NO171169B - Monoklonale antistoffer eller fragmenter derav, spesifikke for alfa2-plasmininhibitor - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse omfatter monoklonalt antistoff eller monoklonalt antistoff-fragment av den type som er angitt i krav l<*>s ingress, spesielt slike som er spesifikke for en human a2~Plasmin~inhikitc>r / ©Her et cx2-antiplasmin, spesielt et monoklonalt antistoff som spesifikt blokkerer det reaktive sete på en human cx2-plasmin-inhibitor, dvs. det sete på a2-plasmin-inhibitoren som inhiberer fibrinolytisk aktivitet til plasmin, og følgelig undertrykker virkningen til den humane a2-plasmin-inhibitor som inhiberer den fibrinolytiske aktivitet til plasmin og påskynner fibrinolyse av plasmin; samt bruken av det monoklonale antistoff i immunologiske assay av human a2-plasmin-inhibitor; °9 til bruken av det monoklonale antistoff ved separasjon og fremstilling av human a2-plasmin-inhibitor.

Det er kjent at den humane c^-plasmin-inhibitor (heretter forkortet til "human c^-PI") er et enkeltkjedet glykoprotein irted et karbohydratinnhold på 11,7% og en molekylvekt på ca. 6 7.000, og som først ble isolert i ren form fra humant plasma av Aoki og Moroi og som virker som en sterk inhibitor som er i stand til å umiddelbart inhibere esteraseaktivite-ten til plasmin, et fibrinolytisk enzym [se Moroi & Aoki: The Journal of Biological Chemistry, 251, 5956-5965 (1976)].

På den andre side har humant c^-PI tre funksjoner. For det første har det et inhiberende sete for den fibrinolytiske aktivitet til plasmin (i den foreliggende beskrivelse blir dette sete referert til som det "reaktive sete") [se

B. Wiman & D. Coilen: The Journal of Biological CHemistry,

254, 9291-9297 (1979)]. For det andre har det et sete som reagerer med plasmin ved karboksylgruppeenden [B. Wiman & D. Coilen: European Journal of Biochemistry, 8_4, 573-

578 (1978)]. For det tredje har det et sete som reagerer med fibrin ved aminogruppeenden [Y. Sakata et al.' Thrombosis Research, 16./ 279-282 (1979)].

Det er kjent i klinisk medisin at nivået til humant c^-PI

i blodet minker ved abnormaliteter i de parenchymale lever-celler, og det har blitt rapportert at nivået av humant a2~ PI i blod viser en markert minking ved dekompensert lever-skrumping og fulminant hepatitt [se N. Aoki & T. Yamanaka: Clinica Chimica Acta, 8_4, 99-105 (1978)].

Nylig har de kjemiske, fysiske og biologiske egenskaper

til humant a2-PI blitt fremskaffet i detalj, og det er blitt funnet at humant a2~PI spesifikt kontrollerer og regulerer den fibrinolytiske mekanisme til plasmin og står for en viktig del av denne mekanisme [se f.eks. N. Aoki & P.C. Har-pel: "Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 10, 24-41

(1984)].

Følgelig ville fremskaffelsen av et monoklonalt antistoff som er i stand til å blokkere det relative sete til humant a2~PI spesifikt gjøre mengden av humant ct2-PI ^ b^01^ i stand til å bli nøyaktig og lett målt, og ville være svært viktig for å in vitro diagnostisere forskjellige sykdom-mer.

Den eneste litteraturreferanse som gjengir et monoklonalt antistoff til humant c^-PI er belgisk patentspesifikasjon nr. 896.543, publisert 16. aug. 1983. Denne patentspesifikasjon gjengir at 23 monoklonale antistoffer til c^-PI som kan klassifiseres i 11 antistoffgrupper med forskjellige epitop-spesifikke reaksjoner, ble erholdt, men klarer ikke å bestemme hvilke epitoper til ct-j-PI disse monoklonale antistoffer spesifikt ville gjenkjenne og binde seg til. ■

Det er derfor et hovedmål for denne oppfinnelse å fremskaffe et høyt spesifikt monoklonalt antistoff eller fragment derav med den funksjon å spesifikt blokkere det reaktive sete av humant o^-PI som inhiberer den fibrinolytiske aktivitet til plasmin og derved undertrykker virkningen til humant c^-PI som inhiberer den fibrinolytiske aktivitet til plasmin.

Et ytterligere mål for denne oppfinnelse er å anvende et slikt antistoff eller -fragment i en metode til immunologisk assay for cx2-PI i en assay-prøve.

Enda et videre mål for denne oppfinnelse er å fremskaffe et selektivt adsorberende stoff for oc2-PI ved å benytte det tidligere nevnte monoklonale antistoff, og anvende dette i en metode for å separere og gjenvinne oc2-PI ved å benytte en uløselig bærer.

Videre mål og fordeler av denne oppfinnelse vil gjøres tyde-ligere fra den følgende beskrivelse.

Ifølge én utførelse av denne oppfinnelse blir det fremkaffet et monoklonalt antistoff som er spesifikt for humant a2-PI, hvor nevnte antistoff har den funksjon å spesifikt blokkere det sete på humant ct2~PI som inhiberer den fibrinolytiske aktivitet til plasmin og undertrykke den fibrinolytiske aktivitets inhiberende funksjon til det humane a2-PI.

I henhold til denne oppfinnelse kan det monoklonale antistoff erholdes ved å etablere en hybridom cellelinje som er i stand til å produsere nevnte antistoff, og dyrke dette hybridom.

Hybridomet som er i stand til å danne det monoklonale antistoff fra denne oppfinnelse kan bli laget ved en teknikk kjent som Kohler og Milstein metoden (Kohler and Milstein, Nature, 256. 495-497 (1975)]. Spesifikt blir en mus, immunisert med humant cx2- PI, 0<? antistoffproduserende

celler, f .eks. miltceller, fra dette dyr fusjonert med musemyelomceller som er allment tilgjengelige. De fusjonerte celler blir skjermet ved kloning for fusjonerte celler som er i stand til å produsere det monoklonale antistoff i denne oppfinnelse. F.eks. blir de fusjonerte celler som er dannet syste-matisk skjermet for et antistoff som reagerer med humant c^-PI fiksert til mikrotitreringsplater. På denne måte blir hybridomceller som syntetiserer og utskiller et antistoff til f^-PI valgt ut. De resulterende hybridomceller blir dyrket i et medium inneholdende et serum eller ikke. Antistoff til humant c^-PI utskilt i en supernatant fra dyrkningsvæsken blir undersøkt på fibrinplater for undertrykkende virkning av fibrinolysen som inhiberer aktiviteten til humant o^-PI. Som et resultat kan et hybridom som er i stand til å produsere et monoklonalt antistoff med den virkning å spesifikt undertrykke den fibrinolyseinhiberende aktivitet til humant o^-PI bli isolert.

Det monoklonale antistoff i henhold til denne oppfinnelse kan fremskaffes fra produktet som kommer fra dette hybridom. Det resulterende monoklonale antistoff virker monospesifikt på det reaktive sete til humant o^-PI.

Det monoklonale antistoff fra denne oppfinnelse og metoden for dets fremstilling vil nå bli beskrevet i større detalj.

(A) Isolering og rensning av antigen

Humant a2-PI brukt som et antigen blir isolert i ren form

fra en human plasmaprøve ved hjelp av den tidligere nevnte metoden til Aoki og Moroi.

(B) Immunisering av pattedyr med humant c^-PI

Det er ingen spesielle begrensninger på de dyr som skal immu-niseres, og forskjellige pattedyr så som mus, rotter, mar-svin, kaniner, sauer, geiter, hunder og katter kan brukes. På grunn av den lette behandlingen ble Balb./c hannmus stort sett benyttet. Mus fra andre stammer kan også bli brukt. Immuniseringen bør være planlagt, og konsentrasjonen av humant a2-PI som skal benyttes i immuniseringen bør være valgt slik at tilstrekkelige mengder av antigenisk stimu-lerte lymfocytter kan bli dannet. F.eks. blir en mus immunisert intraperitonealt flere ganger med en liten mengde humant a2~' Pl ved gitte intervaller, og antigenet blir videre tilført intravenøst flere ganger for å øke titreringen av antistoffet. Flere dager etter den endelige immunisering blir antistoff-produserende celler, f.eks. lymfocytter, fortrinnsvis miltceller, tatt ut fra de immuniserte dyr. Den følgende beskrivelse er gitt med hensyn på å bruke miltceller som de antistoff-produserende celler, men det er underforstått at andre antistoff-produserende celler isolert fra immuniserte dyr like godt kan benyttes for cellefusjon.

(C) Cellefusjon

Milten blir tatt ut aseptisk fra det immuniserte dyr og en

miltcellesuspensjon blir forberedt fra denne. Miltcellene blir så fusjonert med myelomceller tatt fra en passende cellelinje i et fusjonsmedium i nærvær av en passende fu-sjonspromotor. Myolomcellene benyttet for fusjon kan erholdes fra ethvert pattedyr, men generelt er de. foretrukket som kommer fra samme type dyr som det immuniserte dyr. Det foretrukne blandeforhold mellom miltcellene og myolomcellene ligger generelt i området fra 20:1 til ca. 2:1, fortrinns-fra 10:1 til 2:1. ' Vanligvis er bruken av 0,5 til 1,5 ml av fusjonsmediet passende for ca. 10 miltceller. Passende fusjonsmedia er f.eks. fysiologisk saltvann, pufret saltvann, et serumfritt medium hvorav hvert inneholder fusjons-promotoren i en konsentrasjon på 30 til 70 %.

Hange myelomceller egnet for cellefusjon.er kjent. I eksemplene som skal gis senere benyttes P3-X63-Ag8-Ul celler

(som forkortes P3-U1) [se D.E. Yelton et al.: Curent Topics

in Microbiology and Immunology, 81, 1 (1978)]. De er en 8-azaguaninresistent cellelinje. De mangler hypoxantin-gua-ninfosforibosyltransferase, og kan derfor ikke overleve i HAT medium (inneholdende hypoxantin, aminopterin og tymi-

din). Videre, siden denne cellelinjen er av en ikke-sekre-

rende type som ikke skiller ut antistoff i seg selv, er den passende for hybridomet beskrevet av den foreliggende oppfinnelse. Andre myelomceller kan også brukes. Eksempler innbefatter P3-NSl-l-Ag4-l, NSl-Ag4/l, P3X63-Ag8, (MPCH-45, 6. TG1.7), SP2/0-Agl4, FO, X-63-Ag8-6.5.3, 210.RCY3.Agl.2.3, S194/5XX0.BU.1, SK0-007, og GM15006TG-A12.

Polyetylenglykol med en gjennomsnittlig molekylvekt på 1.000

til 4.000 kan med fordel benyttes som fusjonsprotoraor. Det kan også brukes andre fusjonspromotorer kjent i faget, så

som Sendai-virus. I de følgende eksempler er polyetylen-

glykol med en gjennomsnittlig molekylvekt på 1.540 benyt-

tet.

(D) Påvisning av fusjonerte celler

En blanding av de fusjonerte celler, ikke-fusjonerte miltceller og ikke-fusjonerte myelomceller fortynnes i en sepa-

rat beholder (så som en mikrotitreringsplate) med et selek-

tivt medium hvor de ikke-fusjonerte myelomceller ikke kan overleve, og dyrket i en tilstrekkelig tidsperiode for å

gjøre at de ikke-fusjonerte celler dør (ca. 1 uke). Dyrk-ningsmediet kan være ett som er resistent til et medika-

ment så som 8-azaguanin hvor de ikke-fusjonerte myelomcel-

ler ikke kan overleve, f.eks. ved tidligere nevnte HAT me-

dium. I det selektive medium dør de ikke-fusjonerte myelomceller. Siden de ikke-fusjonerte miltceller ikke har tu-moregenskaper dør de etter en viss tidsperiode (ca. 1 uke).

På den annen side kan de fusjonerte celler overleve i det selektive medium fordi de både er av tumor-opprinnelse fra de opprinnelige myelomceller og har egenskapene til de opphavelige miltceller.

(E) Bestemmelse av et antistoff til humant c^-PI i

hver beholder

Etter at hybridomceliene er funnet som beskrevet ovenfor, blir supernatanten av dyrkningsvæsken samlet opp og skjermet for et antistoff til humant cx2-PI ved enzymkoblet immu-noabsorbent assay (se f.eks. A.H.W.M. Schuurs'og B.K. van Weemen: Clin. Chim. Acta, 81, 1-40 (1977) ] .

(F) Utvelgelse av et hybridom i stand til å danne et antistoff med aktivitet til humant ot2-PI

Supernatanten fra dyrkningsvæsken funnet ved å dyrke hybridomet som danner et antistoff til humant a2~PI blir konsentrert og inkubert med det humane o^-^1 i en bestemt tidsperiode. Plasmin blir tilsatt til blandingen og blandingen blir plassert på en fibrinplate. Arealet av det oppløste fibrin blir målt. På denne måte velges det ut et hybridom som er i stand til å danne et antistoff med aktivitet mot humant a2~PI.

(G) Kloning av hybridomet i stand til å danne det ønskete antistoff

Hybridomet i stand til å produsere det ønskete antistoff kan klones ved en passende metode så som en begrensende for-tynn ingsmetode på to forskjellige måter. I den ene metode dyrkes hybridomet i et passende medium i en gitt tidsperiode og det monoklonale antistoff dannet av hybridomet kan fremskaffes fra supernatanten i dyrkningsvæsken. I den andre metode, kan hybridomet injiseres intraperitonealt i en syngenisk mus. Etter en viss tidsperiode kan det monoklonale antistoff dannet av hybridomet erholdes fra blodet og bukvannet til vertsdyret.

Det resulterende monoklonale antistoff er svært spesifikt til humant ct2~Pl og har den funksjon å spesifikt blokkere det reaktive sete til humant a2~PI, dvs. det sete til humant a2~PI som inhiberer den fibrinolytiske aktivitet til plasmin og undertrykke den iboende virkning til humant a2~ PI til å inhibere den fibrinolytiske aktivitet til plasmin. I foreliggende omtale og de påfølgende krav betyr uttrykket "blokkerer det reaktive sete" tilføringen eller kombi-nasjonen av det monoklonale antistoff til eller med det reaktive sete til humant c^-PI Pa en s^-^ måte at det monoklonale antistoff kjenner igjen det reaktive sete i seg selv eller ethvert av epitopene av humant o^-PI ^or ^er-ved å gjøre at det reaktive sete mister aktivitet.

Det er antatt at det monoklonale antistoff fremskaffet ved denne oppfinnelse, lik andre antistoffer, har i sin variable region et antigenbindende sete i stand til å fremskaffe den tidligere nevnte funksjon.

Det resulterende -æcndclonale antistoff blir spaltet ved hjelp av Porter's metode [se R.R. Porter, Biochemical Journal, 73, 119-126 (1959)] under anvendelse av papain, et pro-teolytisk enzym, og det isoleres en partiell struktur som er omgitt av en stiplet linje i figur 1 på de medfølgende tegninger, og som er merket "Fab".

Den partielle struktur Fab av det monoklonale antistoff un-dersøkes på en fibrinplate for dets undertrykkende virkning på aktivitet til humant o^-PI ^or a inhibere den fibrinolytiske aktivitet til plasmin. Dette fører til konklusjonen at selv den partielle struktur til Fab alene fra det monoklonale antistoff har den funksjon å spesifikt undertrykke aktiviteten til humant ct2_PI f°r a inhibere den fibrinolytiske aktivitet til plasmin.

Ifølge et annet synspunkt er det derfor fremskaffet et monoklonalt antistoff-fragment som består av minst Fab-regionen av et monoklonalt antistoff som er spesifikt til en human c^-plasmininhibitor og som har funksjonen å spesifikt blokkere det sete på human a2-plasmininhibitor som inhiberer den fibrinolytiske aktivitet til plasmin, dvs. det reaktive sete,og som har den funksjon å undertrykke aktiviteten til den humane a2~plasmininhibitor som inhiberer den fibrinolytiske aktivitet til plasmin. Et slikt fragment innbefatter ikke bare et papain-spaltet fragment, men også andre fragmenter inneholdende Fab-regionen erholdt etter kløvning med trypsin, plasmin, etc. Trypsin- og plasminspaltnings-stedene er vist ved piler i figur 1.

Det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelse eller dets Fab-inneholdende fragment fremstilt som ovenfor, kan bli brukt til å bestemme ct2~PI i en biologisk prøve slik som en human plasmaprøve fordi det har den funksjon spesifikt å blokkere det reaktive sete til humant a2-PI. En tidligere kjent metode for assay av a2~PI er en imraunodiffusjons-metode som innbefatter bruken av et antiserum til humant a^-PI [N. Aoki og I. Yamanaka: Clinica Chimica Acta, 84, 99-105 (1978)]. En annen metode er å tilsette et overskudd av plasmin til en assay-prøve og måle aktiviteten av gjenværende plasmin ikke bundet til ct2-PI (A.C. Tiger-Nilsson et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest., 37, 403-409 (1977)].

Ved å utføre den førstnevnte er det svært vanskelig å fremskaffe, et antiserum med en konstant aktivitet fordi antiserummet er av animalsk opprinnelse. Følgelig må man ta det bryderi å korrigere aktiviteten til antiserummet ved å bruke et standard reagens. Det har også den ulempe at det er krevet lange tidsperioder for imraunodiffusjon. I henhold til den sistnevnte blir mengden av humant c^-PI indirekte målt ved å måle mengden av det gjenværende plasmin. Følgelig er det gjenstand for varierende plasminaktiviteteffekter som inhiberer reagenser tilstede i assay-prøven og kan ikke på noen måte unngå feil i mengden av humant a2-plasmin som er indirekte målt. Nøyaktighet må også oppvises i denne metoden med hensyn til renhet eller stabilitet av det benyt-tede plasmin.

I motsetning til dette er det blitt funnet, i samsvar med denne oppfinnelse, at mengden av humant a2-plasmin i oppløs-ning kan bli bestemt immunologisk direkte og nøyaktig av såkalte "sandwich"-metoden, som benytter det monoklonale antistoff eller dets Fab-inneholdende fragment som er fremskaffet ved denne oppfinnelse.

Ut fra en ytterligere betraktning fremskaffer de monoklonale antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelse derfor en mulighet for immunologisk å bestemme en human cx2~Plasminin-hibitor i en assay-prøve ved å bruke et primært antistoff bundet til et uløselig fast bærestoff og et merket sekundært antistoff (den såkalte ,lsandwich"-metoden) , hvori de primære og sekundære antistoffer er anti-human A2~plasminin-hibitor-antistoffer eller deres Fab-regionholdige fragmenter som spesifikt gjenkjenner og binder seg til forskjellige epitope av den humane o<2-plasmininhibitor og én av dem er det monoklonale antistoff eller dets Fab-regioninneholdende fragment fra denne oppfinnelse.

Generelt er metoden for bestemmelse av tilstedeværelsen eller fraværet av et antigen eller måling av denne mengden ved å benytte antistoff som kombinerer seg med to forskjellige seter på antigenet kalt "sandwich"-metoden og er beskrevet f.eks. i Wide's Radioimmunoassay Methods, 199-206,

(1970).

Den immunologiske assay-metoden kan utføres ved å benytte anti-humant o<2~PI antistoffer som spesifikt gjenkjenner og binder seg til forskjelliger epitoper av humant a2-PI som de to antistoffer (primært og sekundært antistoff) og spesielt ved å benytte det monoklonale antistoff av denne oppfinnelsen som spesifikt blokkerer det reaktive sete av humant a2-PI soln ett av disse antistoffer. I denne metoden kan et fragment av det monoklonale antistoff fra foreliggende oppfinnelse som minst inneholder et Fab-region med et antigenbindende sete (variable region), også bli benyttet. Følgelig er det underforstått at med mindre annet er nevnt, gjengir uttrykket "antistoff" benyttet i den foreliggende beskrivelse også det fragment som i det minste inneholder Fab-regionen.

Derved gjør det monoklonale antistoff i henhold til denne oppfinnelse humant cx2-PI i oppløsning, f.eks. i en plasmaprøve, i stand til alltid å bli bestemt med høy nøyaktighet og uten forskjel-ler i kvaliteten på det brukte reagens. Da mengden av humant c^-PI blir direkte målt, påvirkes ikke prøven i det hele tatt av fremmed materiale, og kan bestemme humant a2_ PI nøyaktig etter korte tidsperioder. Følgelig fremskaffer den foreliggende oppfinnelse en mulighet for å bestemme humant o^-PI nøyaktig og raskt.

I henhold til påvisningsmetoden blir ett (pri-

mært antistoff) av de to antistoffer fiksert til en uløse-lig fast biarer, og det andre (sekundært antistoff) blir brukt i merket form. Det monoklonale antistoff fra denne oppfinnelse kan bli brukt som det primære antistoff fiksert til et uløselig fast antistoff, eller som det merkete sekundære antistoff. I hvert tilfelle er det i hovedsak ingen virkning på resultatene ved bestemmelsen av humant c^-PI.

Det anti-humane c^-PI antistoff som skal brukes i kombinasjon med det monoklonale antistoff fra denne oppfinnelse, kan være monoklonalt eller polyklonalt hvis det kan gjenkjenne og kombinere seg med et sete på det humane o^-PI som er forskjellig fra det reaktive sete. Generelt er det passende å bruke et monoklonalt antistoff som spesifikt gjenkjenner og kombinerer seg méd et sete på humant o^-PI som er forskjellig fra det reaktive sete og som utskilles fra et hybridom erholdt som et bi-produkt ved dannelsen av det monoklonale antistoff i den foreliggende oppfinnelse.

Det primære antistoff kan bindes til det uløselige faste bærestoff ved metoder som er i og for seg kjent. F.eks. kan en oppløsning av det primære antistoff og det uløselige faste bærestoff bringes i kontakt med hverandre og overlatt til å stå, hvorved antistoffet blir fysisk absorbert til '.... bærestoffet. Det er også mulig å kombinere de funksjonelle grupper til antistoffet, såsom en karboksyl-, amino-eller hydroksylgruppe, kjemisk med det uløselige faste bærestoff. Fortrinnsvis dekkes overflaten av bærestoffet,

hvor det primære antistoff er blitt fiksert, med en passende

substans så som bovinseriumalbumin for å unngå ikke-spesifikke kombinasjoner med det sekundære antistoff eller med assay-prøven.

Eksempler på det uløselige faste bærestoff benyttet til å fiksere det primære antistoff omfatter polymere materialer så som polystyren, polyetylen, polypropylen, polyestere, polyakrylonitril, fluor-inneholdende harpikser, nitro-cellulose, fornettet dekstran, polysakkarider og agarose, uorganiske materialer slik som glass og metall, og kombinasjoner av disse. De.t faste bærestoff kan være av forskjellig fasong, f.eks. i form av et fat, en sfære, en fiber, par-tikkel, kjede, skive, stav, beger, celle eller prøverør. Spesifikke eksempler på det uløselige faste bærestoff er plastbegere, plastkjedér, glasskjeder og metallpartikler.

Det sekundære antistoff blir merket med radioisotoper, enzymer eller luminisente substanser. Eksempler på radioisotoper er 3.25 I, 131 I, 14 C og 3H. Eksempler på enzymene er alkalisk fosfatase, peroksydase og beta-D-galaktosidase. Eksempler på luminisente substanser er fluorescein isotiocyanat og tetrametyl rhodamin isotiocyanat. Disse er bare ment som illustrasjon og andre merkestoffer benyttet i immunologiske assay kan også brukes. Kombinasjon mellom de merkende substanser med det sekundære antistoff kan bli utført med metoder som i og for seg er kjent, f.eks. ved metodene beskrevet i G.S. David: Biochem. Biophys. Res. Com-mun. , 4jS, 464-471 (1972), M. Imagawa et al., Anal. Lett., 16, 1509-1523 (1983) og M. Nishioka et al., Cancer Res.,

32, 162-166 (1972).

Det fikserte primære antistoff og det merkete sekundære antistoff bringes deretter i kontakt med en assay-prøve for bestemmelse av humant & 2~^ vé(^ en to-trinnsmetode som består av å bringe prøven først i kontakt med det fikserte primære antistoff og så med det merkete sekundære antistoff eller ved en efi-trinnsmetode som består av å bringe prøven i kontakt med det sekundære antistoff samtidig med det primære antistoff. Ett-trinnsmetoden er imidlertid fordelaktig i forhold til to-trinnsmetoden fordi det muliggjør en en-klere og raskere bestemmelse av humant a2~PI.

I to-trinnsmetoden blir det fikserte primære antistoff og prøven bragt i kontakt med hverandre og reagert ved en gitt temperatur i en gitt tidsperiode.. I løpet av denne tid kombinere det fikserte primære antistoff med den humane a2~PI i prøven. Etter vask med en passende vaskeoppløsning bringes reaksjonsproduktet i kontakt med og reageres med en oppløsning (dvs. en vandig oppløsning) med det merkete sekundære antistoff ved en gitt temperatur i en gitt tidsperiode. Reaksjonsproduktet vaskes med en passende vaske-oppløsning og mengden av den merkende substans som er tilstede på det uløselige faste bærestoff blir målt. Mengden av det humane c^-PI kan bli bestemt ved å sammenligne mengden av det merkende stoff med en kalibreringskurve som er trukket ved å benytte en assay-prøve som inneholder humant a2~Pl i en kjent konsentrasjon.

I ett-trinnsmetoden bringes det fikserte primære antistoff

i kontakt med og reageres med assay-prøveh og det merkete sekundære antistoff samtidig, fortrinnsvis med en blanding av prøven og det merkete sekundære antistoff ved en gitt temperatur i en gitt tidsperiode. Produktet blir så vasket med en passende vaskeoppløsning og mengden av det merkende stoff som er tilstede på det uløselige faste bærestoff blir målt som beskrevet ovenfor. Som et resultat kan mengden av humant o^-PI i prøven bestemmes.

Ifølge metodene beskrevet foran kan mengden av humant <*2~PI

i assay-prøven bli målt lett med god reproduserbarhet og stor nøyaktighet. Humant plasma, humant serum og en supernatant fra en cellekultur er eksempler på prøver som kan underkastes en assay ved de ovenfor nevnte metoder.

For utførelse av den ovenfor nevnte metode

benyttes et reagenssystem som består av det pri-

mære antistoff fiksert til det uløselige faste bærestoff og det merkete sekundære antistoff. Et sett kan bli laget av dette reagenssystem og forskjellige hjelpestoffer kan innbefattes til bruk av effektiv og enkel bruk av reagenssystemet. Eksempler på hjelpestoffer innbefatter oppløs-ningsstoff for oppløsning av faste sekundære antistoffer, vaskestoffer for vask av det uløselige bærestoff, substra-ter for måling av enzymaktiviteten til enzymer som kan brukes som merkende substanser for det sekundære antistoff, og reaksjonsstoppere for dette, som normalt blir brukt i rea-genssett for immunologiske assay.

Bruken av det monoklonale antistoff eller dets Fab-inneholdende fragment fra denne oppfinnelse gjør humant c^-PI i stand til å bli bestemt nøyaktig og lett og med god reproduserbarhet ved å benytte "lateks-agglutinasjonsmetoden".

"Lateks-agglutinasjonsmetoden" er en metode hvorved et antistoff kjemisk og fysisk blir bundet til en immunologisk inert syntetisk harpiks, og agglutinering av den syntetiske harpiks ved et oppløselig antigen.

Dette blir utført ved å bringe ét primært

antistoff og et.sekundært antistoff fiksert

samtidig til fine partikler av det samme uløselige bærestoff eller separat til fine partikler- av- forskjellig uløse-lig bærestoff i kontakt med en assay-prøve i et flytende medium, og måle forandringer som kan finne sted ved agglutinering av partiklene.

Som de primære og sekundære antistoffer som skal fikseres på de uløselige fine bærepartikler benyttes anti-humant c^-PI antistoffer som spesifikt gjenkjenner og kombinerer seg med forskjellige epitoper på humant c^-PI som i tilfelle med "sandwich"-metoden beskrevet ovenfor og et at disse antistoffer er det monoklonale antistoff fra den forelianen-de oppfinnelse som spesifikt blokkerer det reaktive sete på humant (X2-PI.

Det uløselige bærestoff til hvilket det primære og sekundære antistoff er koblet kan passende være en immunologisk inert uoppløselig forbindelse, fortrinnsvis polymerer, silika, aluminiumoksyd eller metaller. Spesielt passende uløselige bærestoffer har omtrent samme spesifikke vekt som det flytende medium benyttet i metoden. Passende fine partikler har en partikkeldiaraeter på generelt 0,05 til 10 pia, fortrinnsvis 0,2 til 2 pia, og partikkeldiametrene er fortrinnsvis så enhetlige som mulig.

Fikseringen av de primære og sekundære antistoffer til uløse-lige bærestoffpartikler kan utføres ved fysisk adsorpsjon eller kjemisk binding som i tilfelle med "sandwich"-metoden beskrevet ovenfor. De primære og sekundære antistoffer kan samtidig være bundet til fine partikler av samme bærestoff slik at de to antistoffer eksisterer i samme bærestoff, eller de kan være fiksert til fine partikler av forskjellige bærestoffer.

Ved å bestemme humant c^-PI i en assay-prøve ved å benytte de fikserte primære og sekundære antistoffer, blir disse fikserte primære og sekundære antistoffer bragt i kontakt med prøven i et flytende medium ved en gitt temperatur. Som et resultat reagerer det primære og sekundære antistoff med c^-PIj og bærepartiklene hvor disse antistoffer er bundet ag-glutineres sammen ved intermediatet av a2—PI og vokser. Ved å påvise forandringer som oppstår ved agglutineringen av disse partikler og å sammenligne dem med en kalibreringskurve fått istand ved å benytte en prøve av kjent konsentrasjon,kan mengden av humant ct2~PI i prøven bestemmes.

Forandringene ved agglutineringen av partiklene kan påvises som forandringer i transmittanseri til lys gjennom det flytende medium, eller forandringer i selv-fluorescens generert ved å tilføre ultrafiolett lys. F.eks. kan mengden av humant ct2~PI i assay-prøven bestemmes ved å måle lystransmit-tansen i det flytende medium etter en viss tidsperiode eller tiden som har gått frem til en på forhånd bestemt transmit-tanse blir nådd, og sammenligne den målte verdi med en kalibreringskurve (standardkurve) som er gjort i stand på forhånd.

Enhver væske som er blandbar med assay-prøven kan bli brukt som flytende medium i den ovenfor nevnte metode. Generelt er fysiologisk saltvann, fosfatpufret saltvann og Tris-pufret saltvann passende eksempler på flytende medium. Etter behov kan glycin, albumin, natriumazid, etc. tilsettes til det flytende medium. Konsentrasjonen av de fine bærepartikler med de tilkoblete primære og sekundære antistoffer i det flytende medium er generelt 0,002 til 10%, fortrinnsvis 0,02 til 2 %. Forholdet mellom det fikserte primære antistoff og det fikserte sekundære antistoff er generelt fra 0,01 til 100, fortrinnsvis fra 0,1 til 10.

I henhold til denne oppfinnelse er det fremskaffet et reagenssystem til bruk i de ovenfor nevnte målemetoder. I hovedsak består dette reagenssystemet av et primært og et skun-dært antistoff samtidig bundet til fine partikler av samme uløselige bærestoff eller separat til fine partikler av forskjellige uløselige bærestoff, ;.og som kan kombineres med en væskeoppløsning, en reaksjonsstoppér, en fortynningsvæske, et standardreagens, etc. etter behov for å danne et reaksjons-sett.

De uoppløselige fine bærepartikler med det primære antistoff og/eller det sekundære antistoff tilkoblet^ kan frysetørkes til et pulver; eller de kan inkorporeres i form av en suspensjon i det tidligere nevnte flytende medium i reagenssystemet.

Det monoklonale antistoff eller dets FAb-region-inneholdende fragment i henhold til.denne oppfinnelse kan også benyttes for separering eller opprenskning av humant ct2~PI fra en væske inneholdende det humane c^-PI fordi det har den funksjon å spesifikt blokkere det reaktive sete til humant a2~PI.

Derved er det fremskaffet et selektivt adsorbsjonsstoff

for humant a2~PI som består av et uløselig fast bærestoff og det monoklonale antistoff eller dets Fab-region-inneholdende fragment i henhold til oppfinnelsen bundet til .dette, og en metode for in vitro å separere eller rense humant cx2-PI fra en væske inneholdende humant tX2-PI som består av å bringe nevnte væske inneholdende humant a2-PI i kontakt med det tidligere nevnte selektive adsorpsjonsmiddel for å adsorbere humant cc2-PI på adsorpsjonsstoffet og separere adsorpsjonsstoffet fra nevnte væske, og etter behov å desorbere humant a2~PI fra adsorpsjonsstoffet og rense det.

Genrelt kalles kromatografering basert på benyttelse av den biologiske affinitet av et adsorpsjonsstoff til separasjonen og opprenskningen av en biologisk substans affinitets-kromatografi [Ichiro Chihata, Testsuya Tosa og Yushi Matsuo, "Experimental and Applied Affinity Chromatography" (japansk sproglig utgivelse), Kodansha Co., Ltd.].

Uttrykkene "affinitet", "ligand", "uløselig fast bærestoff" og "adsorberende stoff", slik som benyttet heri, vil haføl-gende betydninger: Affinitet: Spesifikk affinitet mellom to substanser.

Ligand: En substans med affinitet for en substans,

som skal adsorberes eller renses.

Uløselig fast bærestoff: En fast støtteforbindelse som

er uløselig i vann (bortsett fra liganden)

Adsorberende stoff: Det uløselige faste bærestoff hvorpå

liganden er bundet.

Nå vil det selektive adsorberende stoff for humant a2~PI og metoden for å separere og rense humant ct2~PI frå en væske inneholdende det humane cx2-PI ved a anvende det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen, beskrives i detalj.

Det monoklonale antistoff til humant a2~PI eller dets Fab-regionirnehbldende fragment i henhold til foreliggende oppfinnelse blir kjemisk bundet som en ligand til et passende uoppløselig bærestoff (f.eks. Sepharose), og bærestoffet blir så pakket i en kolonne. Kolonnen blir så ekvilibrert med en passende puffer (f.eks. 50mM Tris puffer, pH 7,4, 0,15 M NaCl) . En væske inneholdende humant o^-PI soin s^al behandles (så som humant plasma eller en serumprøve), tilsettes til det resulterende adsorberende stoff somskal adsorbere humant ct2~PI på det adsorberende stoff. Urenheter blir så fjernet fra det adsorberende stoff med en passende vaskeoppløsning (f.eks. 50mM Tris puffer, pH 7,4, 0,15M NaCl) . Deretter blir mengden av humant ct2~PI i en fraksjon som har passert gjennom kolonnen ("gjennompasseringsfrak-sjonen"), og en fraksjon som er blitt vasket ut fra kolonnen ("den vaskete fraksjon"), målt. Fra de målte verdier kan gra-den av separasjon av humant a2~PI fra prøvevæsken bli funnet.

Forskjellige substanser kan benyttes sam det uløselige faste bærestoff brukt som selektivt adsorberende stoff i denne oppfinnelse. Fortrinnsvis er det laget av f.eks. agarose, po-lyakrylamid, cellulose, dekstran, maleinsyrepolymer eller en blanding av enhver av disse. Det uløselig faste bærestoff kan være i forskjellig form, f.eks. i form av et pulver, et granulat, pellets, kjeder, filmer eller fibre.

Fiksering av det monoklonale antistoff eller dets fragment til det uløselige faste bærestoff blir generelt utført ved kjemisk binding til bærestoffet. F.eks. kan det utføres ved å aktivere Sepharose ved aksjonen med CNBr og fiksere antistoffet til det [R. Axén et al.: Naturen, 214, 1302-1304

(1967) ] .

Når det adsorberende stoff med humant a2~PI adsorbert på dette ved kontakt med væsken inneholdende humant a2-PI blir separert fra væsken, kan det humane a2-PI tilstede i væsken bli fjernet. Hvis humant plasma eller serum brukes som væsken kan humant plasma eller serum i hovedsak fritt for humant a2~Pi oppnås. Slikt humant o^-PI-fritt humant plasma eller serum kan med fordel benyttes, f.eks. i plasma eller serumbyttende terapi.

Det adsorberende stoff med humant c^-PI adsorbert og separert fra prøvevæsken kan bli underkastet desorpsjonsbehand-ling for å eluere humant c^-PI fra det adsorberende stoff og gjenvinne det. Det gjenvundne humane a2~PI kan bli brukt f.eks. som tilsetning i medfødta2~PI mangelsykdom og lever-sykdommer eller som en hemostat. Desorpsjonsbehandlingen kan bli utført ved å behandle det adsorberende stoff med adsorbert humant a2-PI med et elueringsstoff. En vandig opp-løsning med etylenglykol med en pH på 2,5 til 12,5, fortrinnsvis 5,0 til 11,5, kan med fordel benyttes som elueringsvæske. Andre eksempler på elueringsvæske som kan benyttes i foreliggende oppfinnelse innbefatter en vandig oppløsning av glycerol, en vandig oppløsning av glycin, en vandig opp-løsning av propionsyre, en vandig oppløsning av tiocyanat-salt og en vandig oppløsning av guanidin.

Konsentrasjonen av etylenglykol i den vandige etylenglykol-oppløsning er med fordel 20 til 80%, fortrinnsvis 40 til 60%. For pH justering, kan den vandige oppløsning innbefatte, passende pH-justerende forbindelser, f.eks. hydroksyder så

som natriumhydroksyd eller kalimhydroksyd, salter så som Tris-salter, fosfatsalter eller Veronal-salter, syrer så

som saltsyre, salpetersyre, eddiksyre, sitronsyre og oksal-syre, aminer så som etanolarain, ammoniakk eller urea. Des-orps jonsbehandlingen blir utført ved en temperatur over fry-sepunktet, men ikke overskridende 37°C, fortrinnsvis ved 2-10°C. Desorpsjonsbehandlingen utføres ved en kolonne-metode, en batch-metode, etc.. Tiden som kreves for eluering er foretrukket kort, men kan være opp til 2 dager.

Fra eluatet inneholdende det eluerte humane a2-PI kan det humane a2~Pl separeres og renses ved metoder som i og for seg er kjent, f.eks. ved dialyse, konsentrering eller væskekromatografi.

Som gjengitt ovenfor, har det monoklonale antistoff eller dets Fab-regioninneholdende fragment ifølge denne oppfinnelse, den f vinks jon å spesifikt blokkere det reaktive sete i humant oc2-PI, dvs. det sete på humant cx2-PI som inhiberer den fibrinolytiske aktivitet til plasmin og undertrykker virkningen til humant cx2-PI til å inhibere den f ibrinolyti-ske aktivitet til plasmin. Følgelig, hvis det monoklonale antistoff eller dets fragment blir tilført et system hvor den fibrinolytiske aktivitet til plasmin er inhibert ved virkningen av humant a2-PI °9 et blodaggregat er dannet, er den inhiberende virkning til humant oc2-PI blokkert og plasmin kan direkte virke på blodaggregatet og oppløse det. Effekten av det monoklonale antistoff eller dets fragment i henhold til denne oppfinnelse for å fremskaffe fibrinolyse av blodaggregater kan verifiseres f.eks. ved de følgende to in vitro tester. En første av disse tester er en lyserende test i et opprensket system som benytter en fibrinplate, og en andre test er en lysis-test på en trombe fremstilt ved å benytte plasma eller blod. I den første test oppløses området av fibrinplaten ved plasmin i nærvær a humant cx2-PI og i nærvær av humant a2-PI og det monoklonale antistoff eller dets fragment i henhold til denne oppfinnelse blir målt, og sammenlignet med området av fibrinplaten oppløst kun i nærvær av plasmin. I den andre test koaguleres humant plasma eller blod med trombin, og den koagulerte masse suspenderes i humant plasma eller blod til hvilket det monoklonale antistoff eller dets fragment i henhold til denne oppfinnelse er blitt tilsatt. Tiden som går før det koagulerte aggregat er oppløst sammenlignes med den i det tilfelle det blir brukt normalt humant plasma eller blod. Det er blitt bekreftet at, som det er beskrevet i detalj i eksemplene, i enhver av disse testene blir fibrinplaten eller det koagulerte aggregat raskt oppløst i nærvær av det monoklonale antistoff eller dets fragment i henhold til denne oppfinnelse.

De følgende eksempler illustrerer den foreliggende oppfinnelse mere spesifikt.

EKSEMPEL 1

(1) Fremstilling av humant c^-PI

I samsvar med metoden til Aoki og Moroi nevnt ovenfor ble 7,7 mg humant c^-PI fremstilt fra 2.360 ml humant plasma.

(2) Immunisering av mus

Balb/c hannmus ble immunisert intraperitonealt med en emul-sjon av 100 p. q av humant c^-plasmininhibitor og fullstendig Freund<*>s hjelpestoff to ganger med et intervall på 21 dager. 7 dager og 88 dager senere ble 30 jug av humant ct2-PI i fysiologisk saltvann i tillegg tilført intravenøst. 4 dager etter den endelige immunisering ble miltceller isolert for cellefusjon . (3) Fremstilling av en suspensjon av miltceller

Miltcellene ble tatt ut aseptisk og ført gjennom et rust-fritt stålfilter for å erholde en suspensjon av miltceller. Cellene ble overført til et RPMI-1640 medium (fremstilt av FIBCO) og tilsatt 0,39 g/l L-glutamih, 0,2 g/l kanamycinsulfat og 2,0 g/l NaHC03. Cellene som vokste ble vasket 3 ganger med RPMI-1640 og igjen suspendert i RPMI-1640 medium.

(4) Fremstilling av myelomceller

Musemyelomceller, P3-U1, ble dyrket i RPJ<y>iI-1640 medium tilsatt 0,39 g/l L-glutamin, 0,2 g/l kanamycinsulfat, 2,0 g/l NaHC03 og 10% føtalt kalveserum (forkortet som 10% FCS-RPMI-1640). Ved cellefusjon var myelomceliene i den logaritmiske fase av celledelingen.

(5) Cellefusjon

Miltcellene og myelomcellene ble suspendert i et forhold på 10:1 i et serumt-fritt RPMI-1640 medium og så sentrifugert ved ca. 200 G i 5 minutter. Supernatanten ble fjernet og bunnfallet ble inkubert sammen med 1 ml av [en 50%'s oppløs-ning av polyetylenglykol med en gjennomsnittlig molekylvekt på 1.540 (pH 8,2)] ved 37°C i 2 minutter. Så ble 9 ml serum-fritt RPMI-1640 medium tilsatt, og cellene ble igjen suspendert forsiktig i 5 minutter. Suspensjonen ble sentrifugert ved ca. 200G i 5 minutter og igjen suspendert i 10% F.CS-RPMI-16 40 medium slik at en konsentrasjon på 8 x 10 celler/ml ble erholdt. Suspensjonen ble deretter fordelt på en 96-mikrobrønnplate (ca. 100 jul pr. brønn) . De fuserte celler ble dyrket ved 37°C med 5% C02.

(6) Utvelgelse og dyrkning av fuserte celler i stand til

å danne et antistoff til humant a2~PI.

1 dag etter cellefusjon ble HAT-medium tilført i en mengde på 100 jul pr. brønn. Deretter ble halvdelen av mediet byttet ut med intervaller på 2 dager med en frisk tilførsel av HAT-medium og dyrkingen ble opprettholdt. 8 dager senere ble supernatanten av dyrkningsvæsken til hybridomceliene skjermet for antistoffer for humant ct2~PI ved det enzymkoblete immunosorbent-assay. Det anvendte antigen i skjermingen

var humant ct2~PI og det andre antistoff var alkalisk fosfatase-konjugert kanin-anti-musantistoffer.

149 brønner totalt ble funnet å være positive ved det enzym-koblete immunosorbent-assay, og derved å danne antistoffer til ot2-PI.

Når det ble observert at delingen av cellene var aktiv ble HT-medium tilført. Mediet ble byttet med HT medium 4 ganger med intervaller på 1 dag. Deretter ble dyrkingen utført ved å bruke vanlig 10% FCS-RPMI-16 40 medium.

EKSEMPEL 2

Utvelgelse av fuserte celler som danner antistoffer til humant a2~PI: De fuserte celler som danner antistoffer til humant a2~Pi,ble skjermet ved følgende prosedyre for fuserte celler som hadde den virkning å undertrykke fibrinolysen som inhiberer aktiviteten av humant i^-PI.

De fuserte celler i hver brønn ble dyrket i 10% FCS-RPMI-1640 medium inntil antallet celler var ca. 2 x 10 7. Cellene ble så sentrifugert ved ca. 200G i 5 minutter. Supernatanten ble fjernet og cellene ble vasket med 10 ml serum-fritt RPMI-16 40 medium og videre sentrifugert ved ca. 200 G i 5 minutter. Supernatanten ble fjernet, og cellene ble suspendert i 10 ml av blandet serum-fritt medium (forkortet "MITES medium") sam-mensatt av RPMI-16 40 medium tilsatt 5,0 ml/l 2-merkaptoeta-nol, 7,5 ml/l insulin, 5,0 ml/l transferrin, 5,0 ml/l eta-nolamin, 5,0 ml/l natriumselenitt, 0,39 g/l L-glutamin, 0,2 g/l kanamycinsulfat, og 2,38 g/l Hepes, Dulbecco's MEM, og Ham's F-12 (2:1:1) og dyrket i 3 dagér.

Supernatanten av dyrkningsvæsken ble gjenvunnet og konsentrert 25 ganger. Til 25 /al av konsentratet ble det tilsatt 0,4 ug humant c^-PI, og blandingen ble inkubert ved 37°C i 30 minutter. Så ble 0,025 enheter plasminogen og 0,031 enheter urokinase tilsatt, og mengden av hele oppløsningen ble justert til 40 ul. 10 ul av dette ble plassert på en fibrinplate. Fibrinplaten ble oppbevart ved en temperatur ved 37°C og en fuktighet på mer enn 95% i 18 timer, og arealet av oppløst fibrin ble målt.

Resultatene viser at den fibrinolyseinhiberende aktivitet til humant ot2~PI tilført til antistoffene dannet av 1D10 fuserte celler var fullstendig hemmet.

EKSEMPEL 3

Kloning av fuserte celler:

De fuserte celler (1D10) som ble funnet å være positive i testen for aktivitet av antistoffer til humant a2~PIf ble klo-net ved følgende prosedyre. 1D10 cellene ble fortynnet slik at hver brønn av en 96-brøn-ners mikro titerplate inneholdt 0,9 celler. Tymus-celler fra Balb/c mus ble tilsatt som feederceller og distribuert på platen og dyrket i 10% FCS-RPMI-16 40 medium. Mikroskopisk observasjon utviste nøyaktig enkeltcellekolonier som ble dannet. Supernatanten av dyrkningsvæsken til de fuserte celler ble skjermet ved det enzym-koblete immunosorbente assay for antistoffer til humant a2-PI. 2 6 brønner totalt ble funnet å være positive ved det enzym-koblete immunosorbent-assay, og følgelig å produsere monoklonale antistoffer til humant ct2-PI.

Opprenskning av monoklonale antistoffer:

For å danne store mengder monoklonale antistoffer til humant a2~PI, ole ca. 10 7 fuserte celler injisert intraperitonealt i Balb/c mus på forhånd behandlet med pristan. Omkring 1

uke senere ble antistoffene isolert fra bukvannet og renset ved metoden til Ey et al. [P.L.Ey, S.J.Prowse og C.R.Jenkin, Immunochemistry, 15, 429-436 (1978)]. 20 mg monoklonale antistoffer til humant a2-PI ble erholdt fra 2,5 ml bukvann.

Karakterisering av de opprenskete monoklonale antistoffer:

De spesielle klasser rensete monoklonale antistoffer ble bestemt ved Ouchterlony geldiffusjonstest ved å benytte klasse-spesifikt antimus-immunoglobulinantisera. Resultatene gitt i tabell 1 viser at mange av antistoffene til humant <x2-PI er av H-kjede type og L-kjede jctype.

EKSEMPEL 4

Undertrykking av aktiviteten til humant o^-PI vec^ antistoffer til a2~PI: 1 mikrogram av humant c^-PI °9 5 mikrogram av hvert av de monoklonale antistoffer indikert ovenfor ble oppløst i 50 mikroliter 0,05M fosfatpufret fysiologisk saltvann (forkortet PBS) og inkubert ved 37°C i 30 minutter. Deretter ble 0,025. enheter plasminogen og 0,031 enheter urokinase tilsatt, og mengden av oppløsningen ble justert til 60 mikroliter. 10 mikroliter av dette ble plassert på en fibrinplate. Fibrinplaten ble oppbevart ved en temperatur på 37°C og en fuktighet på mere enn 95 % i 18 timer, og arealet av oppløst fibrin ble målt. Resultatene er vist i tabell 2.

Verdiene vist i tabell 2 er relative verdier erholdt ved å

ta arealet oppløst med 0,025 enheter plasminogen og 0,031 enheter urokinase som 100%.

EKSEMPEL 5

Effekt av monoklonalt antistoff til humant c^-PI vec* kombinasjon av humant a^—PI med fibrin: 125

0,01 juM med I -merket humant c^-PI og 0,05 pM av et monoklonalt antistoff til (X2-PI ble inkubert ved 37 C i 30 minutter sammen med 2% bovinserumalbumin-0,05M Tris puffer (pH 7,4)-0,15 NaCl, og så oppbevart over natten ved 4°C. Til antigen- antistoff-reaksjonsblandingen ble det tilført 2,5 mM CaCl2, ^ av en ^ibrinogenfraksjon og 2 enheter/ml trombin, og den totale mengde av blandingen ble justert til 100 mikroliter. Det ble inkubert ved 37°C i 30 minutter. Dannelse av et koagulert materiale (fibrinaggregat)- ble observert. 30 minutter senere ble det tilført 100 yul med 200mM EDTA, og kal-siumioner ble fjernet» Så ble det koagulerte materiale tatt ut ved å tvinne det omkring en tynn stav av bambus. Det koagulerte materiale ble vasket 3 ganger med en vaskeoppløsning [2% BSA, 0,05M Tris-puffer (pH 7,4), 0,15M NaCl, 2mM EDTA]. Til slutt ble koagulert materiale separert fra bambussta-ven og gjenvunnet i et prøverør. Radioaktiviteten (cpm) av det koagulerte materiale ble deretter målt. Radioaktiviteten av det koagulerte materiale relativt til radioaktiviteten i den opprinnelige reaksjonsblanding i hvert tilfelle er vist i tabell 3.

Tabell 3 gir også resultatet erholdt ved å benytte ordinært kommersielt muse IgG brukt som et komparativt antistoff. Resultatene indikerer at det monoklonale antistoff til humant a^-PI er monoklonale antistoffer som ikke gjenkjenner det fibrinbindende sete til humant a2-PI.

EKSEMPEL 6

Utvelgelse av et monoklonalt antistoff som gjenkjenner

det reaktive sete til humant a2~PI:

I dette eksempel ble effekten av et monoklonalt antistoff til humant ct2-PI ved inaktiveringen av plasmin av humant <a>2~PI undersøkt.

0,6 jag av o^-PI °9 *>,6 av et monoklonalt antistoff til a2~PI ble oppløst i 60 /ul med 2% bovinsyrealbuminoppløsning [0,05M Tris puffer (pH 7,4), 0,15M NaCl] og inkubert ved 3 7°C i 30 minutter, fulgt av henstand over natt ved 4°C.

Reaksjonsblandingen ble blandet med 20 /ul av en plasminopp-løsning (0,47 uM), og 0,05M Tris puffer (pH7,4) og 0,15M NaCl ble tilsatt, og den totale mengde væske ble justert til 500 / al. For hvert monoklonale antistoff ble 2 prøver av denne blanding forberedt og inkubert ved 37°C i 2 minutter henh. 20 minutter. Deretter ble 200 / al av en vandig opp-løsning av 3,5 mM syntetisk substrat S-2251 (H-D-valyl-L-leucyl-L-lysyl-p-nitroaniliddihydroklorid) tilsatt, og ved et spektrofotometer (Beckman, DU-8) ble forandringer i absorbans ved en bølgelengde på 405 nm pr. minutt målt. Som kontroller ble forandringer i absorbans likeledes undersøkt med hensyn til eti prøve som resulterte fra reaksjonen av plasmin alene, og en prøve erholdt ved reaksjonen av humant a2~PI med plasmin ved fravær av monoklonalt antistoff. Resultatene er vist i tabell 4.

Resultatene erholdt i eksemplene 5 og 6 viser at de monoklonale antistoffer i henhold til denne oppfinnelse spesifikt gjenkjenner det reaktive sete av humant <*2~PI °9 ikke gjenkjenner det plasminbindende sete og det fibrinbindende sete av humant ct2-PI.

EKSEMPEL 7

Spaltning av papain av et monoklonalt antistoff som gjenkjenner det reaktive sete av humant a2_PI: 1 mg av det monoklonale antistoff 1D10C1 beskrevet i det foregående eksempel som spesifikt gjenkjenner det reaktive sete av humant c^-PI, ble oppløst i 300 pl med en oppløsning [2mM EDTA, 12,5mM cystein, 50mM Tris puffer (pH 7,4), 0,15

M NaCl], og 100 yul av en papainoppløsning i en konsentrasjon på 1 mg/ml ble tilsatt og reagert ved 37°C i 18 timer.

Reaksjonsblandingen ble underkastet væskekromatografi og Fab-komponenten av antistoffet ble separert. Ved SDS-poly-akrylamid-gelelektroforese ble dets molekylvekt målt under reduserende og ikke-reduserende betingelser. Det ble bekreftet at Fab-komponenten besto av et fragment med en molekylvekt på ca. 2 3.000 fra amihogruppeterminalen av den tunge kjeden av antistoffet og den fullstendige kjedelengde hadde en molekylvekt på ca. 2 3.000.

EKSEMPEL 8

Undertrykking av aktiviteten til humant o^-PI ve<^ Fag-komponenten til antistoffet til humant a2~PI: 1 pg av humant ct2-PI og 3 jag av hvert av de monoklonale antistoffer indikert i tabell 5 ble oppløst i 50 jul 0,05M PBS og inkubert ved 37°C i 30 minutter. Deretter ble 0,025 enheter plasminogen og 0,031 enheter urokinase tilsatt, og den totale mengde av oppløsningen ble justert til 60 /ul. 10 jul av dette ble plassert på en fibrinplate, og fibrinplaten fikk henstå ved en temperatur på 37°C og en fuktighet på mer enn 95%. Arealet av oppløst fibrin ble målt. Resultatene er vist i tabell 5. Verdiene vist i den følgende tabell er relative verdier erholdt ved å ta arealet av oppløst fibrin med 0,025 enheter plasminogen og 0,031 enheter urokinase som 100 %.

Videre ble undertrykkingen av aktiviteten til humant c^-PI ved Fab-komponenten av dette monoklonale antistoff under-søkt ved samme prosedyre som i eksempel 6.

0,6 /ug (9;pikomol) av a2~PI og 40 pikomol av et monoklonalt antistoff til humant ct2-PI ble oppløst i 60 /ul av en 2%'s bovinserumalbuminopptøning [0,05M Tris puffer (pH 7,4) , 0,15 M NaCl], og inkubert ved 37°C i 30 minutter, fulgt av opp-bevaring over natten ved 4°C.

Reaksjonsblandningen ble blandet med 20 yul av en plasminopp-løsning (0,47 /uM) , og deh totale mengde oppløsning ble justert til 500 jul. Deretter ble 200 jul av en vandig oppløs-ning av 3,5 mM syntetisk substrat S-2251 tilsatt, og forandringer i absorbans ved en bølgelengde på 405 nm pr. tidsenhet ble målt med et spektrofotometer (Hitachi 100-50). Som kontroll ble forandringer i absorbans likeledes undersøkt med hensyn til en prøve erholdt ved å reagere plasmin alene, og en prøve erholdt ved å reagere både humant a2~PI og plasmin. Resultatene er vist i tabell 6.

Resultatene erholdt i eksempel 8 viser at det monoklonale antistoff med Fab-regionen i samsvar med denne oppfinnelse spesifikt gjenkjenner det reaktive sete til humant ct2-PI

og undertrykker den fibrinolyseinhiberende funksjon av humant cj^-PI.

EKSEMPEL 9

Spalting med pepsin av :et monoklonalt antistoff som gjenkjenner det reaktive sete av humant a2-PI: 0,39 mg av det monoklonale antistoff 1D10C1 beskrevet i det foregående eksempel som spesifikt gjenkjenner det reaktive sete til humant ct2-PI ble oppløst i 0,5 ml av 0,1M natriumacetat (pH 4,6), og 1,0 ml av en pepsinoppløsning (0,1M natriumacetat, pH 4,6) med en konsentrasjon på 0,33 mg/ml ble tilført og reagert ved 37°C i 14 timer.

Reaksjonsblandingen ble underkastet væskekromatografi og F(ab')2-komponenten ble separert. Molekylvekten til denne kom-ponent ble målt ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese under reduserende og ikke-reduserende betingelser. Det ble funnet at F(ab')2-komponenten besto av et fragment med en molekylvekt på ca. 28.000 fra aminogruppeterminalen i den tunge kjeden, og den fullstendig lette kjede hadde en molekylvekt på ca. 2 3.000.

EKSEMPEL 10

Undertrykking av aktiviteten av humant ct2_PI av F (ab1) 2-komponenten av et antistoff til humant a2-PI: 1 ug humant ot2-PI og 2 pg av et monoklonalt antistoff ble opp-løst i 50 jul 0,05 M PBS og inkubert ved 37°C i 30 minutter. Deretter ble 0,025 enheter plasminogen og 0,031 enheter urokinase tilsatt, og den totale mengde av oppløsningen ble justert til 60 jul. 10 jul av dette ble plassert på en fibrinplate, og fibrinplaten ble oppbevart ved en temperatur på 37°C og en fuktighet på mer enn 95% i 18 timer. Arealet av det oppløste fibrin ble målt. Resultatene er vist i tabell 7. Verdiene vist i den følgende tabell er relative verdier erholdt ved å ta det oppløste areal av 0,025 enheter plasminogen og 0,031 enheter urokinase som 100%.

Ved samme prosedyre som i eksempel 6 ble undertrykking av aktiviteten av humant ct2~PI av F (a<b>1) 2-komponenten til dette monoklonale antistoff undersøkt.

0,6 jug (9 pikomol) a2_PI og 40 pikomol av det monoklonale antistoff til ct2~PI ble oppløst i 60 /ul av en 2%'s bovinserum-albuminoppløsning. [0,05M Tris puffer (pH 7,4), 0,15 M NaCl] og inkubert ved 37°C i 30 minutter fulgt av henstand over natten ved 4°C.

Reaksjonsblandingen ble blandet med 20 yul av en plasminopp-løsning (0,47 juM) og 0,05iYI Tris puffer (pH 7,4) og 0,15M NaCl ble tilsatt, og den totale mengde oppløsning ble justert til 500 jul. Deretter ble 200 jul av en vandig oppløsning av 3,5mM syntetisk substrat S-2251 tilsatt. Forandringer i absorbans ved en bølgelengde på 405 nm pr. tidsenhet ble målt på et spektrofotometer (Hitachi 100-50). Som kontroll ble forandringer i absorbans likeledes undersøkt med hensyn på en prøve erholdt ved å reagere plasmin aleneog en prøve erholdt ved å reagere humant c^-PI og plasmin uten å tilføre det monoklonale antistoff. Resultatene er vist i tabell 8.

Resultatene viser at det monoklonale antistoff med F(ab')2

i samsvar med denne oppfinnelse spesifikt gjenkjenner det reaktive sete av humant a2-PI/ og undertrykker den fibrinolyseinhiberende funksjon til humant o^-PI.

EKSEMPEL 11

Fremstilling av et immunologisk assay-reagens inneholdende et monoklonalt antistoff til c^-PI:

F ørs te antisto ff

Antistoff 1D10C1 erholdt i eksempel 3 ble brukt etter at det var fiksert til et uløselig bærestoff (mikrotitrerplate) som vist nedenfor. Dette antistoff kan spesifikt gjenkjenne det reaktive sete til o^-PI til hvilket denne inhibitoren inhiberer den fibrinolytiske aktivitet til plasmin.

Annet antistoff

Antistoffet 1B10G11 erholdt i eksempel 3 ble brukt. Dette antistoff spesifikt gjenkjenner seter på i^-PI andre enn det reaktive sete. Det ble brukt etter merking med alkalisk fosfatase.

Det monoklonale antistoff 1D10C1 i en konsentrasjon på 20 yug/ml ble oppbevart ved 4°C på en mikrotitrerplate for å feste denne til platen. En puffer (15mM Na2C03, 35mM NaHC03, 3 mM NaN^) som inneholder 1%'s bovinserum ble tilsatt og blandingen fikk henstå i 4 timer. Platen ble deretter vasket 5 ganger med en vaskevæske (20mM fosfatpuffer, 0,135M NaCl, 2mM NaN3, 0,05% "Tween 20") som inneholder 1%'s bovinserumalbumin. Deretter ble det tilført CX2~PI fortynnet til forskjellige konsentrasjoner méd en fortynning på 20 mM fos-f atpuf f er, 0,135JM NaCl) . Blandingen ble oppbevart ved romtemperatur i 4 timer.

Platen ble så vasket 5 ganger med den tidligere nevnte vaske-oppløsning, og det alkalisk fosfatasemerkete monoklonale antistoff, 1B10G11, som gjenkjenner seter på a2~PI#ble til-ført i en konsentrasjon på 329 ng/ml fulgt av henstand over natten ved 4°C. Platen ble vasket med den tidligere nevnte vaskeoppløsning og så ble en alkalisk fosfatasesubstratopp-løsning tilsatt i en konsentrasjon på 1 mg/ml. Forandringer i absorbans ved en bølgelengde på 405 nm pr. minutt ble målt. Resultatene er vist figur 2 i de vedlagte tegninger. Det kan ses fra denne figur at konsentrasjonen av ct2~PI og forandringene i absorbans er liniære. Følgelig, ved å benytte et monoklonalt antistoff som spesifikt gjenkjenner det reaktive sete på a2~PI som ett antistoff i sandwich-metoden, kan mengden av ct2-PI lett måles.

EKSEMPEL - 12

Det monoklonale antistoff, 1D10C1, i stand til å spesifikt gjenkjenne det reaktive sete til humant a2~PIf ble brukt i en konsentrasjon på 20 ug/ml og oppbevart over natten ved 4°C på en mikrotitrerplate for å fiksere det til platen. En puffer (15mM Na2C03, 35mM NaHC03, 3mM NaN3) som inneholder 1%'s bovinserumalbumin ble tilsatt, og blandingen ble oppbevart ved romtemperatur i 4 timer. Deretter ble blandingen vasket 5 ganger med en vaskevæske (20 mM f osf atpuf fer, 0,135JM NaCl, 2mM "NaN3, 0,05% "Tween 20") som inneholder 1%'s bovinserumalbumin. Deretter ble det tilsatt en assay-prøve (humant plasma) fortynnet til forskjellige konsentrasjoner med en fortynningsoppløsning (20mM fosfatpuffer, 0,135M NaCl) ble tilsatt og oppbevart ved romtemperatur i 4 timer.

Derpå ble blandingen vasket 5 ganger med tidligere nevnte vaskevæske og det alkalisk fosfatasemerkete monoklonale antistoff, 1B10G11, som gjenkjenner seter andre enn det reaktive sete til humant c^-PI, ble tilsatt i en konsentrasjon på 329 ng/ml, og blandingen ble oppbevart over natten ved 4°C. Blandingen ble vasket med den tidligere nevnte vaskeoppløsning og en alkalisk fosfatasesubstratoppløsning (1 mg/ml) ble tilsatt, og forandringer i absorbans ved en bølgelengde på

405 nm pr. minutt ble målt i den tidligere Elisa-analysator. Resultatene er tegnet inn i figur 3 i de medfølgende tegninger. Det går frem av figur 3 at fortynningsforholdet til prø-ve-assay'et (humant plasma) og forandringer i absorbans repre-senterer en liniær funksjon. Siden verdien for absorbansfor-andring til en standard assay-prøve ved 600 gangers fortynning av 6,2 x 10 , ble konsentrasjonen av humant c-^-PI i denne prøve funnet å være 74,0 yug/ml (1,1 /iM) .

EKSEMPEL 13

Immunologisk bestemmelse av o^-PI i humant plasma

i ett trinn:

Første antistoff

Antistoffet 1D10C1, erholdt i eksempel 3, ble brukt etter

at det var fiksert til et uløselig bærestoff (mikrotitrerplate) på den følgende måte. Det var et monoklonalt antistoff i stand til spesifikt å gjenkjenne det reaktive sete til'humant o^-PI.

Det andre antistoff

Antistoffet, 1B10G11, erholdt i eksempel 3, ble brukt etter å merke det med alkalisk fosfatase. Dette antistoff var et monoklonalt antistoff i stand til å spesifikt gjenkjenne seter andre enn det reaktive sete til c^-PI.

Det monoklonale antistoff, 1D10C1, i stand til spesifikt å gjenkjenne det reaktive sete til humant a2-:pi ble brukt i en konsentrasjon på 20 ug/ml, og oppbevart over natten ved 4°C på en mikrotitrerplate for å fiksere det til platen. En fosfat-pufret saltoppløsning inneholdende 0,5 % bovinserumalbur.l.-. min (forkortet som 0,5% BSA-PBS) ble tilsatt. Blandingen ble oppbevart ved romtemperatur i 2 timer og vasket 3 ganger med 0,5 %'s BSA-PBS. En blanding bestående av humant plasma fortynnet med PBS og det alkalisk fosfatase-merkete monoklonale antistoff, 1B10G11, i en konsentrasjon på 329 ng/ml ble tilsatt og reagert ved romtemperatur i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble vasket med 0,5 %'s BSA-PBS, og en alkalisk fosfatasesubstratoppløsnihg ble tilsatt i en konsentrasjon på 1,0 mg/ml. Blandingen ble reagert ved romtemperatur i 20 minutter. Deretter ble absorbansen til reaksjonsoppløsningen ved en bølgelengde på 405 nm målt på et mikroplatefotometer. En kalibreringskurve ble fremstilt ved bruk av en standard-prøve av renset ct2~PI og fra kalibreringskurven ble mengden (mikrogram/ml) av c^-PI i serumprøven fra hver av pasientene regnet ut. Figur 4 viser kalibreringskurven, og mengdene av a2-PI i plasmaprøverie fra pasientene er oppsummert i tabell 9.

Konsentrasjonen av ct2~PI og absorbansen gjengir en liniær funksjon, og ved den ovenfor nevnte assay-metoden kan mengden av a2~PI ■■■ plasmaet nøyaktig bestemmes.

EKSEMPEL 14

Immunologisk bestemmelse av mengden av c^-PI i humant

plasma ved lateksagglutinasjon:

Monoklonale antistoffer 1D10C1 og 1B10G11 til a2-PI ble separat oppløst i oppløsninger inneholdende 0,02M glycin og 0,03M NaCl (pH 9,0) i en konsentrasjon på p ml. En polystyrenlateks med en partikkeldiameter på 0,60 yum ble suspendert i hver av disse to antistoffoppløsninger (1,0 ml) til en konsentrasjon på 2%. Suspensjonene ble hver oppbevart over natten ved romtemperatur for å adsorbere anstistof-fene til nettverkene. Nettverkene ble hver for seg vasket to ganger med en oppløsning inneholdende 0,02M glycin og 0,03M NaCl (pH 9,0) og deretter suspendert i 1,0 ml av en oppløs-ning inneholdende 0,1M glycin, 0,15M NaCl, 1% BSA og 0,05% NaN-j (pH 9,0) . Deretter ble 50 yum liter av lateksen med det monoklonale antistoff 1D10C1 til a2_PI adsorbert til denne blandet med 50 fil av lateksen med det monoklonale antistoff 1B10G11 adsorbert på denne for å danne en standard prøve av lateksen. 100 yul av standardprøven av lateks og en ct2-PI standardprøve i forskjellige tilstander eller 100 jai av humant plasma fortynnet med en oppløsning inneholdende 0,1M glycin, 0,15M NaCl, 1% BSA og 0,05% NaN3 (pH 9,0) ble blandet og reagert ved 37°C i 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble fortynnet 125 ganger med en oppløsning som inneholder 0,1M glycin, 0,15M NaCl, 1% BSA og 0,05% NaN3 (pH 9,0), og absorbansen av den fortynnete oppløsning ved en bølgelengde på 600nm ble målt. En kalibreringskurve ble laget ved å bruke standard ct2~PI prøven ved forskjellige konsentrasjoner, og mengden av ot2~PI i den humane plasmaprøve ble regnet ut. Figur 5 viser kalibreringskurven.

Siden absorbansen ved 600nm av et plasma fra en frisk person fortynnet 620 ganger var 1,068, var mengden av cc2~PI funnet ved å bruke kalibreringskurven 60,8 yug/ml.

EKSEMPEL 15

Immunologisk bestemmelse av mengden av a2~PI i humant plasma ved lateksagglutinering: Monoklonale antistoffer, 1D10C1 og 1B10G11 til a2-PI ble blandet slik at forholdet mellom konsentrasjonene ble 1:1. Blandingen ble løst i en oppløsning inneholdende 0,02M glycin og 0,03M NaCl (pH 9,0) for å lage en oppløsning med en antistoffkonsentrasjon på 50 /ug/ml. En polystyrenlateks med en partikkeldiameter på 0,60 yum ble suspendert i en konsentrasjon på 2% i 1,0 ml av antistoffoppløsningen og oppbevart over natten ved romtemperatur for å adsorbere de to monoklonale antistoffer på lateksen. Lateksen ble vasket 2 ganger med 1,0 ml av en oppløsning inneholdende 0,02M glycin og 0,03M NaCl (pH 9,0), og suspendert i 1,0 ml av en oppløs-ning inneholdende 0,1M glycin, 0,15M NaCl, 1% BSA og 0,05% NaN3 (pH9,0). 100 jul av suspensjonen og en standard a2~PI prøve i forskjellige konsentrasjoner eller 100 jul av en human plasmaprøve fortynnet med en oppløsning inneholdende 0,1M glycin, 0,15M NaCl, 1% BSA og 0,05% NaN^ (pH 9,0) ble blandet, og reagert ved 37°C i 30 minutter, Reaksjonsblandingen ble fortynnet 125 ganger med en oppløsning inneholdende 0,1M glycin, 0,15M NaCl, 1% BSA og 0,05% NaN^ (pH

9,0) og absorbansen av oppløsningen ved en bølgelengde på 600 nm ble målt. En kalibreringskurve ble laget ved å benytte standard cc2~PI prøver i forskjellige konsentrasjoner, og mengden av a2~PI i den humane plasmaprøve ble funnet.

Figur 6 viser kalibreringskurven.

Siden absorbansen av en plasmaprøve tatt fra en frisk person og fortynnet 620 ganger var 1,002, var mengden av a2~PI funnet ved å bruke kalibreringskurven 60,1 /ug/ml.

EKSEMPEL 16

Separering av ct2~PI fra humant plasma:

Et adsorberende stoff (0,5 ml) med antistoffet 1D10C1 funnet i eksempel 3 som kjemisk bundet ligand, ble pakket i en kolonne. Kolonnene ble vasket grundig med en vaskevæske (50mM puffer, pH 7,4; 0,15M NaCl), og 1,0 ml av den humane plasma-prøven ble passert gjennom kolonnen. Innerveggen av kolonnen var vasket med 1,0 ml av den tidligere nevnte vaskeopp-løsning. Den eluerte fraksjon ble betegnet som "gjennompassasjefraksjonen"). Kolonnen ble så vasket med 2,0 ml av den samme vaskeoppløsning for å eluere den uadsorberte substans for å danne en "vasket fraksjon". De foregående operasjoner ble alle utført ved 4°C. "Gjennompassasjefraksjonen" og "den vaskete fraksjon" ble avsaltet og konsentrert ved 4°C.

Fremstilling av en kalibreringskurve for humant a2~PI: Mengden av a2~PI ble målt ved metoden beskrevet i eksempel 11. Spesifikt ble de følgende første og andre antistoffer brukt.

Første antistoff

Anjtistoffet 1D10C1, erholdt i eksempel 3, ble brukt og fiksert til et uløselig bærestoff (mikrotitrerplate) på følgen-de måte. Dette antistoff var en monoklonalt antistoff med evne til å spesifikt gjenkjenne det reaktive sete på a2~PI.

Andre antistoff

Antistoffet 1B10G11, erholdt i eksempel 3, ble brukt etter at det var merket med alkalisk fosfatase. Dette antistoff var et monoklonalt antistoff i stand til å spesifikt gjenkjenne et sete forskjellig fra det reaktive sete av a2~PI.

Det monoklonale antistoff 1D10C1 i en konsentrasjon på 20 ug/ ml ble oppbevart over natten ved 4°C på en mikrotitrerplate og fiksert til denne. En puffer (15mM Na2C03, 35mM NaHC03, 3mM NaN3) inneholdende 1% bovinserumalbumin ble tilført og blandingen ble oppbevart i 4 timer ved romtemperatur. Den ble så vasket 5 ganger med en vaskeoppløsning (20mM fosfat-puf fer, 0,135M NaCl, 2mM NaN3, 0,05% "Tween 20") inneholdende 1% bovinserumalbumin, og så ble a2~PI fortynnet til forskjellige konsentrasjoner med en fortynningsvæske (20mM fosfatpuffer, pH 7,4; 0,135M NaCl) ble tilsatt og blandingen ble oppbevart ved romtemperatur i 4 timer.

Blandingen ble videre vasket 5 ganger med den samme vaske-oppløsning som brukt ovenfor og det alkalisk fosfatase-merkete monoklonale antistoff 1B10G11 i stand til å gjenkjenne et sete et annet enn det reaktive seie av a2-PI ble tilført og blandingen ble oppbevart over natten ved 4°C. Etter vasking med samme vaskeoppløsning som brukt ovenfor/ ble en alkalisk fosfatasesubstratoppløsning tilsatt i en konsentrasjon på lmg/ml. 20 minutter senere ble absorbansen av oppløsningen ved en bølgelengde på 405 nm målt på et mikroplatefotometer (MTP-20 fremstilt ved Corona Electrical Co., Ltd.). Resultatene er tegnet i fig 7. Det går frem av figur 7 at konsentrasjon av c^-PI og absorbansen er gjengitt ved en liniær funksjon. Følgelig, ved å benytte et monoklonalt antistoff i stand til spesifikt å gjenkjenne det reaktive sete av ct2~PI som ett antistoff i sandwich-metoden,

kan mengden av a2-PI lett bli målt.

Ved å bruke figur 7 som en kalibreringskurve ble mengden av o^-PI i "én-passasjefraksjonen" og den "vaskete fraksjon" mål t.

Måling av c^-PI ^ en assav-PrØve:

Det monoklonale antistoff 1D10C1 i stand til spesifikt å gjenkjenne det reaktive sete av humant ct2~PI ble oppbevart i en konsentrasjon på 20 /ug/ml på en mikrotitrertplate ved 4°C over natten for å fiksere det til platen. En puffer (15mM Na2C03, 35mM NaHC03, 3mM NaN3) inneholdende 1% bovinseriumalbumin ble tilsatt, og blandingen ble oppbevart ved romtemperatur i 4 timer. Blandingen ble så vasket 5 ganger med en vaskeoppløsning (20mM fosfatpuffer, 0,135M NaCl,

2mM baN3, 0,05% "Tween 20") inneholdende 1% bovinserumalbumin. En prøve (gjennompassasjefraksjonen", "den vaskete fraksjon" og humant plasma) fortynnet til forskjellige fraksjoner med en fortynningsoppløsning (20 mM fosfatpuffer, 0,135

M NaCl) ble tilsatt, og blandingen ble oppbevart ved rom-

temperatur i 4 timer.

Blandingen ble vasket 5 ganger med samme vaskeoppløsning som ble brukt ovenfor og det alkalisk fosfatase-merkete monoklonale antistoff 1B10G11 i stand til å gjenkjenne et sete annet enn det reaktive sete av humant o^-PI kle tilsatt. Blandingen ble oppbevart over natten ved 4°C og vasket med samme vaskeoppløsning som brukt ovenfor. Deretter ble en alkalisk fosfatasesubstratoppløsning tilsatt i en konsentrasjon på 1 mg/ml, og 20 minutter senere ble absorbansen av oppløsningen ved en bølgelengde på 405 nm målt på et mikroplatefotometer (MTP-12 fremstilt av Corona Electrical Co., Ltd.).

Resultatene er vist i tabell 10. Intet a2-PI kle påvist i "gjennom-passasjefraksjonen" og i den "vaskete fraksjon". Det kunne derfor bli bekreftet at c^-PI fullstendig kunne bli separert fra humant plasma ved å tilsette humant plasma til det adsorberende stoff.

EKSEMPEL 17

Separering og eluering av humant o^-PI ^ra humant plasma ved å benytte en selektiv adsorbeut for humant c^-PI: En adsorbent (1,0 ml) med det monoklonale antistoff 1D1DC1 til humant c^-PI kjemisk bundet til dette ble pakket i en kolonne. Kolonnen ble ekvilibrert med en passende puffer (0,01M natriumfosfatpuffer, 0,15MNaCl, pH 7,2). Deretter ble 2,0 ml humant plasma ført gjennom kolonnen pakket med det adsorberende stoff. Fraksjoner som ble eluert uten adsorpsjon til det adsorberende stoff ble samlet opp og brukt som "gjennompassasjefraksjon". Deretter ble 10 ml av den samme puffer som ovenfor passert gjennom kolonnen, og stof-fer som var ikke-spesifikt bundet på det adsorberende stoff ble eluert og samlet opp ("vasket fraksjon").

Til slutt, ved å benytte passende elueringsmidle^ ble humant a2_PI bundet til det adsorberende stoff eluert for å erholde en "elueringsfraksjon".

De følgende tre elueringsmidler (a) til (c) ble brukt.

(a) 50%, v/v etylenglykol, pH 11,5

(b) 50%, v/v etylenglykol-PBS, pH 7,4

(c) 50%, v/v etylenglykol-PBS, 0,05% "Tween 80", pH 7,4

Etter hver eluering ble kolonnen (adsorberende stoff) rege-nerert og ekvilibrert, og humant <x2-PI ble adsorbert på det adsorberende stoff og eluert med det neste eluerende stoff. Mengden av antigenet c^-PI ^ hver av de "eluerte fraksjoner" erholdt med de tre typer elueringsmidler ble bestemt ved enzym-koblet immunosorbent-assay (ELISA) . Aktivitet til o^-PI ble bestemt ved å måle den gjenværende plasminaktivitet ved å benytte et syntetisk substrat S-2251 (H—D-valyl-L-leucyl-L-lysyl-p-nitroaniliddihydroklorid) . Mengden (mikrogram) av antigenet d2~PI ^ ^ver reaksjon bestemt ved den ovenfor nevnte assay-metodeti er vist i tabell 11, og mengden (mikrogram) av ct2-PI med aktivitet bestemt ved å benytte det syntetiske substrat er vist i tabell 12.

Resultatene viser at passering av elueringsmidlene (a) til (c) gjennom det adsorberende stoff kan lede til elueringen og opprenskningen av humant c^-PI, og at spesielt når (c) blir brukt som elueringsmiddel ble 37,4 ug som tilsvarte 29,7% <i2_PI (12f> ;ug) i 2,0 ml av humant plasma eluert og mengden c^-PI med aktivitet var 37,2 jug, hvilket indikerte at det eluerte c^-PI hadde en aktivitet på omkring 100%.

EKSEMPEL 18

Fremstilling av c^-PI i humant plasma:

Humant plasma (4,0 ml) ble påsatt en kolonne pakket med 2,0 ml av det adsorberende stoff beskrevet i eksempel 17. Kolonnen ble vasket på samme måte som i eksempel 17 og eluert med elueringsmiddel (c) (50%, v/v etylenglykol-PBS,. 0,05%

"Tween 80", pH 7,4) for å erholde, en ^2-:pI fraksjon fra det humane plasma. Denne fraksjon ble konsentrert og ytterligere renset ved høyeffekt-væskekromatografi (HLC-803D, Toyo Soda Co., Ltd.). o^-PI ble separert og gjenvunnet med et oppløsningsmiddel bestående av 0,1M trifluoreddiksyre og 50% acetonitril og konsentrert. Oppløsningsmidlet ble erstat-tet av vann og produktet ble frysetørket for å erholde 70,4 jug av en renset standard prøve av o^-PI. SDS-polyakrylamid-elektroforese med 10% gelkonsentrasjon på denne standard-prøven ledet til konklusjonen at renset o^-PI med en molekylvekt på 67.000 kunne isoleres.

EKSEMPEL 19

Test for nedbrytning av tromber ved å benytte

humant plasma:

60 ul av en trombinoppløsning (200 enheter/ml ble tilsatt til 150 ul av en plasmaprøve tatt fra et normalt friskt menneske. Blandingen ble varmet til 37°C i 2 minutter for

å koagulere plasma og erholde et aggregat. Separat ble 2 7 ul av en oppløsning av et monoklonalt antistoff til c^-PI

(1D10C1; 3,39 mg/ml) tilsatt til 290 jai av en plasmaprøve fra et normalt friskt menneske. Blandingen ble varmet ved 37°C i 30 minutter. Til oppløsningen ble det tilsatt 100 yul

av en plasminoppløsning (1.000 enheter/ml) og samtidig ble aggregatet neddykket i denne. Oppløsningen ble så varmet ved 37°C. For sammenligning ble den ovenfor nevnte fremgangsmåte gjentatt ved å benytte fosfatpufret saltvann i stedet for den monoklonale antistoffoppløsning. Tidsenhetene som var nød-vendige for å løse opp aggregatet ble sammenlignet. Bruken av monoklonalt antistoff til o^-PI førte til fullstendig opp-løsning av aggregatet etter ca. 2 timer. I fravær av monoklonalt antistoff var en periode på mere enn 10 timer nødven-dig for å oppløse det.

EKSEMPEL 20

Test for nedbrytning av tromber ved å benytte humant blod:

Til 150 jul av en blodprøve tatt fra et normalt friskt menneske ble det tilsatt 60 jug av en trombinoppløsning (200 enheter/ml). Blandingen ble varmet til 37°C i 2 minutter for å koagulere blodet og erholde et aggregat. Separat ble 27

ul av en oppløsning av et monoklonalt antistoff til a2~PI (1D10C1; 3,39 mg/ml) tilsatt, og blandingen ble varmet til 37°C i 30 minutter. Til oppløsningen ble det tilsatt 100 /ul av en plasminoppløsning (1.000 enheter/ml) og samtidig ble aggregatet senket ned i dette. Oppløsningen ble så varmet til 37°C. Til sammenligning ble den ovenfor nevnte prosedyre gjentatt ved å benytte fosfat-pufret saltvann i stedet for den monoklonale antistoffoppløsning. Tiden som ble krevet for å løse opp prøven ble sammenlignet. Bruken av det mono-^ klonale antistoff til ot2~PI førte til fullstendig oppløsning av aggregatet etter ca. 2 timer. I fravær av det monoklonale antistoff var en periode på mere enn 10 timer nødvendig for å oppløse de t.

Claims (4)

1. Monoklonalt antistoff eller monoklonalt antistoff-fragment omfattende i det minste en Fab-region til et monoklonalt antistoff for anvendelse in vitro, som er spesifikt for en human a2-plasmin inhibitor og som ved tilbinding undertrykker den f ibrinolyse-aktiverende inhiberende funksjon av a2-plasmin inhibitor, hvilket monoklonalt antistoff er fremstilt på i og for seg kjent måte av hybridomer fremskaffet ved cellefusjon mellom miltceller fra mus inMunisert med humant oc2-plasmin inhibitor og irtusemyelomceller som er ålment tilgjengelige, karakterisert ved at antistoffet eller antistoff-fragmentet har den funksjon å spesifikt blokkere det reaktive sete hos human a2-plasmin-inhibitor som inhiberer den fibrinolytiske aktivitet til plasmin.

2. Anvendelse av monoklonalt antistoff eller monoklonalt antistoff-fragment ifølge krav 1 ved in vitro bestemmelse av a2-plasmin-inhibitor i en human assay-prøve, fortrinnsvis ved en "sandwich"-metode ved hjelp av et andre eventuelt merket anti-human-a2-plasmin-inhibitor-antistoff eller fragment, hvor markøren kan være et enzym, en luminescent substans eller en radioisotop og hvor det første eller andre antistoff eller antistoff-fragment kan være koblet til en uløselig bærer.

3. Anvendelse av monoklonalt antistoff eller -fragment ifølge krav 1 ved in vitro bestemmelse av oc2-plasmin-inhibitor i en human assay-prøve ved en agglutinerings-metode, eksempelvis ved påvisning av en forandring i lystransmittans i det medium prøven befinner seg, ved bruk av et andre anti-human-cx2-plasmin-inhibitor-antistoff eller -fragment, eksempelvis hvor de enkelte antistoff gjenkjenner forskjellige epitoper på oc2-plasmin-inhibitor, hvor minst ett av antistoffene eller -fragmentene er bundet til en uløselig bærer eller begge er bundet til samme bærer, hvilken bærer kan være fine partikler av en polymer, silika, aluminiumoksyd eller et metall.

4. Anvendelse av monoklonalt antistoff eller -fragment ifølge krav 1 ved in vitro separasjon, eksempelvis i vandig oppløsning av etylenglykol med en pH mellom 2,5 og 12,5, eller gjenvinning av a2~Plasmin-innibitor fra en fluidum-prøve såsom human plasma eller serum, hvor det monoklonale antistoff eller -fragment er bundet til en uløselig bærer.