ＥＩＡ）あるいは発光免疫定
量法（ＬＩＡ）における試薬として使用することができ
る。酵素免疫定量法の例としては、マイクロタイターあ
るいはプラスチックチューブを用いるワン・ステップ・
サンドイッチ酵素免疫定量法を挙げることができる。こ
の酵素免疫定量法の具体例は、下記実施例７に示す通り
であるが、一般的には、ＶＴＡＴの互いに異なった抗原
決定基を認識する２種類の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗
体を用いて行い、まずマイクロタイター・プレートの穴
（ウエル）あるいはプラスチックチューブを前もって１
種類の抗体（例えばＶＡＴ−１）で感作させておき、次
に、この穴あるいはプラスチックチューブにＶＴＡＴを
含む被検体及び酵素標識した別種の抗体（例えば、ＶＡ
Ｔ−２）の溶液を入れ、約３０分間静置後清浄し、酵素
基質溶液を加えて３０分間程度酵素反応を行う。反応終
了後、比色法などにより、被検体中のＶＴＡＴの量を定
量することにより行うことが可能である。
【００１０】発光免疫定量法（ＬＩＡ）を利用する場合
には、本発明の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体の１種類
（例えばＶＡＴ−２）をポリスチレンビーズなどの担体
に感作させておき、次に、この担体にＶＴＡＴを含む被
検体を接解させ、必要に応じて担体を洗浄した後、発光
物質を標識した別種の抗体（例えばＶＡＴ−１）の溶液
を入れて反応させ、洗浄後、発光物質が発光する条件に
雰囲気を調整し、その発光量をルミホトメーターで測定
することで被検体中のＶＴＡＴ量を定量することにより
行うことが可能である。発光物質としてはルミノール又
はアクリジニウム誘導体などを用いることができる。
には、本発明の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体の１種類
（例えばＶＡＴ−２）をポリスチレンビーズなどの担体
に感作させておき、次に、この担体にＶＴＡＴを含む被
検体を接解させ、必要に応じて担体を洗浄した後、発光
物質を標識した別種の抗体（例えばＶＡＴ−１）の溶液
を入れて反応させ、洗浄後、発光物質が発光する条件に
雰囲気を調整し、その発光量をルミホトメーターで測定
することで被検体中のＶＴＡＴ量を定量することにより
行うことが可能である。発光物質としてはルミノール又
はアクリジニウム誘導体などを用いることができる。
【００１１】本発明のモノクローナル抗体をラテックス
凝集免疫法に使用する場合には、本発明のモノクローナ
ル抗体を感作したラテックスと被検試料とを接触させ、
それに伴う凝集の有無を測定することで、被検体中のＶ
ＴＡＴを定量することができる。使用するラテックスは
特に限定されるものではなく、例えば、ポリスチレンラ
テックス粒子を用いることができる。
凝集免疫法に使用する場合には、本発明のモノクローナ
ル抗体を感作したラテックスと被検試料とを接触させ、
それに伴う凝集の有無を測定することで、被検体中のＶ
ＴＡＴを定量することができる。使用するラテックスは
特に限定されるものではなく、例えば、ポリスチレンラ
テックス粒子を用いることができる。
【００１２】本発明の前記モノクローナル抗体と、トロ
ンビン・アンチトロンビンIII 複合体と特異的に反応す
るが、遊離トロンビン及び遊離アンチトロンビンIII と
反応しないモノクローナル抗体とを併用して、ＶＴＡＴ
と共にＴＡＴを免疫学的に測定することもできる。前記
の抗ＴＡＴモノクローナル抗体としては、例えば、特開
昭６２−１３８１８７号公報記載のモノクローナル抗
体、特には、ＡＴ−１を用いることができる。
ンビン・アンチトロンビンIII 複合体と特異的に反応す
るが、遊離トロンビン及び遊離アンチトロンビンIII と
反応しないモノクローナル抗体とを併用して、ＶＴＡＴ
と共にＴＡＴを免疫学的に測定することもできる。前記
の抗ＴＡＴモノクローナル抗体としては、例えば、特開
昭６２−１３８１８７号公報記載のモノクローナル抗
体、特には、ＡＴ−１を用いることができる。
【００１３】ＶＴＡＴとＴＡＴとを同時に測定する場合
にも、前記と同様に酵素免疫定量法、化学発光免疫定量
法又はラテックス凝集免疫定量法を利用することができ
る。例えばラテックス凝集法の場合には、本発明のＶＡ
Ｔ−１及び／又はＶＡＴ−２と前記のＡＴ−１をそれぞ
れ単独で別々にラテックス粒子に感作するか、あるいは
前記モノクローナル抗体の混合物をラテックス粒子に感
作したものを用いて、被検体中のＶＴＡＴと接触させ、
それに伴う凝集の有無を測定すればよい。また、酵素免
疫定量法あるいは発光免疫定量法の場合には、プレート
やビーズの担体に本発明のＴＡＴ−１及び／又はＶＡＴ
−２と前記のＡＴ−１を固定化し、本発明の別種のモノ
クローナル抗体あるいは抗アンチトロンビンIII 抗体
（ポリクローナル抗体）を酵素あるいは発光物質で標識
したものを用いて前記と同様の操作を行えばよい。本発
明による前記の各種測定法において、被検試料としては
ＶＴＡＴ及び場合によりＴＡＴを含む可能性のある試
料であれば特に限定はされないが、例えば、生体試料、
特には血液、血清、血漿などを挙げることができる。
にも、前記と同様に酵素免疫定量法、化学発光免疫定量
法又はラテックス凝集免疫定量法を利用することができ
る。例えばラテックス凝集法の場合には、本発明のＶＡ
Ｔ−１及び／又はＶＡＴ−２と前記のＡＴ−１をそれぞ
れ単独で別々にラテックス粒子に感作するか、あるいは
前記モノクローナル抗体の混合物をラテックス粒子に感
作したものを用いて、被検体中のＶＴＡＴと接触させ、
それに伴う凝集の有無を測定すればよい。また、酵素免
疫定量法あるいは発光免疫定量法の場合には、プレート
やビーズの担体に本発明のＴＡＴ−１及び／又はＶＡＴ
−２と前記のＡＴ−１を固定化し、本発明の別種のモノ
クローナル抗体あるいは抗アンチトロンビンIII 抗体
（ポリクローナル抗体）を酵素あるいは発光物質で標識
したものを用いて前記と同様の操作を行えばよい。本発
明による前記の各種測定法において、被検試料としては
ＶＴＡＴ及び場合によりＴＡＴを含む可能性のある試
料であれば特に限定はされないが、例えば、生体試料、
特には血液、血清、血漿などを挙げることができる。
【００１４】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１ ＶＴＡＴ複合体はＥ．Ｒ．ポダックらの方法〔ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ，第２６１巻，
７３８７−７３９２頁（１９８６）〕により精製した。
すなわち、ビトロネクチン８００μｇとトロンビン４０
０μｇとアンチトロンビンIII ８００μｇを塩化ナトリ
ウム０．９％を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）１ｍｌ中に加え、３７℃で３０分間反応させ、
ＶＴＡＴ複合体を調製した。更に、セファアクリル Ｓ
−３００（ファルマー社；スウェーデン）による分子ふ
るいクロマトグラフィーにより精製し、精製ＶＴＡＴ
（Ａ２８０ｎｍ＝１．０のＶＴＡＴ）１ｍｌを得た。こ
のようにして得た精製ＶＴＡＴは、以下の実施例におい
て、免疫原として、また抗ＶＴＡＴ抗体産生性ハイブリ
ドーマを選別するためのＥＬＩＳＡ用抗原として使用し
た。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１ ＶＴＡＴ複合体はＥ．Ｒ．ポダックらの方法〔ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ，第２６１巻，
７３８７−７３９２頁（１９８６）〕により精製した。
すなわち、ビトロネクチン８００μｇとトロンビン４０
０μｇとアンチトロンビンIII ８００μｇを塩化ナトリ
ウム０．９％を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）１ｍｌ中に加え、３７℃で３０分間反応させ、
ＶＴＡＴ複合体を調製した。更に、セファアクリル Ｓ
−３００（ファルマー社；スウェーデン）による分子ふ
るいクロマトグラフィーにより精製し、精製ＶＴＡＴ
（Ａ２８０ｎｍ＝１．０のＶＴＡＴ）１ｍｌを得た。こ
のようにして得た精製ＶＴＡＴは、以下の実施例におい
て、免疫原として、また抗ＶＴＡＴ抗体産生性ハイブリ
ドーマを選別するためのＥＬＩＳＡ用抗原として使用し
た。
【００１５】実施例２ （ａ）免疫化した脾臓細胞の調製：前記実施例１で調製
したＶＴＡＴ免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等
量のフロインド氏完全アジュバンドと乳化するまで混合
し、その混合液２００μｌをマウス腹腔内に投与するこ
とにより免疫を行った（第１回免疫）。３０日経過後、
該マウスに上記と同様の方法でマウス腹腔内に投与した
（第２免疫）。第２回免疫から２１日経過後、ＶＴＡＴ
免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量の生理食塩
水で希釈し、その希釈液２００μｌを、該マウスの静脈
内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、
脾臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に使用した。
したＶＴＡＴ免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等
量のフロインド氏完全アジュバンドと乳化するまで混合
し、その混合液２００μｌをマウス腹腔内に投与するこ
とにより免疫を行った（第１回免疫）。３０日経過後、
該マウスに上記と同様の方法でマウス腹腔内に投与した
（第２免疫）。第２回免疫から２１日経過後、ＶＴＡＴ
免疫原溶液（Ａ２８０ｎｍ＝０．１）を等量の生理食塩
水で希釈し、その希釈液２００μｌを、該マウスの静脈
内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過後、
脾臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に使用した。
【００１６】（ｂ）細胞融合：無菌的に摘出した上記の
脾臓を、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地５
ｍｌを入れたシャーレに入れた。次に、脾臓を、１０〜
１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５ｍｌで還流
して脾細胞を流出させた後、この脾細胞懸濁液をナイロ
ンメッシュに通した。この脾細胞５０ｍｌを遠心チュー
ブに集めて遠心（５００×ｇ，１０分間）した。こうし
て得たペレットにヘモライジング溶液（１５５ｍＭ−Ｎ
Ｈ4 Ｃｌ，１０ｍＭ−ＫＨＣＯ3 ，１ｍＭ−Ｎａ2 ＥＤ
ＴＡ，ｐＨ７．０）５ｍｌを加え、懸濁させた。０℃
で、５〜１０分間放置すると懸濁液中の赤血球が破壊さ
れた。１０〜１５％ウシ胎児血清１５ｍｌを含むＤＭＥ
培地を加えてから遠心分離した。こうして得られた細胞
ペレットをＤＭＥ培地で遠心法によって洗浄し、生きて
いる脾細胞数を測定した。
脾臓を、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地５
ｍｌを入れたシャーレに入れた。次に、脾臓を、１０〜
１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５ｍｌで還流
して脾細胞を流出させた後、この脾細胞懸濁液をナイロ
ンメッシュに通した。この脾細胞５０ｍｌを遠心チュー
ブに集めて遠心（５００×ｇ，１０分間）した。こうし
て得たペレットにヘモライジング溶液（１５５ｍＭ−Ｎ
Ｈ4 Ｃｌ，１０ｍＭ−ＫＨＣＯ3 ，１ｍＭ−Ｎａ2 ＥＤ
ＴＡ，ｐＨ７．０）５ｍｌを加え、懸濁させた。０℃
で、５〜１０分間放置すると懸濁液中の赤血球が破壊さ
れた。１０〜１５％ウシ胎児血清１５ｍｌを含むＤＭＥ
培地を加えてから遠心分離した。こうして得られた細胞
ペレットをＤＭＥ培地で遠心法によって洗浄し、生きて
いる脾細胞数を測定した。
【００１７】一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細
胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４約２×１０
7 個に上記脾細胞約１×１０8 個を加え、ＤＭＥ培地中
でよく混合し、遠心分離を行った（５００×ｇ、１０分
間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、
３８℃に保温しておいた４０％ポリエチレングリコール
４０００溶液０．５ｍｌを滴下し、遠心チューブを、手
で１分間穏やかに回転することによってポリエチレング
リコール溶液と細胞ペレットを混合させた。次に、３８
℃に保温しておいたＤＭＥ培地を、３０秒毎に１ｍｌ加
えてチューブを穏やかに回転させた。この操作を１０回
繰り返した後、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ
培地２０ｍｌを加えて、遠心分離（５００×ｇ，１０分
間）を行った。上清を除去した後、細胞ペレットを１０
〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地に
アミノプテリン４×１０-7Ｍ，チミジン１．６×１０-5
Ｍ，ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加した
のも）で、遠心法によって２回洗浄後、上記ＨＡＴ培地
４０ｍｌに懸濁した。この細胞懸濁液を９６ウエル細胞
培養プレートの各ウエルに２００μｌずつ分注し、３７
℃で、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開始
した。培養中、２〜３日間隔で各ウエルの培地を約１０
０μｌ除き、新たに上記のＨＡＴ培地を１００μｌ加え
ることによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを
選択した。８日目頃から１０〜１５％ウシ胎児血清を含
むＨＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６×１０-5Ｍ，
ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加したも
の）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察するととも
に、約１０日目に、下述のＥＬＳＩＡ法により、抗ＶＴ
ＡＴ抗体産生ハイブリドーマをクスリーニングした。
胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４約２×１０
7 個に上記脾細胞約１×１０8 個を加え、ＤＭＥ培地中
でよく混合し、遠心分離を行った（５００×ｇ、１０分
間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、
３８℃に保温しておいた４０％ポリエチレングリコール
４０００溶液０．５ｍｌを滴下し、遠心チューブを、手
で１分間穏やかに回転することによってポリエチレング
リコール溶液と細胞ペレットを混合させた。次に、３８
℃に保温しておいたＤＭＥ培地を、３０秒毎に１ｍｌ加
えてチューブを穏やかに回転させた。この操作を１０回
繰り返した後、１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ
培地２０ｍｌを加えて、遠心分離（５００×ｇ，１０分
間）を行った。上清を除去した後、細胞ペレットを１０
〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地に
アミノプテリン４×１０-7Ｍ，チミジン１．６×１０-5
Ｍ，ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加した
のも）で、遠心法によって２回洗浄後、上記ＨＡＴ培地
４０ｍｌに懸濁した。この細胞懸濁液を９６ウエル細胞
培養プレートの各ウエルに２００μｌずつ分注し、３７
℃で、５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開始
した。培養中、２〜３日間隔で各ウエルの培地を約１０
０μｌ除き、新たに上記のＨＡＴ培地を１００μｌ加え
ることによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを
選択した。８日目頃から１０〜１５％ウシ胎児血清を含
むＨＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６×１０-5Ｍ，
ヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加したも
の）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察するととも
に、約１０日目に、下述のＥＬＳＩＡ法により、抗ＶＴ
ＡＴ抗体産生ハイブリドーマをクスリーニングした。
【００１８】（ｃ）ハイブリドーマの樹立 ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無はＥＬＳＩ
Ａ法により測定した。９６ウエルＥＬＳＩＡ用プレート
（ＩｍｍｕｌｏｎII；日本ダイナテック株式会社）の各
ウエルに、前述の精製ＶＴＡＴ溶液（Ａ２８０ｎｍ＝
０．０５，生理食塩水で希釈したもの）を５０μｌずつ
分注し、２５℃で２時間放置した。次に、０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０（ＩＣＩ社の登録商標）−生理食塩水で３
回洗浄した後、各ウエルに培養上清を５０μｌ加え、２
５℃で１時間反応させた。次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０−生理食塩水で２００倍に希釈したペルオキシダー
ゼ結合抗マウス抗体（ダコ社；デンマーク）５０μｌを
各ウエルに加えた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０−生理食塩水で各ウエルを３回洗浄し、０．５ｍＭ
アミノアンチピリンと１０ｍＭフェノールと０．００５
％過酸化水素水とを含む溶液２５０μｌを各ウエルに加
え、２５℃で３０分間反応させ、各ウエルの４９０ｎｍ
における吸光度を測定した。その結果、１９２ウエル
中、２３ウエルに抗体産生が認められた。
Ａ法により測定した。９６ウエルＥＬＳＩＡ用プレート
（ＩｍｍｕｌｏｎII；日本ダイナテック株式会社）の各
ウエルに、前述の精製ＶＴＡＴ溶液（Ａ２８０ｎｍ＝
０．０５，生理食塩水で希釈したもの）を５０μｌずつ
分注し、２５℃で２時間放置した。次に、０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０（ＩＣＩ社の登録商標）−生理食塩水で３
回洗浄した後、各ウエルに培養上清を５０μｌ加え、２
５℃で１時間反応させた。次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０−生理食塩水で２００倍に希釈したペルオキシダー
ゼ結合抗マウス抗体（ダコ社；デンマーク）５０μｌを
各ウエルに加えた。反応終了後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０−生理食塩水で各ウエルを３回洗浄し、０．５ｍＭ
アミノアンチピリンと１０ｍＭフェノールと０．００５
％過酸化水素水とを含む溶液２５０μｌを各ウエルに加
え、２５℃で３０分間反応させ、各ウエルの４９０ｎｍ
における吸光度を測定した。その結果、１９２ウエル
中、２３ウエルに抗体産生が認められた。
【００１９】上記のＥＬＩＳＡ法によって認められた培
養上清中の抗ＶＴＡＴ抗体が、ビトロネクチン、ＡＴII
I 、トロンビン及びＴＡＴと反応するか否かを、ビトロ
ネクチン、ＡＴIII 、トロンビン及びＴＡＴを感作した
９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレートを用いて上記と同様の
方法で測定した。その結果、ＶＴＡＴと反応した１５ウ
エルの培養上清中、８ウエルの培養上清がＴＡＴとＡＴ
III とも、５ウエルの培養上清がビトロネクチンとも、
反応した。一方、トロンビンとは全く反応しなかった。
ビトロネクチン、ＡＴIII 、トロンビン及びＴＡＴとは
反応しないで、ＶＴＡＴのみに特異的に反応する２ウエ
ル中のハイブリドーマを２４ウエルプレートに移し、１
０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地で４〜５日間培
養した。その後、再度ＥＬＩＳＡ法によって「抗ＶＴＡ
Ｔ特異的抗体」（以下単に抗ＶＴＡＴ抗体という）の産
生の有無を確認してから限界希釈法によりクローニング
した。限界希釈法は、ＨＴ培地でハイブリドーマが５個
／ｍｌとなるように希釈した細胞浮遊液を、予め正常Ｂ
ＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔細胞がウエルあたり２×１０
4個分注してある９６ウエルプレートの各ウエルに１０
０μｌずつ分注した。約１０日後、ＥＬＩＳＡ法によっ
て、抗ＶＴＡＴ抗体を産生するハイブリドーマのクロー
ンをスクリーニングした。その結果、各ハイブリドーマ
につき、２０〜４０個の抗体産生クローンが得られた。
これらのクローンの中から、増殖性が良好で、抗体分泌
能が高く、しかも安定なクローンを選び、前述と同様の
方法で再クローン化を行い、「抗ＶＴＡＴ特異的抗体」
産生ハイブリドーマＶＡＴ−１、及びＶＡＴ−２を樹立
した。これらのハイブリドーマＶＡＴ−１及びＶＡＴ−
２から分泌される抗体はビトロネクチン・トロンビン複
合体（ＶＴ）とは反応しなかった。
養上清中の抗ＶＴＡＴ抗体が、ビトロネクチン、ＡＴII
I 、トロンビン及びＴＡＴと反応するか否かを、ビトロ
ネクチン、ＡＴIII 、トロンビン及びＴＡＴを感作した
９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレートを用いて上記と同様の
方法で測定した。その結果、ＶＴＡＴと反応した１５ウ
エルの培養上清中、８ウエルの培養上清がＴＡＴとＡＴ
III とも、５ウエルの培養上清がビトロネクチンとも、
反応した。一方、トロンビンとは全く反応しなかった。
ビトロネクチン、ＡＴIII 、トロンビン及びＴＡＴとは
反応しないで、ＶＴＡＴのみに特異的に反応する２ウエ
ル中のハイブリドーマを２４ウエルプレートに移し、１
０〜１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地で４〜５日間培
養した。その後、再度ＥＬＩＳＡ法によって「抗ＶＴＡ
Ｔ特異的抗体」（以下単に抗ＶＴＡＴ抗体という）の産
生の有無を確認してから限界希釈法によりクローニング
した。限界希釈法は、ＨＴ培地でハイブリドーマが５個
／ｍｌとなるように希釈した細胞浮遊液を、予め正常Ｂ
ＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔細胞がウエルあたり２×１０
4個分注してある９６ウエルプレートの各ウエルに１０
０μｌずつ分注した。約１０日後、ＥＬＩＳＡ法によっ
て、抗ＶＴＡＴ抗体を産生するハイブリドーマのクロー
ンをスクリーニングした。その結果、各ハイブリドーマ
につき、２０〜４０個の抗体産生クローンが得られた。
これらのクローンの中から、増殖性が良好で、抗体分泌
能が高く、しかも安定なクローンを選び、前述と同様の
方法で再クローン化を行い、「抗ＶＴＡＴ特異的抗体」
産生ハイブリドーマＶＡＴ−１、及びＶＡＴ−２を樹立
した。これらのハイブリドーマＶＡＴ−１及びＶＡＴ−
２から分泌される抗体はビトロネクチン・トロンビン複
合体（ＶＴ）とは反応しなかった。
【００２０】実施例３：モノクローナル抗体の製造 （ａ）イン・ビトロ法 マウスハイブリドーマＶＡＴ−１及びＶＡＴ−２を各々
１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地中で３７℃にて、
５％二酸化炭素雰囲気中で７２〜９６時間培養した。培
養物を遠心分離（１００００×ｇ，１０分）した後、上
清に固形の硫酸アンモニウムを５０％最終濃度となるよ
うに徐々に加えた。混合物を氷冷下３０分間撹拌した
後、６０分間放置し、遠心分離（１００００×ｇ，１０
分）した後、得られた沈渣を少量の１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量の１０ｍＭリ
ン酸緩衝液に対して透析した。これを、１０ｍＭリン酸
緩衝液で既に平衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラム
に充填した。モノクローナル抗体の溶出は１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ８．０）と０．２Ｍ ＮａＣｌを含む１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）の間で濃度勾配法に
より行った。溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過
法で濃縮し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対
して透析した。ウシ血清ＩｇＧを除くために、透析物を
ヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムに通
した。次に通過液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化したプロテインＡ−セファロース４Ｂのカ
ラムに充填した。カラムをｐＨ３．５の緩衝液で溶出し
て、精製した抗ＶＴＡＴ抗体ＶＡＴ−１の溶液を得た。
同様にしてＶＡＴ−２の溶液も得た。
１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地中で３７℃にて、
５％二酸化炭素雰囲気中で７２〜９６時間培養した。培
養物を遠心分離（１００００×ｇ，１０分）した後、上
清に固形の硫酸アンモニウムを５０％最終濃度となるよ
うに徐々に加えた。混合物を氷冷下３０分間撹拌した
後、６０分間放置し、遠心分離（１００００×ｇ，１０
分）した後、得られた沈渣を少量の１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量の１０ｍＭリ
ン酸緩衝液に対して透析した。これを、１０ｍＭリン酸
緩衝液で既に平衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラム
に充填した。モノクローナル抗体の溶出は１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ８．０）と０．２Ｍ ＮａＣｌを含む１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）の間で濃度勾配法に
より行った。溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過
法で濃縮し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対
して透析した。ウシ血清ＩｇＧを除くために、透析物を
ヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムに通
した。次に通過液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化したプロテインＡ−セファロース４Ｂのカ
ラムに充填した。カラムをｐＨ３．５の緩衝液で溶出し
て、精製した抗ＶＴＡＴ抗体ＶＡＴ−１の溶液を得た。
同様にしてＶＡＴ−２の溶液も得た。
【００２１】（ｂ）イン・ビボ法 プリスタン（２，６，１，１４−テトラメチルペンタデ
カン）０．５ｍｌを１０から１２週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系
マウスの腹腔内に投与した後、１４〜２０日目のマウス
腹腔内にインビトロで増殖させたハイブリドーマＶＡＴ
−１、又はＶＡＴ−２をマウス一匹あたり２×１０6 細
胞となるように接種した。各ハイブリドーマにつき一匹
のマウスから約１０〜１５ｍｌの腹水が得られた。その
抗体濃度は、２〜１０ｍｇ／ｍｌであった。腹水中のモ
ノクローナル抗体の精製（但し、ヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ
−セファロース４Ｂのカラムを通す操作は除く）は、上
記のインビトロ精製法と同様の方法で行った。
カン）０．５ｍｌを１０から１２週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系
マウスの腹腔内に投与した後、１４〜２０日目のマウス
腹腔内にインビトロで増殖させたハイブリドーマＶＡＴ
−１、又はＶＡＴ−２をマウス一匹あたり２×１０6 細
胞となるように接種した。各ハイブリドーマにつき一匹
のマウスから約１０〜１５ｍｌの腹水が得られた。その
抗体濃度は、２〜１０ｍｇ／ｍｌであった。腹水中のモ
ノクローナル抗体の精製（但し、ヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ
−セファロース４Ｂのカラムを通す操作は除く）は、上
記のインビトロ精製法と同様の方法で行った。
【００２２】実施例４：モノクローナル抗体の免疫グロ
ブリンクラス及び特異性の同定 抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体ＶＡＴ−１及びＶＡＴ−
２の免疫グロブリン・クラス、及び特異性の同定は、各
々オクテロニー免疫拡散法、及びエンザイムイムノアッ
セイ法〔前記実施例２（ｃ）に記載のＥＬＩＳＡ法と同
様の方法〕により行った。結果を表１並びに図１（ＶＡ
Ｔ−１）及び図２（ＶＡＴ−２）に示す。図１及び図２
において、Ｔはトロンビン、ＡはアンチトロンビンIII
、ＶＴはビトロネクチン・トロンビン複合体、ＴＡＴ
はトロンビン・アンチトロンビンIII 複合体、そしてＶ
ＴＡＴはビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビ
ンIII 複合体である。
ブリンクラス及び特異性の同定 抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体ＶＡＴ−１及びＶＡＴ−
２の免疫グロブリン・クラス、及び特異性の同定は、各
々オクテロニー免疫拡散法、及びエンザイムイムノアッ
セイ法〔前記実施例２（ｃ）に記載のＥＬＩＳＡ法と同
様の方法〕により行った。結果を表１並びに図１（ＶＡ
Ｔ−１）及び図２（ＶＡＴ−２）に示す。図１及び図２
において、Ｔはトロンビン、ＡはアンチトロンビンIII
、ＶＴはビトロネクチン・トロンビン複合体、ＴＡＴ
はトロンビン・アンチトロンビンIII 複合体、そしてＶ
ＴＡＴはビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビ
ンIII 複合体である。
【００２３】
【表１】免疫グロブリンのクラスモノクローナル抗体 免疫グロブリン・クラス ＶＡＴ−１ ＩｇＧ1 ＶＡＴ−２ ＩｇＧ1
【００２４】実施例５：ラテックススライド凝集免疫定
量法 抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体によるラテックス（日本
合成ゴム社製，０．４９７μｍ）の感作は次のような操
作で行った。２種類のモノクローナル抗体ＶＡＴ−１及
びＶＡＴ−２の各々の濃度が０．３ｍｇ／ｍｌの溶液１
０ｍｌに、ラテックス濃度が１％（ｗ／ｖ）になるよう
にラテックスを加え、２５℃で１時間激しく撹拌した。
次に、牛アルブミン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．２ｍ
ｌ添加し、２５℃で３０分間激しく撹拌した後、遠心分
離（２００００×ｇ，３０分間）を行った。沈渣を水５
０ｍｌに懸濁し、抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体感作ラ
テックスＶＴＡＴ・Ｌ−１として以下のラテックススラ
イド凝集免疫定量に用いた。次に、モノクローナル抗体
ＶＡＴ−１と特開平６２−１３８１８７号公報実施例３
に記載のＴＡＴに特異的に反応するモノクローナル抗体
ＡＴ−１との組み合わせを用いて上記と同様の方法で感
作ラテックスを調製し、ＶＴＡＴ測定用ラテックスＶＴ
ＡＴ・Ｌ−２として以下のラテックススライド凝集免疫
定量に用いた。
量法 抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体によるラテックス（日本
合成ゴム社製，０．４９７μｍ）の感作は次のような操
作で行った。２種類のモノクローナル抗体ＶＡＴ−１及
びＶＡＴ−２の各々の濃度が０．３ｍｇ／ｍｌの溶液１
０ｍｌに、ラテックス濃度が１％（ｗ／ｖ）になるよう
にラテックスを加え、２５℃で１時間激しく撹拌した。
次に、牛アルブミン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．２ｍ
ｌ添加し、２５℃で３０分間激しく撹拌した後、遠心分
離（２００００×ｇ，３０分間）を行った。沈渣を水５
０ｍｌに懸濁し、抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体感作ラ
テックスＶＴＡＴ・Ｌ−１として以下のラテックススラ
イド凝集免疫定量に用いた。次に、モノクローナル抗体
ＶＡＴ−１と特開平６２−１３８１８７号公報実施例３
に記載のＴＡＴに特異的に反応するモノクローナル抗体
ＡＴ−１との組み合わせを用いて上記と同様の方法で感
作ラテックスを調製し、ＶＴＡＴ測定用ラテックスＶＴ
ＡＴ・Ｌ−２として以下のラテックススライド凝集免疫
定量に用いた。
【００２５】スライド凝集板の各ウエルに感作ラテック
ス（０．２％）２５μｌを添加し、次に生理食塩水によ
る２倍希釈列の被検体２５μｌを加えた。このスライド
凝集板を６０回転／分で３分間回転させ、各ウエルの凝
集の有無を測定した。被検体中のＶＴＡＴの量は、同時
に測定した２倍希釈列の検量用複合体によるラテックス
凝集反応の有無から求めた。結果を表２に示す。
ス（０．２％）２５μｌを添加し、次に生理食塩水によ
る２倍希釈列の被検体２５μｌを加えた。このスライド
凝集板を６０回転／分で３分間回転させ、各ウエルの凝
集の有無を測定した。被検体中のＶＴＡＴの量は、同時
に測定した２倍希釈列の検量用複合体によるラテックス
凝集反応の有無から求めた。結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】 VTATの濃度(ng/ml) 160 80 40 20 10 5.0 2.5 1.25 ＶＴＡＴ・Ｌ−１ ＋ ＋ ＋ − − − − − ＶＴＡＴ・Ｌ−２ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 表２において、＋は凝集ありを、そして−は凝集なしを各々表している。
【００２７】実施例６：ワン・ステップ・サンドイッチ
酵素免疫定量法 抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体ＶＡＴ−２を２０ｍＭ炭
酸緩衝液中に１０μｇ／ｍｌの濃度で含む抗体液と、そ
れとは別に抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体ＶＡＴ−２及
び実施例６で用いた抗ＴＡＴモノクローナル抗体ＡＴ−
１を２０ｍＭ炭酸緩衝液中にそれぞれ５μｇ／ｍｌの濃
度で含む抗体液を調製し、それぞれ９６ウエル平底型ポ
リスチレン製マイクロタイター・プレートに、１００μ
ｌの量で入れて２５℃で３０分間静置した。そのプレー
トを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む生理食塩水で
３回洗浄した。こうして得た抗体感作プレートのウエル
に、被検体５０μｌ、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトアン
チトロンビンIII 抗体（ラビット，ダコ社：デンマー
ク）、０．１５Ｍ−ＮａＣｌ、及び２％ウシアルブミン
を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００μｌ
を加えた。２５℃で３０分間静置後、プレートを、０．
０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む生理食塩水で３回洗浄し
た。次いで、酵素基質液（１０ｍＭフェノール、２０ｍ
Ｍ−４−アミノアンチピリン、及び０．００５％過酸化
水素を含む液）２００μｌずつをプレートのそれぞれの
ウエルに添加した。２５℃で３０分間反応させた後、各
ウエルの４９０ｎｍにおける吸光度をＭＰ−５９０型マ
クロエライザ・ミニリーダー（ダイナテック社製）で測
定した被検体中のＶＴＡＴの量は、同時に測定した検量
用複合体の４９０ｎｍにおける吸光度から描いた検量線
から求めた。結果を図３に示す。図３において、Ａは本
発明のモノクローナル抗体ＶＡＴ−２と特開昭６２−１
３８１８７号公報の実施例３に記載のＴＡＴに特異的な
モノクローナル抗体ＡＴ−１の２種類を固定化した場合
の結果であり、Ｂは本発明のモノクローナル抗体ＶＡＴ
−２を固定化した場合の結果である。
酵素免疫定量法 抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体ＶＡＴ−２を２０ｍＭ炭
酸緩衝液中に１０μｇ／ｍｌの濃度で含む抗体液と、そ
れとは別に抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体ＶＡＴ−２及
び実施例６で用いた抗ＴＡＴモノクローナル抗体ＡＴ−
１を２０ｍＭ炭酸緩衝液中にそれぞれ５μｇ／ｍｌの濃
度で含む抗体液を調製し、それぞれ９６ウエル平底型ポ
リスチレン製マイクロタイター・プレートに、１００μ
ｌの量で入れて２５℃で３０分間静置した。そのプレー
トを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む生理食塩水で
３回洗浄した。こうして得た抗体感作プレートのウエル
に、被検体５０μｌ、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトアン
チトロンビンIII 抗体（ラビット，ダコ社：デンマー
ク）、０．１５Ｍ−ＮａＣｌ、及び２％ウシアルブミン
を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００μｌ
を加えた。２５℃で３０分間静置後、プレートを、０．
０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む生理食塩水で３回洗浄し
た。次いで、酵素基質液（１０ｍＭフェノール、２０ｍ
Ｍ−４−アミノアンチピリン、及び０．００５％過酸化
水素を含む液）２００μｌずつをプレートのそれぞれの
ウエルに添加した。２５℃で３０分間反応させた後、各
ウエルの４９０ｎｍにおける吸光度をＭＰ−５９０型マ
クロエライザ・ミニリーダー（ダイナテック社製）で測
定した被検体中のＶＴＡＴの量は、同時に測定した検量
用複合体の４９０ｎｍにおける吸光度から描いた検量線
から求めた。結果を図３に示す。図３において、Ａは本
発明のモノクローナル抗体ＶＡＴ−２と特開昭６２−１
３８１８７号公報の実施例３に記載のＴＡＴに特異的な
モノクローナル抗体ＡＴ−１の２種類を固定化した場合
の結果であり、Ｂは本発明のモノクローナル抗体ＶＡＴ
−２を固定化した場合の結果である。
【００２８】
【発明の効果】本発明の抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体
を使用すると、前記のように、ＶＴＡＴを感度よく定量
することができる。また、本発明の抗ＶＴＡＴモノクロ
ーナル抗体と、抗ＴＡＴモノクローナル抗体とを組み合
わせることにより、検体中にビトロネクチンと結合して
いないＴＡＴが存在していた場合でも両者を測定するこ
とができ、統合的にトロンビンを把握できるという利点
を有する。
を使用すると、前記のように、ＶＴＡＴを感度よく定量
することができる。また、本発明の抗ＶＴＡＴモノクロ
ーナル抗体と、抗ＴＡＴモノクローナル抗体とを組み合
わせることにより、検体中にビトロネクチンと結合して
いないＴＡＴが存在していた場合でも両者を測定するこ
とができ、統合的にトロンビンを把握できるという利点
を有する。
【図１】本発明による抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体Ｖ
ＡＴ−１のビトロネクチントロンビン、ＡＴIII 、Ｖ
Ｔ、ＴＡＴ及びＶＴＡＴとの結合力を、９６ウエルマイ
クロタイター・プレートを用いてエンザイムイムノアッ
セイ法で測定した結果を表すグラフである。
ＡＴ−１のビトロネクチントロンビン、ＡＴIII 、Ｖ
Ｔ、ＴＡＴ及びＶＴＡＴとの結合力を、９６ウエルマイ
クロタイター・プレートを用いてエンザイムイムノアッ
セイ法で測定した結果を表すグラフである。
【図２】本発明による抗ＶＴＡＴモノクローナル抗体Ｖ
ＡＴ−２のビトロネクチントロンビン、ＡＴIII 、Ｖ
Ｔ、ＴＡＴ及びＶＴＡＴとの結合力を、９６ウエルマイ
クロタイター・プレートを用いてエンザイムイムノアッ
セイ法で測定した結果を表すグラフである。
ＡＴ−２のビトロネクチントロンビン、ＡＴIII 、Ｖ
Ｔ、ＴＡＴ及びＶＴＡＴとの結合力を、９６ウエルマイ
クロタイター・プレートを用いてエンザイムイムノアッ
セイ法で測定した結果を表すグラフである。
【図３】ＶＴＡＴのサンドイッチＥＩＡ法による検量線
を示したグラフである。
を示したグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｌ 33/533 33/577 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 伊藤 由美子 東京都千代田区東神田１丁目11番４号 株 式会社ヤトロン内
Claims (5)
- 【請求項１】 ビトロネクチン・トロンビン・アンチト
ロンビンIII 複合体と特異的に反応するが、遊離ビトロ
ネクチン、遊離トロンビン及び遊離アンチトロンビンII
I と反応しないことを特徴とするモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ビトロネクチン・トロンビン・アンチト
ロンビンIII 複合体と特異的に反応するが、遊離ビトロ
ネクチン、遊離トロンビン及び遊離アンチトロンビンII
I と反応しないモノクローナル抗体を分泌することを特
徴とするハイブリドーマ。 - 【請求項３】 ビトロネクチン・トロンビン・アンチト
ロンビンIII 複合体と特異的に反応するが、遊離ビトロ
ネクチン、遊離トロンビン及び遊離アンチトロンビンII
I と反応しないモノクローナル抗体を使用することを特
徴とするビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビ
ンIII 複合体の免疫学的測定方法。 - 【請求項４】 トロンビン・アンチトロンビンIII 複合
体と特異的に反応するが、遊離トロンビン及び遊離アン
チトロンビンIII と反応しないモノクローナル抗体を併
用して、トロンビン・アンチトロンビンIII 複合体を同
時に定量する請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 免疫定量法が、酵素免疫定量法、化学発
光免疫定量法又はラテックス凝集免疫定量法である請求
項３又は４に記載の方法。
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|---|---|---|---|
| JP27827894A JP3841364B2 (ja) | 1994-10-18 | 1994-10-18 | 抗ヒトビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンｉｉｉ 複合体モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27827894A JP3841364B2 (ja) | 1994-10-18 | 1994-10-18 | 抗ヒトビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンｉｉｉ 複合体モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08120000A true JPH08120000A (ja) | 1996-05-14 |
| JP3841364B2 JP3841364B2 (ja) | 2006-11-01 |
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ID=17595126
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27827894A Expired - Fee Related JP3841364B2 (ja) | 1994-10-18 | 1994-10-18 | 抗ヒトビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンｉｉｉ 複合体モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3841364B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002316999A (ja) * | 2001-04-17 | 2002-10-31 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | モノクローナル抗体 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UY35457A (es) | 2013-03-14 | 2014-10-31 | Bayer Healthcare Llc | ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA ANTITROMBINA ß |
-
1994
- 1994-10-18 JP JP27827894A patent/JP3841364B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2002316999A (ja) * | 2001-04-17 | 2002-10-31 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | モノクローナル抗体 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3841364B2 (ja) | 2006-11-01 |
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