JP4612922B2 - 新規のモノクローナル抗体並びにｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の免疫学的分析方法 - Google Patents
新規のモノクローナル抗体並びにｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の免疫学的分析方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なモノクローナル抗体、並びにヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー（以下、ｅ−Ｄモノマーと称することがある）、ヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄダイマー（以下、ｅ−Ｄダイマーと称することがある）、及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解ＤＤ／Ｅ複合体（以下、ｅ−ＤＤ／Ｅ複合体と称することがある）の免疫学的分析方法に関する。
前記のｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体は、例えば、肺気腫若しくは敗血症、又は外科手術に伴う多臓器不全の予知マーカーとして有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトフィブリノーゲン及びヒト安定化フィブリンの各種プロテアーゼによる分解物は、生体内血液凝固線溶異常の診断における診断マーカーとして有用である。例えば、ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解Ｄモノマー（以下、ｐ−Ｄモノマーと称することがある）、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解Ｄダイマー（以下、ｐ−Ｄダイマーと称することがある）、及びヒト安定化フィブリンのプラスミン分解ＤＤ／Ｅ複合体（以下、ｐ−ＤＤ／Ｅ複合体と称することがある）は、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の診断マーカーとして広く用いられている。生体試料中のｐ−Ｄモノマー、ｐ−Ｄダイマー、及びｐ−ＤＤ／Ｅ複合体の測定においては、ｐ−Ｄモノマー、ｐ−Ｄダイマー、及びｐ−ＤＤ／Ｅ複合体に特異的なモノクローナル抗体を用いた酵素免疫学的測定法（ＥＩＡ法）又はラテックス凝集法が一般に使用されている。
【０００３】
一方、ヒトフィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマー、ヒト安定化フィブリンのｅ−Ｄダイマー、及びヒト安定化フィブリンのｅ−ＤＤ／Ｅ複合体は、生体内局所において白血球、特には顆粒球が活性化されたときに放出されるエラスターゼによってフィブリノーゲン又はフィブリンが分解を受けて生じるもので、前記のプラスミン分解物とは異なった臨床診断マーカーとしての有用性が認められる。すなわち、顆粒球の活性化が広範に起こると考えられる肺気腫若しくは敗血症、又は外科手術に伴う多臓器不全などの予知マーカーとして有用である。
【０００４】
しかしながら、前記のｐ−Ｄモノマー、ｐ−Ｄダイマー、及びｐ−ＤＤ／Ｅ複合体に特異的なモノクローナル抗体を用いた測定法では、プラスミンの作用で生成したｐ−Ｄモノマー、ｐ−Ｄダイマー、及びｐ−ＤＤ／Ｅ複合体を測定することはできるが、顆粒球エラスターゼの作用によって生成したｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を測定することは不可能である。このため、既にヒトフィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマー、ヒト安定化フィブリンのｅ−Ｄダイマー、及びヒト安定化フィブリンのｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を測定しようとする試みがいくつか成されている。
【０００５】
例えば、フィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマーを免疫して得られたポリクローナル抗体より、ｐ−Ｄモノマー、ｐ−Ｄダイマー、及びｐ−ＤＤ／Ｅ複合体、並びにフィブリノーゲンに反応する抗体を除去したポリクローナル抗体が使用される場合がある（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，第１０２巻，８５８頁，１９８３年）が、操作が煩雑である。
また、顆粒球エラスターゼがフィブリノーゲンに作用した際にフィブリノーゲンのＡα鎖上に新たに生ずるＮ末端部位（Ａα２２〜）に反応するモノクローナル抗体が報告されている（Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，第６巻、２５９頁，１９９５年）。このモノクローナル抗体の反応部位は、Ｅドメインのα鎖にあり、本発明のモノクローナル抗体とは異なる。また、このモノクローナル抗体は、フィブリノーゲンに対しても約１．３％の反応性を示すので、血漿中のフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解物又は安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解物を特異的に測定することはできない。
【０００６】
更にまた、顆粒球エラスターゼをフィブリノーゲンに作用して得られるｅ−Ｄモノマーのα鎖上に新たに生ずるＮ末端部位（すなわち、アミノ酸残基Ａα１１２から始まるアミノ酸配列）に反応するモノクローナル抗体が報告されている（特開平９−３０１９９９号公報）。このモノクローナル抗体は、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー、ヒト安定化フィブリンのｅ−Ｄダイマー及びヒト安定化フィブリンのｅ−ＤＤ／Ｅ複合体と特異的に反応して検出することができることが記載されているが、実際には、それら顆粒球エラスターゼ分解産物の一部とのみ、特異的に反応して検出しているにすぎない。すなわち、ｅ−Ｄモノマーは、Ｎ末端アミノ酸残基が異なる、少なくとも４種類のポリペプチドの混合物であり、特開平９−３０１９９９号公報に記載のモノクローナル抗体は、４種類のｅ−Ｄモノマ−の全部とは反応しない。
【０００７】
ｅ−Ｄモノマーが少なくとも４種類のポリペプチドの混合物であることは、後述する実施例５に示すように、ヒトフィブリノーゲンを顆粒球エラスターゼによって分解した後に、ｅ−Ｄモノマーを単離し、そのｅ−Ｄモノマーのα鎖のＮ末端配列を調べることにより確認した。すなわち、特開平９−３０１９９９号公報に記載のモノクローナル抗体が反応するアミノ酸残基Ａα１１２より始まるＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−の配列以外にも、アミノ酸残基Ａα１００より始まるＳｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−、アミノ酸残基Ａα１０２より始まるＡｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−、及びアミノ酸残基Ａα１０８より始まるＴｙｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−の合計４配列が、メジャー配列として確認され、ｅ−Ｄモノマーには、少なくとも４種類の異なるポリペプチド（以下、アミノ酸残基Ａα１１２より始まるポリペプチドを「ｅ−Ｄモノマー１」、アミノ酸残基Ａα１００より始まるポリペプチドを「ｅ−Ｄモノマー２」、アミノ酸残基Ａα１０２より始まるポリペプチドを「ｅ−Ｄモノマー３」、そして、アミノ酸残基Ａα１０８より始まるポリペプチドを「ｅ−Ｄモノマー４」と称することがある）が含まれることが判明した。更に、本発明者は、前記の４種類の各ポリペプチドと、特開平９−３０１９９９号公報に記載のモノクローナル抗体との反応性を調べたところ、ｅ−Ｄモノマー１にのみ反応し、ｅ−Ｄモノマー２、ｅ−Ｄモノマー３、及びｅ−Ｄモノマー４には反応しないことを確認した。この結果から明らかなように、特開平９−３０１９９９号公報に記載のモノクローナル抗体では、全ての顆粒球エラスターゼ分解産物を捕らえることができない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、前記の従来技術の欠点を解消し、顆粒球エラスターゼ分解により生じたｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体に分類される全ての顆粒球エラスターゼ分解産物に反応するモノクローナル抗体を提供し、このモノクローナル抗体を用いることにより、生体試料中のｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の量を迅速かつ正確に測定可能で、しかも試料中に同時に含まれると考えられるフィブリノーゲン、フィブリノーゲンのプラスミン分解物（特には、ｐ−Ｄモノマー）及び安定化フィブリンのプラスミン分解物（特には、ｐ−Ｄダイマー又はｐ−ＤＤ／Ｅ複合体）の量に影響を受けることない、免疫学的分析方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記の課題は、本発明による、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー、及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物と特異的に反応し、ヒトフィブリノーゲン、並びにヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＸ、顆粒球エラスターゼ分解フラグメンＹ、及び顆粒球エラスターゼ分解フラグメンＥと反応しないモノクローナル抗体であって、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物との前記反応が、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物に含まれるα鎖のＣ末端領域との反応であることを特徴とする、前記モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントによって達成することができる。
【００１０】
また、本発明は、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマーのα鎖のＣ末端領域を含むペプチドを、ハプテンとして用いて免疫することにより得られた、前記モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントに関する。
また、本発明は、配列表の配列番号１（数字見出し＜２１０＞欄）の配列（数字見出し＜４００＞欄）に記載のアミノ酸配列を有するペプチドと反応することを特徴とするモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントに関する。
また、本発明は、前記モノクローナル抗体を産生することを特徴とする、ハイブリドーマに関する。
【００１１】
また、本発明は、前記モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを第１抗体として不溶性担体に固定化し、この固定化された第１抗体と、被検試料と、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物に反応し、且つ前記第１抗体とは異なるエピトープに反応する抗体に標識を付した第２抗体とを接触させ、そして、前記の固定化第１抗体に補足された、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー若しくはヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物と結合した前記第２抗体の前記標識からの信号、又は前記の固定化第１抗体に補足された、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー若しくはヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物と結合しなかった前記第２抗体の前記標識からの信号を検出することを特徴とする、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物の免疫学的分析方法にも関する。
【００１２】
更には、本発明は、不溶性担体に固定化された前記モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントと、被検試料とを接触させ、凝集反応を観察することを特徴とする、ヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物の免疫学的分析方法にも関する。
【００１３】
本明細書において、「顆粒球エラスターゼ」とは、顆粒球のアズール顆粒（一次顆粒）又は特殊顆粒（二次顆粒）に含まれ、炎症局所に誘導され活性化された顆粒球より放出されるセリンプロテアーゼであって、その生理的な基質である、細胞外マトリックスに含まれるエラスチン、コラーゲン、フィブロネクチン、若しくはプロテオグリカン、又は血漿中タンパク質のフィブリノーゲン、フィブリン、プラスミノーゲン、若しくはアンチトロンビンIIIなどを、主に疎水性アミノ酸であるバリン、アラニン、ロイシン、又はイソロイシンなどのＣ末端側で加水分解するエステラーゼを意味する。
【００１４】
本明細書において、顆粒球エラスターゼによって分解されることによって生成する分解物を、その分解物名の前に「ｅ−」を付けることによって表すことがある。例えば、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー、顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＸ、顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＹ、及び顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＥを、ヒトフィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマー、ｅ−フラグメントＸ、ｅ−フラグメントＹ、及びｅ−フラグメントＥとそれぞれ表すことがある。同様に、本明細書において、プラスミンに分解されたことによって生じる分解物を、その分解物の名称の前に「ｐ−」を付与することによって表すことがある。
【００１５】
また、本明細書において、ヒトフィブリノーゲンのＡα鎖における各アミノ酸残基を、「Ａα」の後に、Ａα鎖のＮ末端から数えた番号を付けることによって表すことがある。例えば、「Ａα１１２」は、ヒトフィブリノーゲンのＡα鎖のＮ末端から数えて第１１２番目のアミノ酸残基を意味する。なお、Ａα鎖とは、ヒトフィブリノーゲンを構成する３種類のポリペプチド（Ａα鎖、Ｂβ鎖、及びγ鎖）の１つである。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー、及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物と特異的に反応し、ヒトフィブリノーゲン、並びにヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＸ、顆粒球エラスターゼ分解フラグメンＹ、及び顆粒球エラスターゼ分解フラグメンＥとは反応しない。
【００１７】
本発明のモノクローナル抗体におけるヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー、及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物との前記反応は、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物に含まれるα鎖のＣ末端領域との反応である。
本発明の好ましいモノクローナル抗体は、更に、ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解物、及びヒト安定化フィブリンのプラスミン分解物とも反応しない。
【００１８】
ここで「ヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物」とは、ヒト安定化フィブリンを顆粒球エラスターゼで処理することにより生成する分解物の内、ヒト安定化フィブリンのｅ−Ｄドメインを有する分解物を意味し、例えば、ｅ−ＤＤ／Ｅを基本単位としたｅ−ＤＤ／Ｅのポリマー様物質、ｅ−Ｄダイマー、又はｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を挙げることができ、特にはｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を意味する。
また、本明細書において、「ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー（ｅ−Ｄモノマー）と反応する」とは、特に断わらない限り、ｅ−Ｄモノマーに含まれる４種類のポリペプチド（すなわち、ｅ−Ｄモノマー１、ｅ−Ｄモノマー２、ｅ−Ｄモノマー３、及びｅ−Ｄモノマー４）の全てと反応することを意味する。すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、ｅ−Ｄモノマー１、ｅ−Ｄモノマー２、ｅ−Ｄモノマー３、及びｅ−Ｄモノマー４の全てと反応する。
【００１９】
本発明の前記モノクローナル抗体は、例えば、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマーのα鎖のＣ末端領域を含むペプチドを、ハプテンとして用いて免疫することにより得られる。ここで「ｅ−Ｄモノマーのα鎖」とは、ｅ−Ｄモノマーを構成する３種類のポリペプチド（α鎖、β鎖、及びγ鎖）の１つであって、ヒトフィブリノーゲンのＡα鎖に顆粒球エラスターゼが作用することにより、前記Ａα鎖のＮ末端側とＣ末端領域の一部が切断除去され、得られるポリペプチドを意味する。なお、前記α鎖は、Ｎ末端アミノ酸残基が異なる、少なくとも４種類のポリペプチドの混合物である。
【００２０】
前記ペプチドに含まれるｅ−Ｄモノマーのα鎖のＣ末端領域は、α鎖のＣ末端側に位置する領域であって、且つα鎖のＣ末端のアミノ酸残基であるロイシン残基（ヒトフィブリノーゲンのＡα鎖のアミノ酸残基Ａα２０４に相当する）を含む領域である限り特に限定されるものではない。また、前記Ｃ末端領域の長さ、すなわち、Ｃ末端領域を構成するアミノ酸残基の数も特に限定されるものではないが、好ましくは６〜１３個のアミノ酸残基からなることができる。前記Ｃ末端領域としては、例えば、ヒトフィブリノーゲンのＡα鎖における第１９２番目のアミノ酸残基〜第２０４番目のアミノ酸残基からなる領域（配列表の配列番号１の配列に記載のアミノ酸配列で表される領域）を挙げることができる。
【００２１】
前記Ｃ末端領域を含むペプチドの長さ（すなわち、ペプチドを構成するアミノ酸残基の数）も、通常、ハプテンとして用いることのできる長さである限り、特に限定されるものではなく、好ましくは８〜１５個のアミノ酸残基からなることができる。
本発明の前記モノクローナル抗体を製造する際に使用するヒトフィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマーのα鎖のＣ末端領域を含むペプチドとしては、例えば、配列表の配列番号２の配列に記載のアミノ酸配列で表されるペプチド（すなわち、配列表の配列番号１の配列に記載のアミノ酸配列におけるＮ末端のＡｓｐをＣｙｓに置換したアミノ酸配列を有するペプチド）を挙げることができる。ヒトフィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマーのα鎖のＣ末端領域を含むペプチドは、公知の従来方法に従って調製することができる。例えば、ペプチド合成機を用いて所望のアミノ酸配列からなるペプチドを化学合成することもできるし、あるいは、精製ｅ−Ｄモノマーを適当な酵素で消化し、所望のペプチドを精製することにより調製することもできる。
【００２２】
本発明の前記モノクローナル抗体を製造する際には、ヒトフィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマーのα鎖のＣ末端領域を含むペプチドを、抗体製造に使用することのできる従来公知の担体に結合させることにより、ハプテン−担体複合体を形成させ、得られたハプテン−担体複合体を抗原として使用する。前記担体としては、例えば、ウシ血清アルブミン、スカシガイ（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、又は卵白アルブミンなどを挙げることができる。前記ペプチドと前記担体とを結合する手段も、従来公知の方法を使用することができ、例えば、マレイミド、カルボジイミド、又はグルタルアルデヒドなどを、ペプチドと担体との架橋剤として使用することができる。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体を別の観点からみると、本発明のモノクローナル抗体は、配列表の配列番号１の配列に記載のアミノ酸配列を有するペプチドと反応する。このような本発明のモノクローナル抗体は、例えば、配列表の配列番号１の配列に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを、ハプテンとして用いて免疫することにより得られる。
【００２４】
本発明のモノクローナル抗体は、そのモノクローナル抗体を産生することのできる本発明のハイブリドーマ（例えば、マウスハイブリドーマ）を、例えば、適当な培地又は哺乳動物（例えば、マウス）の腹腔内で培養することにより製造することができる。
前記の本発明のハイブリドーマは、これまで説明したように、ヒトフィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマーのα鎖のＣ末端領域を含むペプチドを、従来公知の担体に結合させることにより、ハプテン−担体複合体を形成させ、得られたハプテン−担体複合体を用いて免疫した哺乳動物（例えば、マウス）又は鳥類の脾臓細胞と哺乳動物（例えば、マウス）のミエローマ細胞（骨髄腫細胞）とを、ケーラー及びミルシュタインの基本方法［Ｎａｔｕｒｅ，第２５６巻，４９５頁（１９７５年）参照］により細胞融合して製造することが可能である。詳細には、下記実施例に記載の方法によって製造することができる。
【００２５】
前記のハイブリドーマを培養することのできる培地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地であればよく、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｅａｇｌｅ'ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ：以下、ＤＭＥと称する）にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸、及び抗生物質（ペニシリンＧとストレプトマイシン）を含む培地が用いられる。
前記のハイブリドーマの培養は、培地中で行なう場合には、例えば、５％ＣＯ2濃度及び３７℃の条件下で約３日間行なう。あるいは、マウスの腹腔内で行なう場合には、例えば、約１４日間行なう。
【００２６】
このようにして製造された培養液又は哺乳動物の腹水から、例えば、タンパク質の単離・精製に一般的に用いられている方法により、本発明のモノクローナル抗体を分離・精製することが可能である。
そのような方法としては、例えば、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、又は凍結乾燥等を挙げることができる。
【００２７】
本発明の抗体フラグメントは、本発明のモノクローナル抗体のフラグメントであって、しかも、もとのモノクローナル抗体と同じ反応特異性を有する抗体フラグメントである。すなわち、本発明の抗体フラグメントは、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー、及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物と特異的に反応し、ヒトフィブリノーゲン、並びにヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＸ、顆粒球エラスターゼ分解フラグメンＹ、及び顆粒球エラスターゼ分解フラグメンＥと反応せず、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物との前記反応は、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物を構成するα鎖のＣ末端領域との反応である。また、本発明の好ましい抗体フラグメントは、更に、ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解物、及びヒト安定化フィブリンのプラスミン分解物とも反応しない。
更に、本発明の抗体フラグメントは、配列表の配列番号１の配列に記載のアミノ酸配列を有するペプチドと反応する。
【００２８】
本発明の抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、又はＦｖ等が含まれる。これらのフラグメントは、例えば、本発明のモノクローナル抗体を常法によりタンパク質分解酵素によって消化し、続いて、タンパク質の分離・精製の常法に従って得ることができる。
【００２９】
このようにして得られた本発明のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントは、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー、及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物とのみ反応し、ヒトフィブリノーゲン、並びにヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＸ、顆粒球エラスターゼ分解フラグメンＹ、及び顆粒球エラスターゼ分解フラグメンＥとは反応しないので、ｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の各種の免疫学的分析方法の試薬として有用である。なお、本明細書において、前記「分析方法」には、分析対象物の存在の有無を確認する検出方法と、分析対象物の量を測定する定量方法との両方が含まれる。
【００３０】
また、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントのエピトープは、先に説明したように、ヒトフィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマーを構成するα鎖のＣ末端領域に存在するので、従来公知のモノクローナル抗体、例えば、特開平９−３０１９９９号公報に記載のモノクローナル抗体では、ｅ−Ｄモノマーの一部としか反応することができなかったのに対して、以下に示す理由により、全てのｅ−Ｄモノマーと反応することができる。
すなわち、後述する実施例５に示すように、ヒトフィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマーを構成するα鎖のＮ末端領域のアミノ酸配列を解析したところ、４種類の異なるアミノ酸配列が確認された［実施例５（ｂ）参照］のに対して、同じα鎖のＣ末端領域のアミノ酸配列は１種類であった［実施例５（ｃ）参照］。特開平９ー３０１９９９号公報に記載の前記モノクローナル抗体のエピトープは、α鎖における４種類のＮ末端アミノ酸配列の中の特定のＮ末端アミノ酸配列に存在するため、ｅ−Ｄモノマーの一部しか捕らえることができない。一方、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントのエピトープは、全てのｅ−Ｄモノマーに共通して存在するＣ末端領域のアミノ酸配列に存在するため、全てのｅ−Ｄモノマーを捕らえることができる。
【００３１】
例えば、本発明のモノクローナル抗体及び／又は抗体フラグメントを第１抗体として不溶性担体に固定化し、この固定化された第１抗体と、被検試料と、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物に反応し、且つ前記第１抗体とは異なるエピトープに反応する抗体（モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）に標識を付した第２抗体とを接触させた後に、前記の固定化第１抗体に補足されたヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー（ｅ−Ｄモノマー）及び／又はヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物（特にはｅ−Ｄダイマー及び／又はｅ−ＤＤ／Ｅ複合体）と結合した前記第２抗体と、前記の固定化第１抗体に補足されたヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー（ｅ−Ｄモノマー）及び／又はヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物（特にはｅ−Ｄダイマー及び／又はｅ−ＤＤ／Ｅ複合体）と結合しなかった前記第２抗体とに分離すると、いずれか（又は両方）の第２抗体の前記標識からの信号を検出することができるので、本発明のモノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物の免疫学的分析方法（サンドイッチ法）に適用することができる。
【００３２】
また、本発明のモノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、例えば、本発明によるモノクローナル抗体及び／又は抗体フラグメントを不溶性担体（支持体）に感作し、この感作支持体と被検試料とを接触させ、凝集反応によりヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物を測定する方法（凝集法）にも適用することができる。
この凝集法による測定法において、前記感作支持体は、ｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体、並びにｅ−Ｄモノマーとそれぞれ反応することができ、それ以外の成分とは反応しない。前記感作支持体とｅ−Ｄダイマー又はｅ−ＤＤ／Ｅ複合体とを接触させると、ｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体は複数の抗原決定基を有するので、前記感作支持体の凝集反応が生じる。それに対して、ｅ−Ｄモノマーは抗原決定基を一つしか持たないので、前記感作支持体とｅ−Ｄモノマーとを接触させても、前記感作支持体の凝集反応は生じない。従って、ｅ−Ｄダイマー、ｅ−ＤＤ／Ｅ複合体、及びｅ−Ｄモノマーを含む被検試料と、前記感作支持体とを接触させたときに生じる前記感作支持体の凝集反応は、ｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体との反応によるものであり、このような凝集反応における差異に基づいて、ｅ−Ｄモノマーの影響を受けることなく、被検試料中のｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の量を測定することができる。
【００３３】
本発明の免疫学的分析方法に用いる被検試料は、ｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及び／又はｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を含む可能性のある試料であれば特に限定されるものでないが、例えば、生体試料、特には血液、血漿、血清、又は尿、好ましくは血漿又は血清である。本発明の免疫学的分析方法においては、被検試料中にフィブリノーゲン、ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解物、又はヒト安定化フィブリンのプラスミン分解物が存在する場合であっても、本発明のモノクローナル抗体はそれらとは反応しないので、それらの影響を受けることなく、被検試料中に存在するｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を測定することができる。
【００３４】
サンドイッチ法を利用する本発明の免疫学的測定法では、具体的には、前記の本発明によるモノクローナル抗体を適当な不溶性担体に固定化する（第１抗体）。次に、不溶性担体と被検試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤［例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やゼラチン等］で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、被検試料を加えて一定時間（たとえば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（１次反応）。続いて、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物に反応し、且つ前記第１抗体とは異なるエピトープに反応する抗体に標識を付した第２抗体を加えて一定時間（たとえば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（２次反応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する標識抗体の量を定量する。その値から、被検試料中のｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の量を算出することができる。
前記第２抗体としては、例えば、抗ヒトフィブリノーゲンポリクローナル抗体、抗ｅ−Ｄモノマーポリクローナル抗体、又はｅ−Ｄモノマーに含まれる４種類のポリペプチド（すなわち、ｅ−Ｄモノマー１、ｅ−Ｄモノマー２、ｅ−Ｄモノマー３、及びｅ−Ｄモノマー４）の全てと反応する抗ｅ−Ｄモノマーモノクローナル抗体などを挙げることができる。
【００３５】
本発明のサンドイッチ法による免疫学的測定法に使用することのできる不溶性担体は特に限定されるものでなく、例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子、その他ニトロセルロース、紙、アガロース、及びこれらの組み合わせ等を例示することができる。
【００３６】
標識物質としては、酵素、蛍光物質、又は発光物質を使用するのが有利である。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート等、また、発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル、ルシフェリン等を使用することができる。
【００３７】
凝集反応を利用する本発明の免疫測定法において、不溶性担体としては、一般に抗原抗体反応の凝集反応を利用する免疫学的分析方法において用いられる任意の不溶性担体を用いることができ、例えば、ラテックス粒子（特には、ポリスチレンラテックス粒子）を挙げることができる。本発明によるモノクローナル抗体を不溶性担体に固定化させるには、公知の方法、例えば、化学結合法（架橋剤としてカルボジイミド、グルタルアルデヒド等を用いる）又は物理吸着法を用いることができる。
スライド板を用いる場合には目視的に、又は反応セルを用いる場合には特定の波長を用いて分光学的に凝集反応を測定し、被検試料中のｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の量を定量することができる。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解物及びｅ−Ｄモノマーの調製》
ヒトフィブリノーゲン（エンザイムリサーチ社，米国）２０ｍｇを１０ｍｇ／ｍｌとなるように、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。この溶液に塩化カルシウムを終濃度５ｍＭとなるように添加した後に、ヒト顆粒球エラスターゼ（１．０ｍｇ／ｍｌ，アテンズリサーチ社，米国）０．２ｍｌを加え、３７℃で２時間反応させた。反応停止は、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ，和光純薬，日本）を終濃度１ｍＭとなるように添加することによって行なった。反応を停止させた後の生成物を、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したセファクリルＳ−３００ＨＲカラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ，ファルマシア・バイオテク）に充填し、ゲル濾過法によりｅ−Ｄモノマー（分子量約１０万）、ｅ−フラグメントＸ（分子量約２５万）、ｅ−フラグメントＹ（分子量約１５万）、及びｅ−フラグメントＥ３（分子量約５万）を分画した。こうして得られた各分画を、本発明のモノクローナル抗体の認識部位の同定に使用した。
【００３９】
【実施例２】
《ｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の調製》
フィブリノーゲン（エンザイムリサーチ社，米国）１００ｍｇ（１０ｍｇ／ｍｌ）に、ヒトトロンビン（シグマ社，米国）、第XIII因子（エンザイムリサーチ社，米国）、及び塩化カルシウムをそれぞれ終濃度５０単位／ｍｌ、２単位／ｍｌ、及び５ｍＭとなるよう加え、３７℃で２時間反応させ、フィブリノーゲンをフィブリンに変換させた。１８０００×ｇで３０分間遠心し、フィブリンを非凝固性物質から分離した。得られたフィブリンを凍結乾燥した後に、破砕し、フィブリンパウダーとした。
【００４０】
このフィブリンパウダー２０ｍｇを、５ｍＭ−ＣａＣｌ2含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）３．２ｍｌに浮遊させ、この浮遊液にヒト顆粒球エラスターゼ（１．０ｍｇ／ｍｌ，アテンズリサーチ社，米国）０．０６７ｍｌを添加し、穏やかに撹拌しながら３７℃で反応させた。２時間経過した後に、ＤＦＰを終濃度１ｍＭとなるように加えて分解反応を停止させた。この反応液を１８０００×ｇで３０分間遠心し、分解されずに残ったフィブリンを沈殿として除去した。遠心上清を、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したセファクリルＳ−３００ＨＲカラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ）に充填し、ゲル濾過法を行なった。各フラクションをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析し、ｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の分画を同定及び分離した。
【００４１】
このようにして得られたｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を、５Ｍ尿素−５０ｍＭクエン酸（ｐＨ５．５）の溶液中で３７℃で３時間保温した後に、０．５Ｍ−ＮａＣｌ含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したセファクリルＳ−３００ＨＲカラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ）に充填し、溶出した。各フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、ｅ−Ｄダイマー分画、ｅ−フラグメントＥ１分画、及びｅ−フラグメントＥ２分画を同定及び分離した。このようにして調製したｅ−Ｄダイマー、ｅ−フラグメントＥ１、及びｅ−フラグメントＥ２を、本発明のモノクローナル抗体の認識部位の同定のために使用した。
【００４２】
【実施例３】
《ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解物の調製》
ヒトフィブリノーゲン（エンザイムリサーチ社，米国）２０ｍｇを１０ｍｇ／ｍｌとなるように、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。この溶液に塩化カルシウムを終濃度５ｍＭとなるように添加した後に、ヒトプラスミン（１．０ｍｇ／ｍｌ，クロモジェニックス社，スウェーデン）０．０２ｍｌを加え、３７℃で２時間反応させた。反応停止は、ＤＦＰを終濃度１ｍＭとなるように添加することによって行なった。反応を停止させた後の生成物を、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したセファクリルＳ−３００ＨＲカラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ，ファルマシア・バイオテク）に充填し、ゲル濾過法によりｐ−Ｄモノマー（分子量約１０万）、ｐ−フラグメントＸ（分子量約２５万），ｐ−フラグメントＹ（分子量約１５万）、及びｐ−フラグメントＥ３（分子量約５万）を分画した。このようにして得られた各分画を、本発明のモノクローナル抗体の認識部位の同定に使用した。
【００４３】
【実施例４】
《ｐ−Ｄダイマー及びｐ−ＤＤ／Ｅ複合体の調製》
実施例２で調製したフィブリンパウダー２０ｍｇを、５ｍＭ−ＣａＣｌ2含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）３．２ｍｌに浮遊させ、この浮遊液に、ヒトプラスミン（１．０ｍｇ／ｍｌ）０．００５ｍｌを添加し、穏やかに撹拌しながら３７℃で反応させた。４時間経過した後に、ＤＦＰを終濃度１ｍＭとなるように加えて分解反応を停止させた。この反応液を１８０００×ｇで３０分間遠心し、分解されずに残ったフィブリンを沈殿として除去した。遠心上清を、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したセファクリルＳ−３００ＨＲカラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ）に充填し、ゲル濾過法を行なった。各フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、ｐ−ＤＤ／Ｅ複合体の分画を同定及び分離した。
このようにして得られたｐ−ＤＤ／Ｅ複合体について、実施例２においてｅ−ＤＤ／Ｅ複合体に対して実施した操作と同様の操作を行なうことにより、ｐ−Ｄダイマー、ｐ−フラグメントＥ１、及びｐ−フラグメントＥ２を調製し、本発明のモノクローナル抗体の認識部位の同定のために使用した。
【００４４】
【実施例５】
《ｅ−Ｄモノマーのα鎖Ｎ末端アミノ酸配列及びＣ末端アミノ酸配列の分析》
（ａ）ｅ−Ｄモノマーのα鎖の単離
実施例１で調製したｅ−Ｄモノマー４ｍｇを、６Ｍ塩酸グアニジン及び１０ｍＭ−ＥＤＴＡ含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）０．８ｍｌに溶解し、気相を窒素で置換した後に、２０％ジチオスレイトール（ＤＴＴ）０．０１２ｍｌを添加し、５０℃で３時間保温することにより還元した。再び気相を窒素で置換した後に、４−ビニルピリジン０．０１ｍｌを添加し、遮光下、２５℃で２時間保温することにより、チオール基をピリジルエチル化した。続いて、蒸留水に対して充分に透析を行なった後に、透析内液を回収し、凍結乾燥した。凍結乾燥物を、６Ｍ塩酸グアニジン溶液０．０５ｍｌに溶解した後に、ＰＯＲＯＳ−Ｒ１／Ｍカラム（４．６ｍｍ×１００ｍｍ，日本パーセプティブ）を用いた逆相クロマトグラフィーにより、ピリジルエチル化したα鎖（ＰＥ−αと称する）を単離した。
【００４５】
（ｂ）ｅ−Ｄモノマーのα鎖Ｎ末端アミノ酸配列の分析
前記実施例５（ａ）で単離したＰＥ−αのＮ末端アミノ酸配列分析を、自動アミノ酸配列分析機（モデル４７６Ａ，アプライドバイオシステムズ社）を用いて行なった。分析の結果、４種類のアミノ酸配列、すなわち、フィブリノーゲンのアミノ酸残基Ａα１００（フィブリノーゲンのＡα鎖のＮ末端より数えて１００番目のアミノ酸残基を意味し、以下に記載の「アミノ酸残基Ａα１０２」、「アミノ酸残基Ａα１０８」、及び「アミノ酸残基Ａα１１２」についても同様）より始まるアミノ酸配列（Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−）、アミノ酸残基Ａα１０２より始まるアミノ酸配列（Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−）、アミノ酸残基Ａα１０８より始まるアミノ酸配列（Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−）、及びアミノ酸残基Ａα１１２より始まるアミノ酸配列（Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−）が確認された。この結果は、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解で生じたｅ−Ｄモノマーのα鎖Ｎ末端は、単一の切断部位から構成されないことを示している。
【００４６】
（ｃ）ｅ−Ｄモノマーのα鎖Ｃ末端アミノ酸配列の分析
前記実施例５（ａ）で単離したＰＥ−α０．５ｍｇを、３Ｍ尿素含有１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）０．２５ｍｌに溶解した。この溶液にリシルエンドペプチダーゼ（１．０ｍｇ／ｍｌ，和光純薬）０．０２ｍｌを添加し、３７℃で１８時間保温した後に、終濃度１ｍＭとなるようにＤＦＰを添加し、反応を停止した。この操作により、ＰＥ−αは、リシン残基のＣ末端側で特異的に切断された。この分解物に０．２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）０．２５ｍｌを加えた後に、希酢酸を添加し、ｐＨを５．０に調整した。得られた溶液を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で予め平衡化したアンヒドロトリプシン固定化アガロースカラム（容量１ｍｌ，宝酒造）に充填し、非吸着画分を集めた。非吸着画分には、Ｃ末端アミノ酸としてリシンを持たないペプチド、すなわち、リシルエンドペプチダーゼ処理を行なう前のＰＥ−αにおいてＣ末端に位置しているペプチドが回収される。
【００４７】
次に、非吸着画分に回収されたペプチドを、コスモシール５Ｃ１８Ｐカラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，ナカライテスク）を用いた逆相クロマトグラフィーにより分離した。０〜４０％（容量／容量）アセトニトリル濃度の直線濃度勾配溶出において、１本のペプチドピークのみが認められた。この結果は、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解で生じたｅ−Ｄモノマーのα鎖Ｃ末端は、単一の切断部位から構成されることを示している。
このピークを自動アミノ酸配列分析機（モデル４７６Ａ、アプライドバイオシステムズ社）にかけ、Ｎ末端側からＣ末端まで順次アミノ酸配列を分析した。分析の結果は、フィブリノーゲンのアミノ酸残基Ａα１９２〜２０４に相当するアミノ酸配列であるＡｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列表の配列番号１の配列に記載のアミノ酸配列）が確認された。
【００４８】
【実施例６】
《免疫用抗原の調製》
配列表の配列番号２の配列に記載のアミノ酸配列で表されるペプチド（以下、ハプテンペプチドと称する）、すなわち、配列表の配列番号１の配列に記載のアミノ酸配列におけるＮ末端のＡｓｐをＣｙｓに置換したアミノ酸配列を有するペプチドを合成した。得られたハプテンペプチドを、以下に示す手順に従って、Ｎ末端のＣｙｓを介して、担体タンパク質であるスカシガイ（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（以下、ＫＬＨと称する）に結合させることにより、ハプテン化した。
すなわち、ＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ社）５ｍｇを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）２．５ｍｌに溶解し、次いで、ジメチルホルムアミドに溶解した架橋剤スクシニミジル６−（Ｎ−マレイミド）−ｎ−ヘキサノエート［ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ６−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ）−ｎ−ｈｅｘａｎｏａｔｅ，以下、ＭＨＳと称する］（濃度１００ｍｇ／ｍｌ，同仁化学）０．１ｍｌを添加した。撹拌しながら、２５℃で３０分間反応させた後に、２．５ｍＭ−ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（直径１．６ｃｍ×長さ１０．０ｃｍ，ファルマシア・バイオテク）に充填し、ゲル濾過法にて未反応のＭＨＳを除去した。
【００４９】
続いて、ＭＨＳを付加したＫＬＨ５ｍｇに対して、ハプテンペプチド５ｍｇ［２．５ｍＭ−ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）２．５ｍｌに予め溶解したもの］を添加した。撹拌しながら、２５℃で３時間反応させた後に、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に対して充分に透析し、未反応のハプテンペプチドを除去した。このようにして調製したハプテンペプチド−ＫＬＨコンジュゲートを、本発明のモノクローナル抗体作製のための免疫用抗原として使用した。
【００５０】
【実施例７】
《スクリーニング用抗原の調製》
ハプテンペプチドを、以下に示す手順に従って、Ｎ末端のＣｙｓを介して、担体タンパク質であるウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと称することがある）に結合させることにより、ハプテン化した。
すなわち、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社）５ｍｇを０．０１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．６）２．５ｍｌに溶解し、次いで、エタノールに溶解した架橋剤スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート［ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ，以下、ＳＰＤＰと称する］（濃度５０ｍｇ／ｍｌ，ファルマシア・バイオテク）０．０９６ｍｌを添加した。２５℃で３０分間反応させた後に、２．５ｍＭ−ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（直径１．６ｃｍ×長さ１０．０ｃｍ，ファルマシア・バイオテク）に充填し、ゲル濾過法にて未反応のＳＰＤＰを除去した。
【００５１】
続いて、ＳＰＤＰを付加したＢＳＡ５ｍｇに対して、ハプテンペプチド５ｍｇ［２．５ｍＭ−ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）２．５ｍｌに予め溶解したもの］を添加した。２５℃で３時間反応させた後に、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に対して充分に透析し、未反応のハプテンペプチドを除去した。このようにして調製したハプテンペプチド−ＢＳＡコンジュゲートを、本発明のモノクローナル抗体作製のためのスクリーニング用抗原として使用した。
【００５２】
【実施例８】
《ハイブリドーマの調製》
（ａ）免疫化した脾臓細胞の調製
前記実施例６で得られたハプテンペプチド−ＫＬＨコンジュゲート免疫抗原溶液（１．０ｍｇ／ｍｌ）を、等量のフロインド氏完全アジュバンドと乳化するまで混和し、その混合液０．１ｍｌをマウス腹腔内に投与することにより免疫を行なった（第１回免疫）。２１日経過した後に、そのマウスに前記と同様の方法で調製した混合液０．１ｍｌを腹腔内に投与した（第２回免疫）。第２回免疫から２１日経過した後に、ハプテンペプチド−ＫＬＨコンジュゲート溶液（１．０ｍｇ／ｍｌ）を等量の生理的食塩水で希釈し、その希釈液０．１ｍｌを、マウスの静脈内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過した後に、マウスから脾臓を無菌的に摘出し、以下の工程に使用した。
【００５３】
（ｂ）細胞融合
無菌的に摘出した前記の脾臓を、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地５ｍｌを入れたシャーレーに入れた。次に、脾臓を１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５ｍｌで還流して脾細胞を流出させた後、この脾細胞懸濁液をナイロンメッシュに通した。この脾細胞を５０ｍｌ遠心チューブに集めて５００×ｇで１０分間遠心した。こうして得たペレットにヘモライジング溶液（１５５ｍＭ−ＮＨ4Ｃｌ，１０ｍＭ−ＫＨＣＯ3，及び１ｍＭ−Ｎａ2ＥＤＴＡ；ｐＨ７．０）５ｍｌを加え、懸濁させた。０℃で５分間放置すると、懸濁液中の赤血球が破壊された。１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地１５ｍｌを加えてから遠心分離した。このようにして得た細胞ペレットをＤＭＥ培地で遠心法によって洗浄し、生きている脾細胞数を測定した。
【００５４】
一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／０−Ａｇ１４（約２×１０7個）に前記脾臓細胞（１×１０8個）を加え、ＤＭＥ培地中でよく混合し、遠心分離を行なった（５００×ｇ，１０分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、３８℃に保温しておいた４０％ポリエチレングリコール４０００溶液０．５ｍｌを滴下し、遠心チューブを手で、１分間穏やかに回転することによってポリエチレングリコール溶液と細胞ペレットとを混合させた。次に、３８℃に保温しておいたＤＭＥ培地を３０秒毎に１ｍｌずつ加えてチューブを穏やかに回転させた。この操作を１０回繰り返した後、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地２０ｍｌを加えて、遠心分離（５００×ｇ，１０分間）を行なった、上清を除去した後、細胞ペレットを１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にアミノプテリン４×１０-7Ｍ、チミジン１．６×１０-5Ｍ、及びヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加したもの）で、遠心法によって２回洗浄した後、前記ＨＡＴ培地４０ｍｌに懸濁した。
【００５５】
この細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに２００μｌずつ分注し、５％炭酸ガスを含む３７℃の炭酸ガス培養器で培養を開始した。培養中、２〜３日間隔で各ウェルの培地約１００μｌを除き、新たに前記のＨＡＴ培地１００μｌを加えることによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを選択した。８日頃から１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６×１０-5Ｍ及びヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加したもの）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察するとともに、約１０日目に、後述するＥＬＩＳＡ法により、本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。
【００５６】
（ｃ）ハイブリドーマの樹立
ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無をＥＬＩＳＡ法により測定した。
９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ II，日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに、前記実施例７で調製したハプテンペプチド−ＢＳＡコンジュゲートの溶液［５μｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で希釈したもの］を５０μｌずつ分注し、４℃で一夜放置した。次に、０．０５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含む生理食塩水（以下、トウィーン２０−生理食塩水と称する）で３回洗浄した後、各ウェルの培養上清５０μｌを加え、２５℃で１時間反応させた。
【００５７】
次に、０．０５％トウィーン２０及び１５０ｍＭ−ＮａＣｌを含む５０ｍＭ−トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリンウサギＩｇＧ抗体（ダコ社、デンマーク）５０μｌを各ウェルに加えた。反応終了後、トウィーン２０−生理食塩水で各ウェルを３回洗浄し、酵素基質溶液［０．５ｍＭ−４−アミノアンチピリン、１０ｍＭフェノール、及び０．００５％過酸化水素水を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）］２００μｌを各ウェルに加え、２５℃で３０分間反応させ、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５８】
その結果、２７９ウェル中４ウェルに抗体産生が認められた。その４ウェル中の各ハイブリドーマを２４ウェルプレートに移し、１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地で４〜５日間培養した。その後、再度、ハプテンペプチド−ＢＳＡコンジュゲートを固定化したＥＬＩＳＡ法によって、本発明のモノクローナル抗体の産生の有無を確認してから、限界希釈法によりクローニングした。１０日後に、ハプテンペプチド−ＢＳＡコンジュゲートを固定化したＥＬＩＳＡ法によって、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンをスクリーニングした。その結果、各ハイブリドーマにつき、２０〜４０個の抗体産生クローンが得られた。これらのクローンの中から、増殖性が良好で、抗体分泌能が高く、しかも安定なクローン４種（クローンＮｏ．１〜Ｎｏ．４）を選んだ。これらクローンの培養上清中の抗体について、前記実施例１で調製したｅ−Ｄモノマー、又は前記実施例３で調製したｐ−Ｄモノマーを固相化したＥＬＩＳＡ法によって反応性を調べた。この結果を表１に示す。表中、「＋」は結合反応性が有ることを示し、「−」は結合反応性がないことを示す。
【００５９】
【表１】
【００６０】
表１の結果より、クローン番号Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、及びＮｏ．４の各クローンより産生されるモノクローナル抗体は、ｅ−Ｄモノマーに対して反応性を示すと共に、ｐ−Ｄモノマーに対しても反応性を示すことが明らかとなった。このため、これらのクローンについては、以下の実験を行わなかった。一方、クローン番号Ｎｏ．１より産生されるモノクローナル抗体は、ｅ−Ｄモノマーに対して反応性を示し、ｐ−Ｄモノマーに対して反応性を示さなかったので、前記と同様の方法により再クローン化を行い、本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＥＤＣ−１を樹立した。ハイブリドーマＥＤＣ−１は、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１０年７月２４日から寄託されている。ハイブリドーマＥＤＣ−１の受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１６９１１である。
【００６１】
【実施例９】
《モノクローナル抗体の製造》
（ａ）イン・ビトロ法
前記実施例８で得られたマウスハイブリドーマＥＤＣ−１を、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地で３７℃にて５％二酸化炭素雰囲気中において７２〜９６時間培養した。培養物を遠心分離（１０，０００×ｇ，１０分間）した後、上清に固形の硫酸アンモニウムを５０％最終濃度となるように徐々に加えた。混合物を氷冷下で３０分間攪拌した後、６０分間放置し、遠心分離（１０，０００×ｇ，１０分）した。得られた沈渣を少量の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量の１０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析した。
【００６２】
透析物を、１０ｍＭリン酸緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに充填した。モノクローナル抗体の溶出は、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）と０．２Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）との間で濃度勾配法により行なった。溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過法で濃縮し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析した。ウシ血清ＩｇＧを除くために、透析物をヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムに通した。次に通過液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したプロテインＡ−セファロース４Ｂのカラムに充填した。カラムをｐＨ３．５の緩衝液で溶出して、精製した本発明のモノクローナル抗体ＥＤＣ−１を得た。なお、本明細書においては、ハイブリドーマの名称を、そのハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の名称としても使用する。
【００６３】
（ｂ）イン・ビボ法
プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍｌを１０〜１２週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与し、投与後１４〜２０日目のマウス腹腔内にインビトロで増殖させたハイブリドーマＥＤＣ−１をマウス一匹あたり２×１０6細胞となるように接種した。
一匹のマウスから約１０〜１５ｍｌの腹水が得られた。その抗体濃度は、５〜１０ｍｇ／ｍｌであった。腹水中のモノクローナル抗体の精製は、前記のイン・ビトロ法と同様の方法で行なった。但し、ヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムを通す操作は行わなかった。
【００６４】
【実施例１０】
《モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラスの同定》
本発明のモノクローナル抗体ＥＤＣ−１の免疫グロブリンクラスの同定は、オクテロニー免疫拡散法により行なった。モノクローナル抗体ＥＤＣ−１の免疫グロブリンクラスは、ＩｇＧ1，κであった。
【００６５】
【実施例１１】
《モノクローナル抗体の特異性》
モノクローナル抗体ＥＤＣ−１の特異性の検討は、ＥＬＩＳＡ法によって以下の手順で行なった。
すなわち、前記実施例１又は実施例２で調製したヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼによる各種分解物と、前記実施例３又は実施例４で調製したヒトフィブリノーゲンのプラスミンによる各種分解物と、ヒトフィブリノーゲンとを、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ II；日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに、前記希釈液５０μｌずつを分注し、２５℃で２時間放置することにより固定化した。次に、トウィーン２０−生理食塩水でウェルを３回洗浄した後、モノクローナル抗体ＥＤＣ−１を、０．０５％トウィーン２０及び１５０ｍＭ−ＮａＣｌを含む５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、各ウェルに５０μｌずつ分注し、２５℃で１時間反応させた。この際、ブランクとして、本発明のモノクローナル抗体の代わりに、ＳＰ２／０細胞をマウス腹腔に投与して採取した腹水を反応させた。
【００６６】
続いて、トウィーン２０−生理食塩水でウェルを洗浄した後、０．０５％トウィーン２０及び１５０ｍＭ−ＮａＣｌを含む５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で２００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリンウサギＩｇＧ抗体（ダコ社、デンマーク）５０μｌずつを各ウェルに加えた。反応終了後、トウィーン２０−生理食塩水で各ウェルを３回洗浄し、酵素基質溶液［０．５ｍＭ−４−アミノアンチピリン、１０ｍＭフェノール、及び０．００５％過酸化水素水を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）］２００μｌを各ウェルに加え、２５℃で３０分間発色反応させ、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。各モノクローナル抗体と各抗原との結合反応の結果を表２に示す。表２において、「＋」は結合反応性を有することを示し、「−」は結合反応性がないことを示す。
【００６７】
【表２】
【００６８】
表２の結果から明らかなように、モノクローナル抗体ＥＤＣ−１は、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解物中のＤモノマー、及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解物の内、Ｄドメインを有する分解物（すなわち、ｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体）と特異的に反応するが、顆粒球エラスターゼのフィブリノーゲン分解物のフラグメントＸ、フラグメントＹ、及びフラグメントＥ、並びにヒトフィブリノーゲンとは反応しなかった。また、ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解物及びヒト安定化フィブリンのプラスミン分解物とも反応しなかった。
【００６９】
ヒトフィブリノーゲンを顆粒球エラスターゼにより分解すると、ｅ−フラグメントＸ、ｅ−フラグメントＹ、そして、ｅ−フラグメントＤの各フラグメントの順に分解反応が進行する。この過程で、それぞれのフラグメントを構成しているα鎖のＣ末端も順次切断される。表２に示すように、モノクローナル抗体ＥＤＣ−１は、ｅ−フラグメントＸ及びｅ−フラグメントＹに反応せず、ｅ−フラグメントＤに反応したことにより、免疫抗原として用いた配列番号２のペプチドＣ末端構造、すなわち、ｅ−フラグメントＤまで分解が進んだときに初めて露出するエピトープを、モノクローナル抗体ＥＤＣ−１は認識することがわかる。モノクローナル抗体ＥＤＣ−１は、ｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体に対しても反応したので、同様のエピトープは、ｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体においても露出している。更に、ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解物及びヒト安定化フィブリンのプラスミン分解物には反応しないので、これらプラスミン分解物には、このエピトープを形成するＣ末端構造は露出していない。
【００７０】
【実施例１２】
《モノクローナル抗体ＥＤＣ−１のエピトープの同定》
種々の合成ペプチドを用いた阻害試験によって、モノクローナル抗体ＥＤＣ−１のエピトープを更に調べた。使用した合成ペプチドは、配列表の配列番号３の配列に記載のアミノ酸配列（配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列における第１番目のアミノ酸残基〜第８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する）で表されるペプチド（以下、ペプチドＡと称する）、配列表の配列番号４の配列に記載のアミノ酸配列（配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列における第４番目のアミノ酸残基〜第１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する）で表されるペプチド（以下、ペプチドＢと称する）、及び配列表の配列番号５の配列に記載のアミノ酸配列（配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列における第６番目のアミノ酸残基〜第１３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する）で表されるペプチド（以下、ペプチドＣと称する）である。阻害試験は、以下の手順に従って、ＥＬＩＳＡ法によって行なった。
【００７１】
すなわち、前記実施例５（ｃ）で得られたペプチド（配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド）を、５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で４ｎＭとなるように希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ II，日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに、前記希釈液５０μｌずつを分注し、４℃で１５時間放置することにより固定化した。次に、トウィーン２０−生理食塩水でウェルを３回洗浄した後、０．２５μｇ／ｍｌモノクローナル抗体ＥＤＣ−１に、３種の前記合成ペプチド（ペプチドＡ、ペプチドＢ、又はペプチドＣ）のいずれか１種を０〜１０００ｎＭの種々の濃度で共存させた０．０５％トウィーン２０及び１５０ｍＭ−ＮａＣｌを含む５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を、各ウェルに５０μｌずつ分注し、２５℃で１時間反応させた。
【００７２】
トウィーン２０−生理食塩水でウェルを洗浄した後、０．０５％トウィーン２０及び１５０ｍＭ−ＮａＣｌを含む５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で２００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリンウサギＩｇＧ抗体（ダコ社，デンマーク）５０μｌずつを各ウェルに加えた。反応終了後、トウィーン２０−生理食塩水で各ウェルを３回洗浄し、酵素基質溶液［０．５ｍＭ−４−アミノアンチピリン、１０ｍＭフェノール、及び０．００５％過酸化水素水を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）］２００μｌを各ウェルに加え、２５℃で３０分間発色反応させ、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００７３】
結果を図１に示す。図１において、「残存活性」とは、共存ペプチド（すなわち、ペプチドＡ、ペプチドＢ、又はペプチドＣ）が存在しないときの吸光度を１００％とした場合の、各共存ペプチド濃度における吸光度の割合である。図１から明らかなように、固相化した配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに対するモノクローナル抗体ＥＤＣ−１の反応性は、ペプチドＡ及びペプチドＢにより阻害されず、ペプチドＣにより阻害された。すなわち、モノクローナル抗体ＥＤＣ−１は、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのＣ末端アミノ酸配列部分に反応する。
【００７４】
【実施例１３】
《酵素免疫測定法によるｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の測定》
モノクローナル抗体ＥＤＣ−１を２０μｇ／ｍｌの濃度で含有する５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）１００μｌを、９６ウェルＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ−II，日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに分注し、２５℃で２時間放置した。そのプレートをトウィーン２０−生理食塩水で３回洗浄した。このようにして抗体を感作したプレートのウェルに、種々濃度のｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、ｅ−ＤＤ／Ｅ複合体、フィブリノーゲンのプラスミン分解物、又は安定化フィブリンのプラスミン分解物を添加した正常血漿１００μｌを加え、２５℃で３０分間反応させた。
【００７５】
トウィーン２０−生理食塩水でプレートを３回洗浄した後、０．０５％トウィーン２０及び１５０ｍＭ−ＮａＣｌを含む５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で２００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトフィブリノーゲンウサギＩｇＧ抗体（ダコ社、デンマーク）１００μｌを加え、２５℃で３０分間反応させた。トウィーン２０−生理食塩水でプレートを３回洗浄した後、酵素基質液［１ｍＭ−２，２'−アジノ−ジ（３−エチルベンツチアゾリンスルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び０．００２５％過酸化水素水を含む溶液（ｐＨ４．５）］２００μｌずつを各ウェルに加え、２５℃で４０分間反応させた後に、各ウェルの４０５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ Ａ４ｉ型；東ソー）で測定した。
【００７６】
得られた検量線を図２に示す。反応曲線ａは、ｅ−Ｄダイマーをサンプルとして測定した場合の結果を示し、以下同様に、反応曲線ｂはｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を、反応曲線ｃはｅ−ＤＤ／Ｅ複合体及びｐ−ＤＤ／Ｅ複合体の等量混合物を、反応曲線ｄはｅ−Ｄモノマーを、反応曲線ｅはｐ−ＤＤ／Ｅ複合体を、そして、反応曲線ｆはフィブリノーゲンのプラスミン分解物をサンプルとして測定した場合の結果を示す。図２より明らかなように、モノクローナル抗体ＥＤＣ−１を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）において、ｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を特異的に定量測定することができた。
【００７７】
【実施例１４】
《モノクローナル抗体ＥＤＣ−１結合ラテックスの調製、及び前記ラテックスによるｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の測定》
モノクローナル抗体ＥＤＣ−１（２．０ｍｇ／ｍｌ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２ｍｌと、ラテックス溶液（２％ポリスチレンラテックス，日本合成ゴム，粒径０．３１０μｍ）２ｍｌとを混合し、マグネチックスターラーにて２時間撹拌し、抗体をラテックス粒子上に固定化した。遠心分離（２０，０００×ｇ，２０分間）した後、沈殿を、０．１％ＢＳＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、１時間撹拌した。遠心分離（２０，０００×ｇ，２０分間）を繰り返すことにより、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で沈殿を３回洗浄した後、沈殿を、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させ（１重量／容量％）、モノクローナル抗体ＥＤＣ−１結合ラテックス含有液を得た。前記モノクローナル抗体ＥＤＣ−１結合ラテックス含有液は、使用するまで４℃で保存した。
【００７８】
得られたモノクローナル抗体ＥＤＣ−１結合ラテックス含有液と、種々濃度のｅ−Ｄダイマー、ｅ−ＤＤ／Ｅ複合体、フィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解物、フィブリノーゲンのプラスミン分解物、又はフィブリンのプラスミン分解物とを混合し、全自動免疫血清検査システム（三菱化学株式会社製ＬＰＩＡ−２００）を用いて、凝集の反応速度を測定することにより、定量を実施した。
結果を図３に示す。反応曲線ａは、ｅ−Ｄダイマーをサンプルとして測定した場合の結果を示し、以下同様に、反応曲線ｂはｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を、反応曲線ｃはｅ−ＤＤ／Ｅ複合体及びｐ−ＤＤ／Ｅ複合体の等量混合物を、反応曲線ｄはフィブリノーゲンのプラスミン分解物を、反応曲線ｅはｐ−ＤＤ／Ｅ複合体を、そして、反応曲線ｆはフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解物を、サンプルとして測定した場合の結果を示す。図３における「Ｖ値」とは、凝集の反応速度である。図３より明らかなように、モノクローナル抗体ＥＤＣ−１結合ラテックスを用いて、ｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を特異的に定量測定することができた。
【００７９】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体によれば、生体試料中のｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の量を、前記生体試料中に存在すると考えられるフィブリノーゲン、フィブリノーゲンのプラスミン分解物、フィブリノーゲンのプラスミン分解物（特には、ｐ−Ｄダイマー又はｐ−ＤＤ／Ｅ複合体）の干渉を受けることなく、特異的に測定することのできる免疫学的測定法を提供することができる。
【００８０】
【配列表フリーテキスト】
配列表の配列番号２の配列に記載のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１の配列に記載のアミノ酸配列におけるＮ末端のＡｓｐをＣｙｓに置換したアミノ酸配列である。
【００８１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のモノクローナル抗体ＥＤＣ−１のエピトープの同定を、各種合成ペプチドを用いた阻害試験により行なった結果を示すグラフである。
【図２】本発明によるモノクローナル抗体ＥＤＣ−１を用いた酵素免疫測定法により、各種濃度に調製したｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の測定を行なった検量線を示すグラフである。
【図３】本発明のモノクローナル抗体ＥＤＣ−１を結合したラテックスと、各種抗原とを接触させた場合に生じる凝集反応における、抗原濃度と凝集反応速度との関係を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なモノクローナル抗体、並びにヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー（以下、ｅ−Ｄモノマーと称することがある）、ヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄダイマー（以下、ｅ−Ｄダイマーと称することがある）、及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解ＤＤ／Ｅ複合体（以下、ｅ−ＤＤ／Ｅ複合体と称することがある）の免疫学的分析方法に関する。
前記のｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体は、例えば、肺気腫若しくは敗血症、又は外科手術に伴う多臓器不全の予知マーカーとして有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトフィブリノーゲン及びヒト安定化フィブリンの各種プロテアーゼによる分解物は、生体内血液凝固線溶異常の診断における診断マーカーとして有用である。例えば、ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解Ｄモノマー（以下、ｐ−Ｄモノマーと称することがある）、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解Ｄダイマー（以下、ｐ−Ｄダイマーと称することがある）、及びヒト安定化フィブリンのプラスミン分解ＤＤ／Ｅ複合体（以下、ｐ−ＤＤ／Ｅ複合体と称することがある）は、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の診断マーカーとして広く用いられている。生体試料中のｐ−Ｄモノマー、ｐ−Ｄダイマー、及びｐ−ＤＤ／Ｅ複合体の測定においては、ｐ−Ｄモノマー、ｐ−Ｄダイマー、及びｐ−ＤＤ／Ｅ複合体に特異的なモノクローナル抗体を用いた酵素免疫学的測定法（ＥＩＡ法）又はラテックス凝集法が一般に使用されている。
【０００３】
一方、ヒトフィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマー、ヒト安定化フィブリンのｅ−Ｄダイマー、及びヒト安定化フィブリンのｅ−ＤＤ／Ｅ複合体は、生体内局所において白血球、特には顆粒球が活性化されたときに放出されるエラスターゼによってフィブリノーゲン又はフィブリンが分解を受けて生じるもので、前記のプラスミン分解物とは異なった臨床診断マーカーとしての有用性が認められる。すなわち、顆粒球の活性化が広範に起こると考えられる肺気腫若しくは敗血症、又は外科手術に伴う多臓器不全などの予知マーカーとして有用である。
【０００４】
しかしながら、前記のｐ−Ｄモノマー、ｐ−Ｄダイマー、及びｐ−ＤＤ／Ｅ複合体に特異的なモノクローナル抗体を用いた測定法では、プラスミンの作用で生成したｐ−Ｄモノマー、ｐ−Ｄダイマー、及びｐ−ＤＤ／Ｅ複合体を測定することはできるが、顆粒球エラスターゼの作用によって生成したｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を測定することは不可能である。このため、既にヒトフィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマー、ヒト安定化フィブリンのｅ−Ｄダイマー、及びヒト安定化フィブリンのｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を測定しようとする試みがいくつか成されている。
【０００５】
例えば、フィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマーを免疫して得られたポリクローナル抗体より、ｐ−Ｄモノマー、ｐ−Ｄダイマー、及びｐ−ＤＤ／Ｅ複合体、並びにフィブリノーゲンに反応する抗体を除去したポリクローナル抗体が使用される場合がある（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，第１０２巻，８５８頁，１９８３年）が、操作が煩雑である。
また、顆粒球エラスターゼがフィブリノーゲンに作用した際にフィブリノーゲンのＡα鎖上に新たに生ずるＮ末端部位（Ａα２２〜）に反応するモノクローナル抗体が報告されている（Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，第６巻、２５９頁，１９９５年）。このモノクローナル抗体の反応部位は、Ｅドメインのα鎖にあり、本発明のモノクローナル抗体とは異なる。また、このモノクローナル抗体は、フィブリノーゲンに対しても約１．３％の反応性を示すので、血漿中のフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解物又は安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解物を特異的に測定することはできない。
【０００６】
更にまた、顆粒球エラスターゼをフィブリノーゲンに作用して得られるｅ−Ｄモノマーのα鎖上に新たに生ずるＮ末端部位（すなわち、アミノ酸残基Ａα１１２から始まるアミノ酸配列）に反応するモノクローナル抗体が報告されている（特開平９−３０１９９９号公報）。このモノクローナル抗体は、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー、ヒト安定化フィブリンのｅ−Ｄダイマー及びヒト安定化フィブリンのｅ−ＤＤ／Ｅ複合体と特異的に反応して検出することができることが記載されているが、実際には、それら顆粒球エラスターゼ分解産物の一部とのみ、特異的に反応して検出しているにすぎない。すなわち、ｅ−Ｄモノマーは、Ｎ末端アミノ酸残基が異なる、少なくとも４種類のポリペプチドの混合物であり、特開平９−３０１９９９号公報に記載のモノクローナル抗体は、４種類のｅ−Ｄモノマ−の全部とは反応しない。
【０００７】
ｅ−Ｄモノマーが少なくとも４種類のポリペプチドの混合物であることは、後述する実施例５に示すように、ヒトフィブリノーゲンを顆粒球エラスターゼによって分解した後に、ｅ−Ｄモノマーを単離し、そのｅ−Ｄモノマーのα鎖のＮ末端配列を調べることにより確認した。すなわち、特開平９−３０１９９９号公報に記載のモノクローナル抗体が反応するアミノ酸残基Ａα１１２より始まるＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−の配列以外にも、アミノ酸残基Ａα１００より始まるＳｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−、アミノ酸残基Ａα１０２より始まるＡｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−、及びアミノ酸残基Ａα１０８より始まるＴｙｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−の合計４配列が、メジャー配列として確認され、ｅ−Ｄモノマーには、少なくとも４種類の異なるポリペプチド（以下、アミノ酸残基Ａα１１２より始まるポリペプチドを「ｅ−Ｄモノマー１」、アミノ酸残基Ａα１００より始まるポリペプチドを「ｅ−Ｄモノマー２」、アミノ酸残基Ａα１０２より始まるポリペプチドを「ｅ−Ｄモノマー３」、そして、アミノ酸残基Ａα１０８より始まるポリペプチドを「ｅ−Ｄモノマー４」と称することがある）が含まれることが判明した。更に、本発明者は、前記の４種類の各ポリペプチドと、特開平９−３０１９９９号公報に記載のモノクローナル抗体との反応性を調べたところ、ｅ−Ｄモノマー１にのみ反応し、ｅ−Ｄモノマー２、ｅ−Ｄモノマー３、及びｅ−Ｄモノマー４には反応しないことを確認した。この結果から明らかなように、特開平９−３０１９９９号公報に記載のモノクローナル抗体では、全ての顆粒球エラスターゼ分解産物を捕らえることができない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、前記の従来技術の欠点を解消し、顆粒球エラスターゼ分解により生じたｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体に分類される全ての顆粒球エラスターゼ分解産物に反応するモノクローナル抗体を提供し、このモノクローナル抗体を用いることにより、生体試料中のｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の量を迅速かつ正確に測定可能で、しかも試料中に同時に含まれると考えられるフィブリノーゲン、フィブリノーゲンのプラスミン分解物（特には、ｐ−Ｄモノマー）及び安定化フィブリンのプラスミン分解物（特には、ｐ−Ｄダイマー又はｐ−ＤＤ／Ｅ複合体）の量に影響を受けることない、免疫学的分析方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記の課題は、本発明による、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー、及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物と特異的に反応し、ヒトフィブリノーゲン、並びにヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＸ、顆粒球エラスターゼ分解フラグメンＹ、及び顆粒球エラスターゼ分解フラグメンＥと反応しないモノクローナル抗体であって、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物との前記反応が、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物に含まれるα鎖のＣ末端領域との反応であることを特徴とする、前記モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントによって達成することができる。
【００１０】
また、本発明は、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマーのα鎖のＣ末端領域を含むペプチドを、ハプテンとして用いて免疫することにより得られた、前記モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントに関する。
また、本発明は、配列表の配列番号１（数字見出し＜２１０＞欄）の配列（数字見出し＜４００＞欄）に記載のアミノ酸配列を有するペプチドと反応することを特徴とするモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントに関する。
また、本発明は、前記モノクローナル抗体を産生することを特徴とする、ハイブリドーマに関する。
【００１１】
また、本発明は、前記モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを第１抗体として不溶性担体に固定化し、この固定化された第１抗体と、被検試料と、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物に反応し、且つ前記第１抗体とは異なるエピトープに反応する抗体に標識を付した第２抗体とを接触させ、そして、前記の固定化第１抗体に補足された、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー若しくはヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物と結合した前記第２抗体の前記標識からの信号、又は前記の固定化第１抗体に補足された、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー若しくはヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物と結合しなかった前記第２抗体の前記標識からの信号を検出することを特徴とする、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物の免疫学的分析方法にも関する。
【００１２】
更には、本発明は、不溶性担体に固定化された前記モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントと、被検試料とを接触させ、凝集反応を観察することを特徴とする、ヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物の免疫学的分析方法にも関する。
【００１３】
本明細書において、「顆粒球エラスターゼ」とは、顆粒球のアズール顆粒（一次顆粒）又は特殊顆粒（二次顆粒）に含まれ、炎症局所に誘導され活性化された顆粒球より放出されるセリンプロテアーゼであって、その生理的な基質である、細胞外マトリックスに含まれるエラスチン、コラーゲン、フィブロネクチン、若しくはプロテオグリカン、又は血漿中タンパク質のフィブリノーゲン、フィブリン、プラスミノーゲン、若しくはアンチトロンビンIIIなどを、主に疎水性アミノ酸であるバリン、アラニン、ロイシン、又はイソロイシンなどのＣ末端側で加水分解するエステラーゼを意味する。
【００１４】
本明細書において、顆粒球エラスターゼによって分解されることによって生成する分解物を、その分解物名の前に「ｅ−」を付けることによって表すことがある。例えば、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー、顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＸ、顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＹ、及び顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＥを、ヒトフィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマー、ｅ−フラグメントＸ、ｅ−フラグメントＹ、及びｅ−フラグメントＥとそれぞれ表すことがある。同様に、本明細書において、プラスミンに分解されたことによって生じる分解物を、その分解物の名称の前に「ｐ−」を付与することによって表すことがある。
【００１５】
また、本明細書において、ヒトフィブリノーゲンのＡα鎖における各アミノ酸残基を、「Ａα」の後に、Ａα鎖のＮ末端から数えた番号を付けることによって表すことがある。例えば、「Ａα１１２」は、ヒトフィブリノーゲンのＡα鎖のＮ末端から数えて第１１２番目のアミノ酸残基を意味する。なお、Ａα鎖とは、ヒトフィブリノーゲンを構成する３種類のポリペプチド（Ａα鎖、Ｂβ鎖、及びγ鎖）の１つである。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー、及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物と特異的に反応し、ヒトフィブリノーゲン、並びにヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＸ、顆粒球エラスターゼ分解フラグメンＹ、及び顆粒球エラスターゼ分解フラグメンＥとは反応しない。
【００１７】
本発明のモノクローナル抗体におけるヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー、及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物との前記反応は、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物に含まれるα鎖のＣ末端領域との反応である。
本発明の好ましいモノクローナル抗体は、更に、ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解物、及びヒト安定化フィブリンのプラスミン分解物とも反応しない。
【００１８】
ここで「ヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物」とは、ヒト安定化フィブリンを顆粒球エラスターゼで処理することにより生成する分解物の内、ヒト安定化フィブリンのｅ−Ｄドメインを有する分解物を意味し、例えば、ｅ−ＤＤ／Ｅを基本単位としたｅ−ＤＤ／Ｅのポリマー様物質、ｅ−Ｄダイマー、又はｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を挙げることができ、特にはｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を意味する。
また、本明細書において、「ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー（ｅ−Ｄモノマー）と反応する」とは、特に断わらない限り、ｅ−Ｄモノマーに含まれる４種類のポリペプチド（すなわち、ｅ−Ｄモノマー１、ｅ−Ｄモノマー２、ｅ−Ｄモノマー３、及びｅ−Ｄモノマー４）の全てと反応することを意味する。すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、ｅ−Ｄモノマー１、ｅ−Ｄモノマー２、ｅ−Ｄモノマー３、及びｅ−Ｄモノマー４の全てと反応する。
【００１９】
本発明の前記モノクローナル抗体は、例えば、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマーのα鎖のＣ末端領域を含むペプチドを、ハプテンとして用いて免疫することにより得られる。ここで「ｅ−Ｄモノマーのα鎖」とは、ｅ−Ｄモノマーを構成する３種類のポリペプチド（α鎖、β鎖、及びγ鎖）の１つであって、ヒトフィブリノーゲンのＡα鎖に顆粒球エラスターゼが作用することにより、前記Ａα鎖のＮ末端側とＣ末端領域の一部が切断除去され、得られるポリペプチドを意味する。なお、前記α鎖は、Ｎ末端アミノ酸残基が異なる、少なくとも４種類のポリペプチドの混合物である。
【００２０】
前記ペプチドに含まれるｅ−Ｄモノマーのα鎖のＣ末端領域は、α鎖のＣ末端側に位置する領域であって、且つα鎖のＣ末端のアミノ酸残基であるロイシン残基（ヒトフィブリノーゲンのＡα鎖のアミノ酸残基Ａα２０４に相当する）を含む領域である限り特に限定されるものではない。また、前記Ｃ末端領域の長さ、すなわち、Ｃ末端領域を構成するアミノ酸残基の数も特に限定されるものではないが、好ましくは６〜１３個のアミノ酸残基からなることができる。前記Ｃ末端領域としては、例えば、ヒトフィブリノーゲンのＡα鎖における第１９２番目のアミノ酸残基〜第２０４番目のアミノ酸残基からなる領域（配列表の配列番号１の配列に記載のアミノ酸配列で表される領域）を挙げることができる。
【００２１】
前記Ｃ末端領域を含むペプチドの長さ（すなわち、ペプチドを構成するアミノ酸残基の数）も、通常、ハプテンとして用いることのできる長さである限り、特に限定されるものではなく、好ましくは８〜１５個のアミノ酸残基からなることができる。
本発明の前記モノクローナル抗体を製造する際に使用するヒトフィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマーのα鎖のＣ末端領域を含むペプチドとしては、例えば、配列表の配列番号２の配列に記載のアミノ酸配列で表されるペプチド（すなわち、配列表の配列番号１の配列に記載のアミノ酸配列におけるＮ末端のＡｓｐをＣｙｓに置換したアミノ酸配列を有するペプチド）を挙げることができる。ヒトフィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマーのα鎖のＣ末端領域を含むペプチドは、公知の従来方法に従って調製することができる。例えば、ペプチド合成機を用いて所望のアミノ酸配列からなるペプチドを化学合成することもできるし、あるいは、精製ｅ−Ｄモノマーを適当な酵素で消化し、所望のペプチドを精製することにより調製することもできる。
【００２２】
本発明の前記モノクローナル抗体を製造する際には、ヒトフィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマーのα鎖のＣ末端領域を含むペプチドを、抗体製造に使用することのできる従来公知の担体に結合させることにより、ハプテン−担体複合体を形成させ、得られたハプテン−担体複合体を抗原として使用する。前記担体としては、例えば、ウシ血清アルブミン、スカシガイ（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、又は卵白アルブミンなどを挙げることができる。前記ペプチドと前記担体とを結合する手段も、従来公知の方法を使用することができ、例えば、マレイミド、カルボジイミド、又はグルタルアルデヒドなどを、ペプチドと担体との架橋剤として使用することができる。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体を別の観点からみると、本発明のモノクローナル抗体は、配列表の配列番号１の配列に記載のアミノ酸配列を有するペプチドと反応する。このような本発明のモノクローナル抗体は、例えば、配列表の配列番号１の配列に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを、ハプテンとして用いて免疫することにより得られる。
【００２４】
本発明のモノクローナル抗体は、そのモノクローナル抗体を産生することのできる本発明のハイブリドーマ（例えば、マウスハイブリドーマ）を、例えば、適当な培地又は哺乳動物（例えば、マウス）の腹腔内で培養することにより製造することができる。
前記の本発明のハイブリドーマは、これまで説明したように、ヒトフィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマーのα鎖のＣ末端領域を含むペプチドを、従来公知の担体に結合させることにより、ハプテン−担体複合体を形成させ、得られたハプテン−担体複合体を用いて免疫した哺乳動物（例えば、マウス）又は鳥類の脾臓細胞と哺乳動物（例えば、マウス）のミエローマ細胞（骨髄腫細胞）とを、ケーラー及びミルシュタインの基本方法［Ｎａｔｕｒｅ，第２５６巻，４９５頁（１９７５年）参照］により細胞融合して製造することが可能である。詳細には、下記実施例に記載の方法によって製造することができる。
【００２５】
前記のハイブリドーマを培養することのできる培地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地であればよく、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｅａｇｌｅ'ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ：以下、ＤＭＥと称する）にウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸、及び抗生物質（ペニシリンＧとストレプトマイシン）を含む培地が用いられる。
前記のハイブリドーマの培養は、培地中で行なう場合には、例えば、５％ＣＯ2濃度及び３７℃の条件下で約３日間行なう。あるいは、マウスの腹腔内で行なう場合には、例えば、約１４日間行なう。
【００２６】
このようにして製造された培養液又は哺乳動物の腹水から、例えば、タンパク質の単離・精製に一般的に用いられている方法により、本発明のモノクローナル抗体を分離・精製することが可能である。
そのような方法としては、例えば、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、又は凍結乾燥等を挙げることができる。
【００２７】
本発明の抗体フラグメントは、本発明のモノクローナル抗体のフラグメントであって、しかも、もとのモノクローナル抗体と同じ反応特異性を有する抗体フラグメントである。すなわち、本発明の抗体フラグメントは、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー、及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物と特異的に反応し、ヒトフィブリノーゲン、並びにヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＸ、顆粒球エラスターゼ分解フラグメンＹ、及び顆粒球エラスターゼ分解フラグメンＥと反応せず、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物との前記反応は、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物を構成するα鎖のＣ末端領域との反応である。また、本発明の好ましい抗体フラグメントは、更に、ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解物、及びヒト安定化フィブリンのプラスミン分解物とも反応しない。
更に、本発明の抗体フラグメントは、配列表の配列番号１の配列に記載のアミノ酸配列を有するペプチドと反応する。
【００２８】
本発明の抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、又はＦｖ等が含まれる。これらのフラグメントは、例えば、本発明のモノクローナル抗体を常法によりタンパク質分解酵素によって消化し、続いて、タンパク質の分離・精製の常法に従って得ることができる。
【００２９】
このようにして得られた本発明のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントは、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー、及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物とのみ反応し、ヒトフィブリノーゲン、並びにヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解フラグメントＸ、顆粒球エラスターゼ分解フラグメンＹ、及び顆粒球エラスターゼ分解フラグメンＥとは反応しないので、ｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の各種の免疫学的分析方法の試薬として有用である。なお、本明細書において、前記「分析方法」には、分析対象物の存在の有無を確認する検出方法と、分析対象物の量を測定する定量方法との両方が含まれる。
【００３０】
また、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントのエピトープは、先に説明したように、ヒトフィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマーを構成するα鎖のＣ末端領域に存在するので、従来公知のモノクローナル抗体、例えば、特開平９−３０１９９９号公報に記載のモノクローナル抗体では、ｅ−Ｄモノマーの一部としか反応することができなかったのに対して、以下に示す理由により、全てのｅ−Ｄモノマーと反応することができる。
すなわち、後述する実施例５に示すように、ヒトフィブリノーゲンのｅ−Ｄモノマーを構成するα鎖のＮ末端領域のアミノ酸配列を解析したところ、４種類の異なるアミノ酸配列が確認された［実施例５（ｂ）参照］のに対して、同じα鎖のＣ末端領域のアミノ酸配列は１種類であった［実施例５（ｃ）参照］。特開平９ー３０１９９９号公報に記載の前記モノクローナル抗体のエピトープは、α鎖における４種類のＮ末端アミノ酸配列の中の特定のＮ末端アミノ酸配列に存在するため、ｅ−Ｄモノマーの一部しか捕らえることができない。一方、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントのエピトープは、全てのｅ−Ｄモノマーに共通して存在するＣ末端領域のアミノ酸配列に存在するため、全てのｅ−Ｄモノマーを捕らえることができる。
【００３１】
例えば、本発明のモノクローナル抗体及び／又は抗体フラグメントを第１抗体として不溶性担体に固定化し、この固定化された第１抗体と、被検試料と、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物に反応し、且つ前記第１抗体とは異なるエピトープに反応する抗体（モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）に標識を付した第２抗体とを接触させた後に、前記の固定化第１抗体に補足されたヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー（ｅ−Ｄモノマー）及び／又はヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物（特にはｅ−Ｄダイマー及び／又はｅ−ＤＤ／Ｅ複合体）と結合した前記第２抗体と、前記の固定化第１抗体に補足されたヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー（ｅ−Ｄモノマー）及び／又はヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物（特にはｅ−Ｄダイマー及び／又はｅ−ＤＤ／Ｅ複合体）と結合しなかった前記第２抗体とに分離すると、いずれか（又は両方）の第２抗体の前記標識からの信号を検出することができるので、本発明のモノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物の免疫学的分析方法（サンドイッチ法）に適用することができる。
【００３２】
また、本発明のモノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、例えば、本発明によるモノクローナル抗体及び／又は抗体フラグメントを不溶性担体（支持体）に感作し、この感作支持体と被検試料とを接触させ、凝集反応によりヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物を測定する方法（凝集法）にも適用することができる。
この凝集法による測定法において、前記感作支持体は、ｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体、並びにｅ−Ｄモノマーとそれぞれ反応することができ、それ以外の成分とは反応しない。前記感作支持体とｅ−Ｄダイマー又はｅ−ＤＤ／Ｅ複合体とを接触させると、ｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体は複数の抗原決定基を有するので、前記感作支持体の凝集反応が生じる。それに対して、ｅ−Ｄモノマーは抗原決定基を一つしか持たないので、前記感作支持体とｅ−Ｄモノマーとを接触させても、前記感作支持体の凝集反応は生じない。従って、ｅ−Ｄダイマー、ｅ−ＤＤ／Ｅ複合体、及びｅ−Ｄモノマーを含む被検試料と、前記感作支持体とを接触させたときに生じる前記感作支持体の凝集反応は、ｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体との反応によるものであり、このような凝集反応における差異に基づいて、ｅ−Ｄモノマーの影響を受けることなく、被検試料中のｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の量を測定することができる。
【００３３】
本発明の免疫学的分析方法に用いる被検試料は、ｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及び／又はｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を含む可能性のある試料であれば特に限定されるものでないが、例えば、生体試料、特には血液、血漿、血清、又は尿、好ましくは血漿又は血清である。本発明の免疫学的分析方法においては、被検試料中にフィブリノーゲン、ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解物、又はヒト安定化フィブリンのプラスミン分解物が存在する場合であっても、本発明のモノクローナル抗体はそれらとは反応しないので、それらの影響を受けることなく、被検試料中に存在するｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を測定することができる。
【００３４】
サンドイッチ法を利用する本発明の免疫学的測定法では、具体的には、前記の本発明によるモノクローナル抗体を適当な不溶性担体に固定化する（第１抗体）。次に、不溶性担体と被検試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤［例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やゼラチン等］で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、被検試料を加えて一定時間（たとえば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（１次反応）。続いて、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物に反応し、且つ前記第１抗体とは異なるエピトープに反応する抗体に標識を付した第２抗体を加えて一定時間（たとえば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ反応させる（２次反応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する標識抗体の量を定量する。その値から、被検試料中のｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の量を算出することができる。
前記第２抗体としては、例えば、抗ヒトフィブリノーゲンポリクローナル抗体、抗ｅ−Ｄモノマーポリクローナル抗体、又はｅ−Ｄモノマーに含まれる４種類のポリペプチド（すなわち、ｅ−Ｄモノマー１、ｅ−Ｄモノマー２、ｅ−Ｄモノマー３、及びｅ−Ｄモノマー４）の全てと反応する抗ｅ−Ｄモノマーモノクローナル抗体などを挙げることができる。
【００３５】
本発明のサンドイッチ法による免疫学的測定法に使用することのできる不溶性担体は特に限定されるものでなく、例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子、その他ニトロセルロース、紙、アガロース、及びこれらの組み合わせ等を例示することができる。
【００３６】
標識物質としては、酵素、蛍光物質、又は発光物質を使用するのが有利である。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート等、また、発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル、ルシフェリン等を使用することができる。
【００３７】
凝集反応を利用する本発明の免疫測定法において、不溶性担体としては、一般に抗原抗体反応の凝集反応を利用する免疫学的分析方法において用いられる任意の不溶性担体を用いることができ、例えば、ラテックス粒子（特には、ポリスチレンラテックス粒子）を挙げることができる。本発明によるモノクローナル抗体を不溶性担体に固定化させるには、公知の方法、例えば、化学結合法（架橋剤としてカルボジイミド、グルタルアルデヒド等を用いる）又は物理吸着法を用いることができる。
スライド板を用いる場合には目視的に、又は反応セルを用いる場合には特定の波長を用いて分光学的に凝集反応を測定し、被検試料中のｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の量を定量することができる。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解物及びｅ−Ｄモノマーの調製》
ヒトフィブリノーゲン（エンザイムリサーチ社，米国）２０ｍｇを１０ｍｇ／ｍｌとなるように、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。この溶液に塩化カルシウムを終濃度５ｍＭとなるように添加した後に、ヒト顆粒球エラスターゼ（１．０ｍｇ／ｍｌ，アテンズリサーチ社，米国）０．２ｍｌを加え、３７℃で２時間反応させた。反応停止は、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ，和光純薬，日本）を終濃度１ｍＭとなるように添加することによって行なった。反応を停止させた後の生成物を、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したセファクリルＳ−３００ＨＲカラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ，ファルマシア・バイオテク）に充填し、ゲル濾過法によりｅ−Ｄモノマー（分子量約１０万）、ｅ−フラグメントＸ（分子量約２５万）、ｅ−フラグメントＹ（分子量約１５万）、及びｅ−フラグメントＥ３（分子量約５万）を分画した。こうして得られた各分画を、本発明のモノクローナル抗体の認識部位の同定に使用した。
【００３９】
【実施例２】
《ｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の調製》
フィブリノーゲン（エンザイムリサーチ社，米国）１００ｍｇ（１０ｍｇ／ｍｌ）に、ヒトトロンビン（シグマ社，米国）、第XIII因子（エンザイムリサーチ社，米国）、及び塩化カルシウムをそれぞれ終濃度５０単位／ｍｌ、２単位／ｍｌ、及び５ｍＭとなるよう加え、３７℃で２時間反応させ、フィブリノーゲンをフィブリンに変換させた。１８０００×ｇで３０分間遠心し、フィブリンを非凝固性物質から分離した。得られたフィブリンを凍結乾燥した後に、破砕し、フィブリンパウダーとした。
【００４０】
このフィブリンパウダー２０ｍｇを、５ｍＭ−ＣａＣｌ2含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）３．２ｍｌに浮遊させ、この浮遊液にヒト顆粒球エラスターゼ（１．０ｍｇ／ｍｌ，アテンズリサーチ社，米国）０．０６７ｍｌを添加し、穏やかに撹拌しながら３７℃で反応させた。２時間経過した後に、ＤＦＰを終濃度１ｍＭとなるように加えて分解反応を停止させた。この反応液を１８０００×ｇで３０分間遠心し、分解されずに残ったフィブリンを沈殿として除去した。遠心上清を、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したセファクリルＳ−３００ＨＲカラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ）に充填し、ゲル濾過法を行なった。各フラクションをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析し、ｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の分画を同定及び分離した。
【００４１】
このようにして得られたｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を、５Ｍ尿素−５０ｍＭクエン酸（ｐＨ５．５）の溶液中で３７℃で３時間保温した後に、０．５Ｍ−ＮａＣｌ含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したセファクリルＳ−３００ＨＲカラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ）に充填し、溶出した。各フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、ｅ−Ｄダイマー分画、ｅ−フラグメントＥ１分画、及びｅ−フラグメントＥ２分画を同定及び分離した。このようにして調製したｅ−Ｄダイマー、ｅ−フラグメントＥ１、及びｅ−フラグメントＥ２を、本発明のモノクローナル抗体の認識部位の同定のために使用した。
【００４２】
【実施例３】
《ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解物の調製》
ヒトフィブリノーゲン（エンザイムリサーチ社，米国）２０ｍｇを１０ｍｇ／ｍｌとなるように、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。この溶液に塩化カルシウムを終濃度５ｍＭとなるように添加した後に、ヒトプラスミン（１．０ｍｇ／ｍｌ，クロモジェニックス社，スウェーデン）０．０２ｍｌを加え、３７℃で２時間反応させた。反応停止は、ＤＦＰを終濃度１ｍＭとなるように添加することによって行なった。反応を停止させた後の生成物を、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したセファクリルＳ−３００ＨＲカラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ，ファルマシア・バイオテク）に充填し、ゲル濾過法によりｐ−Ｄモノマー（分子量約１０万）、ｐ−フラグメントＸ（分子量約２５万），ｐ−フラグメントＹ（分子量約１５万）、及びｐ−フラグメントＥ３（分子量約５万）を分画した。このようにして得られた各分画を、本発明のモノクローナル抗体の認識部位の同定に使用した。
【００４３】
【実施例４】
《ｐ−Ｄダイマー及びｐ−ＤＤ／Ｅ複合体の調製》
実施例２で調製したフィブリンパウダー２０ｍｇを、５ｍＭ−ＣａＣｌ2含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）３．２ｍｌに浮遊させ、この浮遊液に、ヒトプラスミン（１．０ｍｇ／ｍｌ）０．００５ｍｌを添加し、穏やかに撹拌しながら３７℃で反応させた。４時間経過した後に、ＤＦＰを終濃度１ｍＭとなるように加えて分解反応を停止させた。この反応液を１８０００×ｇで３０分間遠心し、分解されずに残ったフィブリンを沈殿として除去した。遠心上清を、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化したセファクリルＳ−３００ＨＲカラム（２．６ｃｍ×９０ｃｍ）に充填し、ゲル濾過法を行なった。各フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、ｐ−ＤＤ／Ｅ複合体の分画を同定及び分離した。
このようにして得られたｐ−ＤＤ／Ｅ複合体について、実施例２においてｅ−ＤＤ／Ｅ複合体に対して実施した操作と同様の操作を行なうことにより、ｐ−Ｄダイマー、ｐ−フラグメントＥ１、及びｐ−フラグメントＥ２を調製し、本発明のモノクローナル抗体の認識部位の同定のために使用した。
【００４４】
【実施例５】
《ｅ−Ｄモノマーのα鎖Ｎ末端アミノ酸配列及びＣ末端アミノ酸配列の分析》
（ａ）ｅ−Ｄモノマーのα鎖の単離
実施例１で調製したｅ−Ｄモノマー４ｍｇを、６Ｍ塩酸グアニジン及び１０ｍＭ−ＥＤＴＡ含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）０．８ｍｌに溶解し、気相を窒素で置換した後に、２０％ジチオスレイトール（ＤＴＴ）０．０１２ｍｌを添加し、５０℃で３時間保温することにより還元した。再び気相を窒素で置換した後に、４−ビニルピリジン０．０１ｍｌを添加し、遮光下、２５℃で２時間保温することにより、チオール基をピリジルエチル化した。続いて、蒸留水に対して充分に透析を行なった後に、透析内液を回収し、凍結乾燥した。凍結乾燥物を、６Ｍ塩酸グアニジン溶液０．０５ｍｌに溶解した後に、ＰＯＲＯＳ−Ｒ１／Ｍカラム（４．６ｍｍ×１００ｍｍ，日本パーセプティブ）を用いた逆相クロマトグラフィーにより、ピリジルエチル化したα鎖（ＰＥ−αと称する）を単離した。
【００４５】
（ｂ）ｅ−Ｄモノマーのα鎖Ｎ末端アミノ酸配列の分析
前記実施例５（ａ）で単離したＰＥ−αのＮ末端アミノ酸配列分析を、自動アミノ酸配列分析機（モデル４７６Ａ，アプライドバイオシステムズ社）を用いて行なった。分析の結果、４種類のアミノ酸配列、すなわち、フィブリノーゲンのアミノ酸残基Ａα１００（フィブリノーゲンのＡα鎖のＮ末端より数えて１００番目のアミノ酸残基を意味し、以下に記載の「アミノ酸残基Ａα１０２」、「アミノ酸残基Ａα１０８」、及び「アミノ酸残基Ａα１１２」についても同様）より始まるアミノ酸配列（Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−）、アミノ酸残基Ａα１０２より始まるアミノ酸配列（Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−）、アミノ酸残基Ａα１０８より始まるアミノ酸配列（Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−）、及びアミノ酸残基Ａα１１２より始まるアミノ酸配列（Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−）が確認された。この結果は、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解で生じたｅ−Ｄモノマーのα鎖Ｎ末端は、単一の切断部位から構成されないことを示している。
【００４６】
（ｃ）ｅ−Ｄモノマーのα鎖Ｃ末端アミノ酸配列の分析
前記実施例５（ａ）で単離したＰＥ−α０．５ｍｇを、３Ｍ尿素含有１０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）０．２５ｍｌに溶解した。この溶液にリシルエンドペプチダーゼ（１．０ｍｇ／ｍｌ，和光純薬）０．０２ｍｌを添加し、３７℃で１８時間保温した後に、終濃度１ｍＭとなるようにＤＦＰを添加し、反応を停止した。この操作により、ＰＥ−αは、リシン残基のＣ末端側で特異的に切断された。この分解物に０．２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）０．２５ｍｌを加えた後に、希酢酸を添加し、ｐＨを５．０に調整した。得られた溶液を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で予め平衡化したアンヒドロトリプシン固定化アガロースカラム（容量１ｍｌ，宝酒造）に充填し、非吸着画分を集めた。非吸着画分には、Ｃ末端アミノ酸としてリシンを持たないペプチド、すなわち、リシルエンドペプチダーゼ処理を行なう前のＰＥ−αにおいてＣ末端に位置しているペプチドが回収される。
【００４７】
次に、非吸着画分に回収されたペプチドを、コスモシール５Ｃ１８Ｐカラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，ナカライテスク）を用いた逆相クロマトグラフィーにより分離した。０〜４０％（容量／容量）アセトニトリル濃度の直線濃度勾配溶出において、１本のペプチドピークのみが認められた。この結果は、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解で生じたｅ−Ｄモノマーのα鎖Ｃ末端は、単一の切断部位から構成されることを示している。
このピークを自動アミノ酸配列分析機（モデル４７６Ａ、アプライドバイオシステムズ社）にかけ、Ｎ末端側からＣ末端まで順次アミノ酸配列を分析した。分析の結果は、フィブリノーゲンのアミノ酸残基Ａα１９２〜２０４に相当するアミノ酸配列であるＡｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列表の配列番号１の配列に記載のアミノ酸配列）が確認された。
【００４８】
【実施例６】
《免疫用抗原の調製》
配列表の配列番号２の配列に記載のアミノ酸配列で表されるペプチド（以下、ハプテンペプチドと称する）、すなわち、配列表の配列番号１の配列に記載のアミノ酸配列におけるＮ末端のＡｓｐをＣｙｓに置換したアミノ酸配列を有するペプチドを合成した。得られたハプテンペプチドを、以下に示す手順に従って、Ｎ末端のＣｙｓを介して、担体タンパク質であるスカシガイ（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（以下、ＫＬＨと称する）に結合させることにより、ハプテン化した。
すなわち、ＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ社）５ｍｇを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）２．５ｍｌに溶解し、次いで、ジメチルホルムアミドに溶解した架橋剤スクシニミジル６−（Ｎ−マレイミド）−ｎ−ヘキサノエート［ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ６−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ）−ｎ−ｈｅｘａｎｏａｔｅ，以下、ＭＨＳと称する］（濃度１００ｍｇ／ｍｌ，同仁化学）０．１ｍｌを添加した。撹拌しながら、２５℃で３０分間反応させた後に、２．５ｍＭ−ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（直径１．６ｃｍ×長さ１０．０ｃｍ，ファルマシア・バイオテク）に充填し、ゲル濾過法にて未反応のＭＨＳを除去した。
【００４９】
続いて、ＭＨＳを付加したＫＬＨ５ｍｇに対して、ハプテンペプチド５ｍｇ［２．５ｍＭ−ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）２．５ｍｌに予め溶解したもの］を添加した。撹拌しながら、２５℃で３時間反応させた後に、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に対して充分に透析し、未反応のハプテンペプチドを除去した。このようにして調製したハプテンペプチド−ＫＬＨコンジュゲートを、本発明のモノクローナル抗体作製のための免疫用抗原として使用した。
【００５０】
【実施例７】
《スクリーニング用抗原の調製》
ハプテンペプチドを、以下に示す手順に従って、Ｎ末端のＣｙｓを介して、担体タンパク質であるウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと称することがある）に結合させることにより、ハプテン化した。
すなわち、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社）５ｍｇを０．０１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．６）２．５ｍｌに溶解し、次いで、エタノールに溶解した架橋剤スクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート［ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ，以下、ＳＰＤＰと称する］（濃度５０ｍｇ／ｍｌ，ファルマシア・バイオテク）０．０９６ｍｌを添加した。２５℃で３０分間反応させた後に、２．５ｍＭ−ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で予め平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（直径１．６ｃｍ×長さ１０．０ｃｍ，ファルマシア・バイオテク）に充填し、ゲル濾過法にて未反応のＳＰＤＰを除去した。
【００５１】
続いて、ＳＰＤＰを付加したＢＳＡ５ｍｇに対して、ハプテンペプチド５ｍｇ［２．５ｍＭ−ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）２．５ｍｌに予め溶解したもの］を添加した。２５℃で３時間反応させた後に、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に対して充分に透析し、未反応のハプテンペプチドを除去した。このようにして調製したハプテンペプチド−ＢＳＡコンジュゲートを、本発明のモノクローナル抗体作製のためのスクリーニング用抗原として使用した。
【００５２】
【実施例８】
《ハイブリドーマの調製》
（ａ）免疫化した脾臓細胞の調製
前記実施例６で得られたハプテンペプチド−ＫＬＨコンジュゲート免疫抗原溶液（１．０ｍｇ／ｍｌ）を、等量のフロインド氏完全アジュバンドと乳化するまで混和し、その混合液０．１ｍｌをマウス腹腔内に投与することにより免疫を行なった（第１回免疫）。２１日経過した後に、そのマウスに前記と同様の方法で調製した混合液０．１ｍｌを腹腔内に投与した（第２回免疫）。第２回免疫から２１日経過した後に、ハプテンペプチド−ＫＬＨコンジュゲート溶液（１．０ｍｇ／ｍｌ）を等量の生理的食塩水で希釈し、その希釈液０．１ｍｌを、マウスの静脈内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過した後に、マウスから脾臓を無菌的に摘出し、以下の工程に使用した。
【００５３】
（ｂ）細胞融合
無菌的に摘出した前記の脾臓を、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地５ｍｌを入れたシャーレーに入れた。次に、脾臓を１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地約１５ｍｌで還流して脾細胞を流出させた後、この脾細胞懸濁液をナイロンメッシュに通した。この脾細胞を５０ｍｌ遠心チューブに集めて５００×ｇで１０分間遠心した。こうして得たペレットにヘモライジング溶液（１５５ｍＭ−ＮＨ4Ｃｌ，１０ｍＭ−ＫＨＣＯ3，及び１ｍＭ−Ｎａ2ＥＤＴＡ；ｐＨ７．０）５ｍｌを加え、懸濁させた。０℃で５分間放置すると、懸濁液中の赤血球が破壊された。１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地１５ｍｌを加えてから遠心分離した。このようにして得た細胞ペレットをＤＭＥ培地で遠心法によって洗浄し、生きている脾細胞数を測定した。
【００５４】
一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／０−Ａｇ１４（約２×１０7個）に前記脾臓細胞（１×１０8個）を加え、ＤＭＥ培地中でよく混合し、遠心分離を行なった（５００×ｇ，１０分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、３８℃に保温しておいた４０％ポリエチレングリコール４０００溶液０．５ｍｌを滴下し、遠心チューブを手で、１分間穏やかに回転することによってポリエチレングリコール溶液と細胞ペレットとを混合させた。次に、３８℃に保温しておいたＤＭＥ培地を３０秒毎に１ｍｌずつ加えてチューブを穏やかに回転させた。この操作を１０回繰り返した後、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地２０ｍｌを加えて、遠心分離（５００×ｇ，１０分間）を行なった、上清を除去した後、細胞ペレットを１５％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にアミノプテリン４×１０-7Ｍ、チミジン１．６×１０-5Ｍ、及びヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加したもの）で、遠心法によって２回洗浄した後、前記ＨＡＴ培地４０ｍｌに懸濁した。
【００５５】
この細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに２００μｌずつ分注し、５％炭酸ガスを含む３７℃の炭酸ガス培養器で培養を開始した。培養中、２〜３日間隔で各ウェルの培地約１００μｌを除き、新たに前記のＨＡＴ培地１００μｌを加えることによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを選択した。８日頃から１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地（ＤＭＥ培地にチミジン１．６×１０-5Ｍ及びヒポキサンチン１×１０-4Ｍになるように添加したもの）に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察するとともに、約１０日目に、後述するＥＬＩＳＡ法により、本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。
【００５６】
（ｃ）ハイブリドーマの樹立
ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無をＥＬＩＳＡ法により測定した。
９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ II，日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに、前記実施例７で調製したハプテンペプチド−ＢＳＡコンジュゲートの溶液［５μｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で希釈したもの］を５０μｌずつ分注し、４℃で一夜放置した。次に、０．０５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含む生理食塩水（以下、トウィーン２０−生理食塩水と称する）で３回洗浄した後、各ウェルの培養上清５０μｌを加え、２５℃で１時間反応させた。
【００５７】
次に、０．０５％トウィーン２０及び１５０ｍＭ−ＮａＣｌを含む５０ｍＭ−トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリンウサギＩｇＧ抗体（ダコ社、デンマーク）５０μｌを各ウェルに加えた。反応終了後、トウィーン２０−生理食塩水で各ウェルを３回洗浄し、酵素基質溶液［０．５ｍＭ−４−アミノアンチピリン、１０ｍＭフェノール、及び０．００５％過酸化水素水を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）］２００μｌを各ウェルに加え、２５℃で３０分間反応させ、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００５８】
その結果、２７９ウェル中４ウェルに抗体産生が認められた。その４ウェル中の各ハイブリドーマを２４ウェルプレートに移し、１５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地で４〜５日間培養した。その後、再度、ハプテンペプチド−ＢＳＡコンジュゲートを固定化したＥＬＩＳＡ法によって、本発明のモノクローナル抗体の産生の有無を確認してから、限界希釈法によりクローニングした。１０日後に、ハプテンペプチド−ＢＳＡコンジュゲートを固定化したＥＬＩＳＡ法によって、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンをスクリーニングした。その結果、各ハイブリドーマにつき、２０〜４０個の抗体産生クローンが得られた。これらのクローンの中から、増殖性が良好で、抗体分泌能が高く、しかも安定なクローン４種（クローンＮｏ．１〜Ｎｏ．４）を選んだ。これらクローンの培養上清中の抗体について、前記実施例１で調製したｅ−Ｄモノマー、又は前記実施例３で調製したｐ−Ｄモノマーを固相化したＥＬＩＳＡ法によって反応性を調べた。この結果を表１に示す。表中、「＋」は結合反応性が有ることを示し、「−」は結合反応性がないことを示す。
【００５９】
【表１】
表１の結果より、クローン番号Ｎｏ．２、Ｎｏ．３、及びＮｏ．４の各クローンより産生されるモノクローナル抗体は、ｅ−Ｄモノマーに対して反応性を示すと共に、ｐ−Ｄモノマーに対しても反応性を示すことが明らかとなった。このため、これらのクローンについては、以下の実験を行わなかった。一方、クローン番号Ｎｏ．１より産生されるモノクローナル抗体は、ｅ−Ｄモノマーに対して反応性を示し、ｐ−Ｄモノマーに対して反応性を示さなかったので、前記と同様の方法により再クローン化を行い、本発明のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマＥＤＣ−１を樹立した。ハイブリドーマＥＤＣ−１は、工業技術院生命工学工業技術研究所に平成１０年７月２４日から寄託されている。ハイブリドーマＥＤＣ−１の受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１６９１１である。
【００６１】
【実施例９】
《モノクローナル抗体の製造》
（ａ）イン・ビトロ法
前記実施例８で得られたマウスハイブリドーマＥＤＣ−１を、１５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地で３７℃にて５％二酸化炭素雰囲気中において７２〜９６時間培養した。培養物を遠心分離（１０，０００×ｇ，１０分間）した後、上清に固形の硫酸アンモニウムを５０％最終濃度となるように徐々に加えた。混合物を氷冷下で３０分間攪拌した後、６０分間放置し、遠心分離（１０，０００×ｇ，１０分）した。得られた沈渣を少量の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００倍量の１０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析した。
【００６２】
透析物を、１０ｍＭリン酸緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに充填した。モノクローナル抗体の溶出は、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）と０．２Ｍ−ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）との間で濃度勾配法により行なった。溶出されたモノクローナル抗体を限外濾過法で濃縮し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析した。ウシ血清ＩｇＧを除くために、透析物をヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムに通した。次に通過液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したプロテインＡ−セファロース４Ｂのカラムに充填した。カラムをｐＨ３．５の緩衝液で溶出して、精製した本発明のモノクローナル抗体ＥＤＣ−１を得た。なお、本明細書においては、ハイブリドーマの名称を、そのハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の名称としても使用する。
【００６３】
（ｂ）イン・ビボ法
プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）０．５ｍｌを１０〜１２週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投与し、投与後１４〜２０日目のマウス腹腔内にインビトロで増殖させたハイブリドーマＥＤＣ−１をマウス一匹あたり２×１０6細胞となるように接種した。
一匹のマウスから約１０〜１５ｍｌの腹水が得られた。その抗体濃度は、５〜１０ｍｇ／ｍｌであった。腹水中のモノクローナル抗体の精製は、前記のイン・ビトロ法と同様の方法で行なった。但し、ヤギ抗ウシ血清ＩｇＧ−セファロース４Ｂのカラムを通す操作は行わなかった。
【００６４】
【実施例１０】
《モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラスの同定》
本発明のモノクローナル抗体ＥＤＣ−１の免疫グロブリンクラスの同定は、オクテロニー免疫拡散法により行なった。モノクローナル抗体ＥＤＣ−１の免疫グロブリンクラスは、ＩｇＧ1，κであった。
【００６５】
【実施例１１】
《モノクローナル抗体の特異性》
モノクローナル抗体ＥＤＣ−１の特異性の検討は、ＥＬＩＳＡ法によって以下の手順で行なった。
すなわち、前記実施例１又は実施例２で調製したヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼによる各種分解物と、前記実施例３又は実施例４で調製したヒトフィブリノーゲンのプラスミンによる各種分解物と、ヒトフィブリノーゲンとを、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ含有５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ II；日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに、前記希釈液５０μｌずつを分注し、２５℃で２時間放置することにより固定化した。次に、トウィーン２０−生理食塩水でウェルを３回洗浄した後、モノクローナル抗体ＥＤＣ−１を、０．０５％トウィーン２０及び１５０ｍＭ−ＮａＣｌを含む５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、各ウェルに５０μｌずつ分注し、２５℃で１時間反応させた。この際、ブランクとして、本発明のモノクローナル抗体の代わりに、ＳＰ２／０細胞をマウス腹腔に投与して採取した腹水を反応させた。
【００６６】
続いて、トウィーン２０−生理食塩水でウェルを洗浄した後、０．０５％トウィーン２０及び１５０ｍＭ−ＮａＣｌを含む５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で２００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリンウサギＩｇＧ抗体（ダコ社、デンマーク）５０μｌずつを各ウェルに加えた。反応終了後、トウィーン２０−生理食塩水で各ウェルを３回洗浄し、酵素基質溶液［０．５ｍＭ−４−アミノアンチピリン、１０ｍＭフェノール、及び０．００５％過酸化水素水を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）］２００μｌを各ウェルに加え、２５℃で３０分間発色反応させ、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。各モノクローナル抗体と各抗原との結合反応の結果を表２に示す。表２において、「＋」は結合反応性を有することを示し、「−」は結合反応性がないことを示す。
【００６７】
【表２】
表２の結果から明らかなように、モノクローナル抗体ＥＤＣ−１は、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解物中のＤモノマー、及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解物の内、Ｄドメインを有する分解物（すなわち、ｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体）と特異的に反応するが、顆粒球エラスターゼのフィブリノーゲン分解物のフラグメントＸ、フラグメントＹ、及びフラグメントＥ、並びにヒトフィブリノーゲンとは反応しなかった。また、ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解物及びヒト安定化フィブリンのプラスミン分解物とも反応しなかった。
【００６９】
ヒトフィブリノーゲンを顆粒球エラスターゼにより分解すると、ｅ−フラグメントＸ、ｅ−フラグメントＹ、そして、ｅ−フラグメントＤの各フラグメントの順に分解反応が進行する。この過程で、それぞれのフラグメントを構成しているα鎖のＣ末端も順次切断される。表２に示すように、モノクローナル抗体ＥＤＣ−１は、ｅ−フラグメントＸ及びｅ−フラグメントＹに反応せず、ｅ−フラグメントＤに反応したことにより、免疫抗原として用いた配列番号２のペプチドＣ末端構造、すなわち、ｅ−フラグメントＤまで分解が進んだときに初めて露出するエピトープを、モノクローナル抗体ＥＤＣ−１は認識することがわかる。モノクローナル抗体ＥＤＣ−１は、ｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体に対しても反応したので、同様のエピトープは、ｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体においても露出している。更に、ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解物及びヒト安定化フィブリンのプラスミン分解物には反応しないので、これらプラスミン分解物には、このエピトープを形成するＣ末端構造は露出していない。
【００７０】
【実施例１２】
《モノクローナル抗体ＥＤＣ−１のエピトープの同定》
種々の合成ペプチドを用いた阻害試験によって、モノクローナル抗体ＥＤＣ−１のエピトープを更に調べた。使用した合成ペプチドは、配列表の配列番号３の配列に記載のアミノ酸配列（配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列における第１番目のアミノ酸残基〜第８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する）で表されるペプチド（以下、ペプチドＡと称する）、配列表の配列番号４の配列に記載のアミノ酸配列（配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列における第４番目のアミノ酸残基〜第１１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する）で表されるペプチド（以下、ペプチドＢと称する）、及び配列表の配列番号５の配列に記載のアミノ酸配列（配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列における第６番目のアミノ酸残基〜第１３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する）で表されるペプチド（以下、ペプチドＣと称する）である。阻害試験は、以下の手順に従って、ＥＬＩＳＡ法によって行なった。
【００７１】
すなわち、前記実施例５（ｃ）で得られたペプチド（配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド）を、５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で４ｎＭとなるように希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡ用プレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ II，日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに、前記希釈液５０μｌずつを分注し、４℃で１５時間放置することにより固定化した。次に、トウィーン２０−生理食塩水でウェルを３回洗浄した後、０．２５μｇ／ｍｌモノクローナル抗体ＥＤＣ−１に、３種の前記合成ペプチド（ペプチドＡ、ペプチドＢ、又はペプチドＣ）のいずれか１種を０〜１０００ｎＭの種々の濃度で共存させた０．０５％トウィーン２０及び１５０ｍＭ−ＮａＣｌを含む５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を、各ウェルに５０μｌずつ分注し、２５℃で１時間反応させた。
【００７２】
トウィーン２０−生理食塩水でウェルを洗浄した後、０．０５％トウィーン２０及び１５０ｍＭ−ＮａＣｌを含む５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で２００倍希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリンウサギＩｇＧ抗体（ダコ社，デンマーク）５０μｌずつを各ウェルに加えた。反応終了後、トウィーン２０−生理食塩水で各ウェルを３回洗浄し、酵素基質溶液［０．５ｍＭ−４−アミノアンチピリン、１０ｍＭフェノール、及び０．００５％過酸化水素水を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）］２００μｌを各ウェルに加え、２５℃で３０分間発色反応させ、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００７３】
結果を図１に示す。図１において、「残存活性」とは、共存ペプチド（すなわち、ペプチドＡ、ペプチドＢ、又はペプチドＣ）が存在しないときの吸光度を１００％とした場合の、各共存ペプチド濃度における吸光度の割合である。図１から明らかなように、固相化した配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに対するモノクローナル抗体ＥＤＣ−１の反応性は、ペプチドＡ及びペプチドＢにより阻害されず、ペプチドＣにより阻害された。すなわち、モノクローナル抗体ＥＤＣ−１は、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのＣ末端アミノ酸配列部分に反応する。
【００７４】
【実施例１３】
《酵素免疫測定法によるｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の測定》
モノクローナル抗体ＥＤＣ−１を２０μｇ／ｍｌの濃度で含有する５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）１００μｌを、９６ウェルＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ−II，日本ダイナテック株式会社）の各ウェルに分注し、２５℃で２時間放置した。そのプレートをトウィーン２０−生理食塩水で３回洗浄した。このようにして抗体を感作したプレートのウェルに、種々濃度のｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、ｅ−ＤＤ／Ｅ複合体、フィブリノーゲンのプラスミン分解物、又は安定化フィブリンのプラスミン分解物を添加した正常血漿１００μｌを加え、２５℃で３０分間反応させた。
【００７５】
トウィーン２０−生理食塩水でプレートを３回洗浄した後、０．０５％トウィーン２０及び１５０ｍＭ−ＮａＣｌを含む５０ｍＭ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で２００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトフィブリノーゲンウサギＩｇＧ抗体（ダコ社、デンマーク）１００μｌを加え、２５℃で３０分間反応させた。トウィーン２０−生理食塩水でプレートを３回洗浄した後、酵素基質液［１ｍＭ−２，２'−アジノ−ジ（３−エチルベンツチアゾリンスルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び０．００２５％過酸化水素水を含む溶液（ｐＨ４．５）］２００μｌずつを各ウェルに加え、２５℃で４０分間反応させた後に、各ウェルの４０５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（ＭＰＲ Ａ４ｉ型；東ソー）で測定した。
【００７６】
得られた検量線を図２に示す。反応曲線ａは、ｅ−Ｄダイマーをサンプルとして測定した場合の結果を示し、以下同様に、反応曲線ｂはｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を、反応曲線ｃはｅ−ＤＤ／Ｅ複合体及びｐ−ＤＤ／Ｅ複合体の等量混合物を、反応曲線ｄはｅ−Ｄモノマーを、反応曲線ｅはｐ−ＤＤ／Ｅ複合体を、そして、反応曲線ｆはフィブリノーゲンのプラスミン分解物をサンプルとして測定した場合の結果を示す。図２より明らかなように、モノクローナル抗体ＥＤＣ−１を用いた酵素免疫測定法（ＥＩＡ）において、ｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を特異的に定量測定することができた。
【００７７】
【実施例１４】
《モノクローナル抗体ＥＤＣ−１結合ラテックスの調製、及び前記ラテックスによるｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の測定》
モノクローナル抗体ＥＤＣ−１（２．０ｍｇ／ｍｌ）を含有する５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２ｍｌと、ラテックス溶液（２％ポリスチレンラテックス，日本合成ゴム，粒径０．３１０μｍ）２ｍｌとを混合し、マグネチックスターラーにて２時間撹拌し、抗体をラテックス粒子上に固定化した。遠心分離（２０，０００×ｇ，２０分間）した後、沈殿を、０．１％ＢＳＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、１時間撹拌した。遠心分離（２０，０００×ｇ，２０分間）を繰り返すことにより、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で沈殿を３回洗浄した後、沈殿を、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁させ（１重量／容量％）、モノクローナル抗体ＥＤＣ−１結合ラテックス含有液を得た。前記モノクローナル抗体ＥＤＣ−１結合ラテックス含有液は、使用するまで４℃で保存した。
【００７８】
得られたモノクローナル抗体ＥＤＣ−１結合ラテックス含有液と、種々濃度のｅ−Ｄダイマー、ｅ−ＤＤ／Ｅ複合体、フィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解物、フィブリノーゲンのプラスミン分解物、又はフィブリンのプラスミン分解物とを混合し、全自動免疫血清検査システム（三菱化学株式会社製ＬＰＩＡ−２００）を用いて、凝集の反応速度を測定することにより、定量を実施した。
結果を図３に示す。反応曲線ａは、ｅ−Ｄダイマーをサンプルとして測定した場合の結果を示し、以下同様に、反応曲線ｂはｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を、反応曲線ｃはｅ−ＤＤ／Ｅ複合体及びｐ−ＤＤ／Ｅ複合体の等量混合物を、反応曲線ｄはフィブリノーゲンのプラスミン分解物を、反応曲線ｅはｐ−ＤＤ／Ｅ複合体を、そして、反応曲線ｆはフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解物を、サンプルとして測定した場合の結果を示す。図３における「Ｖ値」とは、凝集の反応速度である。図３より明らかなように、モノクローナル抗体ＥＤＣ−１結合ラテックスを用いて、ｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体を特異的に定量測定することができた。
【００７９】
【発明の効果】
本発明のモノクローナル抗体によれば、生体試料中のｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の量を、前記生体試料中に存在すると考えられるフィブリノーゲン、フィブリノーゲンのプラスミン分解物、フィブリノーゲンのプラスミン分解物（特には、ｐ−Ｄダイマー又はｐ−ＤＤ／Ｅ複合体）の干渉を受けることなく、特異的に測定することのできる免疫学的測定法を提供することができる。
【００８０】
【配列表フリーテキスト】
配列表の配列番号２の配列に記載のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１の配列に記載のアミノ酸配列におけるＮ末端のＡｓｐをＣｙｓに置換したアミノ酸配列である。
【００８１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のモノクローナル抗体ＥＤＣ−１のエピトープの同定を、各種合成ペプチドを用いた阻害試験により行なった結果を示すグラフである。
【図２】本発明によるモノクローナル抗体ＥＤＣ−１を用いた酵素免疫測定法により、各種濃度に調製したｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の測定を行なった検量線を示すグラフである。
【図３】本発明のモノクローナル抗体ＥＤＣ−１を結合したラテックスと、各種抗原とを接触させた場合に生じる凝集反応における、抗原濃度と凝集反応速度との関係を示すグラフである。
Claims (4)
- ヒトフィブリノーゲンのＡα鎖の第２０４番目のロイシン残基であって、ヒトフィブリノーゲンのＡα鎖に顆粒球エラスターゼが作用して前記Ａα鎖のＣ末端領域の一部が切断除去されることにより、Ｃ末端アミノ酸残基として初めて露出する前記ロイシン残基と反応し、
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと反応し、且つ、前記ペプチドに対する反応性が、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドで阻害される
ことを特徴とする、モノクローナル抗体又はその抗体フラグメント。 - 請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生することを特徴とする、ハイブリドーマ。
- 請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントを第１抗体として不溶性担体に固定化し、
この固定化された第１抗体と、被検試料と、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物に反応し、且つ前記第１抗体とは異なるエピトープに反応する抗体に標識を付した第２抗体とを接触させ、そして、
前記の固定化第１抗体に補足された、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー若しくはヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物と結合した前記第２抗体の前記標識からの信号、又は前記の固定化第１抗体に補足された、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー若しくはヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物と結合しなかった前記第２抗体の前記標識からの信号を検出する
ことを特徴とする、ヒトフィブリノーゲンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄモノマー及びヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物の免疫学的分析方法。 - 不溶性担体に固定化された請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントと、被検試料とを接触させ、凝集反応を観察することを特徴とする、ヒト安定化フィブリンの顆粒球エラスターゼ分解Ｄドメイン含有分解物の免疫学的分析方法。
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